[go: up one dir, main page]

CN117751145A - 包括抗b7h3结合分子的双特异性抗体 - Google Patents

包括抗b7h3结合分子的双特异性抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN117751145A
CN117751145A CN202280032108.1A CN202280032108A CN117751145A CN 117751145 A CN117751145 A CN 117751145A CN 202280032108 A CN202280032108 A CN 202280032108A CN 117751145 A CN117751145 A CN 117751145A
Authority
CN
China
Prior art keywords
binding portion
heavy chain
antibody
constant region
antigen binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280032108.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王结义
吴毅
许翔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lyvgen Biopharma Holdings Ltd
Lyvgen Biopharma Co Ltd
Original Assignee
Lyvgen Biopharma Holdings Ltd
Lyvgen Biopharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lyvgen Biopharma Holdings Ltd, Lyvgen Biopharma Co Ltd filed Critical Lyvgen Biopharma Holdings Ltd
Publication of CN117751145A publication Critical patent/CN117751145A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

一种多特异性抗体(例如，双特异性或三特异性)，其包括：一个抗原结合部分，所述一个抗原结合部分对人B7H3具有特异性；以及一个或多个抗原结合部分，所述一个或多个抗原结合部分对一种或多种所关注抗原，例如CD40、CD137、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、OX40、CD3、CD28和CD47具有特异性。本文还提供了用于制备此类抗体的方法以及使用此类抗体调节免疫应答的方法。

Description

包括抗B7H3结合分子的双特异性抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月28日提交的国际专利申请第PCT/CN2021/090537号的申请日的权益，所述国际专利申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用整体并入的序列表。创建于2022年4月27日的所述ASCII副本命名为112238-0098-70010WO2_SEQ.txt并且大小为2,650,405字节。
背景技术
B7H3(也称为CD276，一种免疫检查点分子)在许多类型的癌症中异常过表达，并且这种上调通常与不良的临床预后有关。最近的发现表明B7H3在促进致癌和转移中起着至关重要的作用。
考虑到B7H3在癌症免疫和进展中的重要作用，B7H3对癌症诊断和治疗的价值值得进一步详细研究。在此，开发了新的在治疗癌症中有效且安全的B7H3靶向免疫疗法。
发明内容
本公开至少部分地基于针对人B7H3和其它期望抗原，如CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28两者的双特异性和多特异性抗体的开发。此类双特异性和多特异性抗体表现出与亲本抗体的抗原结合亲和力和特异性基本上类似的抗原结合亲和力和特异性，并显示出一个或多个优越特征，例如同时与两种靶抗原结合、增强B7H3和任选地其它期望抗原的拮抗活性、优越的抗肿瘤活性或其组合。例如，与CD40亲本mAb Ly253-G2(对应于表1中的CD40 Ab1)相比，包含Ly1581、Ly1579、Ly1663和Ly1585的B7H3/CD40 bsAb双特异性抗体显示出更强的功效和更好的安全性。
因此，一方面，本公开的特征在于一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包括：
(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分与第一抗原结合，其中所述第一抗原结合部分包括第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)；
(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分与第二抗原结合，其中所述第二抗原结合部分包括第二VH和第二VL；以及任选地
(c)第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分与第三抗原结合，其中所述第三抗原结合部分包括第三VH和第三VL。
所述第一抗原和所述第二抗原中的一个是人B7H3，并且另一个是人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47。任选的第三抗原选自由以下组成的组：人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28和人CD47。所述任选的第三抗原不同于所述第一抗原和所述第二抗原。
在一些实施例中，与B7H3结合的所述抗原结合部分包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链互补决定区(CDR)相同的重链CDR；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的轻链CDR相同的轻链CDR。
在一些实施例中，与B7H3结合的所述抗原结合部分包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括重链互补决定区(CDR)，相对于抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链CDR3，所述重链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括轻链CDR，相对于抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的轻链CDR，所述轻链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异。
在一些实例中，与B7H3结合的所述抗原结合部分包括：(i)所述VH，所述VH包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；以及(ii)所述VL，所述VL包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在具体实例中，与B7H3结合的所述抗原结合部分包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的VH和VL相同的VH和相同的VL。
可替代地或另外地，与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的重链互补决定区(CDR)相同的重链CDR；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的轻链CDR相同的轻链CDR。
在一些实施例中，与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括重链互补决定区(CDR)，相对于抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的重链CDR3，所述重链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括轻链CDR，相对于CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的轻链CDR，所述轻链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异。
在一些实例中，其中与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括：(i)所述VH，所述VH包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；以及(ii)所述VL，所述VL包括与抗体CD40 Ab1、CD137Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在具体实例中，与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括与抗体CD40 Ab1、CD137Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3Ab1或CD3 Ab2的VH和VL相同的VH和相同的VL。
在一些实施例中，本文所公开的所述多特异性抗体可以是包括所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。在一些情况下，所述双特异性抗体具有双链格式。在一些情况下，所述双特异性抗体具有三链格式。可替代地，所述双特异性抗体具有四链格式。
在一些实例中，本文所公开的所述双特异性抗体可以包括：(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包括包含所述第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含所述第一VL和轻链恒定区的轻链；以及(ii)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分是单链可变片段(scFv)；并且其中所述scFv与(i)的所述重链或所述轻链连接。所述scFv可以与(i)的所述重链的N端或所述重链的C端连接。这种双特异性抗体可以包括：第一多肽，所述第一多肽包括(i)的与所述scFv融合的所述重链；以及第二多肽，所述第二多肽包括(i)的所述轻链。可替代地，所述双特异性抗体可以包括：第一多肽，所述第一多肽包括(i)的所述重链；以及第二多肽，所述第二多肽包括(i)的与所述scFv融合的所述轻链。
在一些情况下，所述第一抗原结合部分与B7H3结合，并且所述第二抗原结合部分可以与CD40、CD137、GITR、OX40、CD3、CD28和CD47之一结合。在一些情况下，所述多特异性抗体是包括所述第一多肽和所述第二多肽中的每一个的两个拷贝的多链复合物。
在一些情况下，所述双特异性抗体具有三链格式，所述三链格式可以包括(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分的第二重链，所述第二抗原结合部分是包括所述第二VH和所述第二VL的单链可变片段(scFv)，其中所述第二重链包括所述第一VH和其中包括CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。在一些实例中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化和/或减少蛋白A结合。在一些实例中，所述scFv定位于所述第二多肽中的所述第一VH与所述第二Fc片段或其CH3结构域之间。可替代地，所述scFv定位于所述第二多肽的C端处。
在一些情况下，本文所公开的所述双特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链以及所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的一个；其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的第二重链以及所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的另一个，其中所述第二重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。在一些实例中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。在一些实例中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括突变，所述突变为杵臼突变、带电突变或ZW1突变。可替代地或另外地，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区之一包括相对于所述野生型对应物降低蛋白A结合活性的突变。
在一些情况下，所述双特异性抗体具有四链格式，所述四链格式可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第二抗原结合部分的第二重链，所述第二重链包括所述第二VH、轻链恒定区和包括CH3结构域的第二重链恒定片段；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原部分的轻链，所述轻链包括与重链恒定区的CH1结构域连接的所述第二VL。在一些实例中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些情况下，本文所公开的所述双特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第二重链，所述第二重链包括所述第一VH、作为scFv片段的包括所述第二VH和所述第二VL的所述第二抗体结合部分以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述scFv。在一些实例中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些情况下，本文所公开的所述双特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第二VH、第一TCR片段和包括CH3结构域的第二重链恒定片段；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二VL和第二TCR片段。所述第一TCR片段和所述第二TCR片段共同地是形成二聚体的TCRα链片段和TCRβ链片段。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。在一些实例中，所述第三多肽进一步包括所述第一VH，所述第一VH与重链恒定区的CH1结构域连接。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD40结合的所述第二抗原结合部分。实例包含Ly1581、Ly1660、Ly1661、Ly1662、Ly1663、Ly1679、Ly1935和Ly1936。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD137结合的所述第二抗原结合部分。实例包含Ly1937、Ly1938、Ly1939、Ly1940、Ly1941、Ly1942、Ly1943和Ly1944。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与GITR结合的所述第二抗原结合部分。实例包含Ly1945、Ly1946、Ly1947、Ly1948、Ly1049、Ly1950、Ly1951和Ly1952。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与OX40结合的所述第二抗原结合部分。实例包含Ly1953、Ly1954、Ly1955、Ly1956、Ly1957、Ly1958、Ly1959和Ly1960。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD47结合的所述第二抗原结合部分。实例包含Ly2043、Ly2044、Ly2045、Ly2046、Ly2047、Ly2048、Ly2049、Ly2050、Ly2051、Ly2052、Ly2053、Ly2054、Ly2055、Ly2056、Ly2057、Ly2058、Ly2059、Ly2060、Ly2061、Ly2062、Ly2063和Ly2064。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD3结合的所述第二抗原结合部分。实例包含Ly1900、Ly1901、Ly1902、Ly1903和Ly1904。
在一些实施例中，本文所公开的所述多特异性抗体其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH的第二重链和轻链恒定区以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL和重链恒定区的CH1片段。所述第一多肽、所述第二多肽或两者可以进一步包括作为单链可变片段(scFv)的所述第三抗原结合部分。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，此处所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL和重链恒定区的CH1结构域的第二重链以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH和轻链恒定区。所述第一多肽、所述第二多肽或两者可以进一步包括作为单链可变片段(scFv)的所述第三抗原结合部分。在一些实例中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及所述第三抗原结合部分的所述第三VH和所述第三VL中的一个；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH的第二重链和轻链恒定区、其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及所述第三VH和所述第三VL中的另一个；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL和重链恒定区的CH1结构域。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区可以包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及所述第三抗原结合部分的所述第三VH和所述第三VL中的一个；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL的第二重链和重链恒定区的CH1结构域、其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及所述第三VH和所述第三VL中的另一个；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH和轻链恒定区。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区可以包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、作为scFv的所述第二抗原结合部分和其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。所述第一多肽、所述第二多肽或两者可以进一步包括作为scFv的所述第三抗原结合部分。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区可以包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的一个以及其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、所述第二VH和所述第二VL中的另一个以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。所述第一多肽、所述第二多肽或两者可以进一步包括作为scFv的所述第三抗原结合部分，或者其中所述第三多肽进一步包括所述第三抗原结合部分。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区可以包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的一个、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及所述第三抗原结合部分的所述第三VH和所述第三VL中的一个；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、所述第二VH和所述第二VL中的另一个、以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及所述第三VH和所述第三VL中的另一个；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区可以包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及作为scFv的所述第二抗原结合部分；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及作为scFv的所述第三抗原结合部分；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括包含所述第二抗原结合部分的所述第二VH的第二重链以及所述第三抗原结合部分中的所述第三VH和所述第三VL中的一个，其中所述第三VH与轻链恒定区融合或者所述第三VL与重链恒定区的CH1结构域融合；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第二抗原结合部分的包括所述第二VL和轻链恒定区的轻链，以及所述第三抗原结合部分中的所述第三VH和所述第三VL中的另一个，其中所述第三VH与轻链恒定区融合或者所述第三VL与重链恒定区的CH1结构域融合；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。所述第二多肽或所述第三多肽可以进一步包括其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的所述第一VH、所述第二抗原结合部分的所述第二VH以及其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VH和轻链恒定结构域；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VL和重链恒定区的CH1结构域；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。所述第二多肽或所述第三多肽可以进一步包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。在一些实例中，所述第二多肽或所述第三多肽可以进一步包括所述第一VH，所述第一VH与重链恒定区的CH1融合。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的所述第一VH、所述第二抗原结合部分的所述第二VL以及其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VH和轻链恒定结构域；(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VL和重链恒定区的CH1结构域；以及(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。所述第二多肽或所述第三多肽可以进一步包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区可以包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。在一些实例中，所述第二多肽或所述第三多肽可以进一步包括所述第一VH，所述第一VH与重链恒定区的CH1融合。
在一些实例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的重链和所述第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的所述重链包括所述第一VH和重链恒定区，并且其中所述第二抗原结合部分是scFv片段；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链和所述第三抗原结合部分，其中所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区，并且其中所述第三抗原结合部分是scFv片段。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的重链和所述第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的所述重链包括所述第一VH和第一重链恒定区，并且其中所述第二抗原结合部分是scFv片段；(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的重链和所述第三抗原结合部分，其中所述重链包括所述第一VH和第二重链恒定区，并且其中所述第三抗原结合部分是scFv片段；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区。在一些情况下，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
在本文所公开的所述多特异性抗体的任一种中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括突变，所述突变为杵臼突变、带电突变或ZW1突变。可替代地或另外地，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区之一包括相对于所述野生型对应物降低蛋白A结合活性的突变。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以与B7H3、CD3和CD137结合。实例包含Ly1785、Ly1793、Ly1794、Ly1795、Ly1796、Ly1797、Ly1798、Ly1799、Ly1800、Ly1801、Ly1802、Ly1803、Ly1804、Ly1805和Ly1849。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以与B7H3、CD3和GITR结合。实例包含Ly1905、Ly1906、Ly1907、Ly1908、Ly1909、Ly1910、Ly1911、Ly1912、Ly1913、Ly1914、Ly1915、Ly1916、Ly1917、Ly1918和Ly1933。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以与B7H3、CD3和OX40结合。实例包含Ly1919、Ly1920、Ly1921、Ly1922、Ly1923、Ly1924、Ly1925、Ly1926、Ly1927、Ly1928、Ly1929、Ly1930、Ly1931、Ly1932和Ly1934。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以与B7H3、CD137和OX40结合。实例包含Ly2076、Ly2077和Ly2078。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以与B7H3、CD137和GITR结合。实例包含Ly2079、Ly2080和Ly2081。
在一些实例中，本文所公开的所述三特异性抗体可以与B7H3、CD3和CD28结合。实例包含Ly1968至Ly2042中的任一个。
另一方面，本公开的特征在于一种人源化抗体，所述人源化抗体对人B7H3具有特异性。所述人源化抗体包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实例中，所述VH包括IGHV1-46*01的框架以及重链互补决定区(CDR)1、2和3，所述重链CDR与亲本鼠类抗体Ly383的重链CDR相同或相对于所述亲本鼠类抗体Ly383共同含有不超过5个氨基酸残基变异。在其它实例中，所述VH包括IGHV1-2*02的框架以及重链CDR 1、2和3，所述重链CDR与亲本鼠类抗体Ly387的重链CDR相同或相对于所述亲本鼠类抗体Ly387共同含有不超过5个氨基酸残基变异。
可替代地或另外地，所述VL包括IGKV3-11*01的框架以及轻链CDR 1、2和3，所述轻链CDR与所述亲本鼠类抗体Ly383或Ly387的轻链CDR相同或相对于所述亲本鼠类抗体Ly383或Ly387共同含有不超过5个氨基酸残基变异。
在一些实例中，所述抗体包括与抗体Ly383相同的重链CDR 1、2和3，和/或与抗体Ly383相同的轻链CDR 1、2和3。在一些实例中，所述抗体包括与抗体Ly387相同的重链CDR1、2和3，和/或与抗体Ly387相同的轻链CDR 1、2和3。
本文所公开的所述人源化抗体中的任一种可以包括VH，所述VH包括所述VH框架中的一个或多个突变。所述VH框架中的所述突变可以基于对应定位处的所述亲本鼠类抗体中的氨基酸残基的回复突变。
表2中列出的任何抗B7H3抗体都在本公开的范围内。在具体实例中，所述VH包括SEQ ID NO:35、39、47或49的氨基酸序列；和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:37或41的氨基酸序列。可替代地，所述VH包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列；和/或其中所述VL包括SEQ IDNO:45的氨基酸序列。
本文所公开的人源化抗体中的任一种都可以是全长抗体。在一些实例中，所述全长抗体是IgG/κ分子。在一些具体实例中，所述全长抗体包括重链，所述重链为IgG1、IgG2或IgG4链。在一些情况下，所述重链包括突变的Fc区，相对于野生型对应物，所述突变的Fc区对Fc受体表现出改变的结合亲和力或选择性。示例性人源化抗B7H3抗体包含Ly1426、Ly1562、Ly1612、Ly1614、Ly1616、Ly1618和Ly1442。
本公开的特征还在于一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所公开的任何多特异性抗体或人源化抗B7H3抗体和药学上可接受的载剂。
在另一方面，本公开的特征在于一种核酸或核酸组，所述核酸或核酸组共同编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体。在一些情况下，所述核酸或核酸组可以为表达载体或表达载体组。
进一步地，本公开的特征在于一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本文所公开的核酸或核酸组。在一些实例中，所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
另外，本公开的特征在于一种用于产生根据本文所公开的所述多特异性抗体或所述人源化抗B7H3抗体的方法。所述方法可以包括：(i)在允许表达所述抗体的条件下培养本文所公开的所述宿主细胞；以及(ii)采集因此产生的所述抗体。
另一方面，本公开的特征还在于一种用于调节免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的所述多特异性抗体和/或所述人源化抗B7H3抗体或包括其的药物组合物中的任一种。在一些实例中，所述受试者是患有或疑似患有癌症的人类患者。
还在本公开的范围内的是用于调节免疫应答或治疗癌症以及使用此类抗体制造用于治疗靶疾病的药物的所述多特异性和/或人源化抗B7H3抗体中的任一种。
在下文的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点从以下附图和若干个实施例的详细说明以及还从所附权利要求中将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包含在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考附图与本文呈现的具体实施例的详细说明的组合可以更好地理解所述方面。
图1A-1D是示出了如所指示的抗B7H3抗体与CHO细胞上表达的人B7H3的结合活性的图表。这些抗B7H3抗体的结合由平均荧光强度(MFI)指示。图1A：在如所指示的浓度处的克隆Ly1426和Ly383。图1B：在如所指示的浓度处的克隆Ly1562和Ly383。图1C：在如所指示的浓度处的克隆Ly1442和Ly387。图1D：在如所指示的浓度处的克隆Ly1612、Ly1614、Ly1616和Ly1618。
图2A-2D是示出了如所指示的抗B7H3/CD40双特异性抗体与CHO细胞上表达的人B7H3的B7H3或CD40结合活性的图表。这些抗B7H3/CD40双特异性抗体的结合由平均荧光强度(MFI)指示。图2A：在如所指示的浓度处的克隆Ly1581、Ly1660、Ly1661、Ly1662、Ly1663和Ly383的B7H3结合活性。图2B：在如所指示的浓度处的克隆Ly1578、Ly1579、Ly1581、Ly1583、Ly1585和Ly383的B7H3结合活性。图2C：在如所指示的浓度处的克隆Ly1581、Ly1660、Ly1661、Ly1662、Ly1663和Ly253-G2(CD40 Ab1)的CD40结合活性。图2D：在如所指示的浓度处的克隆Ly1578、Ly1579、Ly1581、Ly1583、Ly1585和Ly253-G2(CD40 Ab1)的CD40结合活性。
图3A-3F是示出如在报告基因测定中通过多种抗B7H3/CD40抗体通过IL8分泌所指示的对人CD40激活的刺激的图表。在没有或与共培养的B7H4过表达CHO细胞一起评估这些双特异性抗体的激动活性。各种抗体在x轴上指示，并且CD40激活信号在y轴上指示。图3A：在如所指示的浓度处的克隆Ly1578、Ly1579、Ly1581、Ly1583、Ly253-G2、Ly383和Ly387，所述浓度用于激活CD40，而不共培养B7H3过表达CHO细胞。图3B：在如所指示的各种浓度处的克隆Ly1578、Ly1579、Ly1581、Ly1583、Ly253-G2、Ly383和Ly387，所述浓度用于激活CD40以及共培养B7H3过表达CHO细胞。图3C：在如所指示的各种浓度处的克隆Ly1585、Ly1587、Ly253-G2、Ly383和Ly387，所述浓度用于激活CD40，而不共培养B7H3过表达CHO细胞。图3D：在如所指示的各种浓度处的克隆Ly1585、Ly1587、Ly253-G2、Ly383和Ly387，所述浓度用于激活CD40以及共培养B7H3过表达CHO细胞。图3E：在如所指示的各种浓度处的克隆Ly1581、Ly1660、Ly1661、Ly1662、Ly1663、Ly1679、Ly253-G2、Ly1612和Ly383，所述浓度用于激活CD40而不共培养B7H3过表达CHO细胞。图3F：在如所指示的各种浓度处的克隆Ly1581、Ly1660、Ly1661、Ly1662、Ly1663、Ly1679、Ly253-G2、Ly1612和Ly383，所述浓度用于激活CD40以及共培养B7H3过表达CHO细胞。
图4A-4C是示出抗B7H3/CD40抗体在患有表达人B7H3的肿瘤细胞的人CD40敲除小鼠同基因模型中的抗肿瘤活性的一组图。图4A：在第0天、第20天和第27天通过腹膜内注射以10mg/kg施用在克隆Ly1581、Ly1585、Ly1579和Ly253-G2的MC38-hB7H3模型中的抗肿瘤作用。图4B：在第0天、第20天和第27天通过腹膜内注射以所示10mg/kg施用在克隆Ly1581、Ly1662、Ly1663和Ly253-G2的MC38-hB7H3模型中的抗肿瘤作用。图4C：在第0天、第20天和第27天通过腹膜内注射以10mg/kg施用在克隆Ly1581、Ly1585、Ly1579和Ly253-G2中。
图5A-5C包含示出代表性双特异性抗体2链格式的图。图5A：呈scFv格式的第二抗体与第一抗体的重链的C端融合。图5B：呈scFv格式的第二抗体与第一抗体的重链的N端融合。图5C：呈scFv格式的第二抗体与第一抗体的轻链融合。
图6A-6D包含示出代表性双特异性抗体3链格式的图。图6A：呈scFv格式的第二抗体在CH1与Fc区中间与第一抗体的重链融合。图6B：呈scFv格式的第二抗体与第一抗体的Fc区的C端融合。图6C：第二抗体的VH和VL在CH1与CH3区之间各自与第一抗体的重链融合。图6D：第二抗体的VH和VL在CH1与Fc区中间各自与第一抗体的重链融合。在这些代表性格式中的每一种中，Fc区可以含有增强异二聚化(例如，KiH、Charge或ZW)和/或降低对蛋白A的结合亲和力(pA mut)的突变。
图7A-7D包含示出代表性双特异性抗体4链格式的图。图7A：呈异二聚体格式的具有杵臼(KiH)突变和pA mut突变的第一抗体和第二抗体。图7B：呈异二聚体格式的具有带电突变和pA mut突变的第一抗体和第二抗体。图7C：呈异二聚体格式的具有ZW1/ZW2突变和pAmut突变的第一抗体和第二抗体。图7D：呈Fab格式的第二抗体，其中一个链与第一抗体的一个重链融合(在CH1与Fc之间)。在这些格式中的任一种中，第二抗体的VH和VL片段可以呈CrossMab形式。
图8A-8B包含示出使用TCRα和TCRβ片段的代表性双特异性抗体的图。图8A：第二抗体的VH和VL各自与TCRα和TCRβ片段之一融合以用于二聚化。VH链进一步与Fc区融合，所述Fc区与第一抗体的重链形成二聚体。图8B：第二抗体的VH和VL各自与TCRα和TCRβ片段之一融合以用于二聚化。两个链中的一个进一步与第一抗体的重链(在CH1与Fc区之间)融合。
图9A-9D包含示出代表性三特异性抗体格式(4链)的图。图9A：呈Fab形式的第二抗体和呈scFv形式的第三抗体。一个scFv链与第一抗体的一个重链融合，并且一个scFv链与第一抗体的另一个重链融合，所述重链进一步包含Fab链中的一个。图9B：呈Fab形式的第二抗体和呈scFv形式的第三抗体。一个scFv链与第一抗体的重链融合，所述重链进一步包含Fab链中的一个。图9C：呈Fab形式的第二抗体和呈scFv形式的第三抗体。一个scFv与第一抗体的一个重链融合，并且一个Fab链与第一抗体的另一个重链融合。图9D：呈Fab形式的第二抗体和呈VH/VL格式的第三抗体(分离链)。VH和VL片段中的一个与第一抗体的一个重链融合，并且另一个与第一抗体的另一个重链融合，所述重链进一步包含Fab链中的一个。在这些格式中的任一种中，第二抗体的VH和VL片段可以呈CrossMab形式。在这些代表性格式中的每一种中，Fc区可以含有增强异二聚化(例如，KiH、Charge或ZW)和/或降低对蛋白A的结合亲和力(pA mut)的突变。
图10A-10C包含示出代表性三特异性抗体格式(3链)的图。图10A：均呈scFv形式的第二抗体和第三抗体，一个与第一抗体的重链融合，并且另一个与第一抗体的另一个重链融合(在CH1与Fc之间)。图10B：均呈scFv形式的第二抗体和第三抗体，一个与第一抗体的重链融合，并且另一个与第一抗体的另一个重链融合(在CH1与Fc之间)，所述重链进一步包含第三抗体scFv的拷贝。图10C：均呈scFv形式的第二抗体和第三抗体，两者均与第一抗体的重链融合(一个在CH1与Fc之间，并且另一个在C端处)。在这些代表性格式中的每一种中，Fc区可以含有增强异二聚化(例如，KiH、Charge或ZW)和/或降低对蛋白A的结合亲和力(pAmut)的突变。
图11A-11E包含示出代表性三特异性抗体格式(3链)的图。图11A：呈VH/VL形式的第二抗体(分离链)和呈scFv形式的第三抗体。VH和VL片段中的每一个都与第一抗体的一个重链融合，所述重链进一步包含scFv链。图11B和11C：呈VH/VL形式的第二抗体(分离链)和呈scFv形式的第三抗体。VH和VL片段中的每一个都与第一抗体的一个重链融合。其中一个重链进一步包含scFv链。在这些代表性格式中的每一种中，Fc区可以含有增强异二聚化(例如，KiH、Charge或ZW)和/或降低对蛋白A的结合亲和力(pA mut)的突变。图11D：呈VH/VL形式的第二抗体和第三抗体(分离链)两者，各自与第一抗体的一个重链融合。图11E：呈VH/VL形式的第二抗体(分离链)和呈scFv形式的第三抗体。VH和VL片段中的每一个与第一抗体的一个重链融合，并且scFv链与第一抗体的轻链中的每一个轻链融合。
图12A-12D包含示出代表性三特异性抗体格式(3链或4链)的图。图12A：第二抗体和第三抗体两者均呈scFv形式，各自与第一抗体的一个重链融合。图12B：第二抗体和第三抗体两者均呈Fab形式，每个Fab的一个链与另一个Fab的一个链融合。图12C：呈VH/VL形式的第二抗体(分离链)和呈Fab形式的第三抗体。VH和VL中的一个与第一抗体的一个重链融合，并且另一个与Fab的一个链融合。图12D：呈VH/VL形式的第二抗体(分离链)和呈Fab形式的第三抗体。VH和VL中的一个与第一抗体的一个重链融合，并且另一个与Fab的一个链融合。融合链进一步包含第一抗体的VH-CH1片段。在这些格式中的任一种中，第二抗体的VH和VL片段可以呈CrossMab形式。在这些代表性格式中的每一种中，Fc区可以含有增强异二聚化(例如，KiH、Charge或ZW)和/或降低对蛋白A的结合亲和力(pA mut)的突变。
图13A-13C包含示出代表性三特异性抗体格式(2链或3链格式)的图。图13A-13B：第二抗体和第三抗体两者均呈scFv格式，各自与第一抗体的重链和轻链融合。图13C：第二抗体和第三抗体两者均呈scFv格式，各自与第一抗体的一个重链融合。
具体实施方式
本文提供了对人B7H3具有特异性的抗体(例如，人源化抗体)(即抗B7H3抗体)。本文还提供了多特异性抗体(例如，双特异性和三特异性抗体)，所述多特异性抗体包括对B7H3具有特异性的第一抗原结合部分以及对免疫调节剂，例如CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28具有特异性的一个或多个(例如，第二和任选地第三)抗原结合部分。此类抗B7H3抗体和多特异性抗体具有各种治疗、诊断或研究应用。例如，抗体可以用于调节需要这种治疗的受试者的免疫应答，如抗肿瘤免疫应答。此类抗体还可以用于癌症治疗或癌症诊断。
如本文所使用的，抗体(以复数形式可互换地使用)是指能够通过定位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点来与靶标，例如本文所公开的靶抗原中的任何一个特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，术语“抗体”不但涵盖完整(即，全长)多克隆抗体或单克隆抗体，而且涵盖其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、纳米抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型，所述经修饰构型包含抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包含任何类的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要属于任何特定类。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分派为不同类。存在五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类中的几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是众所周知的。
典型的抗体分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其通常参与抗原结合。VH和VL区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，其散布有更保守的被称为“框架区”(“FR”)的区。每个VH和VL通常由按以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围可以使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义来精确地鉴定，所有所述定义均是本领域熟知的。参见例如，Kabat,E.A.等人,(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公开号91-3242；Chothia等人,(1989)《自然(Nature)》342:877；Chothia,C.等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917；Al-lazikani等人(1997)《分子生物学杂志)》273:927-948；和Almagro,《分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)》17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs。
本文所描述的抗体可以是鼠类、大鼠、人类或任何其它来源(包含嵌合抗体或人源化抗体)。此类抗体是非天然存在的，即在没有人行为(例如，用所期望的抗原或其片段免疫此类动物或从抗体文库中分离)的情况下将不会在动物中产生。
本文所描述的抗体中的任何抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同质抗体群，并且“多克隆抗体”是指异质抗体群。这两个术语并不限制抗体的来源或制备抗体的方式。
I.人源化抗B7H3抗体
在一些方面，本公开提供了对糖皮质激素诱导的TNFR相关(B7H3)多肽具有特异性的抗体(“抗B7H3抗体”)，所述抗体可以是任何来源，例如人和/或猴B7H3。此类抗B7H3抗体可以与特定物种的B7H3(例如，人B7H3)特异性结合。可替代地，本文所描述的抗B7H3抗体可以与不同物种的B7H3抗原交叉反应(例如，与人和猴B7H3两者结合)。在一些情况下，本文所描述的抗B7H3抗体可以与细胞表面B7H3，例如，在表面上自然表达B7H3的细胞(例如，免疫细胞)上表达的B7H3结合。
B7H3，也称为CD276，在免疫细胞(如抗原呈递细胞或巨噬细胞)和肿瘤细胞上表达，并且对T细胞具有抑制作用，从而有助于肿瘤细胞免疫逃避。最近的研究表明，B7H3在肿瘤生长和转移中发挥着免疫调控作用之外的重要作用。抑制B7H3是B7H3过表达肿瘤的潜在治疗策略。B7H3是本领域中众所周知的蛋白质。例如，人B7H3的结构信息可以在基因ID:80381下找到。
在一些实施例中，本文所公开的抗B7H3抗体是衍生自非人亲本抗体克隆的人源化抗体，例如与B7H3，如人B7H3结合的鼠类抗体。人源化抗体是指为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有衍生自非人免疫球蛋白亲本的最小序列的抗原结合片段的非人(例如，鼠类)抗体的形式。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基被来自如小鼠、大鼠或兔等具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)的CDR的残基替代。在一些情况下，一个或多个人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括既未在受体抗体中发现也未在导入的CDR或框架序列中发现但被包含在内以进一步精化和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将包括至少一个并且典型的两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。
人源化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分。抗体可以具有如WO 99/58572所描述的修饰的Fc区。其它形式的人源化抗体具有关于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个和/或六个)。这也被称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或者多个CDR。人源化抗体还可以涉及亲和力成熟。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见例如Queen等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的VH和VL可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对形成正确CDR结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH链和人VL链。然后选择人VH受体基因和人VL受体基因。
可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代所选人受体基因内的CDR区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与CDR区相互作用时具有重要性的残基来取代人受体基因中的对应残基。
在一些实施例中，本文所公开的抗B7H3抗体是衍生自鼠类亲本克隆Ly383的人源化抗体，其在下文的实例1中公开。这种人源化抗体可以包括IGHV1-2*02的重链框架和/或IGKV3-11*01的轻链框架。另外，这种人源化抗体可以包括与鼠类亲本克隆相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)。可替代地，可以包括IGHV1-2*02的重链框架和/或IGKV3-11*01的轻链框架的人源化抗B7H3抗体可以相对于鼠类亲本Ly383的对应CDR区在一个或多个CDR区中包括一个或多个氨基酸残基变异。例如，人源化抗体可以在三个重链CDR中共同包括至多5个(例如，至多4个、3个、2个或1个)氨基酸残基。在其它实例中，人源化抗体可以在三个轻链CDR中共同包括至多5个(例如，至多4个、3个、2个或1个)氨基酸残基。在又其它实例中，人源化抗体可以在三个重链CDR和三个轻链CDR中共同包括至多8个(例如，至多7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸残基。
在一些实施例中，本文所公开的抗B7H3抗体是衍生自鼠类亲本克隆Ly387的人源化抗体，其在下文的实例1中公开。这种人源化抗体可以包括IGHV4-59*01的重链框架和/或IGKV3-11*01的轻链框架。另外，这种人源化抗体可以包括与鼠类亲本克隆相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)。可替代地，可以包括IGHV1-2*02的重链框架和/或IGKV3-11*01的轻链框架的人源化抗B7H3抗体可以相对于鼠类亲本Lyv396的对应CDR区在一个或多个CDR区中包括一个或多个氨基酸残基变异。例如，人源化抗体可以在三个重链CDR中共同包括至多5个(例如，至多4个、3个、2个或1个)氨基酸残基。在其它实例中，人源化抗体可以在三个轻链CDR中共同包括至多5个(例如，至多4个、3个、2个或1个)氨基酸残基。在又其它实例中，人源化抗体可以在三个重链CDR和三个轻链CDR中共同包括至多8个(例如，至多7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸残基。
可替代地或另外地，氨基酸残基变异可以是保守氨基酸残基取代。如本文所使用的，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特性的氨基酸取代。可以根据用于改变本领域的普通技术人员已知的多肽序列的方法来制备变体，所述方法如编制这种方法的参考文献中发现的，所述参考文献例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,J.Sambrook等人编辑,第二版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York),1989或《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》,F.M.Ausubel等人编辑,纽约的约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York)。氨基酸的保守取代包含在以下组中的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。
在一些实施例中，任何人源化抗B7H3抗体可以包括与由人受体种系VH和/或VL基因编码的抗体的框架相同的框架。在其它实施例中，人源化抗体的框架区可以包括相对于由人受体种系VH和/或VL基因编码的抗体的突变的一个或多个突变。例如，人源化抗体的VH和/或VL链的框架区中的一个或多个定位可以含有一个或更多个回复突变，其是指将人受体种系基因中的残基改变为鼠类亲本的对应位置处的残基。例如，衍生自鼠类亲本克隆Ly383的人源化抗体可以包括重链框架区中的定位A40(例如，A40K)、M48(例如，M48I)、V68(例如，V68A)、R72(例如，R72S)和/或T74(例如，T74K)中的一个或多个定位处的突变(例如，回复突变)，以及重链框架区中的定位P45(例如，P45L)、W46(例如，W46L)、R65(例如，R65G)和/或Y70(例如，Y70F)中的一个或多个定位处的突变(例如，回复突变)。在一些实施例中，本文所公开的人源化抗B7H3抗体可以包括本文所公开的重链和轻链CDR中的任一种(例如，下文实例3中提供的CDR的任何组合)。另外，这种人源化抗B7H3抗体可以包括与IGHV1-2*02的重链框架区至少80％(例如，至少85％、90％、95％或以上)相同的重链框架。可替代地或另外地，人源化抗B7H3抗体可以包括与IGKV3-11*01的轻链框架区至少80％(例如，至少85％、90％、95％或以上)相同的轻链框架。
本文所描述的抗B7H3抗体中的任一种可以是全长抗体，其含有两个重链和两个轻链，每个重链和轻链包含可变结构域和恒定结构域。可替代地，本文所描述的抗体的重链恒定区可以包括单个结构域(例如，CH1、CH2或CH3)或任何单个结构域的组合。抗体重链和轻链恒定区是本领域众所周知的，例如IMGT数据库(www.imgt.org)或www.vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些，这两个数据库以引用的方式并入本文中。
可替代地，本文所公开的抗体可以是全长抗体的抗原结合片段。涵盖在术语全长抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包含(i)Fab片段—由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段—包含在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)《自然》341:544-546)；以及(vi)保留功能的分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成连接子来连接，在所述单个蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv))。参见例如Bird等人,(1988)《科学(Science)》242:423-426；和Huston等人,(1988)《美国国家科学院院刊》85:5879-5883。
在一些实施例中，抗B7H3抗体是下文实例1中所公开的Ly383或衍生自其的功能变体。Ly383或其功能变体可以包括分别与人重链恒定区和人轻链恒定区融合的VH和VL链。人重链恒定区可以来自IgG分子和/或人轻链恒定区可以来自κ链。重链恒定结构域可以衍生自合适的Ig同种型，例如人IgG1、IgG2或IgG4分子。在一些实施例中，恒定结构域可以包括Fc区中的一个或多个突变，以增强或降低对Fc受体的结合亲和力和/或结合特异性。实例提供于本文中或在WO/2018/183520和PCT/US2019/053505(于2019年9月27日提交)中公开，每一个的相关公开出于本文所引用的目的和主题通过引用并入。这种重组抗体可以进一步包括TM676的相同轻链可变区，其与人轻链恒定区融合，例如κ链恒定区。
在一些实施例中，抗B7H3抗体是下文实例1中所公开的Ly387或衍生自其的功能变体。Ly387或其功能变体可以包括分别与人重链恒定区和人轻链恒定区融合的VH和VL链。人重链恒定区可以来自IgG分子和/或人轻链恒定区可以来自κ链。重链恒定结构域可以衍生自合适的Ig同种型，例如人IgG1、IgG2或IgG4分子。在一些实施例中，恒定结构域可以包括Fc区中的一个或多个突变，以增强或降低对Fc受体的结合亲和力和/或结合特异性。实例提供于本文中或在WO/2018/183520和PCT/US2019/053505(于2019年9月27日提交)中公开，每一个的相关公开出于本文所引用的目的和主题通过引用并入。这种重组抗体可以进一步包括TM677的相同轻链可变区，其与人轻链恒定区融合，例如κ链恒定区。
示例性抗B7H3抗体和其人源化版本在下文的实例1和表2中提供，其也在本公开的范围内。
II.包括抗B7H3结合部分的多特异性抗体
在一些方面，本公开还提供了多特异性抗体，所述多特异性抗体包括对B7H3具有特异性的一个抗原结合部分以及对一种或多种所关注另外抗原，例如免疫检查点或调节剂分子具有特异性的一个或多个另外抗原结合部分。实例包含但不限于CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28。在一些实例中，本文所公开的多特异性抗体是双特异性抗体，其包括对B7H3具有特异性的一个抗原结合部分和对抗原CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28中的一个具有特异性的一个抗原结合部分。在其它实例中，本文所公开的多特异性抗体为三特异性抗体，其包括对B7H3具有特异性的一个抗原结合部分以及对选自CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28的两种抗原具有特异性的两个另外抗原结合部分。
A.抗原结合部分
本文所公开的任何多特异性抗体中的每个抗原结合部分可以是任何形式的抗原结合部分，包含但不限于完整的(即全长的)抗体、其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、三功能抗体、triFab、串联连接的Fab、Fab-Fv、串联连接的V结构域、串联连接的scFv和其它形式)、单链抗体(scFv抗体)和四价抗体。双特异性或多特异性抗体中的任何scFv片段都可以处于VH→VL取向。可替代地，其可以处于VL→VH取向。
本文所公开的任何多特异性抗体中的抗原结合部分可以与对应靶抗原(例如，B7H3、CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28)或其表位特异性结合。与抗原或表位“特异性结合”的抗体是本领域熟知的术语。如果分子与特定靶抗原比其与替代性靶标更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应，则所述分子被称为表现出“特异性结合”。如果抗体比其与其它物质亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶抗原或表位“特异性结合”。例如，与抗原(例如，上文列出的那些)或其中的抗原表位特异性(或优先地)结合的抗体是这样的抗体：所述抗体与这种靶抗原比其与其它抗原或同一抗原中的其它表位亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合。利用这个定义还应理解，例如，与第一靶抗原特异性结合的抗体可以或可以不与第二靶抗原或第三靶抗原特异性结合或优先地结合。如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他结合。在一些实例中，与靶抗原或其表位“特异性结合”的抗体可以不与其它抗原或同一抗原中的其它表位结合(即，在常规方法中仅可以检测基线结合活性)。可替代地/另外，相对于猴子对应物，本文所描述的抗体可以与人抗原或其片段特异性结合，或反之亦然(例如，如在相同的测定条件下的同一测定中确定的，对一种抗原的结合亲和力是对另一种抗原的结合亲和力的至少10倍)。在其它情况下，本文所描述的抗体可以与人和非人抗原(例如，猴子)交叉反应，例如对人和非人抗原的结合亲和力差异小于5倍，例如小于2倍，或基本上类似。
在一些实施例中，如本文所描述的任何双特异性或多特异性抗体中的抗原结合部分对靶抗原(例如，B7H3、CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所使用的，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所描述的抗体对于靶抗原或抗原表位的结合亲和力(KD)可以为至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低。增大的结合亲和力对应于减小的KD。抗体相对于第二抗原对第一抗原的更高亲和力结合可以通过比用于与第二抗原结合的KA(或数值KD)更高的用于与第一抗原结合的KA(或更小的数值KD)来指示。在此类情况下，所述抗体相对于第二抗原(例如，第二构象或其模拟物中的相同的第一蛋白质；或第二蛋白质)对第一抗原(例如，第一构象或其模拟物中的第一蛋白质)具有特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其它比较)可以为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、91倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或105倍。在一些实施例中，任何抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
可以通过各种方法来确定结合亲和力(或结合特异性)，所述各种方法包含平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件为处于HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可以用于根据靶蛋白浓度测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度([结合(Bound)])通常通过以下等式与游离靶蛋白([游离(Free)])的浓度相关：
[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])
然而，并不总是需要对KA进行精确测定，因为有时例如通过功能性测定，例如体外或体内测定中的活性足以获得对亲和力的定量测量、获得对亲和力的定性测量或者获得对亲和力的推断，所述亲和力例如是使用如ELISA或FACS分析等方法确定的、与KA成正比并且因此可以用于比较，如确定更高的亲和力是否例如高2倍。
本文所公开的多特异性抗体的抗原结合部分可以衍生自对B7H3具有特异性的亲本抗体和对下表1中列出的其它所关注抗原具有特异性的母体抗体(基于Kabat方案的重链和轻链CDR用粗体标识)。
表1：用于构建多特异性抗体的亲本抗体
如本文所使用的，“衍生自”亲本抗体的多特异性抗体中的抗原结合部分意指将亲本抗体用作制备多特异性抗体中的一个抗原结合部分的起始材料。抗原结合部分可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。两种抗体具有相同的VH和/或VL CDR意味着当通过相同的方法(例如，如本领域已知的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义)确定时，其CDR是相同的。
在一些情况下，衍生自亲本抗体的抗原结合部分可以是亲本抗体的功能变体。此类功能变体在结构和功能两者上基本上类似于参考抗体。功能变体包括与参考抗体基本上相同的VH和VL CDR。例如，其可以在参考抗体的总重链CDR区中包括仅至多5个(例如，4个、3个、2个或1个)氨基酸残基变异，和/或在参考抗体的总轻链CDR区包括仅至多5个(例如，4个、3个、2个或1个)氨基酸残基变异。在一些实例中，相对于参考抗体的那些，功能性变体可以在总重链和轻链CDR中包括至多8个(例如，7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸残基变异。此类功能性变体可以以基本上类似的亲和力(例如，具有相同次序的KD值)与B7H3的相同表位结合。可替代地或另外地，氨基酸残基变异是如本文所公开的保守氨基酸残基取代。
在一些实施例中，如与对应亲本抗体的VH CDR相比，如本文所公开的多特异性抗体中的抗原结合部分可以包括单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可替代地或另外地，与作为亲本抗体的VL CDR相比，抗原结合部分可以包括单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在一些实施例中，如与对应亲本抗体的VH CDR相比，抗原结合部分可以包括单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可替代地或另外地，与作为亲本抗体的VL CDR相比，抗原结合部分可以包括单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
两个氨基酸序列的“同一性百分比”使用Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊》87:2264-68,1990的算法测定，所述算法如Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊》90:5873-77,1993所修改。此类算法并入Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)执行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在缺口的情况下，可以如Altschul等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25(17):3389-3402,1997中描述的带空位的BLAST(Gapped BLAST)。当利用BLAST程序和带空位的BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施例中，本文所公开的多特异性抗体可以是三价、四价、五价或六价，其包括B7H3和其它抗原(例如，CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28)的一个或两个结合位点。
B.多特异性抗体的示例性格式
本文所公开的任何多特异性抗体(例如，双特异性或三特异性抗体)可以是本领域已知的任何双特异性或者多特异性的抗体格式，例如BsIgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白或者BsAb缀合物。参见例如《分子免疫学(Mol.Immunol.)》67(2):95-106(2015)，三特异性IgG、三特异性Ab片段、三特异性融合蛋白或TsAb缀合物。参见例如《方法(Methods)》,第154卷,2019年2月1日,第3-9页。
(i)双特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的多特异性抗体是双特异性抗体，其包括对B7H3具有特异性的一个抗原结合部分和对CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28具有特异性的另一个抗原结合部分。这种双特异性抗体可以是本领域已知的任何格式。示例性双特异性抗体格式示出在图5A-5C、图6A-6D、图7A-7D和图8A-8B中，所有这些都在本公开的范围内。
在一些实例中，双特异性抗体中的一个抗原结合部分(例如，抗B7H3部分)是如本文所公开的多链抗体格式，并且另一个抗原结合部分(例如，对另一所关注抗原中的任一种具有特异性)可以是scFv格式。例如，多链抗体格式包括包含VL结构域和轻链恒定区的轻链，以及包含VH和重链恒定结构域或其片段(其任选地可以包括CH3结构域)的重链。
在其它实例中，双特异性抗体中的两个抗原结合部分可以是如本文所公开的多链抗体格式。例如，一个抗原结合部分(例如，抗B7H3部分)可以包括包含VL结构域和轻链恒定区的轻链，以及包含VH和重链恒定结构域或其片段(其任选地可以包括CH3结构域)的重链。另一抗原结合部分(例如，对另一抗原具有特异性)可以包括作为分离链(VH/VL形式)的VH片段和VL片段。
在一些情况下，本文所公开的双特异性抗体可以是2链格式：包括两种不同的多肽，其共同形成两个抗原结合部分。这种2链格式的双特异性抗体可以包括一种或两种多肽的多个拷贝，从而形成三价、四价、五价或六价抗体。参考例如图5A-5C。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体可以包括两个链：第一链为一个抗原结合部分的scFv片段与另一抗原结合部分的重链或轻链的融合蛋白，并且第二链为另一抗原结合部分的另一链。例如，双特异性抗体可以包括：第一链，所述第一链是与第一抗原(例如，CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28)结合的第一抗原结合部分的scFv片段和与第二抗原(例如，B7H3)结合的第二抗原结合部分的重链融合的融合蛋白；第二链，所述第二链是第二抗原结合部分的轻链。在任何融合链中，scFv片段和重链或轻链可以是任何次序。在一些情况下，scFv可以定位于N端处。在其它情况下，重链或轻链可以定位于N端处。
在一些实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VL片段和包括第二抗原结合部分的VH片段和Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)的重链；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的VL片段。在第一多肽中，VL片段可以定位于N端处，并且重链可以定位于C端处。可替代地，VL片段可以定位于第一多肽的C端处，并且重链可以定位于N端处。类似地，第二多肽可以在N端处具有VH片段，并且在C端处具有VL片段。可替代地，第二多肽可以在C端处具有VH片段，并且在N端处具有VL片段。
例如，双特异性抗体可以包括：(i)第一多肽，所述第一多肽包括与B7H3结合的第一抗原结合部分的VL片段和包括与CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28结合的第二抗体的VH片段和Fc片段的重链；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的VL片段。可替代地，双特异性抗体可以包括(i)第一多肽，所述第一多肽包括与CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28结合的第一抗原结合部分的VL片段和包括结合B7H3的第二抗体的VH片段和Fc片段的重链；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的VL片段。
在其它实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的重链(包括VH片段与Fc片段)，以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的VL片段和第二抗原结合部分的轻链(例如，包括轻链可变区和轻链恒定区)。在第一多肽中，第一抗原结合部分的VH片段可以定位于N端处。可替代地，其可以定位于C端处。在第二多肽中，第一抗原结合部分的VL片段可以定位于N端处。可替代地，其可以定位于C端处。在一些情况下，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分与CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28结合。在其它情况下，第一抗原结合部分与CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28结合，并且第二抗原结合部分结合B7H3。
在一些情况下，本文所公开的双特异性抗体可以是3链格式：包括三种不同的多肽，其共同形成两个抗原结合部分。这种3链格式的双特异性抗体可以包括多肽中的一种或多种的多个拷贝，从而形成三价、四价、五价或六价抗体。参考例如图6A-6D。
在一些实例中，本文所公开的双特异性抗体包括三种多肽。第一多肽包括与第二抗原结合部分(例如，与第二抗原，如CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28结合)的轻链融合的双特异性抗体中的第一抗原结合部分(例如，与B7H3结合)的重链。第二多肽和第三多肽分别包括第一抗原结合部分的轻链和第二抗原结合部分中的重链。在一些情况下，第二抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。可替代地，第一多肽包括第二抗原结合部分的重链(例如，与第二抗原，如CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28结合)，所述重链与第一抗原结合部分(例如，结合B7H3)的轻链融合。第二多肽和第三多肽分别包括第二抗原结合部分的轻链和第一抗原结合部分中的重链。在一些情况下，第一抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。在一些情况下，第一多肽中的轻链片段可以定位于N端处。可替代地，其可以定位于C端处。
在一些实施例中，本文所公开的任何双特异性抗体可以是IgG样格式(4链格式)：一个臂与人B7H3结合，并且另一臂与CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28结合。每个臂包括一个重链和一个轻链。在结构上，其由一半的抗B7H3抗体和一半的针对CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3或CD28的抗体制成，其中大小和形状与天然IgG的大小和形状类似。参考例如图7A-7D。
在一些实施例中，本文所公开的双特异性抗体可以包括分别与TCR恒定区融合的VH和VL抗体可变区。参见例如WO 2014014796A1，2014年1月23日；CN1561343A，2005年1月05日；PCT/CN2018/106766，2018年9月20日。参考例如图8A-8B。
(ii)三特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的多特异性抗体为三特异性抗体，其包括对B7H3具有特异性的一个抗原结合部分以及对选自CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3和CD28的两种不同抗原具有特异性的两个另外抗原结合部分。实例包含但不限于抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体、抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体、抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗、抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体、抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体和抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体。这种三特异性抗体可以是本领域已知的任何格式。示例性三特异性抗体格式示出在图9A-9D、图10A-10C、图11A-11E、图12A-12D和图13A-13C中，所有这些都在本公开的范围内。
在一些实例中，三特异性抗体中的一个抗原结合部分(例如，抗B7H3部分)是如本文所公开的多链抗体格式，并且另两个抗原结合部分(例如，对另两个所关注抗原具有特异性)可以是scFv格式、Fab格式和/或VH/VL格式。例如，多链抗体格式包括包含VL结构域和轻链恒定区的轻链，以及包含VH和重链恒定结构域或其片段(其任选地可以包括CH3结构域)的重链。
在其它实例中，三特异性抗体中的两个抗原结合部分可以是如本文所公开的多链抗体格式，并且另一抗原结合部分可以是scFv或VH/VL格式。例如，一个抗原结合部分(例如，抗B7H3部分)可以包括包含VL结构域和轻链恒定区的轻链，以及包含VH和重链恒定结构域或其片段(其任选地可以包括CH3结构域)的重链。另一抗原结合部分(例如，对另一抗原之一具有特异性)可以包括作为分离链(VH/VL形式)或呈scFv格式的VH片段和VL片段。第三抗原结合部分(例如，对其它所关注抗原具有特异性)可以呈Fab格式。
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)呈多链IgG样格式的第一抗原结合部分(包括包含第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含第一VL和轻链恒定区的轻链)；(ii)呈scFv形式的第二抗原结合部分；以及(iii)呈Fab格式的第三抗原结合部分。参考例如图9A至9D。在一些实例中，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分和第三抗原结合部分与两种其它所关注抗原(例如，CD3和CD137、GITR、OX40和CD28中的一种)结合。可以以任何合适的方式组装三个抗原结合部分以形成如本文所公开的三特异性抗体。一些非限制性实例提供于图9A至9D中。
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)呈多链IgG样格式的第一抗原结合部分(包括包含第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含第一VL和轻链恒定区的轻链)；(ii)呈scFv格式第二抗原结合部分；以及(iii)呈scFv格式的第三抗原结合部分。参考例如图10A至图10C。在一些实例中，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分和第三抗原结合部分与两种其它所关注抗原(例如，CD3和CD137、GITR、OX40和CD28中的一种)结合。可以以任何合适的方式组装三个抗原结合部分以形成如本文所公开的三特异性抗体。一些非限制性实例提供于图10A-10C。
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)呈多链IgG样格式的第一抗原结合部分(包括包含第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含第一VL和轻链恒定区的轻链)；(ii)呈scFv格式第二抗原结合部分；以及(iii)呈VH/VL格式的第三抗原结合部分。参考例如图11A至11C和11E和图12A。在一些实例中，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分和第三抗原结合部分与两种其它所关注抗原(例如，CD3和CD137、GITR、OX40和CD28中的一种)结合。可以以任何合适的方式组装三个抗原结合部分以形成如本文所公开的三特异性抗体。一些非限制性实例提供于图11A-11C和11E和图12A。
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)呈多链IgG样格式的第一抗原结合部分(包括包含第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含第一VL和轻链恒定区的轻链)；(ii)呈VH/VL格式第二抗原结合部分；以及(iii)呈VH/VL格式的第三抗原结合部分。参考例如图11D。在一些实例中，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分和第三抗原结合部分与两种其它所关注抗原(例如，CD3和CD137、GITR、OX40和CD28中的一种)结合。可以以任何合适的方式组装三个抗原结合部分以形成如本文所公开的三特异性抗体。一些非限制性实例提供于图11D。
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)呈多链IgG样格式的第一抗原结合部分(包括包含第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含第一VL和轻链恒定区的轻链)；(ii)呈Fab格式第二抗原结合部分；以及(iii)呈Fab格式的第三抗原结合部分。参考例如图12B。在一些实例中，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分和第三抗原结合部分与两种其它所关注抗原(例如，CD3和CD137、GITR、OX40和CD28中的一种)结合。可以以任何合适的方式组装三个抗原结合部分以形成如本文所公开的三特异性抗体。一些非限制性实例提供于图12B。
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)呈多链IgG样格式的第一抗原结合部分(包括包含第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含第一VL和轻链恒定区的轻链)；(ii)呈VH/VL格式第二抗原结合部分；以及(iii)呈Fab格式的第三抗原结合部分。参考例如图12D。在一些实例中，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分和第三抗原结合部分与两种其它所关注抗原(例如，CD3和CD137、GITR、OX40和CD28中的一种)结合。可以以任何合适的方式组装三个抗原结合部分以形成如本文所公开的三特异性抗体。一些非限制性实例提供于图12D。
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体可以包括：(i)呈多链IgG样格式的第一抗原结合部分(包括包含第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含第一VL和轻链恒定区的轻链)；(ii)呈scFv格式第二抗原结合部分；以及(iii)还呈scFv格式的第三抗原结合部分。参考例如图13A-13C。在一些实例中，第二抗原结合部分的scFv与第一抗原结合部分的重链融合(例如，与C端融合)，并且第三抗原结合部分的scFv与第一抗原结合部分的轻链融合(例如，与C端融合)。图13A。可替代地，第三抗原结合部分的scFv与第一抗原结合部分的重链融合(例如，与C端融合)，并且第二抗原结合部分的scFv与第一抗原结合部分的轻链融合(例如，与C端融合)。图13B。在另一实例中，第二抗原结合部分的scFv与第一抗原结合部分的一个重链融合(例如，与C端融合)，并且第三抗原结合部分的scFv与第一抗原结合部分的另一重链融合(例如，与C端融合)。图13C。
(iii)异二聚体形成
在一些实施例中，本文所公开的任何多特异性抗体(例如，双特异性或三特异性)是通过两个重链之间的二聚化形成的异二聚体。为了促进异二聚体组装，可以将增强异二聚体形成的突变引入到多特异性抗体中的两个重链的Fc区。实例包含“杵臼”(Ridgway等人,《蛋白质工程化(Protein Engineering)》,9(7),第617-21页(1996)；Merchant等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》,16(7),第677-681页(1998))、静电学(Gunasekaran等人,《生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)》,285(25),第19637-19646页(2010))或负态设计(Kreudenstein等人,《单克隆抗体(mAbs)》,5(5),第646-654(2013)；Leaver-Fay等人,《结构(Structure)》,24(4),第641-651页(2016))(带电突变)。其它实例可以在例如Brinkmann等人,《单克隆抗体》(2017),9(2):182-212中找到，相关公开出于本文所引用的主题和目的通过引用并入。
在一些实例中，通过以下，若干策略已被应用于设计正交接口以促进同源配对：交换CH1和CL的结构域，例如CrossMab格式(Schaefer等人,《美国国家科学院院刊》,108(27),第11187-11192页(2011))，引入替代性二硫键(Mazor等人,《单克隆抗体》,7(2),第377-389页(2015))，在CH1-CL区中进一步制造静电(Liu等人,《生物化学杂志》,290(12),第7535-7562页(2015))，并在可变和恒定结构域两者中引入突变(Lewis等人,《自然生物技术》,32(2),第191-198页(2014)，Dillon等人,《单克隆抗体》,9(2),第213-230页(2017))。还参见图7A-7D、9A-9D、12B-12D和13C。
在一些情况下，可以将降低与蛋白A结合亲和力的突变引入到多特异性抗体中的一个或两个重链Fc区中，以促进多特异性的纯化。此类突变在本领域中是已知的。参见例如Tustian等人,《单克隆抗体》8:828-838(2016)，其相关公开内容出于本文所引用的目的和主题通过引用并入本文。
(iv)肽接头
肽接头可以定位于如本文所公开的多特异性抗体中的两个片段之间，例如，scFv片段中的VH与VL部分之间，融合链中的scFv片段与重链或轻链之间，或融合多肽中的重链与轻链之间。示例性肽接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:665-670)的接头，其中n可以是1-6之间的整数，例如1、2、3、4、5或6。本文所描述的任何肽接头，例如SGGGS(SEQ ID NO:671)接头或(GGGGS)4(SEQ ID NO:668)接头可以包括天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包含丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(He)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然存在的氨基酸可以包含受保护的氨基酸，如用如乙酰基、甲酰基、甲苯磺酰基、硝基等基团保护的天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸的非限制性实例包含叠氮高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对溴代苯丙氨酸、对碘代苯丙氨酸、叠氮苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含有内部烯烃，如反式-巴豆基烯烃的氨基酸、丝氨酸烯丙基醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、乙烯基甘氨酸、吡咯赖氨酸、N-σ-邻叠氮苄氧基羰基-L-赖氨酸(AzZLys)、N-σ-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-2-叠氮乙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(BocLys)、N-σ-烯丙氧基羰基-L-赖氨酸(AlocLys)、N-σ-乙酰基-L-赖氨酸(AcLys)、N-σ-苄氧基羰基-L-赖氨酸(ZLys)、N-σ-环戊基氧基羰基-L-赖氨酸(CycLys)、N-σ-D-脯氨酰基-L-赖氨酸、N-σ-烟酰基-L-赖氨酸(NicLys)、N-σ-N-Me-邻氨基苯甲酰-L-赖氨酸(NmaLys)、N-σ-生物素-L-赖氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-甲基-L-赖氨酸、N-σ-二甲基-L-赖氨酸、N-σ-多甲基-L-赖氨酸、N-σ-异丙基-L-赖氨酸、N-σ-丹酰基-L-赖氨酸、N-σ-邻,对二硝基苯基-L-赖氨酸、N-σ-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2羧乙基-L-赖氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-赖氨酸、叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对溴代苯丙氨酸、对碘代苯丙氨酸、叠氮苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含有内部烯烃，如反式-巴豆基烯烃的氨基酸、丝氨酸烯丙基醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸和乙烯基甘氨酸。
C.示例性多特异性抗体
在一些实施例中，本公开提供与B7H3和CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3和CD28之一结合的双特异性抗体。另外，本文提供了与B7H3和CD40、CD137、GITR、OX40、CD47、CD3和CD28抗原中的两种结合的三特异性抗体。这种双特异性和三特异性抗体可以包括衍生自本文所提供的任何亲本抗体(例如，表1中列出的那些)的两个或更多个抗原结合部分。下文提供了非限制性实例。
(i)抗B7H3/CD40双特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的双特异性抗体中的第二抗原结合部分与B7H3和CD40，例如人B7H3和人CD40结合。任何能够与CD40结合的抗体都可以用于构建本文所公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的双特异性抗体的抗CD40部分可以衍生自本文所提供的抗CD40抗体(例如，上表1中提供的抗CD40亲本抗体)。抗CD40抗原结合部分可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗CD40抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD40双特异性抗体可以包括呈scFv格式的抗CD40部分和呈多链格式的抗B7H3部分。抗CD40 scFv片段可以衍生自本文所公开的任何抗CD40抗体，例如，上表1中提供的抗CD40亲本抗体、上表1提供的抗CD40亲本抗体。例如，双特异性抗体可以包括第一链和第二链，所述第一链包括与抗B7H3抗体的重链融合的scFv片段，所述重链例如是上表1中所示的B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链，并且所述第二链为抗B7H3抗体的轻链。可替代地，双特异性抗体可以包括第一链和第二链，所述第一链包括可以与抗B7H3抗体的轻链融合的scFv片段，所述轻链例如是上表1中所示的B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的轻链，并且所述第二链为抗B7H3抗体的重链。在一些情况下，抗B7H3抗体的重链可以包括突变的Fc区，所述突变的Fc区对Fc受体，如本文所描述的那些具有改变的结合亲和力和/或结合特异性。
在一些实施例中，本文所公开的抗B7H3/CD40双特异性抗体可以是如本文所公开的三链格式。这种双特异性抗体可以包括第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分(例如，与B7H3结合)的与第二抗原结合部分(例如，与CD40结合)的轻链融合的重链，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的轻链，所述第三多肽包括第二抗原结合部分的重链。在一些情况下，第二抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。可替代地，双特异性抗体可以包括第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包括第二抗原结合部分(例如，与CD40结合)的与第一抗原结合部分(例如，与B7H3结合)的轻链融合的重链，所述第二多肽包括第二抗原结合部分的轻链，所述第三多肽包括第一抗原结合部分的重链。在一些情况下，第一抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。在一些情况下，第一多肽中的轻链片段可以定位于N端处。可替代地，其可以定位于C端处。
在一些实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的重链；以及(ii)第二链，所述第二链包括第一抗原结合部分的VL片段和第二抗原结合部分的轻链。在一些情况下，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分与CD40结合。在其它情况下，第一抗原结合部分与CD40结合，并且第二抗原结合部分结合B7H3。
在其它实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VL片段和包括第二抗原结合部分的VH片段和Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)的重链；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的VL片段。在一些情况下，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分与CD40结合。在其它情况下，第一抗原结合部分与CD40结合，并且第二抗原结合部分结合B7H3。
在一些实施例中，本文所公开的任何双特异性抗体可以是IgG样格式(包括4链)：一个臂与人B7H3结合，并且另一臂与CD40结合。在结构上，其由一半的抗B7H3抗体和一半的抗CD40抗体制成，其中大小和形状与天然IgG的大小和形状类似。
在一些方面，本公开提供了一种多肽复合物，所述多肽复合物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N端到C端包括第一抗体的与第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)可操作地连接的第一重链可变结构域(VH)，所述第二多肽从N端到C端包括第一抗体的与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接的第一轻链可变结构域(VL)，其中C1和C2能够形成二聚体，所述二聚体包括C1与C2之间的至少一个非天然链间键，并且非天然链间键能够稳定所述二聚体，并且第一抗体具有第一抗原特异性。
在一些方面，本公开提供一种双特异性多肽复合物，所述双特异性多肽复合物包括与第二抗原结合部分相关联的第一抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N端到C端包括第一抗体的与第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)可操作地连接的第一重链可变结构域(VH)，所述第二多肽从N端到C端包括第一抗体的与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接的第一轻链可变结构域(VL)，其中C1和C2能够形成二聚体，所述二聚体包括C1中包括的第一突变残基与C2中包括的第二突变残基之间的至少一个非天然链间键，并且非天然链间键能够稳定二聚体，并且第一抗体具有第一抗原特异性，第二抗原结合部分具有不同于第一抗原特异性的第二抗原特异性，并且第一抗原结合部分和第二抗原结合部分比如果第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均是天然Fab的对应物的情况下更不容易错配。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD40双特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，抗B7H3/CD40双特异性抗体可以呈CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD40双特异性抗体在实例3和表3中提供，其也在本公开的范围内。
(ii)抗B7H3/CD137、抗B7H3/GITR和抗B7H3/OX40双特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的双特异性抗体与B7H3和第二抗原结合，所述第二抗原为CD137、GITR或OX40(例如，人B7H3、人CD137、GITR或OX40)。任何能够与B7H3、CD137、GITR或OX40结合的抗体都可以用于构建本文所公开的双特异性抗体，例如上表1中列出的亲本抗体。在一些实例中，本文所描述的双特异性抗体的抗CD137、抗GITR或抗OX40部分可以衍生自本文所提供的抗CD137、抗GITR或抗OX40抗体中的任何抗体(例如上表1中列出的对应亲本抗体)。抗CD137、抗GITR或抗OX40抗原结合部分可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗CD137、抗GITR或抗OX40抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD137、抗B7H3/GITR或抗B7H3/OX40双特异性抗体可以包括呈scFv格式的抗CD137、抗GITR或抗OX40部分和呈多链格式的抗B7H3部分。抗CD137、抗GITR或抗OX40 scFv片段可以衍生自本文所公开的任何抗CD137、抗GITR或抗OX40抗体，例如上表1中列出的对应亲本抗体。
例如，双特异性抗体可以包括第一链和第二链，所述第一链包括与抗B7H3抗体的重链融合的scFv片段，所述重链例如是B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链，并且所述第二链为抗B7H3抗体的轻链。可替代地，双特异性抗体可以包括第一链和第二链，所述第一链包括可以与抗B7H3抗体的轻链融合的scFv片段，所述轻链例如是B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的轻链，并且所述第二链为抗B7H3抗体的重链。在一些情况下，抗B7H3抗体的重链可以包括突变的Fc区，所述突变的Fc区对Fc受体，如本文所描述的那些具有改变的结合亲和力和/或结合特异性。
在一些实施例中，本文所公开的抗B7H3/CD137、抗B7H3/GITR或抗B7H3/OX40双特异性抗体可以是如本文所公开的三链格式。这种双特异性抗体可以包括第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分(例如，与B7H3结合)的与第二抗原结合部分(例如，与CD137、GITR或OX40结合)的轻链融合的重链，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的轻链，所述第三多肽包括第二抗原结合部分的重链。在一些情况下，第二抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。可替代地，双特异性抗体可以包括第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包括第二抗原结合部分(例如，与CD137、GITR或OX40结合)的与第一抗原结合部分(例如，与B7H3结合)的轻链融合的重链，所述第二多肽包括第二抗原结合部分的轻链，所述第三多肽包括第一抗原结合部分的重链。在一些情况下，第一抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。在一些情况下，第一多肽中的轻链片段可以定位于N端处。可替代地，其可以定位于C端处。
在一些实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的重链；以及(ii)第二链，所述第二链包括第一抗原结合部分的VL片段和第二抗原结合部分的轻链。在一些情况下，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分结合与CD137、GITR或OX40。在其它情况下，第一抗原结合部分结合与CD137、GITR或OX40，并且第二抗原结合部分结合B7H3。
在其它实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VL片段和包括第二抗原结合部分的VH片段和Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)的重链；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的VL片段。在一些情况下，第一抗原结合部分结合B7H3，并且第二抗原结合部分结合与CD137、GITR或OX40。在其它情况下，第一抗原结合部分结合与CD137、GITR或OX40，并且第二抗原结合部分结合B7H3。
在一些实施例中，本文所公开的任何双特异性抗体可以是IgG样格式(4链格式)：一个臂与人B7H3结合，并且另一臂与CD137、GITR或OX40结合。在结构上，其由一半的抗B7H3抗体和一半的抗CD137、抗GITR或抗OX40抗体制成，其中大小和形状与天然IgG的大小和形状类似。
在一些方面，本公开提供了一种多肽复合物，所述多肽复合物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N端到C端包括第一抗体的与第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)可操作地连接的第一重链可变结构域(VH)，所述第二多肽从N端到C端包括第一抗体的与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接的第一轻链可变结构域(VL)，其中C1和C2能够形成二聚体，所述二聚体包括C1与C2之间的至少一个非天然链间键，并且非天然链间键能够稳定所述二聚体，并且第一抗体具有第一抗原特异性。
在一些方面，本公开提供一种双特异性多肽复合物，所述双特异性多肽复合物包括与第二抗原结合部分相关联的第一抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N端到C端包括第一抗体的与第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)可操作地连接的第一重链可变结构域(VH)，所述第二多肽从N端到C端包括第一抗体的与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接的第一轻链可变结构域(VL)，其中C1和C2能够形成二聚体，所述二聚体包括C1中包括的第一突变残基与C2中包括的第二突变残基之间的至少一个非天然链间键，并且非天然链间键能够稳定二聚体，并且第一抗体具有第一抗原特异性，第二抗原结合部分具有不同于第一抗原特异性的第二抗原特异性，并且第一抗原结合部分和第二抗原结合部分比如果第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均是天然Fab的对应物的情况下更不容易错配。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD40双特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，如本文还公开的，抗B7H3/CD40双特异性抗体可以呈CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD137、抗B7H3/GITR或抗B7H3/OX40双特异性抗体在下文的实例4-6和表4-6中提供，其也在本公开的范围内。
(iii)抗B7H3/CD47双特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的双特异性抗体与B7H3和CD47结合，例如人B7H3和人CD47。任何能够与B7H3和CD47结合的抗体都可以用于构建本文所公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的双特异性抗体的抗CD47部分可以衍生自本文所提供的抗CD47抗体中的任一种(例如，上表1中列出的对应亲本抗体)。抗CD47抗原结合部分可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗CD47抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD47双特异性抗体可以包括呈scFv格式的抗CD47部分和呈多链格式的抗B7H3部分。抗CD47 scFv片段可以衍生自本文所公开的任何抗CD47抗体，例如上表1中列出的对应亲本抗体。
例如，双特异性抗体可以包括第一链和第二链，所述第一链包括与抗B7H3抗体的重链融合的scFv片段，所述重链例如是Ly1562的重链，并且所述第二链为抗B7H3抗体的轻链。可替代地，双特异性抗体可以包括第一链和第二链，所述第一链包括可以与抗B7H3抗体的轻链融合的scFv片段，所述轻链例如是B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的轻链，并且所述第二链为抗B7H3抗体的重链。在一些情况下，抗B7H3抗体的重链可以包括突变的Fc区，所述突变的Fc区对Fc受体，如本文所描述的那些具有改变的结合亲和力和/或结合特异性。
在一些实施例中，本文所公开的抗B7H3/CD47双特异性抗体可以是如本文所公开的三链格式。这种双特异性抗体可以包括第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分(例如，与B7H3结合)的与第二抗原结合部分(例如，与CD47结合)的轻链融合的重链，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的轻链，所述第三多肽包括第二抗原结合部分的重链。在一些情况下，第二抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。可替代地，双特异性抗体可以包括第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包括第二抗原结合部分(例如，与CD47结合)的与第一抗原结合部分(例如，与B7H3结合)的轻链融合的重链，所述第二多肽包括第二抗原结合部分的轻链，所述第三多肽包括第一抗原结合部分的重链。在一些情况下，第一抗原结合部分的重链可以包括VH片段和重链恒定区，如CH1。在一些情况下，第一多肽中的轻链片段可以定位于N端处。可替代地，其可以定位于C端处。
在一些实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的重链；以及(ii)第二链，所述第二链包括第一抗原结合部分的VL片段和第二抗原结合部分的轻链。在一些情况下，第一抗原结合部分与B7H3结合，并且第二抗原结合部分结合CD47。在其它情况下，第一抗原结合部分结合CD47，并且第二抗原结合部分与B7H3结合。
在其它实例中，双特异性抗体可以包括两个链：(i)第一多肽，所述第一多肽包括第一抗原结合部分的VL片段和包括第二抗原结合部分的VH片段和Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)的重链；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第一抗原结合部分的VH片段和第二抗原结合部分的VL片段。在一些情况下，第一抗原结合部分与B7H3结合，并且第二抗原结合部分结合CD47。在其它情况下，第一抗原结合部分结合CD47，并且第二抗原结合部分与B7H3结合。
在一些实施例中，本文所公开的任何双特异性抗体可以是IgG样格式：一个臂与人B7H3结合，并且另一臂与CD47结合。在结构上，其由一半的抗B7H3抗体和一半的抗CD47抗体制成，其中大小和形状与天然IgG的大小和形状类似。
在一些方面，本公开提供了一种多肽复合物，所述多肽复合物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N端到C端包括第一抗体的与第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)可操作地连接的第一重链可变结构域(VH)，所述第二多肽从N端到C端包括第一抗体的与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接的第一轻链可变结构域(VL)，其中C1和C2能够形成二聚体，所述二聚体包括C1与C2之间的至少一个非天然链间键，并且非天然链间键能够稳定所述二聚体，并且第一抗体具有第一抗原特异性。
在一些方面，本公开提供一种双特异性多肽复合物，所述双特异性多肽复合物包括与第二抗原结合部分相关联的第一抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N端到C端包括第一抗体的与第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)可操作地连接的第一重链可变结构域(VH)，所述第二多肽从N端到C端包括第一抗体的与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接的第一轻链可变结构域(VL)，其中C1和C2能够形成二聚体，所述二聚体包括C1中包括的第一突变残基与C2中包括的第二突变残基之间的至少一个非天然链间键，并且非天然链间键能够稳定二聚体，并且第一抗体具有第一抗原特异性，第二抗原结合部分具有不同于第一抗原特异性的第二抗原特异性，并且第一抗原结合部分和第二抗原结合部分比如果第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均是天然Fab的对应物的情况下更不容易错配。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD47双特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，如本文还公开的，抗B7H3/CD47双特异性抗体可以呈CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD47双特异性抗体在下文的实例5和表5中提供，其也在本公开的范围内。
(iv)抗B7H3/CD3双特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的双特异性抗体与B7H4和CD3，例如人B7H4和人CD3结合。任何能够与CD3结合的抗体都可以用于构建本文所公开的双特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的双特异性抗体的抗CD3部分可以衍生自本文所提供的抗CD3抗体中的任一种(例如，上表1中列出的对应亲本抗体)。抗CD3抗原结合部分可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，双特异性抗体中的抗CD3抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，双特异性抗体中的抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD3双特异性抗体可以包括呈VH和VL片段格式的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。抗CD3 VH和VL片段可以衍生自本文所公开的任何抗CD3抗体，例如上表1中列出的对应亲本抗体中的每一个。
例如，双特异性抗体可以包括第一链、第二链、第三链和第四链，所述第一链包括抗B7H3 HC的Fab片段和抗CD3 VH以及抗CD3 LC的CH1和Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第二链是抗B7H3抗体的轻链；所述第三链是与抗CD3 HC的CH1融合的抗CD3 VL；所述第四链作为抗B7H3抗体的重链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD3双特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，如本文还公开的，抗B7H3/CD3双特异性抗体可以呈CrossMab格式
示例性抗B7H3/CD3双特异性抗体在实例8和表8中提供，其也在本公开的范围内。
(v)抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体与B7H3、CD3和CD137，例如人B7H3、人CD3和人CD137结合。任何能够与B7H3、CD3和CD137结合的抗体都可以用于构建本文所公开的三特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的三特异性抗体的抗B7H3部分、抗CD3部分和抗CD137部分可以衍生自上表1中提供的抗B7H3、抗CD3和抗CD137亲本抗体中的任一种。抗B7H3、抗CD3和抗CD137抗原结合部分可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，三特异性抗体中的抗B7H3、抗CD3和抗CD137抗原结合部分可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，三特异性抗体中的抗原结合部分中的一个或多个可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体可以是包括呈scFv格式的抗CD137部分以及呈VH/VL和/或Fab格式的抗B7H3部分和抗CD3的多链复合物。例如，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链包括与抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链融合的抗CD137 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC和抗CD3 VH的Fab片段和抗CD3 LC的CH1片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)和抗CD137 scFv片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链；所述第四链是具有抗CD3HC的CH1片段的抗CD3 VL。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体可以包括呈融合的VH和VL(scFv)格式的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链、第三链，所述第一链包括与抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链融合的抗CD137 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC的Fab片段和抗CD3 scFv片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链是抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体可以包括呈融合的VH和VL(片段)格式的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。抗CD3融合VH和VL片段可以衍生自本文所公开的任何抗CD3抗体，例如上表1中提供的任一种。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗CD137 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体可以包括呈融合的VH和VL片段格式(scFv)的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链包括抗B7H3抗体的轻链的抗CD137 scFv片段。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体可以呈CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体在下文的实例9和表9中提供，其也在本公开的范围内。
(vi)抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体与B7H3、CD3和CD28，例如人B7H3、人CD3和人人CD28结合。任何能够与B7H3、CD3和CD28结合的抗体都可以用于构建本文所公开的三特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的三特异性抗体的抗B7H3部分、抗CD3部分和抗CD28部分可以衍生自上表1中提供的对应亲本抗B7H3、抗CD3和抗CD28抗体中的任一种。例如，抗B7H3、抗CD3和抗CD28抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR，例如，上表1中列出的那些。可替代地，所述一个或多个抗原结合部分可以包括与对应亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，三特异性抗体中的抗B7H3、抗CD3和抗CD28抗原结合部分中的一个或多个可以具有与对应亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，三特异性抗体中的抗原结合部分可以具有与对应亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体可以包括呈多链格式(IgG样)的抗B7H3结合部分、呈Fab格式的抗CD3结合部分和呈scFv格式的抗CD28结合部分。在一些情况下，抗CD28 scFv可以与抗B7H3结合部分的重链(一个或两个)融合。可替代地或另外地，抗CD3 Fab的一个链可以与抗B7H3结合部分的一个重链融合(例如，定位于恒定区，例如，在CH1与CH2区之间)。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体可以包括呈多链格式(IgG样)的抗B7H3结合部分、呈scFv格式的抗CD3结合部分和还呈scFv格式的抗CD28结合部分。在一些情况下，抗CD28 scFv可以与抗B7H3结合部分的重链(一个或两个)融合。可替代地或另外地，抗CD3 scFv o可以与抗B7H3结合部分的一个重链融合(例如，定位于恒定区，例如，在CH1与CH2区之间)。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体可以包括呈多链格式(IgG样)的抗B7H3结合部分、呈VH/VL格式的抗CD3结合部分和呈scFv格式的抗CD28结合部分。在一些情况下，抗CD28 scFv可以与抗B7H3结合部分的重链(一个或两个)融合。在其它情况下，抗CD28scFv可以与抗B7H3结合部分的轻链(一个或两个)融合。可替代地或另外地，抗CD3部分的VH和VL中的每一个可以与抗B7H3结合部分的重链之一融合(例如，定位于恒定区，例如，在CH1与CH2区之间)。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体可以包括呈多链格式(IgG样)的抗B7H3结合部分、呈VH/VL格式的抗CD3结合部分和还呈VH/VL格式的抗CD28结合部分。在一些情况下，抗CD28结合部分的VH和VL中的每一个可以与抗B7H3结合部分的重链之一融合(例如，定位于C端处)。可替代地或另外地，抗CD3部分的VH和VL中的每一个还可以与抗B7H3结合部分的重链之一融合(例如，定位于恒定区，例如，在CH1与CH2区之间)。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体可以呈CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体在实例10和表10中提供，其也在本公开的范围内。
(vii)抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体与B7H3、CD3和OX40，例如人B7H3、人CD3和人人OX40结合。任何能够与B7H3、CD3和OX40结合的抗体都可以用于构建本文所公开的三特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的三特异性抗体的抗B7H3部分、抗CD3部分和抗OX40部分可以衍生自上表1中提供的对应亲本抗B7H3、抗CD3和抗OX40抗体中的任一种。例如，抗B7H3、抗CD3和抗OX40抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR，例如，上表1中列出的那些。可替代地，所述一个或多个抗原结合部分可以包括与对应亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，三特异性抗体中的抗B7H3、抗CD3和抗OX40抗原结合部分中的一个或多个可以具有与对应亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，三特异性抗体中的抗原结合部分可以具有与对应亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体可以是包括呈scFv格式的抗OX40部分以及呈VH/VL和/或Fab片段格式的抗B7H3部分和抗CD3的多链分子。例如，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链包括与亲本抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链融合的抗OX40 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC和抗CD3 VH的Fab片段和抗CD3 LC的CH1片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)和抗OX40 scFv片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链；所述第四链是具有抗CD3 HC的CH1片段的抗CD3 VL。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在另一实例中，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链包括与亲本抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链融合的抗OX40scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC和抗CD3 VH的Fab片段和抗CD3 LC的CH1片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链；所述第四链是具有抗CD3 HC的CH1片段的抗CD3 VL。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在又另一实例中，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链包括与抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链融合的抗OX40 VH片段；所述第二链包括抗B7H3 HC和抗CD3 VH的Fab片段和抗CD3 LC的CH1片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)和抗OX40 VL片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链；所述第四链是具有抗CD3 HC的CH1片段的抗CD3 VL。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体可以包括呈融合的VH和VL片段格式(scFv)的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链、第三链，所述第一链包括与亲本抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链融合的抗OX40 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC的Fab片段和抗CD3 scFv片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链是抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在另一实例中，三特异性抗体可以包括第一链、第二链、第三链，所述第一链包括与亲本抗B7H3抗体的重链融合的抗OX40 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC的Fab片段和抗CD3 scFv片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗OX40 scFv片段；所述第三链是抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在又另一实例中，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗OX40 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗OX40 scFv片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗OX40 scFv片段；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
可替代地，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗OX40 scFv片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
另外，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗OX40 VH片段；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗OX40 VL片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
此外，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链包括抗B7H3抗体的轻链的抗OX40 scFv片段。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
进一步地，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3和抗OX40 scFv片段的重链；所述第二链包括抗B7H3和抗CD3 scFv片段的重链；所述第三链是抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在另一实例中，三特异性抗体可以包括第一链、第二链、第三链和第四链，所述第一链是抗B7H3抗体的重链；所述第二链包括抗OX40部分的VH片段和抗CD3 LC的抗CD3 VH和CH1以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链包括抗B7H3和抗CD3 VL的轻链以及抗CD3 HC的CH1；所述第四链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体可以呈CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体在实例11和表11中提供，其也在本公开的范围内。
(viii)抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体与B7H3、CD3和GITR，例如人B7H3、人CD3和GITR结合。任何能够与B7H3、CD3和GITR结合的抗体都可以用于构建本文所公开的三特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的三特异性抗体的抗B7H3部分、抗CD3部分和抗GITR部分可以衍生自上表1中提供的抗CD3和抗GITR亲本抗体中的任一种。抗B7H3、抗CD3和抗GITR抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，三特异性抗体中的抗B7H3、抗CD3和抗GITR抗原结合部分中的一个或多个可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，三特异性抗体中的抗原结合部分中的一个或多个可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以是包括呈scFv格式的抗GITR部分以及呈VH/VL和/或Fab格式的抗B7H3部分和抗CD3的多链分子。例如，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链包括与抗B7H3抗体的重链，如B7H3Ab1或B7H3 Ab2的重链融合的抗GITR scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC和抗CD3 VH的Fab片段和抗CD3 LC的CH1片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)和抗GITR scFv片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链；所述第四链是具有抗CD3 HC的CH1片段的抗CD3 VL。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以是包括呈scFv格式的抗GITR部分以及呈VH/VL和/或Fab片段格式的抗B7H3部分和抗CD3的多链分子。例如，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链是抗B7H3亲本抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2；所述第二链包括抗B7H3 HC和抗CD3 VH的Fab片段和抗CD3 LC的CH1片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)和抗GITR scFv片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链；所述第四链是具有抗CD3HC的CH1片段的抗CD3 VL。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以是包括呈scFv格式的抗GITR部分以及呈VH/VL和/或Fab格式的抗B7H3部分和抗CD3的多链分子。例如，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链包括与抗B7H3亲本抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2融合的抗GITR VH片段；所述第二链包括抗B7H3HC和抗CD3 VH的Fab片段和抗CD3 LC的CH1片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)和抗GITR VL片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链；所述第四链是具有抗CD3 HC的CH1片段的抗CD3VL。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以包括呈融合的VH和VL片段格式(scFv)的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。例如，三特异性抗体可以包括第一链和第二链和第三链和第四链，所述第一链包括与亲本抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3Ab2融合的抗GITR scFv片段；所述第二链包括抗B7H3 HC的Fab片段和抗CD3 scFv片段和Fc片段(例如，整个Fc片段或其部分，如CH2-CH3)；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以是包括呈融合的VH和VL片段格式(scFv)的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分的多链分子。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链、第三链，所述第一链是亲本抗B7H3抗体的重链，如B7H3 Ab1或B7H3 Ab2；所述第二链包括抗B7H3 HC的Fab片段和抗CD3 scFv片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗GITR scFv片段；第三链是抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以包括呈融合的VH和VL(片段)格式的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗GITR scFv片段；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)和抗GITR scFv片段；所述第三链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以是包括呈融合的VH和VL片段格式(scFv)的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分的多链分子。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链和第三链，所述第一链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VH片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第二链包括抗B7H3部分的VH片段和抗CD3 VL片段以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链包括抗B7H3抗体的轻链的抗GITR scFv片段。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以包括呈融合的VH和VL(片段)格式的抗CD3部分和呈多链格式的抗B7H3部分。例如，三特异性抗体可以包括第一链、第二链、第三链和第四链，所述第一链包括抗B7H3抗体的重链；所述第二链包括抗GITR部分的VH片段和抗CD3 LC的抗CD3 VH和CH1以及Fc片段(例如，整个Fc片段或其一部分，如CH2-CH3)；所述第三链包括抗B7H3和抗CD3 VL的轻链以及抗CD3 HC的CH1；所述第四链作为抗B7H3抗体的轻链。两个Fc片段具有工程化CH3结构域，以在一个结构域中产生“杵”，并且在另一个结构域中产生“臼”，以促进异二聚化。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，三特异性抗体中的任何抗原结合部分可以是CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD3/GITR双特异性抗体在下文的实例12和表12中提供，其也在本公开的范围内。
(ix)抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体与B7H3、CD137和GITR，例如人B7H3、人CD137和人GITR结合。任何能够与B7H3、CD137和GITR结合的抗体都可以用于构建本文所公开的三特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的三特异性抗体的抗B7H3部分、抗CD137部分和抗GITR部分可以衍生自上表1中提供的抗CD137和抗GITR亲本抗体中的任一种。抗B7H3、抗CD137和抗GITR抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，三特异性抗体中的抗B7H3、抗CD137和抗GITR抗原结合部分中的一个或多个可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，三特异性抗体中的抗原结合部分中的一个或多个可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体可以包括呈多链格式(IgG样)的抗B7H3结合部分、呈scFv格式的抗CD137结合部分和呈scFv格式的抗GITR结合部分。抗CD137 scFv可以与抗B7H3结合部分的轻链融合，并且抗GITR scFv可以与抗B7H3结合部分的重链融合。可替代地，抗CD137 scFv可以与抗B7H3结合部分的重链融合，并且抗GITRscFv可以与抗B7H3结合部分的轻链融合。在另一实例中，抗CD137scFv可以与抗B7H3结合部分的一个重链融合，并且抗GITR scFv可以与抗B7H3结合部分的另一重链融合。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，三特异性抗体中的任何抗原结合部分可以是CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体在下文的实例13和表13中提供，其也在本公开的范围内。
(xi)抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体
在一些实施例中，本文所公开的三特异性抗体与B7H3、CD137和OX40，例如人B7H3、人CD137和人人OX40结合。任何能够与B7H3、CD137和OX40结合的抗体都可以用于构建本文所公开的三特异性抗体。在一些实例中，本文所描述的三特异性抗体的抗B7H3部分、抗CD137部分和抗OX40可以衍生自上表1中提供的抗CD137和抗OX40亲本抗体中的任一种。抗B7H3、抗CD137和抗OX40抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体中的那些相同的重链和/或轻链CDR。可替代地，抗原结合部分中的一个或多个可以包括与亲本抗体的那些基本上类似的重链和/或轻链CDR(例如，与亲本抗体相比，包括不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基变异)。在一些情况下，三特异性抗体中的抗B7H3、抗CD137和抗OX40抗原结合部分中的一个或多个可以具有与亲本抗体相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。例如，三特异性抗体中的抗原结合部分中的一个或多个可以具有与亲本抗体相同的重链和/或相同的轻链。
在一些实例中，抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体可以包括呈多链格式(IgG样)的抗B7H3结合部分、呈scFv格式的抗CD137结合部分和呈scFv格式的抗OX40结合部分。抗CD137 scFv可以与抗B7H3结合部分的轻链融合，并且抗OX40 scFv可以与抗B7H3结合部分的重链融合。可替代地，抗CD137 scFv可以与抗B7H3结合部分的重链融合，并且抗OX40scFv可以与抗B7H3结合部分的轻链融合。在另一实例中，抗CD137 scFv可以与抗B7H3结合部分的一个重链融合，并且抗OX40 scFv可以与抗B7H3结合部分的另一重链融合。
在一些实例中，任何抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体可以包括用于增强异二聚化和/或减少蛋白A结合的突变，如本文所公开的那些。可替代地或另外地，三特异性抗体中的任何抗原结合部分可以是CrossMab格式。
示例性抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体在下文的实例14和表14中提供，其也在本公开的范围内。
III.用于抗体制备的方法
可以通过本领域已知的任何方法来制备如本文所描述的任何抗体，包含双特异性抗体。参见例如，Harlow和Lane,(1998),《抗体：实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual)》,纽约的冷泉港实验室。可以经由常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生F(ab')2片段、以及可以通过减少F(ab')2片段的二硫桥键生成的Fab片段。
可以通过例如常规重组技术来产生如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体等基因工程化抗体。在一个实例中，使用常规程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当这种DNA的优选来源。一经分离，可以将DNA放置于一个或多个表达载体中，然后将所述表达载体转染到如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其它方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞等宿主细胞中，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。参见例如，PCT公开第WO 87/04462号。然后可以通过以下对DNA进行修饰：例如，通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域来代替同源性鼠类序列(Morrison等人,(1984)《美国国家科学院院刊》81:6851，或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价与免疫球蛋白编码序列连接。以所述方式，可以制备具有靶抗原的结合特异性的经基因工程化的抗体，如“嵌合”抗体或“杂合”抗体。
为生产“嵌合抗体”而开发的技术是本领域所熟知的。参见例如Tsilingiri等人,(1984)《美国国家科学院院刊》81,6851；Neuberger等人,(1984)《自然》312,604；以及Takeda等人(1984)《自然》314:452。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见例如Queen等人,《美国国家科学院院刊》86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的VH和VL可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对形成正确CDR结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH链和人VL链。然后选择人VH受体基因和人VL受体基因。
可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代所选人受体基因内的CDR区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与CDR区相互作用时具有重要性的残基(参见以上描述)来取代人受体基因中的对应残基。
可以通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来通过重组技术制备单链抗体。优选地，在两个可变区之间并入柔性连接子。可替代地，所描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号和第4,704,692号)可以适用于产生噬菌体或酵母scFv文库并且可以按照常规程序从所述文库中鉴定对如本文所公开的靶抗原具有特异性的scFv克隆体。
在一些实例中，任何抗体，包含如本文所公开的双特异性抗体都可以通过重组技术制备，如下所例示。
可以将对如本文所描述的编码抗体的重链和轻链的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与适合的启动子可操作地连接。在一个实例中，编码重链和轻链的核苷酸序列中的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。可替代地，编码重链和轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链两者均从同一启动子表达。在必要时，可以在重链与轻链编码序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实例中，将编码抗体的所述两个链的核苷酸序列克隆到两个载体中，所述载体可以被引入到相同或不同的细胞中。当在不同的细胞中表达这两个链时，其中的每个链均可以从表达这种链的宿主细胞中分离，并且分离的重链和轻链可以混合并在允许形成抗体的合适条件下温育。
通常，可以使用本领域已知的方法将编码抗体的一个或所有链的核酸序列克隆到合适的表达载体中、与合适的启动子可操作地连接。例如，可以在合适条件下使核苷酸序列和载体与限制酶相接触，以在每个分子上产生可以彼此配对并且用连接酶连接在一起的互补端。可替代地，可以将合成核酸连接子与基因的末端连接。这些合成连接子含有对应于载体中的特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将会取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
可以使用各种启动子来表达本文所描述的抗体，所述启动子包含但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR等病毒LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌(E.coli)lac UV5启动子和单纯性疱疹tk病毒启动子。
还可以使用可调控的启动子。这些可调控的启动子包含使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调控的那些启动子\[Brown,M.等人,《细胞(Cell)》,49:603-612(1987)]、使用四环素阻遏物(tetR)的那些启动子(Gossen,M.和Bujard,H.,《美国国家科学院院刊》89:5547-5551(1992)；Yao,F.等人,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》,9:1939-1950(1998)；Shockelt,P.等人,《美国国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995))。其它系统包含FK506二聚体、使用雄二醇(astradiol)的VP16或p65、RU486、二元酚murislerone(diphenol murislerone)或雷帕霉素(rapamycin)。诱导型系统可从英杰公司(Invitrogen)、克隆技术公司(Clontech)和阿瑞雅德公司(Ariad)获得。
可以使用包含具有操纵子的阻遏物的可调控启动子。在一个实施例中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以用作转录调制剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调控(M.Brown等人,《细胞》,49:603-612(1987)；Gossen和Bujard(1992)；M.Gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992))，所述携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP 16)组合，以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，携带有tetO的哺乳动物启动子源自人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子以用于产生tetR-tet操纵基因系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施例中，使用四环素诱导型开关。单独的四环素抑制子(tetR)，而不是tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物，可以充当强效反式调节剂以在四环素操纵子适当地位于CMVIE启动子的TATA元件的下游时调控哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等人,《人类基因疗法》,10(16):1392-1399(2003))。这个四环素诱导型开关的一个特别的优点是其不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白来实现其可调节作用，在一些情况下，所述四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白可能对细胞有毒(Gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992)；Shockett等人,《美国国家国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995))，以达到其可调控的效果。
另外，载体可以含有例如，以下中的一些或全部：可选择标志物基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的附加型复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)；通用多克隆位点；以及用于正义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于产生含有转基因的载体的合适的载体和方法是本领域熟知并且可获得的。
可用于实践本文所描述的方法的聚腺苷酸化信号的实例包含但不限于人胶原蛋白I聚腺苷酸化信号、人胶原蛋白II聚腺苷酸化信号和SV40聚腺苷酸化信号。
可以将包括编码任何抗体的核酸的一个或多个载体(例如表达载体)引入到适合于产生抗体的宿主细胞中。可以在合适的条件下培养宿主细胞以用于表达抗体或其任何多肽链。可以通过常规方法，例如亲和力纯化通过培养的细胞(例如，来自细胞或培养上清液)来回收这种抗体或其多肽链。如果有必要，可以在合适的条件下在允许产生抗体的合适时间段内温育抗体的多肽链。
在一些实施例中，用于制备也如本文所描述的抗体的方法涉及编码还如本文所描述的抗体(包含双特异性抗体)的重链和轻链的重组表达载体。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将重组表达载体引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可以选择并在允许表达形成抗体的两个多肽链的合适条件下培养阳性转化体宿主细胞，这两个多肽链可以从细胞或从培养基中回收。在必要时，可以在允许形成抗体的合适条件下培育从宿主细胞中回收的所述两个链。
在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种编码抗体的第一链(例如，重链)，并且另一种编码抗体的第二链(例如，轻链)。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将这两种重组表达载体都引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可替代地，可以将表达载体中的每种表达载体均引入到合适的宿主细胞中。可以选择并在允许表达抗体的多肽链的合适条件下培养阳性转化体。在将两种表达载体引入到相同的宿主细胞中时，可以从宿主细胞或从培养基中回收其中产生的抗体。如果有必要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，并且然后在允许形成抗体的合适条件下温育多肽链。当将所述两种表达载体引入到不同的宿主细胞中时，所述两种表达载体中的每种表达载体可以从对应的宿主细胞或从对应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下温育所述两个多肽链以用于形成抗体。
使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。例如，可以用蛋白A或蛋白G偶联基质通过亲和色谱法来分离一些抗体。
编码如本文所描述的抗体的第一链(例如，重链)、第二链(例如，轻链)或两者的任何核酸，含有此类核酸的载体(例如，表达载体)；以及包括载体的宿主细胞都在本公开的范围内。
IV.药物组合物
如本文所描述的，任何抗体，包含本文所公开的双特异性抗体以及编码核酸或核酸组、包括所述核酸的载体或包括所述载体的宿主细胞可以与药学上可接受的载剂(赋形剂)混合，以形成用于治疗靶疾病的药物组合物。“可接受的”意指载剂必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载剂)包含缓冲液，所述缓冲液是本领域熟知的。参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》第20版,(2000),利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins),K.E.Hoover编辑。
用于本发明方法的药物组合物可以包括冻干调配物或水溶液形式的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。(《雷明顿：药学科学与实践》第20版,(2000),利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司,K.E.Hoover编辑)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯銨；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3'-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中，本文所描述的药物组合物包括含有抗体(或编码核酸)的脂质体，所述抗体可以通过本领域已知的方法制备，例如在Epstein等人,《美国国家科学院院刊》82:3688(1985)；Hwang等人,《美国国家科学院院刊》77:4030(1980)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号中所描述的。具有增强的循环时间的脂质体公开于例如美国专利第5,013,556号中。特别有用的脂质体可以用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法产生。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。
还可以将抗体或一种或多种编码核酸包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中、或粗乳液中。这些技术是本领域已知的，参见例如，《雷明顿：药学科学与实践》第20版,马克出版公司(Mack Publishing)(2000)。
在其它实例中，本文所描述的药物组合物可以被调配成缓释格式。持续释放制剂的合适的实例包含含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，乙酸异丁酸蔗糖酯和聚D-(-)-3-羟丁酸。
要用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将治疗性抗体组合物放置在具有无菌进口端的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
本文所描述的药物组合物可以采用单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液或栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠施用或者通过吸入或吹入施用。
为了制备如片剂等固体组合物，可以将主要活性成分与药物载剂例如常规压片成分(如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和如水等其它药物稀释剂混合，以形成含有本发明的化合物的均相混合物固体预调配组合物或其药学上可接受的无毒盐。在称这些预调配组合物均相时，这意味着活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这个固体预调配组合物细分成上述类型的单位剂型，所述单位剂型含有0.1至约500mg本发明的活性成分。可以包覆或以其它方式配混新组合物的片剂或丸剂以提供给出延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量组分和外剂量组分，后者在前者之上采用包膜的形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并且允许内组分完整地传递进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可以用于这种肠溶层或包衣，这种材料包含多种聚合酸以及聚合酸与如虫胶、十六醇和乙酸纤维素等此类材料的混合物。
合适的表面活性剂具体地包含非离子剂，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括0.05与5％之间的表面活性剂，并且可以介于0.1与2.5％之间。应当了解，如果必要的话，可以加入其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒剂。
可以使用如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM等可商购获得的脂肪乳剂来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂(egg phospholipid)、大豆磷脂或大豆卵磷脂(soybeanlecithin))和水混合形成的乳剂中。应当理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常含有至多20％的油，例如，介于5与20％之间。脂肪乳剂可以包括介于0.1与1.0μm之间、具体地0.1与0.5μm之间的脂肪滴，并且pH范围为5.5到8.0。
乳剂组合物可以是通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些乳剂组合物。
用于吸入或吹入的药物组合物包含药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上文所列出的适合的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，这些组合物通过口服或鼻腔呼吸途径施用以产生局部或全身作用。
可以通过使用气体来雾化优选地无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附着到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机。可以从以适当方式递送调配物的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、悬浮液或粉末组合物。
V.治疗应用
抗B7H3/CD40双特异性抗体、抗B7H3/CD137双特异性抗体、抗B7H3/GITR双特异性抗体、抗B7H3/CD40双特异性抗体、抗B7H3/OX40双特异性抗体中的任一种，以及本文所公开的任何抗GITR抗体可以用于临床环境(例如，治疗或诊断)或非临床环境(例如，用于研究目的)。
在一些方面，本文提供了使用本文所公开的任何抗体来调控免疫应答或治疗需要治疗的受试者中的靶向疾病的方法。为了实践本文所公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如，人)施用有效量的本文所描述的药物组合物，所述合适的途径如静脉内施用(例如，如推注或通过一段时间内的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。包含喷射雾化器和超声雾化器的用于液体调配物的可商购获得的雾化器可用于施用。液体调配物可以直接雾化并且冻干粉可以在重构之后雾化。可替代地，本文所描述的抗体可以使用碳氟化合物调配物和计量吸入器来雾化或者作为冻干粉和研磨粉吸入。
要通过本文所描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包含但不限于家畜、运动动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有、有风险罹患或怀疑患有目标疾病/病症(如癌症或免疫病症，如自身免疫性疾病)的人类患者。
癌症的实例包含但不限于乳腺癌；胆道癌；膀胱癌；脑癌，包含胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；血液肿瘤，包含急性淋巴细胞性和髓性白血病，如B细胞CLL；T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性粒细胞性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内肿瘤，包含博文氏病(Bowen's disease)和佩吉特氏病(Paget'sdisease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包含霍奇金氏病(Hodgkin's disease)和淋巴细胞淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包含鳞状细胞癌；卵巢癌，包含由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞引起的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包含平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包含黑色素瘤、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包含生殖肿瘤，如精原细胞瘤、非生殖细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞瘤；甲状腺癌，包含甲状腺腺癌和髓细胞癌；和肾癌，包含腺癌和威尔姆氏肿瘤(Wilms tumor)。
患有靶癌症的受试者可以通过常规医学检查，例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描、超声波和/或基因测试来鉴定。在一些实施例中，通过本文所描述的方法待治疗的受试者可以是已经经历或正经受抗癌疗法(例如，化学疗法、放射疗法、免疫疗法或外科手术)的人癌症患者。
免疫紊乱是指免疫系统的功能障碍。实例包含自身免疫性疾病、免疫缺陷或过敏。在一些实施例中，用于治疗的靶疾病是自身免疫性疾病。实例包含但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(MG)、格雷夫氏病(Graves'Disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、自身免疫性心肌炎、膜性肾小球肾炎、高IgM综合征、糖尿病、I型或II型糖尿病、多发性硬化症、雷诺氏综合征(Reynaud's syndrome)、自身免疫性甲状腺炎、胃炎、乳糜泻、白癜风、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、炎症性肠病、脊椎关节病变、实验性自身免疫性脑脊髓炎、免疫性中性粒细胞减少症、青少年型糖尿病、和与常见于结核病、结节病和多肌炎中的由细胞因子、T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫应答、多动脉炎、皮肤血管炎、天疱疮、类天疱疮(pemphigold)、
彻氏综合征(ture's syndrome)、川崎氏病(Kawasaki's disease)、系统性硬化症、抗磷脂综合征、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、移植物抗宿主(GVH)疾病和免疫性血小板减少症。
患有靶标自身免疫性疾病的受试者可以通过常规医学检查来鉴定，例如抗核抗体、抗线粒体自身抗体、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体、抗磷脂抗体、抗瓜氨酸化肽(抗CCP)、抗类风湿因子、免疫球蛋白A、C反应蛋白测试、补体测试、红细胞沉降率(ESR)测试、凝血图谱和蛋白质电泳/免疫固定电泳和/或基因测试。在一些实施例中，通过本文所描述的方法要治疗的受试者可以是患有自身免疫疾病的人类受试者，所述人类受试者已经经历或正经受自身免疫疾病治疗，例如免疫抑制介导、激素替代疗法、输血、抗炎药物和/或疼痛药物。
疑似患有任何这类靶疾病/病症的受试者可能显示所述疾病/病症的一种或多种症状。处于所述疾病/病症风险下的受试者可以是具有所述疾病/病症的风险因素中的一个或多个的受试者。
如本文所使用的，“有效量”是指单独或与一种或多种其它活性剂组合赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。确定一定量的抗体是否达到治疗效果对本领域的技术人员来说是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量的变化取决于所治疗的具体病状、病状的严重程度、个体患者的参数，包含年龄、身体病状、体型、性别和体重、治疗的持续时间、并行疗法(如果存在的话)的性质、特定的施用途径以及健康从业者知识和专长范围内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员熟知的，并且可以通过常规实验解决。通常优选的是使用单独的组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
如半衰期等经验性考虑通常将有助于确定剂量。例如，可以使用如人源化抗体或完全人抗体等与人免疫系统相容的抗体来延长抗体的半衰期并防止抗体受到宿主的免疫系统的攻击。可以在疗程中确定和调节施用频率，并且通常但未必基于靶疾病/病症的治疗和/或抑制和/或减轻和/或延缓。可替代地，抗体的持续连续释放调配物可能是适当的。用于实现持续释放的各种调配物和装置在本领域中是已知的。
在一个实例中，可以在已经给予了抗体的一次或多次施用的个体中凭经验确定如本文所描述的抗体的剂量。给予个体递增剂量的激动剂。为了评定激动剂的功效，可以遵循疾病/病症的指标。
通常，对于本文所描述的任何抗体的施用，初始候选剂量可以为约2mg/kg。出于本公开的目的，根据上述因素，典型的日剂量的范围可以为约0.1μg/kg到3μg/kg、到30μg/kg、到300μg/kg、到3mg/kg、到30mg/kg、到100mg/kg或更多中的任何剂量。对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据病状，治疗持续到出现期望的症状抑制或持续到达到足以减轻靶疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，之后施用约1mg/kg抗体的每周维持剂量或者之后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰变模式，其它剂量方案可能是有用的。例如，设想每周给药一次至四次。在一些实施例中，可以使用范围为约3μg/mg至约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)的剂量。在一些实施例中，给药频率为每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更久一次。通过常规技术和测定，容易地监测这一疗法的进展。给药方案(包含使用的抗体)可以随时间推移而变化。
在一些实施例中，对于正常体重的成年患者，可以施用的给药范围为从约0.003到5.00mg/kg。在一些实例中，本文所描述的抗体的剂量可以为10mg/kg。特定的给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定个体和所述个体的病史以及个别药剂的性质(如药剂的半衰期和本领域所熟知的其它考虑)。
出于本公开的目的，如本文所描述的抗体的适当剂量将取决于所采用的特异性抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度、抗体是否出于预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对激动剂的应答、以及主治医师的判定。临床医生通常将施用抗体，直至达到实现期望结果的剂量。在一些实施例中，期望的结果是肿瘤微环境中抗肿瘤免疫应答的增加。确定剂量是否产生期望结果的方法对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。一种或多种抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如受者的生理病状、施用的目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业者已知的其它因素。抗体的施用可以在预选时间段内基本上是连续的，或者可以例如在发展靶疾病或病症之前、期间或之后采用一系列间隔剂量。
如本文所使用的，术语“治疗”是指向受试者施加或施用包含一种或多种活性剂的组合物，所述受试者患有靶疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/症状有易感性，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。
减轻靶疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度或延长存活期。减轻疾病或延长存活期不一定需要治愈结果。如本文所使用的，“延迟”靶疾病或病症的发展意指推迟、阻碍、减缓、放缓、稳定和/或延缓疾病的进展。这一延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或正在治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间帧内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用所述方法相比在给定时间帧内降低症状的程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所使用的，靶疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。
根据要治疗的疾病的类型或疾病的位点，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来向受试者施用药物组合物。这种组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所使用的，术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径向受试者施用组合物，如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。
可注射组合物可以含有各种载剂，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物调配物。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂(例如，抗体的合适的可溶性盐形式的无菌调配物)可以在如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液等药物赋形剂中溶解和施用。
在一个实施例中，通过位点特异性或靶向局部递送技术施用抗体。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包含抗体的各种可植入贮库源或局部递送导管(例如，输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其它可植入装置)；位点特异性载剂；直接注射或直接应用。参见例如，PCT公开第WO 00/53211号和美国专利第5,981,568号中。
也可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术描述于例如Findeis等人,《生物技术发展趋势(TrendsBiotechnol.)》(1993)11:202；Chiou等人,基因治疗剂：直接基因转移的方法和应用(GeneTherapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff编辑)(1994)；Wu等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》(1988)263:621；Wu等人,《生物化学杂志》(1994)269:542；Zenke等人,《美国国家科学院院刊》(1990)87:3655；Wu等人,《生物化学杂志》(1991)266:338。
对于基因疗法方案中的局部施用，在约100ng到约200mg DNA的范围内施用含有多核苷酸(例如，编码本文所描述的抗体的多核苷酸)的治疗组合物。在一些实施例中，在基因疗法方案期间还可以使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg或更高的浓度范围的DNA。
本文所描述的治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因递送媒剂来递送。基因递送媒剂可以是病毒或非病毒来源的(通常参见Jolly,《癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)》(1994)1:51；Kimura,《人类基因疗法》(1994)5:845；Connelly,《人类基因疗法》(1995)1:185；以及Kaplitt,《自然遗传学(Nature Genetics)》(1994)6:148)。这种编码序列的表达可以使用内源哺乳动物或异源启动子和/或增强子来诱导。编码序列的表达可以是构成的或调控的。
用于递送期望多核苷酸并在期望细胞中表达的基于病毒的载体是本领域所熟知的。示例性基于病毒的媒剂包含但不限于重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公开第WO 90/07936号；第WO 94/03622号；第WO 93/25698号；第WO 93/25234号；第WO 93/11230号；第WO93/10218号；第WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号和第4,777,127号；英国专利第2,200,651号；以及欧洲专利第0 345 242号)；基于α病毒的载体(例如，辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))；以及腺相关病毒(AAV)载体(参见例如，PCT公开第WO 94/12649号、第WO 93/03769号；第WO 93/19191号；第WO 94/28938号；第WO 95/11984号和第WO 95/00655号)。施用与杀伤的腺病毒连接的DNA(如以下中所描述的：Curiel,《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》(1992)3:147)也可以采用。
也可以采用非病毒递送媒剂和方法，其包含但不限于单独与杀伤的腺病毒连接或不连接的聚阳离子浓缩DNA(参见例如，Curiel,《人类基因疗法》(1992)3:147)；配体连接的DNA(参见例如Wu,《生物化学杂志》(1989)264:16985)；真核细胞递送媒剂细胞(参见例如美国专利第5,814,482号；PCT公开第WO 95/07994号；第WO 96/17072号；第WO 95/30763号；和第WO 97/42338号)以及核酸电荷中和或与细胞膜的融合。也可以采用裸DNA。示例性裸DNA引入方法在PCT公开第WO 90/11092号和美国专利第5,580,859号中进行了描述。以下描述了可以充当基因递送媒剂的脂质体：美国专利第5,422,120号；PCT公开第WO 95/13796号；第WO 94/23697号；第WO 91/14445号；以及EP专利第0524968号。以下描述了另外的方法：Philip,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》(1994)14:2411和Woffendin,《美国国家科学院院刊》(1994)91:1581。
本文所描述的方法中使用的特定给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定受试者和所述受试者的病史。
在一些实施例中，可以向需要治疗的受试者施用多于一种抗体或抗体与另一种合适的治疗剂的组合。抗体还可以结合用于增强和/或补充药剂的有效性的其它药剂使用。可以通过本领域熟知的方法对靶疾病/病症的治疗功效进行评估。
当本文所描述的任何抗体用于治疗癌症时，其可以与抗癌疗法组合，例如本领域已知的那些。其它抗癌疗法包含化学疗法、手术、放射线、免疫疗法、基因疗法等。
可替代地，本公开的治疗可以与以下组合：化学治疗剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包含如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)等天然产物、如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛(docetaxel))、长春新碱、长春碱、诺考达唑(nocodazole)、埃博霉素(epothilone)和诺维本(navelbine)等微管破坏剂、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶(amsacrine)、蒽环霉素(anthracycline)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、卡铂、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、六轻甲基蜜胺(hexamethyhnelamine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、二氯甲基二乙胺(merchlorehtamine)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝基脲、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉酚(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和依托泊苷(VP16))；抗生素，如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、伊达比星(idarubicin)、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素；酶(系统地代谢L-天冬酰胺并且剥夺不具有合成其自身的天冬酰胺的能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板药剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和类似物、链脲霉素(streptozocin))、三氮烯-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦(mitotane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素、激素类似物(雌激素、三苯氧胺(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide))和芳香酶抑制剂(来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其它凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林(aspirin)、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(贝莱维定(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，TNP-470、染料木黄酮、贝伐单抗(bevacizumab))和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸(tretinoin))；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、京尼平苷(eniposide)、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))、皮质类固醇(可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基强的松龙(methylpednisolone)、强的松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone))；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；以及染色质破坏剂。
当本文所描述的任何抗体用于治疗免疫紊乱时，其可以与其它免疫调节治疗共使用，所述其它免疫调节治疗如例如治疗性疫苗(包含但不限于GVAX、基于DC的疫苗等)或检查点抑制剂(包含但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的药剂)。在一些情况下，抗体可以与另一种治疗自身免疫性疾病的疗法相组合。实例包含但不限于静脉内Ig疗法；非甾体类抗炎药(NSAID)；皮质类固醇；环孢菌素、雷帕霉素、抗坏血酸霉素；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨蝶呤；布喹那(brequinar)；FTY 720；来氟米特(leflunomide)；咪唑立宾(mizoribine)；霉酚酸；霉酚酸酯；15-脱氧精胍菌素；免疫抑制剂或粘附分子抑制剂。
关于另外的有用药剂的实例，还参见：《内科医师案头参考(Physician's DeskReference)》,补充第59版,(2005),Thomson P D R,Montvale N.J.；Gennaro等人编辑,《雷明顿药学科学与实践》,补充第20版,(2000),马里兰州巴尔的摩的利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins,Baltimore Md.)；Braunwald等人编辑,《哈里森内科医学原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)》,补充第15版,(2001),纽约的麦格劳·希尔公司(McGraw Hill)；Berkow等人,编辑《默克诊断与疗法手册(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)》,(1992),新泽西州拉威的默克研究实验室(Merck Research Laboratories,Rahway N.J.)中找到。
当使用第二治疗剂时，这种药剂可以与本文所描述的治疗剂同时或依次(以任何顺序)施用。当与另外的治疗剂共同施用时，可以根据相加作用或协同效应降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。
VI.包括本文所公开的抗体的试剂盒
本公开还提供了用于治疗或缓解靶疾病，如本文所描述的癌症或免疫紊乱的试剂盒。此类试剂盒可以包含一个或多个容器，所述容器包括抗GITR抗体、抗B7H3/CD40双特异性抗体、抗B7H3/CD137双特异性抗体、抗B7H3/GITR双特异性抗体、抗B7H3/CD40双特异性抗体和/或抗B7H3/OX40双特异性抗体，例如本文所描述的任一种，以及任选地与抗体共使用的第二治疗剂，这也在本文中进行了描述。
在一些实施例中，所述试剂盒可以包括用于根据本文所描述的任何方法使用的说明书。包含的说明书可以包括对施用用于治疗、延迟发作或减轻如本文所描述的那些靶疾病等靶疾病的抗体以及任选地第二治疗剂的描述。试剂盒可以进一步包括对基于鉴定所述个体是否患有靶疾病，例如应用如本文所描述的诊断方法来选择适于治疗的个体的描述。在仍其它实施例中，说明书包括对向处于靶疾病风险中的个体施用抗体的描述。
与抗Cmx抗体的使用相关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
标签或药品说明书指示组合物用于治疗疾病、延迟其发作和/或使其减轻，所述疾病例如癌症或免疫病症(例如自身免疫疾病)。说明书可以被提供用于实践本文所描述的任何方法。
本发明的试剂盒采用适合的包装。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进口端口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抗体，如本文所描述的那些。
试剂盒可以任选地提供如缓冲剂等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和位于容器上的或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本发明提供了制品，所述制品包括上述试剂盒的内含物。
通用技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在如以下等文献中进行了充分解释：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编辑1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A LaboratoryNotebook)》(J.E.Cellis编辑,1989)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱南出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：《哺乳动物细胞基因转移载体(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《当代分子生物学实验指南》(F.M.Ausubel等人编辑1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人,编辑1994)；《当代免疫学指南(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.,编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practicalapproach)》(P.Shepherd和C.Dean,编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999))；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra,编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:Apractical Approach)》,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑,1985)；《核酸杂交(NucleicAcid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1985))；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins,编辑(1984))；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑,(1986))；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells andEnzymes)》(lRL出版社,(1986))；和B.Perbal,《分子克隆实用指南(A practical Guide ToMolecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人,(编辑)。
无需进一步详细阐述，据信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施例应当被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余内容。本文引用的所有公开出于本文引用的目的或主题通过引用并入。
实例1：抗B7H3抗体的构建
使用标准鼠类杂交瘤技术产生抗人B7H3抗体。开发了示例性抗B7H3抗体、Ly383和Ly387。分析抗体Ly383和抗体Ly387的VH和VL链的氨基酸序列，并根据Kabat CDR定义鉴定CDR。Ly383和Ly387的VH和VL序列在下表2中提供(其中CDR区用粗体标识)：
衍生自Ly383的人源化抗B7H3抗体
按照本领域已知的方法进行序列比对以分别将Ly383 VH和VL与人类种系VH和VL序列进行比较。参见例如Glanville J.等人,《美国国家科学院院刊》2009；106(48)20216-21。基于整体序列同一性、匹配的界面定位和类似分类的CDR典型定位，为轻链和重链中的每一个鉴定了种系家族作为期望的受体框架，即轻链的IGKV3-11*01和重链的IGHV1-46*01。鉴定了人类受体，其氨基酸序列如表2所示。
将亲本Ly383抗体的CDR移植到上述人类VH和VL受体序列的对应CDR区中，以产生人源化Ly383_VH-1和Ly383_VL-1链(移植的人源化抗体；克隆Ly1426)，其各自的氨基酸序列在下表2中提供(CDR为粗体)：
Ly383抗体Fv片段的同源性建模如下进行。简而言之，针对PDB抗体数据库对Ly383VH和VL序列进行BLAST搜索，以鉴定Fv片段的合适模板，并且特别地用于构建结构域界面。选择了结构模板2GKI(以Hsp90和Sgt1为中心的多蛋白复合物的结构和功能偶联)，同一性＝72％。
同源模型是使用定制的构建同源模型协议构建的。指定并连接了二硫化物桥。使用DOPE方法对环路进行优化。基于2GKI的同源性模型，分析了Ly383抗体的VH和VL序列。鉴定了预期对结合活性重要的框架区(FR)残基，包含抗体的典型FR残基和VH-VL界面残基。进一步分析了内核中的框架残基，并鉴定了6个Ly383_VH-1(移植的Ly383_VH)残基以用于回复突变，包含A40K、M48I、V67A、R71S、T73K和R94S。对于Ly383_VL-1(移植的LY383_VL)，4个残基被鉴定为回复突变，包含L46P、L47W、G66R和F71Y。这些人源化VH和VL链的氨基酸序列在下表2中提供(对应于克隆Ly1562)
构建了人源化Ly383抗体的重组全长人IgG/κ。人源化Ly383抗体包含：
-Ly1426(包含VH-1/IgG1 mut的重链和VL-1/κ的轻链)
-Ly1562(包含VH-6/IgG1 mut的重链和VL-6/κ的轻链)
克隆Ly1426和Ly1562的全重链和轻链氨基酸序列也提供在下表2中。
基于人源化和回复突变抗体Ly1562鉴定并去除PTM热点，具有PTM去除设计的氨基酸序列提供在下表2中(CDR为粗体，PTM去除下划线)(克隆Ly1612、Ly1614、Ly1616和Ly1618)。
衍生自Ly387的人源化抗B7H3抗体
按照本领域已知的方法进行序列比对以分别将Ly387 VH和VL与人类种系VH和VL序列进行比较。参见例如Glanville J.等人,《美国国家科学院院刊》2009；106(48)20216-21。基于整体序列同一性、匹配的界面定位和类似分类的CDR典型定位，为轻链和重链中的每一个鉴定了种系家族作为期望的受体框架，即轻链的IGKV3-11*01和重链的IGHV1-2*02。鉴定了人类受体，其氨基酸序列如下表2所示。
将亲本Ly387抗体的CDR移植到上述人类VH和VL受体序列的对应CDR区中，以产生人源化Ly387_VH-1和Ly387_VL-1链(移植的人源化抗体)，其各自的氨基酸序列在下表2中提供(CDR为粗体)。
构建了人源化Ly387抗体的重组完全人IgG/κ。人源化Ly387抗体包含：
-Ly1442(包含Ly387_VH-1/IgG1 mut的重链和Ly387_VL-1/κ的轻链)
Ly1442的整个重链和轻链的氨基酸序列还提供在下表2中。
表2：抗B7H3抗体
实例2：抗B7H3抗体的表征
(a)与细胞表面B7H3的结合活性
进行FACS分析以评估示例性抗B7H3人源化抗体的结合特性。简而言之，使用胰蛋白酶-EDTA部分消化，随后以1000g离心3分钟，采集CHO细胞过表达人B7H3。将细胞重新悬浮于2x106/mL的冷PBS-BSA(2％)中，并等分至100μL/管。将抗B7H3人源化抗体在PBS-BSA中连续稀释，并向CHO-B7H3细胞中各自添加50μL。将细胞混合并且在4℃下在黑暗中温育2小时，然后用PBS-BSA洗涤两次。1/500稀释度的100μL/孔的次级抗体缀合(山羊F(ab')2抗人IgG-Fc(PE)，预吸附，Abcam#ab98596)用于重悬细胞。将细胞在4℃下在黑暗中温育另外1小时，并用PBS-BSA洗涤两次，然后在2％PFA/PBS中固定，并且然后进行FACS分析。
评估抗体与表达人B7H3的CHO细胞的结合，并用直方图绘制平均荧光强度，如图1A-1C所示。抗B7H3抗体Ly383和Ly387的人源化抗体Ly1562(具有回复突变)和Ly1442(CDR移植)两者均显示出与亲本嵌合抗体Ly383和Ly387的结合活性类似的与细胞B7H3的结合活性。然而，Ly1426(CDR移植，无回复突变)不与细胞B7H3结合。如图1D所示，衍生自Ly1562的具有PTM去除设计的抗体显示出与亲本嵌合抗体(Ly383)和人源化抗体(Ly1562)的结合活性类似的结合活性。
(b)B7H3的其它活性
评估这些人源化抗B7H3抗体的体外和体内活性。
实例3：抗B7H3/CD40双特异性抗体
使用抗CD40激动剂抗体CD40 Ab1(Ly253-G2)和抗B7H3抗体B7H3 Ab1(Ly1612)和B7H3 Ab2(Ly1442)产生抗B7H3/CD40双特异性抗体。亲本克隆的VH和VL的氨基酸序列提供在上表1中。由Kabat方案确定的重链和轻链互补决定区为粗体。
编码这些抗CD40和抗B7H3抗体的VH和VL链的cDNA(上文所提供的序列)用作构建抗B7H3/CD40双特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达双特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
双特异性抗体的多肽的氨基酸序列提供在下表3中。
表3：B7H3和CD40的示例性双特异性抗体
抗B7H3/CD40双特异性抗体的表征
(i)结合活性
通过FACS分析抗B7H3/CD40双特异性抗体与如上文所描述的在CHO细胞上表达的人CD40和/或人B7H3的结合特性。
如图2A和2B所示，示例性抗CD40/B7H3双特异性抗体对CHO细胞上表达的人B7H3表现出不同范围的结合亲和力。如图2C和2D所示，双特异性抗体对CHO细胞上表达的人CD40表现出不同水平的结合亲和力。
(ii)CD40的激动性活性
为了确定这些抗B7H3/CD40双特异性抗体的激动剂活性，开发了CD40报告基因测定，其涉及报告细胞过表达人CD40。CD40报告基因测定按照如下文所描述的程序在与或不与表达B7H3的CHO细胞共培养的情况下进行。将此GS-H2-huCD40报告细胞重新悬浮并用测定缓冲液(含有1％ FBS的MEM)稀释至1x104个细胞/mL。以100微升/孔添加细胞，使得在测定板(Nunc，目录号167425)中最终细胞数量为1000个细胞/孔。以100微升/孔测试样品以2x最终浓度向测定板添加样品。将测定板在37℃、5％CO2温育箱中温育18-20小时。温育18-20小时之后，从测定板的每个孔中收集8μl上清液并且将其添加到HTRF检测测定板(Nunc)中。使用人IL-8测定试剂盒(Cisbio，目录号62IL8PEB)进行人白介素8(CD40激活的报告基因)检测测定。具体地，使用16μl的测定体积。使用Tecan F200pro的时间分辨荧光读取结果，并且记录相对光单位数据。
如图3A-3F所示，与不存在人B7H3表达细胞的条件相比，在存在人B7H3表达细胞的情况下，所测试的示例性双特异性抗体显示出增强或变化的CD40激动剂活性。所测试的双特异性抗体在微环境中同时与CD40和B7H3两者结合将影响单独结合，并且因此影响CD40激动剂活性。
(iii)抗肿瘤活性
在小鼠同基因肿瘤模型中测试了示例性抗B7H3/CD40抗体，以确定这些抗体的抗肿瘤功效。使用具有人CD40敲入的C57BL6小鼠来开发同基因小鼠肿瘤模型。将人B7H3过表达的鼠类结肠癌MC38肿瘤细胞皮下植入到小鼠中。当肿瘤大小为大约150±50mm3(n＝6)时，将小鼠分组。通过腹膜内注射施用抗B7H3/CD40抗体，并且在4-6周的抗体处理期间测量肿瘤大小。每周2次通过口径测量肿瘤大小，并且使用0.5×长度×宽度2的公式计算为肿瘤体积。
如图4A-4C所示，在对照组和抗体处理组的肿瘤大小之间评估抗肿瘤功效。亲本抗CD40抗体用作参考。与亲本抗CD40抗体相比，包含Ly1581、Ly1579、Ly1663和Ly1585的若干种双特异性抗体显示出更强的功效(图4A-4B)和更好的安全性(图4C)。
评估抗B7H3/CD40抗体的体外和体内活性。
实例4：抗B7H3/CD137双特异性抗体
使用亲本抗B7H3抗体克隆Ly1612、亲本抗CD137抗体克隆CD137 Ab1产生并表征抗B7H3/CD137双特异性抗体。亲本克隆的VH和VL的氨基酸序列提供在上表1中。由Kabat方案确定的重链和轻链互补决定区为粗体。
编码亲本克隆的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的cDNA用作用于制备这些双特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达双特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些所得双特异性抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
示例性双特异性抗体的多肽的氨基酸序列提供在下表4中。
表4：示例性抗B7H3/CD137双特异性抗体
抗B7H3/CD137双特异性抗体的表征
评估这些双特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3和CD137)的结合、CD137报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例5：抗B7H3/GITR双特异性抗体
使用亲本抗B7H3抗体克隆Ly1612、亲本抗GITR克隆，包含TM677(GITR Ab1)产生并表征抗B7H3/GITR双特异性抗体。亲本克隆的VH和VL的氨基酸序列提供在上表1中。由Kabat方案确定的重链和轻链互补决定区为粗体。
编码亲本克隆的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的cDNA用作用于制备这些双特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达双特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些所得双特异性抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
示例性双特异性抗体的多肽的氨基酸序列提供在下表5中：
表5：示例性抗B7H3/GITR双特异性抗体
抗B7H3/GITR双特异性抗体的表征
评估这些双特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3和GITR)的结合、GITR报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例6：抗B7H3/OX40双特异性抗体
使用亲本抗B7H3抗体克隆Ly1612和亲本抗OX40抗体克隆Ly598(OX40 Ab1)产生并表征抗B7H3/OX40双特异性抗体。亲本克隆的VH和VL的氨基酸序列提供在上表1中。由Kabat方案确定的重链和轻链互补决定区为粗体。
编码亲本克隆的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的cDNA用作用于制备这些双特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达双特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些所得双特异性抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
示例性双特异性抗体的多肽的氨基酸序列提供在下表6中：
表6：示例性抗B7H3/OX40双特异性抗体
抗B7H3/OX40双特异性抗体的表征
评估这些双特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3和OX40)的结合、OX40报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例7：抗B7H3/CD47双特异性抗体
使用亲本抗B7H3抗体Ly1612(B7H3 Ab1)和包含Ly1667(CD47 Ab1)和Ly1668(CD47Ab2)的抗CD47抗体产生抗B7H3/CD47双特异性抗体。亲本抗体的VH和VL序列在上表1中提供(根据Kabat方案测定的CDR为粗体)
编码两种亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作构建抗B7H3/CD47双特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达双特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
示例性抗B7H3/CD47双特异性抗体的氨基酸序列提供在下表7中：
表7：示例性抗B7H3/CD47双特异性抗体
抗B7H3/CD47双特异性抗体的表征
评估这些双特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3和CD47)的结合、B7H3和CD47报告基因测定系统中的激动剂活性、小鼠模型中的抗肿瘤活性的激活。
实例8：抗B7H3/CD3双特异性抗体
使用抗B7H3抗体Ly1612(B7H3 Ab1)、抗CD3抗体Ly305(CD3 Ab1)和CD3 Ab2产生抗B7H3/CD3双特异性抗体。亲本抗体的氨基酸序列提供在上表1中。
编码这些亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作用于制备双特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达双特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
双特异性抗体的多肽链的氨基酸序列提供在下表8中：
表8：示例性抗B7H3/CD3双特异性抗体
抗B7H3/CD3双特异性抗体的表征
评估这些双特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3和CD3)的结合、CD3报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例9：抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体
使用抗B7H3抗体Ly1612(B7H3 Ab1)、抗CD3抗体Ly305(CD3 Ab1)和CD3 Ab2和抗CD137抗体Ly1630(CD137 Ab1)产生抗B7H3/CD3/CD137三特异性。亲本抗体的序列提供在上表1中。
编码这些亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作用于制备三特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达三特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
三特异性抗体的多肽链的氨基酸序列提供在下表9中：
表9：示例性抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体
抗B7H3/CD3/CD137三特异性抗体的表征
评估这些三特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3、CD3和CD137)的结合、CD3和CD137报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例10：抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体
使用上文实例9中所公开的相同的抗B7H3和抗CD3亲本克隆以及抗CD28抗体亲本克隆CD28 Ab1或CD28 Ab2产生抗B7H3/CD3/CD28三特异性。亲本抗体克隆的序列提供在上表1中。
编码这些亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作用于制备三特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达三特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
三特异性抗体的多肽链的氨基酸序列提供在下表10中：
表10：示例性抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体
抗B7H3/CD3/CD28三特异性抗体的表征
评估这些三特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3、CD3和CD28)的结合、CD3和CD28报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例11：抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体
使用上文所公开的相同的亲本抗B7H3和抗CD3抗体以及抗OX40亲本抗体Ly598(CD40 Ab1)产生抗B7H3/CD3/OX40三特异性。亲本抗体克隆的序列提供在上表1中。
编码这些亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作用于制备三特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达三特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
三特异性抗体的多肽链的氨基酸序列提供在下表11中：
表11：示例性抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体
抗B7H3/CD3/OX40三特异性抗体的表征
评估这些三特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3、CD3和OX40)的结合、CD3和OX40报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例12：抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体
使用上文所公开的相同的抗B7H3和抗CD3亲本克隆以及抗GITR亲本抗体GITR Ab1产生抗B7H3/CD3/GITR三特异性。亲本抗体克隆的序列提供在上表1中。
编码这些亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作用于制备三特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达三特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
三特异性抗体的多肽链的氨基酸序列提供在下表12中：
表12：示例性抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体
抗B7H3/CD3/GITR三特异性抗体的表征
评估这些三特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3、CD3和GITR)的结合、CD3和GITR报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例13：抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体
使用上文所公开的相同的亲本抗B7H3和抗CD137抗体以及抗OX40亲本抗体Ly598(OX40 Ab1)产生抗B7H3/CD137/OX40三特异性。亲本抗体克隆的序列提供在上表1中。
编码这些亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作用于制备三特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达三特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
三特异性抗体的多肽链的氨基酸序列提供在下表13中：
表13：示例性抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体
抗B7H3/CD137/OX40三特异性抗体的表征
评估这些三特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3、CD137和OX40)的结合、CD137和OX40报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
实例14：抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体
使用上文所公开的相同的抗B7H3和抗CD137亲本克隆以及抗GITR亲本抗体GITRAb1产生抗B7H3/CD137/GITR三特异性。亲本抗体克隆的序列提供在上表1中。
编码这些亲本抗体的VH和VL链的cDNA用作用于制备三特异性抗体的起始材料。CHO细胞瞬时表达用被配置成用于表达三特异性抗体的多肽链的质粒进行。这些抗体通过蛋白A亲和色谱法进行纯化。
三特异性抗体的多肽链的氨基酸序列提供在下表14中：
表14：示例性抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体
抗B7H3/CD137/GITR三特异性抗体的表征
评估这些三特异性抗体的体外和体内活性，包含与靶抗原(B7H3、CD137和GITR)的结合、CD137和GITR报告基因测定系统中的激动剂活性、免疫细胞的激活、小鼠模型中的抗肿瘤活性。
其它实施例
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代性特征替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是通用系列的等效或类似特征的实例。
通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求内。
等效物
尽管本文已经描述和展示了若干个发明实施例，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行本文所描述的功能和/或获得这些结果和/或这些优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变型和/或修改中的每一个被视为处于本文所描述的发明实施例的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所描述的所有参数、尺寸、材料和构型意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明教导所使用的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所描述的具体本发明实施例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施例。本公开的本发明实施例涉及本文所描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合并不相互矛盾，则这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法被包含在本公开的本发明范围内。
本文中定义和使用的所有定义都应当被理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而通过引用并入，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。
除非明确相反指出，否则如本文在说明书和权利要求中所使用的，不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应被理解为表示“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求中使用的，短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素的“任一或两者”，即在一些情况下结合存在和在其它情况下分离存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个要素”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与如“包括”等开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以仅指A(任选地包含除B以外的要素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包含除A以外的要素)；在又另一个实施例中，指A和B两者(任选地包含其它要素)；等。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，在将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个要素，但还包含多于一个要素以及任选地另外的未列出的项。仅明确指出相反的术语例如“仅一个”或“确切一个”或当在权利要求中使用时“由……组成”，指包括许多要素或要素列表中的确切一个要素。一般而言，当之前有排他性术语，如“任一个”、“……之一”、“……中的仅一个”、或“……中的恰好一个”时，如本文所使用的，术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代方案(即，“一个或另一个而不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由…组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为是指选自要素列表中的任一个或多个要素中的至少一个要素、但不一定包含要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。此定义还允许除术语“至少一个”所指要素列表内具体确定的要素外，还可以任选地存在要素，无论与具体确定的这些要素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以指任选地包含多于一个A，不存在B(并且任选地包含除B以外的要素)的至少一个；在另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个B，不存在A(并且任选地包含除A以外的要素)的至少一个；在又另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个A的至少一个，以及任选地包含多于一个B(以及任选地包含其它要素)的至少一个；等。
还应当理解，除非明确指出相反，否则在本文所要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述的方法的步骤或动作的顺序。

Claims (93)

1.一种多特异性抗体，其包括：
(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分与第一抗原结合，其中所述第一抗原结合部分包括第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)；以及
(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分与第二抗原结合，其中所述第二抗原结合部分包括第二VH和第二VL；以及任选地
(c)第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分与第三抗原结合，其中所述第三抗原结合部分包括第三VH和第三VL；
其中所述第一抗原和所述第二抗原中的一个是人B7H3，并且另一个选自由以下组成的组：人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28和人CD47；并且
其中任选的第三抗原选自由以下组成的组：人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28和人CD47；所述任选的第三抗原不同于所述第一抗原和所述第二抗原。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中与B7H3结合的所述抗原结合部分包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的重链互补决定区(CDR)相同的重链CDR；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的轻链CDR相同的轻链CDR。
3.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中与B7H3结合的所述抗原结合部分包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括重链互补决定区(CDR)，相对于抗体B7H3Ab1或B7H3 Ab2的重链CDR3，所述重链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括轻链CDR，相对于抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的轻链CDR，所述轻链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异。
4.根据权利要求3所述的多特异性抗体，其中与B7H3结合的所述抗原结合部分包括：(i)所述VH，所述VH包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；以及(ii)所述VL，所述VL包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的多特异性抗体，其中与B7H3结合的所述抗原结合部分包括与抗体B7H3 Ab1或B7H3 Ab2的VH和VL相同的VH和相同的VL。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多特异性抗体，其中与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的重链互补决定区(CDR)相同的重链CDR；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3Ab1或CD3 Ab2的轻链CDR相同的轻链CDR。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的多特异性抗体，其中与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括：
(i)重链可变区(VH)，所述VH包括重链互补决定区(CDR)，相对于抗体CD40Ab1、CD137Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的重链CDR3，所述重链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异；以及
(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括轻链CDR，相对于CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的轻链CDR，所述轻链CDR共同含有至多5个氨基酸残基变异。
8.根据权利要求7所述的多特异性抗体，其中与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括：
(i)所述VH，所述VH包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；以及
(ii)所述VL，所述VL包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28 Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47 Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的多特异性抗体，其中与人CD40、人CD137、人糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、人OX40、人CD3、人CD28或人CD47结合的所述抗原结合部分各自包括与抗体CD40 Ab1、CD137 Ab1、GITR Ab1、OX40 Ab1、CD28Ab1、CD28 Ab2、CD28 Ab3、CD47Ab1、CD47 Ab2、CD3 Ab1或CD3 Ab2的VH和VL相同的VH和相同的VL。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体，其是包括所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。
11.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有双链格式。
12.根据权利要求11所述的多特异性抗体，其中(i)所述第一抗原结合部分包括包含所述第一VH和重链恒定区或其片段的重链和包含所述第一VL和轻链恒定区的轻链；并且(ii)所述第二抗原结合部分是单链可变片段(scFv)；并且其中所述scFv与(i)的所述重链或所述轻链连接。
13.根据权利要求12所述的多特异性抗体，其中所述scFv与(i)的所述重链的N端或所述重链的C端连接。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的多特异性抗体，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括(i)的与所述scFv融合的所述重链；以及第二多肽，所述第二多肽包括(i)的所述轻链。
15.根据权利要求12或权利要求13所述的多特异性抗体，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括(i)的所述重链；以及第二多肽，所述第二多肽包括(i)的与所述scFv融合的所述轻链。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分与B7H3结合。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是包括所述第一多肽和所述第二多肽中的每一个的两个拷贝的多链复合物。
18.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其具有三链格式。
19.根据权利要求18所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分的第二重链，所述第二抗原结合部分是包括所述第二VH和所述第二VL的单链可变片段(scFv)，其中所述第二重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化和/或减少蛋白A结合。
20.根据权利要求19所述的多特异性抗体，其中在(ii)中，所述scFv定位于所述第一VH与所述第二Fc片段或其所述CH3结构域之间。
21.根据权利要求19所述的多特异性抗体，其中在(ii)中，所述scFv定位于所述第二多肽的C端处。
22.根据权利要求18所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链以及所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的一个；其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的第二重链以及所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的另一个，其中所述第二重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括突变，所述突变为杵臼突变、带电突变或ZW1突变。
24.根据权利要求19至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区之一包括相对于所述野生型对应物降低蛋白A结合活性的突变。
25.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其具有四链格式。
26.根据权利要求25所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第二抗原结合部分的第二重链，所述第二重链包括所述第二VH、轻链恒定区和包括CH3结构域的第二重链恒定片段；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原部分的轻链，所述轻链包括与重链恒定区的CH1结构域连接的所述第二VL；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
27.根据权利要求25所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括第二重链，所述第二重链包括所述第一VH、作为scFv片段的包括所述第二VH和所述第二VL的所述第二抗体结合部分以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述scFv；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
28.根据权利要求25所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的第一重链，其中所述第一重链包括所述第一VH和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第二VH、第一TCR片段和包括CH3结构域的第二重链恒定片段；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二VL和第二TCR片段；
其中所述第一TCR片段和所述第二TCR片段共同地是形成二聚体的TCRα链片段和TCRβ链片段；并且
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
29.根据权利要求28所述的多特异性抗体，其中所述第三多肽进一步包括所述第一VH，所述第一VH与重链恒定区的CH1结构域连接。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括突变，所述突变为杵臼突变、带电突变或ZW1突变。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区之一包括相对于所述野生型对应物降低蛋白A结合活性的突变。
32.根据权利要求11至31中任一项所述的多特异性抗体，其是包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD40结合的所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。
33.根据权利要求32所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1581、Ly1660、Ly1661、Ly1662、Ly1663、Ly1679、Ly1935和Ly1936。
34.根据权利要求11至31中任一项所述的多特异性抗体，其是包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD137结合的所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。
35.根据权利要求34所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1937、Ly1938、Ly1939、Ly1940、Ly1941、Ly1942、Ly1943和Ly1944。
36.根据权利要求11至31中任一项所述的多特异性抗体，其是包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与GITR结合的所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。
37.根据权利要求36所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1945、Ly1946、Ly1947、Ly1948、Ly1049、Ly1950、Ly1951和Ly1952。
38.根据权利要求11至31中任一项所述的多特异性抗体，其是包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与OX40结合的所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。
39.根据权利要求38所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1953、Ly1954、Ly1955、Ly1956、Ly1957、Ly1958、Ly1959和Ly1960。
40.根据权利要求11至31中任一项所述的多特异性抗体，其是包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD47结合的所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。
41.根据权利要求40所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly2043、Ly2044、Ly2045、Ly2046、Ly2047、Ly2048、Ly2049、Ly2050、Ly2051、Ly2052、Ly2053、Ly2054、Ly2055、Ly2056、Ly2057、Ly2058、Ly2059、Ly2060、Ly2061、Ly2062、Ly2063和Ly2064。
42.根据权利要求11至31中任一项所述的多特异性抗体，其是包括与B7H3结合的所述第一抗原结合部分和与CD3结合的所述第二抗原结合部分的双特异性抗体。
43.根据权利要求42所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1900、Ly1901、Ly1902、Ly1903和Ly1904。
44.根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体，其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分。
45.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH的第二重链和轻链恒定区以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL和重链恒定区的CH1片段；
其中所述第一多肽、所述第二多肽或两者进一步包括作为单链可变片段(scFv)的所述第三抗原结合部分；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
46.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL和重链恒定区的CH1结构域的第二重链以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH和轻链恒定区；
其中所述第一多肽、所述第二多肽或两者进一步包括作为单链可变片段(scFv)的所述第三抗原结合部分；并且
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
47.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及所述第三抗原结合部分的所述第三VH和所述第三VL中的一个；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH的第二重链和轻链恒定区、其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及所述第三VH和所述第三VL中的另一个；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL和重链恒定区的CH1结构域；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
48.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及所述第三抗原结合部分的所述第三VH和所述第三VL中的一个；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL和重链恒定区的CH1结构域的第二重链、其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及所述第三VH和所述第三VL中的另一个；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH和轻链恒定区；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
49.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、作为scFv的所述第二抗原结合部分和其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
其中所述第一多肽、所述第二多肽或两者进一步包括作为scFv的所述第三抗原结合部分；并且
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
50.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的一个以及其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、所述第二VH和所述第二VL中的另一个以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
其中所述第一多肽、所述第二多肽或两者进一步包括作为scFv的所述第三抗原结合部分，或者其中所述第三多肽进一步包括所述第三抗原结合部分；并且
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
51.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、所述第二抗原结合部分的所述第二VH和所述第二VL中的一个、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及所述第三抗原结合部分的所述第三VH和所述第三VL中的一个；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、所述第二VH和所述第二VL中的另一个、以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及所述第三VH和所述第三VL中的另一个；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
52.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链、其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段以及作为scFv的所述第二抗原结合部分；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一VH、其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段以及作为scFv的所述第三抗原结合部分；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
53.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括包含所述第一抗原结合部分的所述第一VH的第一重链和其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括包含所述第二抗原结合部分的所述第二VH的第二重链以及所述第三抗原结合部分中的所述第三VH和所述第三VL中的一个，其中所述第三VH与轻链恒定区融合或者所述第三VL与重链恒定区的CH1结构域融合；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第二抗原结合部分的包括所述第二VL和轻链恒定区的轻链，以及所述第三抗原结合部分中的所述第三VH和所述第三VL中的另一个，其中所述第三VH与轻链恒定区融合或者所述第三VL与重链恒定区的CH1结构域融合；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
其中所述第二多肽或所述第三多肽进一步包括其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；并且
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
54.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的所述第一VH、所述第二抗原结合部分的所述第二VH以及其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VH和轻链恒定结构域；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VL和重链恒定区的CH1结构域；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
其中所述第二多肽或所述第三多肽进一步包括所述第二抗原结合部分的所述第二VL以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；并且
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
55.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的所述第一VH、所述第二抗原结合部分的所述第二VL以及其中包括所述CH3结构域的第一重链恒定区或片段；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VH和轻链恒定结构域；
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第三抗原结合部分的所述第三VL和重链恒定区的CH1结构域；以及
(iv)第四多肽，所述第四多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
其中所述第二多肽或所述第三多肽进一步包括所述第二抗原结合部分的所述第二VH以及其中包括所述CH3结构域的第二重链恒定区或片段；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的多特异性抗体，其中所述第二多肽或所述第三多肽进一步包括所述第一VH，所述第一VH与重链恒定区的CH1融合。
57.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的重链和所述第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的所述重链包括所述第一VH和重链恒定区，并且其中所述第二抗原结合部分是scFv片段；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链和所述第三抗原结合部分，其中所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区，并且其中所述第三抗原结合部分是scFv片段。
58.根据权利要求44所述的多特异性抗体，其包括：
(i)第一多肽，所述第一多肽包括所述第一抗原结合部分的重链和所述第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的所述重链包括所述第一VH和第一重链恒定区，并且其中所述第二抗原结合部分是scFv片段；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽包括所述第一抗原结合部分的重链和所述第三抗原结合部分，其中所述重链包括所述第一VH和第二重链恒定区，并且其中所述第三抗原结合部分是scFv片段；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包括所述第一抗原结合部分的轻链，所述轻链包括所述第一VL和轻链恒定区；
任选地其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括所述CH3结构域中的突变，所述突变相对于所述野生型对应物增强异二聚化而非同二聚化。
59.根据权利要求45至58中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包括突变，所述突变为杵臼突变、带电突变或ZW1突变。
60.根据权利要求45至59中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区之一包括相对于所述野生型对应物降低蛋白A结合活性的突变。
61.根据权利要求44至60中任一项所述的多特异性抗体，其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分，其中(i)-(iii)与B7H3、CD3和CD137结合。
62.根据权利要求61所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1785、Ly1793、Ly1794、Ly1795、Ly1796、Ly1797、Ly1798、Ly1799、Ly1800、Ly1801、Ly1802、Ly1803、Ly1804、Ly1805和Ly1849。
63.根据权利要求44至60中任一项所述的多特异性抗体，其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分，其中(i)-(iii)与B7H3、CD3和GITR结合。
64.根据权利要求63所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1905、Ly1906、Ly1907、Ly1908、Ly1909、Ly1910、Ly1911、Ly1912、Ly1913、Ly1914、Ly1915、Ly1916、Ly1917、Ly1918和Ly1933。
65.根据权利要求44至60中任一项所述的多特异性抗体，其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分，其中(i)-(iii)与B7H3、CD3和OX40结合。
66.根据权利要求65所述的多特异性抗体，其选自由以下组成的组：Ly1919、Ly1920、Ly1921、Ly1922、Ly1923、Ly1924、Ly1925、Ly1926、Ly1927、Ly1928、Ly1929、Ly1930、Ly1931、Ly1932和Ly1934。
67.根据权利要求44至60中任一项所述的多特异性抗体，其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分，其中(i)-(iii)与B7H3、CD3和CD28结合。
68.根据权利要求67所述的多特异性抗体，其选自由Ly1968-Ly2042组成的组。
69.根据权利要求44至60中任一项所述的多特异性抗体，其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分，其中(i)-(iii)与B7H3、CD137和OX40结合。
70.根据权利要求69所述的多特异性抗体，其是Ly2076、Ly2077或Ly2078。
71.根据权利要求44至70中任一项所述的多特异性抗体，其是包括以下的三特异性抗体：(i)所述第一抗原结合部分；(ii)所述第二抗原结合部分；以及(iii)所述第三抗原结合部分，其中(i)-(iii)与B7H3、CD137和GITR结合。
72.根据权利要求71所述的多特异性抗体，其是Ly2079、Ly2080或Ly2081。
73.一种对人B7H3具有特异性的人源化抗体，其中所述人源化抗体包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
(i)所述VH包括IGHV1-46*01的框架以及重链互补决定区(CDR)1、2和3，所述重链CDR与亲本鼠类抗体Ly383的重链CDR相同或相对于所述亲本鼠类抗体Ly383共同含有不超过5个氨基酸残基变异；或者
(ii)所述VH包括IGHV1-2*02的框架以及重链CDR 1、2和3，所述重链CDR与亲本鼠类抗体Ly387的重链CDR相同或相对于所述亲本鼠类抗体Ly387共同含有不超过5个氨基酸残基变异。
74.根据权利要求73所述的人源化抗体，其中所述VL包括IGKV3-11*01的框架以及轻链CDR 1、2和3，所述轻链CDR与所述亲本鼠类抗体Ly383或Ly387的轻链CDR相同或相对于所述亲本鼠类抗体Ly383或Ly387共同含有不超过5个氨基酸残基变异。
75.根据权利要求73或权利要求74所述的人源化抗体，其中所述抗体包括与抗体Ly383相同的重链CDR 1、2和3，和/或与抗体Ly383相同的轻链CDR 1、2和3。
76.根据权利要求73或权利要求74所述的人源化抗体，其中所述抗体包括与抗体Ly387相同的重链CDR 1、2和3，和/或与抗体Ly387相同的轻链CDR 1、2和3。
77.根据权利要求75或权利要求76所述的人源化抗体，其中所述VH包括VH框架中的一个或多个突变。
78.根据权利要求77所述的人源化抗体，其中所述VH框架中的所述突变是基于对应定位处的所述亲本鼠类抗体中的氨基酸残基的回复突变。
79.根据权利要求73所述的人源化抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:35、39、47或49的氨基酸序列；和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:37或41的氨基酸序列。
80.根据权利要求73所述的人源化抗体，其中所述VH包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列；和/或其中所述VL包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
81.根据权利要求73至80中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体是全长抗体。
82.根据权利要求81所述的人源化抗体，其中所述全长抗体是IgG/κ分子。
83.根据权利要求82所述的人源化抗体，其中所述全长抗体包括重链，所述重链为IgG1、IgG2或IgG4链。
84.根据权利要求83所述的人源化抗体，其中所述重链包括突变的Fc区，相对于野生型对应物，所述突变的Fc区对Fc受体表现出改变的结合亲和力或选择性。
85.根据权利要求73所述的人源化抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：Ly1426、Ly1562、Ly1612、Ly1614、Ly1616、Ly1618和Ly1442。
86.一种核酸或核酸组，其共同编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体。
87.根据权利要求86所述的核酸或核酸组，其为表达载体或表达载体组。
88.一种宿主细胞，其包括根据权利要求86或权利要求87所述的核酸或核酸组。
89.根据权利要求88所述的宿主细胞，其为哺乳动物宿主细胞。
90.一种用于产生根据权利要求1至85中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括：
(i)在允许表达所述抗体的条件下培养权利要求82或权利要求83的宿主细胞；以及
(ii)采集因此产生的所述抗体。
91.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至85中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载剂。
92.一种用于调节免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1至85中任一项所述的抗体或其药物组合物。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有癌症的人类患者。
CN202280032108.1A 2021-04-28 2022-04-28 包括抗b7h3结合分子的双特异性抗体 Pending CN117751145A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2021/090537 2021-04-28
CN2021090537 2021-04-28
PCT/US2022/026731 WO2022232392A2 (en) 2021-04-28 2022-04-28 Bi-specific antibodies comprising anti-b7h3 binding molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117751145A true CN117751145A (zh) 2024-03-22

Family

ID=83848890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280032108.1A Pending CN117751145A (zh) 2021-04-28 2022-04-28 包括抗b7h3结合分子的双特异性抗体

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20240218069A1 (zh)
CN (1) CN117751145A (zh)
WO (1) WO2022232392A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118420712A (zh) * 2023-02-01 2024-08-02 上海健信生物医药科技有限公司 一种三特异性抗体技术平台及其应用
WO2024206669A2 (en) * 2023-03-29 2024-10-03 Virtuoso Binco, Inc. Antibodies for targeting cd47 and b7h3 and methods of use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ705128A (en) * 2010-03-04 2015-04-24 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
JP2018523686A (ja) * 2015-08-17 2018-08-23 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７‐ｈ３及びｃｄ３に結合できる二重特異性１価ダイアボディ並びにその使用
SG11201912010XA (en) * 2017-06-12 2020-01-30 Obsidian Therapeutics Inc Pde5 compositions and methods for immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022232392A2 (en) 2022-11-03
WO2022232392A3 (en) 2022-12-22
US20240218069A1 (en) 2024-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220372155A1 (en) Anti-cd40 binding molecules and bi-specific antibodies comprising such
CN114026120B (zh) 人源化抗cd137抗体及其用途
WO2020132190A1 (en) Antibodies specific to muc18
CN111542342B (zh) 抗cd137抗体及其用途
US20250367313A1 (en) Antibodies specific to muc18
EP4292611A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
US20240368275A1 (en) Anti-nectin4 antibodies and multi-specific protein complexes comprising such
US20240218069A1 (en) Bi-specific antibodies comprising anti-b7h3 binding molecules
US20210355220A1 (en) Antibodies specific to ctla-4 and uses thereof
US20240336683A1 (en) Antibodies specific to sialic acid-binding ig-like lectin 15 and uses thereof
CN112512572B (zh) 抗cd40抗体及其用途
CN117015399A (zh) 包含抗cd137结合分子的双特异性抗体
HK40068698B (zh) 人源化抗cd137抗体及其用途
HK40068698A (zh) 人源化抗cd137抗体及其用途
WO2021257822A2 (en) Bispecific antibodies targeting human claudin 18.2 and programmed death-ligand 1 (pd-l1)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination