CN117752810A - 一种基于CD16a的靶向脂质纳米粒及其组合物、药物制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于CD16a的靶向脂质纳米粒及其组合物、药物制剂及应用。本发明提供了一种具有靶向性的脂质纳米粒，其包含(a)连接子、(b)CD16a重组蛋白、(c)抗体和(d)脂质纳米粒；其中，所述脂质纳米粒和所述连接子中含有特殊官能团，所述CD16a重组蛋白通过所述连接子与所述脂质纳米粒连接，所述的抗体包括单克隆抗体和纳米抗体。通过CD16a蛋白与多种抗体Fc端结合，依靠抗体的靶向性介导脂质纳米粒对细胞进行识别、结合而到达相应组织器官，增强了脂质纳米粒的靶向递送能力，拓展了其包裹药物的应用范围。通过改变抗体的种类，还可以做到针对不同细胞的精准递送，有效解决体内外靶向递送的难题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和基因递送领域，具体涉及一种基于CD16a的靶向脂质纳米粒及其组合物、药物制剂及应用。
背景技术
基因治疗技术是现代生物医药领域研究的热点，利用核酸药物可预防癌症、细菌和病毒感染及治疗具有遗传病因的疾病等。由于核酸药物具有易降解、难以进入细胞等特点，需要借助载体将其封装起来递送至靶细胞，因此，开发安全高效的递送载体就成为基因治疗在临床应用的前提。
常见的核酸药物载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽具有较高的转导效率，但其基因荷载能力低且具有抗原性、致瘤性、高成本等缺点，从而限制了病毒载体在核酸药物(例如mRNA药物)递送方面的发展。非病毒基因递送载体则因具有较高的生物安全性、稳定性、荷载能力及低成本等优点，成为近几年研究的热点。常用的非病毒载体有脂类或类脂材料、聚合物纳米颗粒和阳离子纳米乳剂等。其中脂类或类脂材料中的脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle，LNP)因具有生物相容性高、稳定性及重复性好以及具有较大的有效载荷能力等优点，成为了目前最主流的递送系统。
然而，已有的绝大多数的核酸脂质纳米粒没有除肝脏外的靶向特异性能力，其一旦进入人体内，很快会被不同类型的细胞(其中绝大部分是肝细胞)内吞，致使难以做到对特定细胞的靶向递送。因此，开发针对不同靶点的具有靶向性的脂质纳米粒是本领域亟待解决的问题。
发明内容
发明要解决的问题
目前，现有的脂质纳米粒作为药物载体时，缺乏针对不同靶点的靶向性，限制了脂质纳米粒在实际临床中的应用。针对上述问题，本发明旨在提供一种靶向性脂质纳米粒及其制备方法，用于解决体内外靶向递送的难题。
本发明还提供包含上述靶向性脂质纳米粒的核酸脂质纳米粒组合物及其制备方法，为基因治疗提供帮助。
本发明还提供包含上述靶向性脂质纳米粒、和/或上述核酸脂质纳米粒组合物的药物制剂。
本发明还提供上述靶向性脂质纳米粒、上述核酸脂质纳米粒组合物、和/或上述药物制剂的用途。
用于解决问题的方案
[1]、一种具有靶向性的脂质纳米粒，其包含(a)连接子、(b)CD16a重组蛋白、(c)抗体和(d)脂质纳米粒；
其中，所述脂质纳米粒和所述连接子中含有特殊官能团，所述CD16a重组蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1～8中任一项所示的序列，所述重组蛋白通过所述连接子与所述脂质纳米粒连接，所述的抗体包括单克隆抗体和纳米抗体。
[2]、根据[1]所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述连接子为如下(i)和/或(ii)：
(i)C末端或N末端连接了含有所述特殊官能团的氨基酸的重组多肽；
(ii)含有所述特殊官能团的小分子化合物；
优选的，所述重组多肽包含如SEQ ID NO.9～11中任一项所示的序列；
优选的，所述小分子化合物包括如下任意一种：Mal-HA-OSu、Mal-di-EG-OPFP、N3-di-EG-OPFP、N3-tri-EG-OPFP、Val-Cit-PAB、SMCC、S-乙酰巯基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、2-IT·HCl、TFCS、DBCO或DBCO衍生物。
[3]、根据[1]或[2]所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒和所述连接子中的特殊官能团各自独立的包括如下任意一种或多种：巯基、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、亚胺酸酯、卤代乙酰基、吡啶二巯基、氨基、羧基、炔基、羟基、叠氮。
[4]、根据[1]～[3]中任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒包含第一脂质化合物和任选的第二脂质化合物；所述第一脂质化合物包含含有所述特殊官能团的两亲性脂质；所述第二脂质化合物包含阳离子脂质、阴离子脂质、中性脂质、固醇和不含所述特殊官能团的两亲性脂质中的至少一种；
所述阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油中的至少一种；
所述中性脂质选自DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SOPE中的至少一种或其经阴离子或阳离子修饰基团修饰的脂质；
所述两亲性脂质选自PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-C14、PEG-C18、ALC0159、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的至少一种；
可选的，所述PEG的重均分子量范围为400～20000。
[5]、根据[4]所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，在所述脂质纳米粒中，所述阳离子脂质、所述阴离子脂质、所述中性脂质、所述固醇、所述含有所述特殊官能团的两亲性脂质与所述不含所述特殊官能团的两亲性脂质之间的摩尔比为(20～65):(0～15):(5～25):(25～55):(0.01～5):(0.1～15)。
[6]、根据[1]～[5]任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述抗体包括如下抗体中的一种或多种：抗CD3、抗CD4、抗CD5、抗CD7、抗CD8、抗CD20、抗CD52、抗HER-1/2、抗EGFR、抗VEGF、抗CD117、抗PD-1或抗PD-L1的抗体。
[7]、一种核酸脂质纳米粒组合物，其包含核酸类药物以及根据[1]～[6]任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒；
可选的，所述核酸类药物选自DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸中的至少一种。
[8]、根据[7]所述的核酸脂质纳米粒组合物的制备方法，其包括如下步骤：将所述核酸类药物与所述第一脂质化合物和任选的第二脂质化合物混合并透析，得到载核酸脂质纳米粒；向其中加入与所述连接子连接的所述CD16a重组蛋白，进行反应，得到所述核酸脂质纳米粒组合物；
优选的，所述重组蛋白与所述载核酸脂质纳米粒中第一脂质化合物的摩尔比为(1～10):(1～10)；
优选的，所述反应温度为20～40℃；
可选的，在上述反应的步骤后还进一步包括去除游离的与所述连接子连接的重组蛋白的步骤；优选的，通过超滤、切向流或者透析除去所述游离的与所述连接子连接的重组蛋白。
[9]、一种药物制剂，其包含根据[7]所述的核酸脂质纳米粒组合物，以及药学上可接受的冻存保护剂、赋形剂、载体和稀释剂中的一种或多种；
可选的，所述药物制剂的粒径为30～500nm。
[10]、根据[1]～[6]任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒，根据[7]所述的核酸脂质纳米粒组合物，和/或根据[9]所述的药物制剂在如下(y)～(z)中的用途：
(y)基因递送；
(z)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物。
发明的效果
本发明提供的靶向性脂质纳米粒将CD16a蛋白与脂质纳米粒偶联，通过CD16a蛋白与多种单克隆抗体或纳米抗体的Fc端结合，依靠单克隆抗体或纳米抗体的靶向性介导脂质纳米粒对细胞进行识别、结合而到达相应组织器官，然后进入细胞内，增强了脂质纳米粒的靶向递送能力，拓展了其包裹药物的应用范围。并且，通过改变单克隆抗体或纳米抗体的种类，可以做到针对不同细胞的精准递送，有效解决体内外靶向递送的难题。
同时，本发明提供的靶向性脂质纳米粒对核酸药物具有较高的包封率，所制备得到的核酸脂质纳米粒组合物的粒径可控，分布均一，具有单分散性。通过装载核酸药物，使脂质纳米粒应用于基因治疗领域，也大大拓展了核酸药物的应用范围。并且，本发明提供的针对上述核酸脂质纳米粒组合物的制备方法条件温和，合成路线简单，适用性广泛，方便规模化生产，具有很高的市场价值。
附图说明
图1为具有靶向性的脂质纳米粒的结构示意图。
图2为实施例1中蛋白CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-SH的SDS-PAGE图。
图3为实施例11中结合/未结合抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA的体外T细胞转染流式图。
图4为实施例11中结合/未结合抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA的体外T细胞转染百分比统计图。
图5为实施例11中结合/未结合抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA的体外T细胞转染平均荧光强度统计图。
具体实施方式
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文中所述的特定实施方案；还应该理解，本文中所使用的术语仅用于描述而非限定特定实施方案。
定义
在本发明中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
在本发明中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
在本发明中，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
在本发明中，术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
在本发明中，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触本发明中所述的靶向性脂质纳米粒、核酸脂质纳米粒组合物和/或药物制剂，从而与不接触时相比降低罹患疾病的概率和/或减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
在本发明中，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明中所述的靶向性脂质纳米粒、核酸脂质纳米粒组合物和/或药物制剂，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
在本发明中，“辅助治疗”是指个体有癌症史并且一般(但未必)对疗法具有反应性的临床环境(clinical setting)，然而，由于个体有癌症史，认为这些个体有发展疾病的风险。“辅助治疗”中的治疗或用药是指后续治疗模式。
在本发明中，“恶性肿瘤”包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖，脑瘤和脑癌，以及头颈癌，及相关转移。
在本发明中，“病毒感染性疾病”包括但不限于乙型肝炎病毒、腺病毒、乳头瘤病毒、带状疱疹病毒、天花病毒和牛痘病毒、流感病毒、猪瘟病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、肠道病毒和人免疫缺陷病毒等病毒感染后产生的疾病症状。
在本发明中，“药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂”包括但不限于甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、明胶、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、大豆卵磷脂、聚维酮K25、尼泊金丙酯、糖精、硫酸氢钠、氧化锌、赖氨酸、亮氨酸、左旋薄荷脑、硬脂酸镁、对羟基苯甲酸甲酯、乙酰半胱氨酸、依地酸钠、甘氨酸、甘油、盐酸、硝酸、乙醇、吐温80、吐温20、碳酸钙、氯化钙、羟丙基纤维素、淀粉等
本发明中，“适量的”指的是所加入溶剂量或药品量可调范围较大，且对实验结果影响较小，可以不作具体限定。
具有靶向性的脂质纳米粒
本发明提供了一种具有靶向性的脂质纳米粒，其包含(a)连接子、(b)CD16a重组蛋白、(c)抗体和(d)脂质纳米粒；其中，所述脂质纳米粒和所述连接子中含有特殊官能团，所述CD16a重组蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1～8中任一项所示的序列，所述CD16a重组蛋白通过所述连接子与所述脂质纳米粒连接，所述的抗体包括单克隆抗体和纳米抗体。
本发明将所述重组蛋白通过所述连接子偶联至所述脂质纳米粒表面，利用所述CD16a重组蛋白与抗体Fc端的特异性结合，将所述抗体紧紧吸附在脂质纳米粒表面，进而利用抗体的靶向作用，为脂质纳米粒带来特异的靶向性，从而可以将脂质纳米粒导向特定的靶点发挥作用，增强了脂质纳米粒的靶向递送能力，拓展了其包裹药物的应用范围。本发明提供的具有靶向性的脂质纳米粒的结构示意图如图1所示。
<连接子>
本发明利用连接子将所述重组蛋白与所述脂质纳米粒相连。
在一些实施方案中，本发明所述的连接子为(i)C末端或N末端连接了含有所述特殊官能团的氨基酸的重组多肽；优选的，所述重组多肽包含如SEQ ID NO.9～11中任一项所示的序列；优选的，所述重组多肽的C末端连接了含有所述特殊官能团的氨基酸。
需要说明的是，本发明对于连接子限定中所说的“末端连接了含有所述特殊官能团的氨基酸”包括以下含义：(a)重组多肽的C末端或N末端本身以含有所述特殊官能团的氨基酸结尾；或(b)重组多肽的C末端或N末端结尾后又额外添加了含有所述特殊官能团的氨基酸。
进一步地，本发明通过在上述序列的C末端或N末端连接含有所述特殊官能团的氨基酸，从而为其与脂质纳米粒表面含有的特殊官能团的共价连接带来可能。
本发明所述的特殊官能团包括但不限于巯基、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、亚胺酸酯、卤代乙酰基、吡啶二巯基、氨基、羧基、炔基、羟基、叠氮。
相应的，本发明所述的含有所述特殊官能团的氨基酸包括但不限于半胱氨酸(Cys)、赖氨酸(Lys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Glu)、天冬酰胺(Asn)等。
在一些具体的实施方案中，本发明所述的含有所述特殊官能团的氨基酸为半胱氨酸(Cys)或赖氨酸(Lys)。
在一些实施方案中，当本发明所述的重组多肽的C末端或N末端本身不以含有所述特殊官能团的氨基酸结尾时，例如氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的重组多肽，其末端额外添加含有所述特殊官能团的氨基酸，优选添加半胱氨酸(Cys)或赖氨酸(Lys)。
在另一些实施方案中，当本发明所述的重组多肽的C末端或N末端本身以含有所述特殊官能团的氨基酸结尾时，例如氨基酸序列为SEQ ID NO.10(C末端本身以侧链含有羟基的丝氨酸结尾)或SEQ ID NO.11(C末端本身以侧链含有氨基的赖氨酸结尾)所示的重组多肽，其末端可额外连接也可不额外连接含有所述特殊官能团的氨基酸。
在另一些实施方案中，本发明所述的连接子为(ii)含有所述特殊官能团的小分子化合物。
进一步地，本发明通过小分子化合物本身含有的特殊官能团与脂质纳米粒表面含有的特殊官能团共价连接。其中，小分子化合物中所含有的特殊官能团如前所述。
本发明所述的小分子化合物包括但不限于Mal-HA-OSu、Mal-di-EG-OPFP、N3-di-EG-OPFP、N3-tri-EG-OPFP、Val-Cit-PAB、SMCC、S-乙酰巯基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、2-IT·HCl、TFCS、DBCO或DBCO衍生物。
在其它一些实施方式中，本发明所述的连接子为(i)C末端或N末端连接了含有所述特殊官能团的氨基酸的重组多肽和(ii)含有所述特殊官能团的小分子化合物，即连接子由(i)和(ii)组成；优选的，(i)中的重组多肽通过其末端连接的含有所述特殊官能团的氨基酸的侧链特殊官能团与(ii)小分子化合物共价连接。
<重组蛋白>
本发明通过CD16a重组蛋白与抗体Fc端的特异性亲和力，将抗体吸附在脂质纳米粒表面。
在一些更具体的实施方案中，本发明所述的CD16a重组蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1～8中任一项所示的序列。
在一些优选的实施方案中，本发明所述的CD16a重组蛋白的氨基酸序列为如SEQID NO.1～8中任一项所示的序列。
<抗体>
本发明通过抗体的靶向作用，将脂质纳米粒导向至特异性靶点。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体包括单克隆抗体和纳米抗体。
进一步地，本发明所述的抗体包括但不限于抗CD3、抗CD4、抗CD5、抗CD7、抗CD8、抗CD20、抗CD52、抗HER-1/2、抗EGFR、抗VEGF、抗CD117、抗PD-1或抗PD-L1的抗体等。
本发明可以通过改变单克隆抗体或纳米抗体的种类，做到脂质纳米粒针对不同细胞的精准递送，有效解决体内外靶向递送的难题。
<脂质纳米粒>
本发明利用脂质纳米粒作为载体，可以运送多类型的药物。并且，本发明所述的脂质纳米粒表面带有特殊官能团，该官能团与上述连接子中的特殊官能团共价连接，从而使所述CD16a重组蛋白与脂质纳米粒偶联。
在一些实施方案中，本发明所述的脂质纳米粒包含第一脂质化合物和任选的第二脂质化合物；所述第一脂质化合物包含含有所述特殊官能团的两亲性脂质；所述第二脂质化合物包含阳离子脂质、阴离子脂质、中性脂质、固醇和不含所述特殊官能团的两亲性脂质中的至少一种。
进一步地，本发明所述的阳离子脂质包括但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、DOTAP、C12-200、DC-Chol、DOTMA和双(((3,3'-((3-氨基丙基)氮杂二基)双(丙酰基))双(氧基))双(丁烷-4,1-二基)双(2-丁基辛酸酯))甲胺；所述阴离子脂质包括但不限于磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油；所述中性脂质包括但不限于DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SOPE或其经阴离子或阳离子修饰基团修饰的脂质；所述两亲性脂质包括但不限于PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-C14、PEG-C18、ALC0159、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG。
在一些实施方案中，在所述脂质纳米粒中，所述阳离子脂质、所述阴离子脂质、所述中性脂质、所述固醇、所述含有所述特殊官能团的两亲性脂质与所述不含所述特殊官能团的两亲性脂质之间的摩尔比为(20～65):(0～15):(5～25):(25～55):(0.01～5):(0.1～15)。
在一些具体的实施方案中，在所述脂质纳米粒中，不含阴离子脂质。
在一些更具体的实施方案中，在所述脂质纳米粒中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述固醇、所述含有所述特殊官能团的两亲性脂质与所述不含所述特殊官能团的两亲性脂质之间的摩尔比为(35～50):(10～16):(38.5～46.5):(0.15～2.2):(0.3～2.2)。
核酸脂质纳米粒组合物
本发明提供了一种核酸脂质纳米粒组合物，其包含核酸类药物以及上述具有靶向性的脂质纳米粒。
本发明通过将上述具有靶向性的脂质纳米粒作为载体靶向运输核酸类药物，维持了核酸类药物在运输过程中地稳定，并且使得核酸脂质纳米粒组合物可以准确导向作用靶点，大大拓展了核酸药物的应用范围。同时上述具有靶向性的脂质纳米粒对核酸药物具有较高的包封率，且核酸脂质纳米粒组合物的粒径可控，分布均一，具有单分散性，
本发明所述的核酸类药物包括但不限于DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸。通过装载核酸药物，使脂质纳米粒可以广泛应用于基因治疗领域。
<制备方法>
本发明提供了上述核酸脂质纳米粒组合物的制备方法，其包括如下步骤：将所述核酸类药物与所述第一脂质化合物和任选的第二脂质化合物混合并透析，得到载核酸脂质纳米粒；向其中加入与所述连接子连接的所述CD16a重组蛋白，进行反应，得到所述核酸脂质纳米粒组合物。
在一些具体的实施方案中，所述重组蛋白与所述载核酸脂质纳米粒中第一脂质化合物的摩尔比为(1～10):(1～10)；优选为(1～5):(1～5)。
在一些具体的实施方案中，加入与所述连接子连接的所述重组蛋白后的反应温度为20～40℃，优选为25～37℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃等。
在一些具体的实施方案中，在上述反应步骤后还进一步包括去除游离的与所述连接子连接的重组蛋白的步骤。本发明对该步骤的具体操作方式不做限制，优选的，通过超滤、切向流或者透析去除游离的与所述连接子连接的重组蛋白。
本发明对核酸类药物的用量不做具体限制，本领域的技术人员可以根据核酸类药物的实际包封率需求进行调整。
本发明提供的针对上述核酸脂质纳米粒组合物的制备方法条件温和，合成路线简单，适用性广泛，方便规模化生产，具有很高的市场价值。
药物制剂
本发明提供了一种药物制剂，其包含上述核酸脂质纳米粒组合物，以及药学上可接受的冻存保护剂、赋形剂、载体和稀释剂中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，本发明所述的药物制剂包含所述核酸脂质纳米粒组合物和冻存保护剂。完全溶解后混匀得到核酸脂质纳米粒药物制剂。
在一些更具体的实施方案中，本发明所述的冻存保护剂包括蔗糖，海藻糖、麦芽糖、甘露醇和乳糖中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，本发明所述的药物制剂的粒径为30～500nm，优选为30～300nm，更优选为100～300nm。本发明提供的药物制剂粒径均一。
<制备方法>
本发明还提供了上述药物制剂的制备方法，其包括如下步骤：在制备得到的核酸脂质纳米粒组合物溶液中加入冻存保护剂，完全溶解后混匀，即得。
在一些具体的实施方案中，所述冻存保护剂的的加入量为10mg/mL-200mg/mL。
医药用途
本发明提供了上述具有靶向性的脂质纳米粒、上述核酸脂质纳米粒组合物、和/或上述药物制剂在如下(y)～(z)中的用途：
(y)基因递送；
(z)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物。
本发明提供的上述具有靶向性的脂质纳米粒、上述核酸脂质纳米粒组合物、和/或上述药物制剂可以用于预防、治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病。
本发明还提供了一种用于预防、治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的方法，其包括向患者施用有效量的上述具有靶向性的脂质纳米粒、上述核酸脂质纳米粒组合物、和/或上述药物制剂。
本发明涉及的氨基酸序列
CD16a氨基酸序列-1(SEQ ID NO.1)：MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQHHHHHHHH。
CD16a氨基酸序列-2(SEQ ID NO.2)：MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK。
CD16a氨基酸序列-3(SEQ ID NO.3)：MGVKVLFALICIAVAEAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQHHHHHHHH。
CD16a氨基酸序列-4(SEQ ID NO.4)：MGVKVLFALICIAVAEAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK。
CD16a氨基酸序列-1-2(SEQ ID NO.5)：MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQ。
CD16a氨基酸序列-2-2(SEQ ID NO.6)：MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDKHHHHHHHH。
CD16a氨基酸序列-3-2(SEQ ID NO.7)：MGVKVLFALICIAVAEAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQ。
CD16a氨基酸序列-4-2(SEQ ID NO.8)：MGVKVLFALICIAVAEAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDVYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDKHHHHHHHH。
连接子-重组多肽氨基酸序列-1(SEQ ID NO.9)：EPEPEPEPEPEP。
连接子-重组多肽氨基酸序列-2(SEQ ID NO.10)：GGGGSGGGGSGGGGS。
连接子-重组多肽氨基酸序列-3(SEQ ID NO.11)：EAAAKEAAAKEAAAK。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了不可避免的系统性误差。
实施例1：CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-SH及CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-SH的合成
1.将Expi293F细胞复苏培养后，按2×105个/mL的接种量向含150mL培养基的1L摇瓶中接种细胞，37℃、120rpm培养3天至细胞密度达到1.0×106～1.5×106个/mL；
2.吸取900μg根据设计而合成好的CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-Cys质粒(该质粒骨架为pCDNA3.1(+)，外源片段包括编码蛋白CD16a(SEQ ID NO.1)和氨基酸序列为EPEPEPEPEPEPC的多肽的核苷酸序列)溶液，加入45mL Opti-MEM培养基中，充分涡旋混合；
3.吸取2.7mL的25kDa PEI溶液(1mg/mL)加入步骤(2)混合液中，涡旋混合后室温下静置30min，得到质粒/PEI混合液；
4.各吸取15mL步骤3制备得到的质粒/PEI混合液，分别加入3瓶含150mL Expi293F细胞悬浮液的1L三角摇瓶中；
5.转染后，于37℃、120rpm、5％CO2的摇床培养箱中孵育3h后，分别向3个摇瓶中补加150mL培养基，继续培养4天后离心收集上清；
6.镍柱纯化重组CD16a(SEQ ID NO.1)
(1)平衡柱材(Equllibration)：设置流速3mL/min，以Buffer A(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0)平衡2×5mL GE Histrap FF Column 5-10个CV至基线平稳；
(2)上样(Sample Application)：设置流速6mL/min，使900mL离心收集的上清液上样完全；
(3)洗涤(Column Wash)：设置流速10mL/min，以Buffer A冲洗2×5mL GE HistrapFF Column 5-10个CV至基线平稳；
(4)梯度洗脱(Gradient Elution)：设置流速6mL/min，以10％、20％、50％和100％(V/V)的洗脱液(Elution Buffer)(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)进行梯度洗脱，收集洗脱液至15mL离心管中，收集的洗脱样品分别进行SDS-PAGE鉴定，图2显示100mM咪唑洗脱液(即20％(V/V)的洗脱液)可收集较纯的CD16a(SEQ ID NO.1)蛋白；
7.SDS-PAGE鉴定正确的CD16a洗脱液用合适的缓冲液(8mM Na2HPO4，200mM NaCl，2mM KH2PO4，2.6mM KCl，10％甘油，1mM DTT)过夜透析，得到蛋白(CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEPC)并将其命名为CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-SH，冻存于-80℃备用。
以同样的方式制备蛋白(CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEPC)并将其命名为CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-SH。
实施例2：CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-NH2及CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-NH2的合成
1～6步骤同实施例1；其中，第2步中所使用的为根据设计而合成好的CD16a(SEQID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-Lys质粒(该质粒骨架为pCDNA3.1(+)，外源片段包括编码蛋白CD16a(SEQ ID NO.1)和氨基酸序列为EPEPEPEPEPEPK的多肽的核苷酸序列)溶液。
7.SDS-PAGE鉴定正确的CD16a洗脱液用合适的缓冲液(8mM Na2HPO4，200mM NaCl，2mM KH2PO4，2.6mM KCl，10％甘油)过夜透析，得到蛋白(CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEPK)并将其命名为CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-NH2，冻存于-80℃备用。
以同样的方式制备蛋白(CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEPK)并将其命名为CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-NH2。
实施例3：CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-炔基及CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-炔基的合成
1～6步骤同实施例1；其中，第2步中所使用的为根据设计而合成好的CD16a(SEQID NO.1)-EPEPEPEPEPEPK质粒(同实施例2所述)溶液。
7.SDS-PAGE鉴定正确的CD16a洗脱液用合适的缓冲液(8mM Na2HPO4，200mM NaCl，2mM KH2PO4，2.6mM KCl，10％甘油)过夜透析，得到蛋白CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-NH2。
8.设定氨基与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：3，将DBCO-PEG-NHS溶于二甲亚砜中(3eq)，并加入到用PBS(pH8.5，10mM)稀释的CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-NH2(1eq)溶液中，25℃，过夜反应，然后用10kDa的超滤管(3000rpm，10min/次，3次)进行超滤处理，除去游离的DBCO-PEG-NHS，得到含炔基的蛋白(CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEPK-PEG-DBCO)并将其命名为CD16a(SEQ ID NO.1)-DBCO。
以同样的方式制备蛋白(CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEPK-PEG-DBCO)并将其命名为CD16a(SEQ ID NO.2)-DBCO。
实施例4：偶联CD16a蛋白纳米粒组合物的合成
将DLin-MC3-DMA与胆固醇、DSPE、马来酰亚胺官能团化的PEG脂质(Mal-PEG-DSPE)、PEG-DMG以35:46.5:16:2.2:0.3的摩尔比溶解于无水乙醇中，将编码EGFP的mRNA溶解于pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，按照脂质与mRNA质量比20:1，体积比1:3，使用纳米粒制备仪将两相快速混合并使用10kDa透析袋透析24小时，将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，以除去乙醇，制备得到Mal-LNP@mRNA脂质纳米溶液。设定巯基与马来酰亚胺的摩尔比为3:1，将得到的Mal-LNP@mRNA脂质纳米溶液通氮气进行除氧处理，然后将实施例1中得到的CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-SH(3eq)溶至pH7.4的PBS中并加入到Mal-LNP@mRNA脂质纳米溶液(10mg/mL，1eq)中，37℃，反应8小时，用100kDa超滤管(2600g，10min/次，3次)进行超滤处理，除去游离的CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-SH，得到CD16a-LNP@mRNA。
实施例5：偶联CD16a蛋白纳米粒组合物的合成
将DOTAP与胆固醇、DOPE、N-羟基琥珀酰亚胺官能化的PEG脂质(NHS-PEG-DSPE)、PEG-DMG以35:46.5:16:0.3:2.2的摩尔比溶解于无水乙醇中，将编码EGFP的mRNA溶解于pH4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，按照脂质与mRNA质量比20:1，体积比1:3，使用纳米粒制备仪将两相快速混合并使用10kDa透析袋透析24小时，将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，以除去乙醇，制备得到NHS-LNP@mRNA脂质纳米溶液。设定氨基与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5:1，将实施例2中得到的CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-NH2(5eq)溶至pH 7.4的PBS并加入到NHS-LNP@mRNA脂质纳米溶液(10mg/mL，1eq)中，37℃，反应8小时，用100kDa超滤管(2600g，10min/次，3次)进行超滤处理，除去游离的CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-NH2，得到CD16a-LNP@mRNA。
实施例6：偶联CD16a蛋白纳米粒组合物的合成
将DLin-MC3-DMA与胆固醇、DSPC、叠氮官能化的PEG脂质化合物(N3-PEG-DSPE)、PEG-DMG以50:38.5:10:0.3:1.2的摩尔比溶解于无水乙醇中，将编码EGFP的mRNA溶解于pH4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，按照脂质与mRNA质量比20:1，体积比1:3，使用纳米粒制备仪将两相快速混合并使用10kDa透析袋透析24小时，将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，以除去乙醇，制备得到N3-LNP@mRNA脂质纳米溶液。设定叠氮与炔基的摩尔比为1:3，将实施例3中得到的CD16a(SEQ ID NO.1)-DBCO(3eq)溶至pH 7.4的PBS并加入到N3-LNP@mRNA脂质纳米溶液(10mg/mL，1eq)中，37℃，反应8小时，用300kDa超滤管(2600g，10min/次，3次)进行超滤处理，除去游离的CD16a(SEQ ID NO.1)-DBCO，得到CD16a-LNP@mRNA。
实施例7：偶联CD16a蛋白纳米粒组合物的合成
将双(((3,3'-((3-氨基丙基)氮杂二基)双(丙酰基))双(氧基))双(丁烷-4,1-二基)双(2-丁基辛酸酯))甲胺与胆固醇、DSPC、马来酰亚胺官能化的PEG脂质(Mal-PEG-DSPE)、PEG-DMG以50:38.5:10:0.15:1.35的摩尔比溶解于无水乙醇中，将编码4-1-BBL的mRNA溶解于pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，按照脂质与mRNA质量比20:1，体积比1:3，使用纳米粒制备仪将两相快速混合并使用10kDa透析袋透析24小时，将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，以除去乙醇，制备得到Mal-LNP@mRNA脂质纳米溶液，对其粒径、粒径分布(PDI)、电位及包封率进行检测。设定巯基与马来酰亚胺的摩尔比为1:3，将得到的Mal-LNP@mRNA脂质纳米溶液(10mg/mL，3eq)通氮气进行除氧处理，然后将实施例1中得到的CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-SH(1eq)溶至pH 7.4的PBS并加入到Mal-LNP@mRNA脂质纳米溶液中，37℃，反应8小时，用100kDa超滤管(2600g，10min/次，3次)进行超滤处理，除去游离的CD16a(SEQ ID NO.1)-EPEPEPEPEPEP-SH，得到CD16a-LNP@mRNA。对其粒径、粒径分布、电位及包封率进行检测，结果如下表1所述，由于偶联上CD16a蛋白，纳米粒的粒径略有增大，但是PDI、电位及包封率均无明显变化。
表1Mal-LNP@mRNA和CD16a-LNP@mRNA的粒径、PDI、电位及包封率
| 样品名称 | 粒径(nm) | PDI | 电位(nm) | 包封率(％) |
| Mal-LNP@mRNA | 144 | 0.12 | -5.9 | 85 |
| CD16a-LNP@mRNA | 168 | 0.03 | -5.8 | 84 |
实施例8：偶联CD16a蛋白纳米粒组合物的合成
将DOTAP与胆固醇、DOPE、N-羟基琥珀酰亚胺官能化的PEG脂质(NHS-PEG-DSPE)、PEG-DMG以50:38.5:10:0.3:1.2的摩尔比溶解于无水乙醇中，将编码EGFP的mRNA溶解于pH4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，按照脂质与mRNA质量比20:1，体积比1:3，使用纳米粒制备仪将两相快速混合并使用10kDa透析袋透析24小时，将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，以除去乙醇，制备得到NHS-LNP@mRNA脂质纳米溶液。设定氨基与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为3:1，将实施例2中得到的CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-NH2(3eq)溶至pH 7.4的PBS并加入到NHS-LNP@mRNA脂质纳米溶液(10mg/mL，1eq)中，37℃，反应8小时，用100kDa超滤管(2600g，10min/次，3次)进行超滤处理，除去游离的CD16a(SEQ ID NO.2)-EPEPEPEPEPEP-NH2，得到CD16a-LNP@mRNA。
实施例9：偶联CD16a蛋白纳米粒组合物的合成
将DLin-KC2-DMA与胆固醇、DOPE、叠氮官能化的PEG脂质化合物(N3-PEG-DSPE)、PEG-DMG以50:38.5:10:0.15:1.35的摩尔比溶解于无水乙醇中，将编码荧光素酶的mRNA溶解于pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，按照脂质与mRNA质量比20:1，体积比1:3，使用微纳米粒制备仪将两相快速混合并使用10kDa透析袋透析24小时，将缓冲环境置换成pH7.4的PBS，以除去乙醇，制备得到N3-LNP@mRNA脂质纳米溶液。设定叠氮与炔基的摩尔比为1:2，将实施例3中得到的CD16a(SEQ ID NO.2)-DBCO(2eq)溶至pH 7.4的PBS并加入到N3-LNP@mRNA脂质纳米溶液(10mg/mL，1eq)中，37℃，反应8小时，用300kDa超滤管(2600g，10min/次，3次)进行超滤处理，除去游离的CD16a(SEQ ID NO.2)-DBCO，得到CD16a-LNP@mRNA。
实施例10：偶联CD16a蛋白的核酸脂质纳米粒组合物的药物制剂
在实施例4-9中得到CD16a-LNP@mRNA溶液中加入10mg/mL-200mg/mL的冻存保护剂(蔗糖，海藻糖、麦芽糖、甘露醇和/或乳糖)，完全溶解后混匀得到核酸脂质纳米粒药物制剂。
实施例11：偶联CD16a蛋白的核酸纳米脂质粒组合物体外T细胞靶向递送
1.按照CD16a与抗CD3单抗1:1(摩尔比)的比例进行混合，将实施例7制备得到的CD16a-LNP@mRNA中掺入抗CD3单抗混合，4℃，孵育4小时，得到CD3-CD16a-LNP@mRNA溶液，将未孵育抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA作为对照组。对其粒径、粒径分布、电位及包封率进行检测，结果如下表2所述，与抗CD3单抗孵育后，样品粒径、PDI、电位和包封率均变化不大。
表2结合/未结合抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA的粒径、PDI、电位和包封率
2.将T细胞按1.0×106细胞/mL的接种量接种到12孔板中，并加入CD3-CD16a-LNP@mRNA(mRNA浓度5μg/mL)，37℃，共孵育1小时后，更换新鲜培养基，继续培养至24小时，收集T细胞(记作CD3+CD16a-LNP组)，通过流式细胞仪检测T细胞中4-1-BBL的表达情况，按照步骤1.的操作，将未孵育抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA作为对照组(记作CD16a-LNP组)。将未经过任何处理的空白T细胞作为空白组(记作Blank组)。
图3为结合/未结合抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA体外转染T细胞的流式数据，图4为其统计数据，结果显示，与抗CD3单抗共孵育的CD16a-LNP@mRNA其T细胞的转染效率为85％，是未孵育抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA组的1.85倍，图5为平均荧光强度的统计图，结果显示，未孵育抗CD3单抗的CD16a-LNP@mRNA组的平均荧光强度为1135，空白背景的荧光强度为999，说明CD16a-LNP@mRNA没有增加细胞内吞和表达的作用，而与抗CD3单抗共孵育的CD16a-LNP@mRNA的平均荧光强度为1734，图4和图5共同说明抗CD3单抗通过Fc端与CD16a结合而紧紧的吸附在CD16a-LNP@mRNA的表面，通过抗CD3单抗与T细胞的特异性识别，结合，而将CD16a-LNP@mRNA带入T细胞内，大大提升了mRNA在T细胞内的表达效果。
实施例12：偶联CD16a蛋白的核酸纳米脂质粒组合物体外肿瘤细胞靶向递送
1.按照CD16a与抗PD-L1单抗1:1(摩尔比)的比例进行混合，将实施例4制备得到的CD16a-LNP@mRNA中掺入抗PD-L1抗体混合，4℃，孵育6小时，得到PD-L1-CD16a-LNP@mRNA溶液。
2.将B16-F10细胞复苏培养后，按1.0×106细胞/mL的接种量接种到12孔板中，并加入PD-L1-CD16a-LNP@mRNA(mRNA浓度5μg/mL)，37℃，共孵育1小时后，更换新鲜培养基，继续培养至24小时，收集B16-F10细胞，通过流式细胞仪检测B16-F10细胞中EGFP的表达情况按照步骤1.的操作，将未孵育抗PD-L1单抗的CD16a的LNP@mRNA作为对照组。
实施例13：偶联CD16a蛋白的核酸纳米脂质粒组合物与体内T细胞靶向递送
1.按照CD16a与抗CD5单抗1:1(摩尔比)的比例进行混合，将实施例4制备得到的CD16a-LNP@mRNA中掺入抗CD5单抗混合，4℃孵育4小时，得到CD5-CD16a-LNP@mRNA溶液。
2.将得到的CD5-CD16a-LNP@mRNA溶液(mRNA 1.0mg/kg)通过尾静脉注入C57BL/6小鼠体内，24小时后收集脾脏并分离出细胞，抗体孵育后通过流式细胞仪检测脾脏中T细胞、B细胞、DC细胞、NK细胞及巨噬细胞中EGFP的表达量，按照步骤1.的操作，将未孵育抗CD5单抗的CD16a的LNP@mRNA作为对照组。
实施例14：偶联CD16a蛋白的核酸纳米脂质粒组合物与体内细胞靶向递送
1.按照CD16a与抗PD-L1单抗1:1(摩尔比)的比例进行混合，将实施例4制备得到的CD16a-LNP@mRNA中掺入抗PD-L1单抗混合，4℃，孵育6小时，得到PDL1-CD16a-LNP@mRNA溶液。
2.将得到的PDL1-CD16a-LNP@mRNA溶液(mRNA 1.0mg/kg)通过尾静脉注入植有B16-F10皮下黑色素瘤模型的C57BL/6小鼠体内，6小时后用近红外荧光成像仪对小鼠体内荧光强度及器官分布情况进行成像分析，按照步骤1.的操作，将未孵育抗PD-L1单抗的CD16a的LNP@mRNA作为对照组。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (10)
1.一种具有靶向性的脂质纳米粒，其包含(a)连接子、(b)CD16a重组蛋白、(c)抗体和(d)脂质纳米粒；
其中，所述脂质纳米粒和所述连接子中含有特殊官能团，所述CD16a重组蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1～8中任一项所示的序列，所述CD16a重组蛋白通过所述连接子与所述脂质纳米粒连接，所述的抗体包括单克隆抗体和纳米抗体。
2.根据权利要求1所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述连接子为如下(i)和/或(ii)：
(i)C末端或N末端连接了含有所述特殊官能团的氨基酸的重组多肽；
(ii)含有所述特殊官能团的小分子化合物；
优选的，所述重组多肽包含如SEQ ID NO.9～11中任一项所示的序列；
优选的，所述小分子化合物包括如下任意一种：Mal-HA-OSu、Mal-di-EG-OPFP、N3-di-EG-OPFP、N3-tri-EG-OPFP、Val-Cit-PAB、SMCC、S-乙酰巯基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、2-IT·HCl、TFCS、DBCO或DBCO衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒和所述连接子中的特殊官能团各自独立的包括如下任意一种或多种：巯基、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、亚胺酸酯、卤代乙酰基、吡啶二巯基、氨基、羧基、炔基、羟基、叠氮。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒包含第一脂质化合物和任选的第二脂质化合物；所述第一脂质化合物包含含有所述特殊官能团的两亲性脂质；所述第二脂质化合物包含阳离子脂质、阴离子脂质、中性脂质、固醇和不含所述特殊官能团的两亲性脂质中的至少一种；
所述阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油中的至少一种；
所述中性脂质选自DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SOPE中的至少一种或其经阴离子或阳离子修饰基团修饰的脂质；
所述两亲性脂质选自PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-C14、PEG-C18、ALC0159、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的至少一种；
可选的，所述PEG的重均分子量范围为400～20000。
5.根据权利要求4所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，在所述脂质纳米粒中，所述阳离子脂质、所述阴离子脂质、所述中性脂质、所述固醇、所述含有所述特殊官能团的两亲性脂质与所述不含所述特殊官能团的两亲性脂质之间的摩尔比为(20～65):(0～15):(5～25):(25～55):(0.01～5):(0.1～15)。
6.根据权利要求1～5任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒，其特征在于，所述抗体包括如下抗体中的一种或多种：抗CD3、抗CD4、抗CD5、抗CD7、抗CD8、抗CD20、抗CD52、抗HER-1/2、抗EGFR、抗VEGF、抗CD117、抗PD-1或抗PD-L1的抗体。
7.一种核酸脂质纳米粒组合物，其包含核酸类药物以及根据权利要求1～6任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒；
可选的，所述核酸类药物选自DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的核酸脂质纳米粒组合物的制备方法，其包括如下步骤：将所述核酸类药物与所述第一脂质化合物和任选的第二脂质化合物混合并透析，得到载核酸脂质纳米粒；向其中加入与所述连接子连接的所述CD16a重组蛋白，进行反应，得到所述核酸脂质纳米粒组合物；
优选的，所述重组蛋白与所述载核酸脂质纳米粒中第一脂质化合物的摩尔比为(1～10):(1～10)；
优选的，所述反应温度为20～40℃；
可选的，在上述反应的步骤后还进一步包括去除游离的与所述连接子连接的重组蛋白的步骤；优选的，通过超滤、切向流或者透析除去所述游离的与所述连接子连接的重组蛋白。
9.一种药物制剂，其包含根据权利要求7所述的核酸脂质纳米粒组合物，以及药学上可接受的冻存保护剂、赋形剂、载体和稀释剂中的一种或多种；
可选的，所述药物制剂的粒径为30～500nm。
10.根据权利要求1～6任一项所述的具有靶向性的脂质纳米粒，根据权利要求7所述的核酸脂质纳米粒组合物，和/或根据权利要求9所述的药物制剂在如下(y)～(z)中的用途：
(y)基因递送；
(z)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物。
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| WO2025232812A1 (en) * | 2024-05-08 | 2025-11-13 | Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. | Biomolecule conjugated lipid nanoparticles |
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