CN117776897A - 一种二萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二萜类化合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明提供的二萜类化合物的结构式如式(I)所示：式(I)中，R₁选自氢或乙酰氧基；R₂选自氢、羟基或甲氧基；R₃选自氢或羟基。本发明的二萜类化合物具有PXR靶点高亲和力，具有显著的抗炎效果，可以通过激活肠道PXR靶点、调控炎症因子水平，具有显著治疗炎症性肠病的效果，并且其为天然提取物，具有疗效显著、毒副作用低的优点，在制备PXR激动剂或制备治疗炎症性肠病的药物中有广泛的应用。

Description

一种二萜类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种二萜类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

炎症性肠病(IBD)包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，是一种慢性、复发性炎症性疾病，其特征是肠道稳态失调、肠上皮屏障破坏、肠道通透性增加和肠道菌群失调、肠道免疫系统紊乱。目前IBD的治疗方法包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇、抗生素、免疫调节剂、生物制剂以及甚至手术。然而，由于治疗效果有限、经济成本高、长期治疗副作用大等，迫切需要寻找新的有效治疗IBD的药物。虽然IBD发病的确切原因尚未完全阐明，但目前认为IBD与肠上皮屏障功能的改变和粘膜免疫系统的失调有关。

孕烷X受体(PXR)是一种配体激活的转录因子，主要在肝脏和肠道中表达，负责药物代谢酶和转运蛋白的表达。PXR在调节肠道稳态和消除炎症方面发挥着重要作用。首先，PXR可以通过多药耐药基因(MDR1)和下游蛋白P-糖蛋白的表达排出粘液层中的毒素并维持肠道稳态。此外，PXR缺乏是IBD肠上皮屏障破坏和肠道通透性增加的是重要因素。PXR对肠道屏障和通透性的影响机制可能是通过TLR4。此外，PXR的激活还会抑制NF-κB下游促炎基因的表达，包括编码IL-1β、IL-10、iNOS和TNFa的基因，表明PXR抑制炎症反应。PXR已成为学术界乃至国际制药公司极具发展潜力的研究热点。中国发明专利CN101896815A也提供了化合物利福昔明用于激活PXR治疗长疾病。此外，孕烯醇酮-16α-腈作为PXR激动剂已纳入临床试验，然而，由于安全问题，这些化合物在临床上的应用受限。

姜黄素、小檗碱和白藜芦醇等化合物已被证明是缓解炎症性肠病的重要来源。其中，传统中药中分离的活性成分因其显著功效和安全性而具有独特优势。研究表明，黄芩素、白杨素和人参皂苷Rb1已被确定为激活PXR的配体。中国发明专利CN107714692A也公开了白芷中的欧前胡素可通过激活PXR来抗肠炎。因此，传统中药的天然PXR激动剂可能是治疗IBD的新策略。

溪黄草(Rabdosia serra(Maxim.))作为一种极具特色中药资源和岭南地区是知名的凉茶原料，其主要分布于中国南部地区，包括广东、福建、广西以及亚洲其他亚热带和热带地区。溪黄草具有清热解毒、清热利湿之功，可湿热黄疽、湿热泻痢，广泛用于治疗急性黄疽型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎、跌打痛等疾病。同时，溪黄草还是中成药消炎利胆片、复方胆通片的重要原料之一。溪黄草提取物有望成为治疗IBD的新策略。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种二萜类化合物，所述二萜类化合物具有PXR靶点高亲和力，具有显著的抗炎效果，可以通过激活肠道PXR靶点、调控炎症因子水平，具有显著治疗炎症性肠病的效果。

本发明的目的之二在于提供一种上述二萜类化合物的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种包括上述二萜类化合物的PXR激动剂。

本发明的目的之三在于提供一种包括上述PXR激动剂的治疗炎症性肠病的药物。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面提供了一种二萜类化合物，所述化合物的结构式如式(I)所示：

式(I)中，R₁选自氢或乙酰氧基；R₂选自氢、羟基或甲氧基；R₃选自氢或羟基。

式(I)中，“---”表示该键存在或不存在。

优选地，式(I)所示化合物选自式(1)～(4)所示化合物中的至少一种：

本发明的第二方面提供了一种本发明的第一方面所述的二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：采用渗漉法对溪黄草进行提取，得到提取液，将所述提取液进行萃取、分离纯化后得到所述的二萜类化合物。

研究发现溪黄草提取物是治疗IBD的有效方法，溪黄草提取物可以通过改善结肠长度、上调抗炎因子、下调促炎因子、恢复T辅助细胞调节细胞的平衡以及增加紧密连接蛋白ZO-1和occludin以保护肠道屏障功能。本发明通过亲和纯化非靶向质谱(AP-UMS)探索了溪黄草粗提物中PXR靶点的高亲和力的靶向结合信号，发现了一种二萜类化合物，其作为天然的PXR激动剂，可以有效激活PXR，促进PXR表达。

优选地，所述制备方法中，所述渗漉法采用的提取溶剂与溪黄草的用量比为(10～15)L：1kg。

优选地，所述制备方法中，所述渗漉法采用的提取溶剂为醇类溶剂；进一步优选为乙醇。

优选地，所述制备方法中，采用渗漉法对溪黄草进行提取的次数为3～5次。

优选地，所述制备方法中，采用渗漉法对溪黄草进行提取前，对溪黄草进行干燥、粉碎。

优选地，所述制备方法中，将所述提取液进行萃取前还包括浓缩、复溶的步骤，即包括将提取液浓缩至干，再用水复溶的步骤。

优选地，所述制备方法中，所述萃取的萃取剂为酯类溶剂；进一步优选为乙酸乙酯。

优选地，所述制备方法中，所述萃取的次数为2～4次。

优选地，所述制备方法中，所述分离纯化为：依次采用硅胶柱、葡聚糖凝胶柱、反相色谱柱进行洗脱。

优选地，所述制备方法中，采用所述硅胶柱进行洗脱时的洗脱液为醚类溶剂和酯类溶剂的混合溶液；进一步优选地，所述醚类溶剂选自石油醚，所述酯类溶剂选自乙酸乙酯。

优选地，所述制备方法中，所述混合溶液中的醚类溶剂和酯类溶剂的体积比为(0～6)：1。

优选地，所述制备方法中，采用所述硅胶柱进行洗脱时的洗脱次数为3～5次；进一步优选为4次；更进一步优选地，采用所述硅胶柱进行4次洗脱时的洗脱液依次为体积比为5：1、3：1、1：1和0：1的醚类溶剂和酯类溶剂的混合溶液。

优选地，所述制备方法中，采用所述硅胶柱进行洗脱时的洗脱液与洗脱柱的体积比为4：1。

优选地，所述制备方法中，所述硅胶柱选自正相硅胶柱。

优选地，所述制备方法中，采用葡聚糖凝胶柱进行洗脱时的洗脱液为醇类溶剂；进一步优选为甲醇；更进一步优选为体积浓度为70～90％的甲醇。

优选地，所述制备方法中，采用葡聚糖凝胶柱进行洗脱时的待洗脱物为采用硅胶柱洗脱得到的第7馏分。

优选地，所述制备方法中，所述葡聚糖凝胶柱选自LH-20柱。

优选地，所述制备方法中，采用反相色谱柱进行洗脱时的待洗脱物为采用葡聚糖凝胶柱洗脱得到的第11组分。

优选地，所述制备方法中，所述反相色谱柱选自C18柱。

本发明的第三方面提供了一种包括本发明的第一方面所述的二萜类化合物的PXR激动剂。

优选地，所述PXR激动剂的活性组分包括所述二萜类化合物；进一步优选地，所述PXR激动剂的活性组分选自所述二萜类化合物。所述二萜类化合物作为PXR激动剂唯一的活性成分，可以有效激活PXR，促进PXR表达。

本发明的第四方面提供了一种包括本发明的第三方面所述的PXR激动剂的治疗炎症性肠病(IBD)的药物。

优选地，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎(UC)。

本发明的有益效果是：本发明的二萜类化合物具有PXR靶点高亲和力，具有显著的抗炎效果，可以通过激活肠道PXR靶点、调控炎症因子水平，具有显著治疗炎症性肠病的效果，并且其为天然提取物，具有疗效显著、毒副作用低的优点，在制备PXR激动剂或制备治疗炎症性肠病的药物中有广泛的应用。

具体而言，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、PXR激动剂作为治疗炎症性肠病的新一代药物，具有靶点明确、疗效确切、毒副作用低的优点，本发明的PXR激动剂是溪黄草中的主要有效成分，先通过亲和纯化非靶向质谱(AP-UMS)探索了PXR靶点结合信号，并通过多重色谱法靶向提取，得到了一种二萜类化合物，其具有PXR靶点高亲和力，具有显著的抗炎效果，通过激活肠道PXR靶点、调控炎症因子水平，具有显著治疗炎症性肠病尤其是溃疡性结肠炎的疗效。

2、本发明的二萜类化合物是溪黄草中的主要有效成分，该类化合物是天然的，具有较高的安全性，作为天然的PXR激动剂可安全、有效地治疗炎症性肠病尤其是溃疡性结肠炎。

附图说明

图1为本发明制备例的化合物1～4的核磁共振氢谱图和碳谱图。

图2为本发明制备例的化合物1～4对HCT116细胞的细胞毒性。

图3为本发明制备例的化合物1～4诱导CYP3A4荧光霉素的活性。

图4为本发明制备例的化合物4缓解DSS诱导的结肠炎效果。

图5为本发明制备例的化合物4缓解DSS诱导的结肠炎炎症水平。

图6为本发明制备例的化合物4激活PXR活性的功效。

图7为本发明制备例的化合物4对DSS诱导PXR^-/-小鼠急性结肠炎疗效。

图8为本发明制备例的化合物4对PXR^-/-结肠炎小鼠炎症因子水平的影响。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。以下实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

制备例

本例提供一种二萜类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：

溪黄草干燥、粉碎，将15kg溪黄草粉末以1：10(w/v)的料液比用乙醇进行渗漉法提取，共提取四次，合并乙醇提取液，真空减压浓缩至干，然后10L超纯水复溶。将复溶的提取物水溶液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，收集乙酸乙酯层。采用正相硅胶柱进行色谱分离纯化乙酸乙酯层样品，依次用体积为5：1(4个柱体积)、3：1(4个柱体积)、1：1(4个柱体积)及0：1(4个柱体积)的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集馏分，共得18个组分。再将第7馏分用葡聚糖凝胶柱LH-20柱分离，以80％甲醇进行洗脱，收集馏分。最后将收集的第11组分收集用反向色谱柱C18分馏纯化并通过LC-MS及NMR进行鉴定。

如表1所示，本发明制备例共筛选出4种具有激活PXR靶点的二萜类化合物，分别为化合物1～4。并通过核磁共振氢谱和核磁共振碳谱对化合物1～4进行结构表征，结果如表2及图1所示，图1为本发明制备例的化合物1～4的核磁共振氢谱图和碳谱图，(A)化合物1；(B)化合物2；(C)化合物3；(D)化合物4。

表1化合物1～4的结构式

表2化合物1～4的核磁共振氢谱数据

实验例1

本例探究制备例制得的二萜类化合物激活PXR的能力。

一、实验方法

(1)细胞毒性研究

将HCT116结肠癌细胞按照1×10⁴个/mL种于96孔培养板中，在37℃恒温培养箱中，5％二氧化碳浓度孵育。待其贴壁后，加入4种本发明制备例制得的化合物(10μM)孵育24h，采用MTT法测细胞活性。

(2)激活PXR的能力研究

将HCT116结肠癌细胞按照1×10⁴个/mL种于96孔培养皿中，细胞贴壁后，使用Lipofectamine 2000试剂转染pCMV6-XL4-hPXR(100ng/well)，PLG-CYP3A4-luc和TK-luc(10ng/well)Renilla荧光素质粒。24h后，去掉培养基，分别加入DMSO(0.1％，v/v)、4种化合物(10μM)和阳性药孕烯醇酮-16α-腈(PCN，10μM)，诱导48h后，采用荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性，研究本发明制备例的二萜类化合物激活PXR的能力。

二、实验结果

图2为本发明制备例的化合物1～4对HCT116结肠癌细胞相对细胞毒性，图3为本发明制备例的化合物1～4诱导CYP3A4荧光霉素的活性。如图2所示，，当该类化合物浓度为10μM时，HCT116细胞相对活力均接近100％，表明该类化合物具有较好的安全性。如图3所示，共转染各种质粒后，本发明制备例的二萜类化合物(10μM)可显著诱导CYP3A4-luc荧光素酶的活性，表明本发明制备例的该类化合物具有激活PXR的活性。

实验例2

本例以化合物4为例，探究其作为天然PXR激动剂，在改善DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的溃疡性结肠炎中的疗效。

一、实验方法

(1)小鼠DSS诱导的急性结肠炎模型构建

将40只SPF级6-8周龄的雄鼠C57BL/6J在SPF的环境下适应性饲养一周，光照周期为12h明/12h暗，保持饮水和饲料充足。小鼠随机分为对照组(Ctrl组)，造模组(DSS组)，阳性对照组(孕烯醇酮-16α-腈，PCN组)、治疗组(化合物4组)，每组小鼠10只。第1-10天，治疗组小鼠灌胃30mg/Kg化合物，阳性对照组灌胃10mg/Kg PCN，对照组和造模组灌胃等体积的0.1％ CMC+3％ DMSO混合溶液，每只小鼠的灌胃体积为200μL，每日给药一次。第4-10天，在给药的同时，对治疗组、造模组及阳性对照组用含有2.8％DSS饮用水喂养7天诱发急性结肠炎。在造模及治疗期间，各组小鼠均自由饮水和饮食。在11天后处死小鼠，收集小鼠的血液和结肠组织。

(2)对小鼠体重的影响

实验期间每日对各组小鼠进行称重并记录，根据体重变化绘制曲线。并记录小鼠粪便，记录小鼠腹泻、血便的情况，并对小鼠进行疾病活动指数(DA1)评分。

(3)组织形态学分析

结肠组织通过苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学分析。取结肠远端段(约1cm)用福尔马林(4％，m/V)固定，脱水后用石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色后脱水封片。随后，使用尼康Eclipse Ts2R+FL显微镜(Nikon Instruments Inc.,Tokyo,Japan)观察H&E染色切片的图像。

(4)结肠组织炎症因子含量的测定

按照ELISA试剂盒的操作说明测定结肠组织中的TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10含量。

(5)实时定量聚合酶链反应(qPCR)

采用qPCR法测定结肠组织中的Cypca11和MDR1a的表达水平。总RNA的提取按照诺唯赞试剂盒执行，结肠组织中的Cypca11和MDR1a mRNA水平评估根据TAKARA试剂盒执行。

二、实验结果

图4为本发明制备例的化合物4缓解DSS诱导的结肠炎效果。(A)体重变化趋势图；(B)DAI变化趋势图；(C)结肠长度；(D)代表性结肠图；(E)结肠HE染色图。结果以平均值±标准差表示，每组n＝10。与对照组比较，###P<0.001；与DSS组比较，***P<0.001，**P<0.05。

结果显示，与Ctrl组小鼠相比，在采用DSS诱导溃疡性结肠炎后，造模组、治疗组和阳性对照组小鼠体重呈先增加，随后炎症的发生，体重逐渐降低(图4A)，并且结肠长度显著缩短(图4C&D))和疾病活动指数DAI评分升高(图4B)。阳性对照组(PCN组)可显著增加DSS组小鼠的结肠长度，降低DAI评分。此外，化合物4亦可显著增加DSS组小鼠的结肠长度，降低DAI评分；通过HE染色对结肠组织进行病理评价，如图4E所示，DSS组小鼠结肠存在明显的隐窝形态改变、杯状细胞大量破损或丢失、炎性细胞浸润和严重的粘膜损伤。阳性对照组(PCN组)小鼠结肠隐窝形态改变缓解，杯状细胞结构清晰，组织中炎症细胞浸润减轻。化合物4可缓解DSS组小鼠结肠隐窝形态改变，保护杯状细胞，降低炎性细胞浸润。由此可见，本发明制备例的化合物4作为天然PXR激动剂，可有效的改善小鼠的结肠病理损伤。

此外，促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α是与IBD密切相关的炎症标志物。图5为本发明制备例的化合物4缓解DSS诱导的结肠炎炎症水平，具体包括：结肠组织中(A)白介素IL-6；(B)IL-1β；(C)TNF-α；(D)IL-10水平。结果以平均值±标准差表示，每组n＝10。与对照组比较，###P<0.001；与DSS组比较，***P<0.001，**P<0.05，*P<0.01。

如图5所示，本发明制备例的化合物4处理可显着降低了结肠组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，并增加了抗炎因子IL-10的水平。在阳性药组中观察到类似的效果。综上，本发明制备例的化合物作为天然PXR激动剂，可显著降低促炎因子水平和促进抗炎因子的释放来减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的肠道炎症。

此外，图6为本发明制备例的化合物4激活PXR活性的功效。(A)Cyp3a11的mRNA水平；(B)MDR1a的mRNA水平。结果以平均值±标准差表示，每组n＝10。与对照组比较，###P<0.001；与DSS组比较，***P<0.001。如图6所示，mPXR靶基因表达量分析显示，小鼠结肠组织中的Cyp3a11和MDR1a mRNA水平降低。表明了本发明制备例的化合物4作为天然PXR激动剂，可显著诱导PXR靶基因表达。

实验例3

本例以化合物4为例，探究其作为天然PXR激动剂，对DSS诱导的PXR^-/-小鼠(敲除PXR基因的小鼠)溃疡性结肠炎的疗效。

一、实验方案

将40只SPF级6-8周龄的PXR^-/-雄鼠在SPF的环境下适应性饲养一周，光照周期为12h明/12h暗，保持饮水和饲料充足。同上述实验例2，将PXR^-/-小鼠随机分为对照组(Ctrl组)，造模组(DSS组)，阳性对照组(PCN组)、治疗组(化合物4组)，每组小鼠10只。第1-10天，治疗组小鼠灌胃30mg/Kg化合物，阳性对照组灌胃10mg/Kg PCN，每只小鼠的灌胃体积为200μL，每日给药一次。第4-10天，在给药的同时，对治疗组、模型组及阳性对照组用含有2.8％DSS饮用水喂养7天诱发急性结肠炎。记录小鼠体重及记录小鼠腹泻、血便的情况。小鼠在11天后处死小鼠，收集小鼠的血液和结肠组织，分析结肠中炎症水平并评估结肠中PXR靶基因表达。

二、实验结果

图7为本发明制备例的化合物4对DSS诱导PXR^-/-小鼠急性结肠炎疗效。(A)体重变化趋势图；(B)DAI变化趋势图；(C)结肠长度；(D)代表性结肠图。结果以平均值±标准差表示，每组n＝10。与对照组比较，###P<0.001；与DSS组比较，ns：no significantdifference，无显著差异。

如图7所示，在采用DSS诱导PXR^-/-小鼠溃疡性结肠炎后，造模组、治疗组和阳性对照组小鼠体重先增加后体重逐渐降低(图7A)，结肠长度显著缩短(图7C&D)和疾病活动指数DAI评分升高(图7B)。但与DSS模型组比较，本发明制备例的化合物4和阳性药PCN并未缓解DSS诱导的急性肠炎。由此可见，本发明制备例的化合物4作为天然PXR激动剂，并不能改善PXR^-/-小鼠的结肠病理损伤，表明化合物4是一种PXR靶点激动剂，通过激活PXR靶点基因达到改善结肠炎的效果。

此外，图8为本发明制备例的化合物4对PXR^-/-结肠炎小鼠炎症因子水平的影响。结肠组织中(A)IL-6；(B)IL-1β；(C)TNF-α；(D)IL-10水平。与对照组比较，##P<0.01；与DSS组比较，ns：no significant difference，无显著差异。

如图8所示，与DSS组比较，本发明制备例的化合物4和阳性药PCN处理并未显著降低PXR^-/-小鼠结肠组织中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，和增加抗炎因子IL-10的水平。

综上，本发明通过在溪黄草中筛选了具有激活PXR靶点的天然激动剂，其通过PXR配体结构域结合，从而激活PXR靶点，并通过调节肠道稳态和消除炎症等重要作用，用于治疗溃疡性结肠炎。本发明制备例的PXR激动剂在体内外均能有效激活PXR靶基因，通过激活PXR靶基因有效的缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎。

本发明将溪黄草提取出的二萜类化合物作为PXR激动剂，能够通过激活PXR受体达到调控炎症效果。动物实验发现，这类化合物具有PXR靶点高亲和力，并且这类化合物可以通过延缓小鼠体重下降、延缓结肠长度变短、改善结肠DAI评分、下调促炎因子和激活PXR靶基因等方式改善DSS诱导的溃疡性结肠炎。

本发明的二萜类化合物具有PXR靶点高亲和力，具有显著的抗炎效果，可以通过激活肠道PXR靶点、调控炎症因子水平，具有显著治疗炎症性肠病的效果，并且其为天然提取物，具有疗效显著、毒副作用低的优点，在制备PXR激动剂或制备治疗炎症性肠病的药物中有广泛的应用。

Claims (10)

1.一种二萜类化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式(I)所示：

式(I)中，R₁选自氢或乙酰氧基；R₂选自氢、羟基或甲氧基；R₃选自氢或羟基。

2.根据权利要求1所述的二萜类化合物，其特征在于，式(I)所示化合物选自式(1)～(4)所示化合物中的至少一种：

3.权利要求1或2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用渗漉法对溪黄草进行提取，得到提取液，将所述提取液进行萃取、分离纯化后得到所述的二萜类化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述渗漉法采用的提取溶剂为醇类溶剂。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述渗漉法采用的提取溶剂与溪黄草的用量比为(10～15)L：1kg。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化为：：依次采用硅胶柱、葡聚糖凝胶柱、反相色谱柱进行洗脱。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，采用所述硅胶柱进行洗脱时的洗脱液为醚类溶剂和酯类溶剂的混合溶液；采用葡聚糖凝胶柱进行洗脱时的洗脱液为醇类溶剂。

8.一种PXR激动剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的二萜类化合物。

9.一种治疗炎症性肠病的药物，其特征在于，包括权利要求8所述的PXR激动剂。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎。