CN117757816B - 一种调控杏果实色泽的功能基因PaPDS及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种调控杏果实色泽的功能基因PaPDS及其应用。PaPDS基因的序列如SEQ ID NO.1所示，PaPDS基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。转录组学分析、过表达实验和基因沉默实验证实，PaPDS基因编码的基因能够调控杏果肉中β‑胡萝卜素的含量，进而影响杏果肉的色泽，当PaPDS基因过表达时，杏果肉颜色较深。本发明为杏果肉颜色以及杏果肉中β‑胡萝卜素含量的遗传改良奠定了基础，在杏树的基因工程育种方面具有潜在的价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。具体地说是一种调控杏果实色泽的功能基因PaPDS及其应用。
背景技术
色泽是评价果实成熟度和品质的重要指标。先前的研究表明，叶绿素、类胡萝卜素、花青素和甜菜素是影响水果颜色的主要色素。杏(Prunus armeniaca)是我国最重要的水果作物之一，因其独特的风味、鲜艳的颜色和丰富的营养而成为一种非常受欢迎的水果。不同品种的杏果实具有不同的颜色，这主要是由于杏中类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素的含量不同造成的。类胡萝卜素有助于杏果实颜色的加深和营养价值的提高，消费者多数偏好果实颜色更深、营养价值更高的杏。然而，在生产过程中，杏果实颜色可能不稳定，这将导致果农利润下降。
目前，高等植物β-胡萝卜素代谢途径已被明确定义，该代谢途径中包含许多种必需的酶，其中一种即为八氢番茄红素脱氢酶(PDS)。许多植物β-胡萝卜素的合成和调控机制已被探明，这些研究结果为其他β-胡萝卜素的合成和调控机制未被探明的植物中β-胡萝卜素含量的研究提供了良好的基础。但是，杏果实色泽的差异是合成β-胡萝卜素基因控制的研究目前少见报道，八氢番茄红素脱氢酶基因在杏果实中参与合成β-胡萝卜素的表达模式和功能作用尚不清楚。所以，探明能够调控杏果实色泽的功能基因，从而将其用于杏果实色泽调控具有重大意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种调控果实色泽的功能基因PaPDS及其应用，以实现对杏树果实色泽的遗传改良。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种调控杏果实色泽的功能基因PaPDS，PaPDS基因的序列如SEQ ID NO.1所示，PaPDS基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有调控杏果实色泽的功能基因PaPDS基因编码区序列的重组载体在调控杏果实颜色中的应用，PaPDS基因编码区序列为SEQ ID NO.1所示的序列或SEQ ID NO.3所示的序列。
上述的应用，重组载体的原始载体为pMD19-T，PaPDS基因编码区序列位于pMD19-T载体的BamHⅠ和XbaⅠ两限制性内切酶位点之间，PaPDS基因编码区序列为如SEQ ID NO.1所示的序列。将PaPDS基因插入pMD19-T后，在后续需要对PaPDS基因进行PCR克隆时，即可以测序正确T载体为模板，与使用杏的cDNA作为模板相比，使用测序正确的T载体作为模板可减少PCR时的非特异性扩增，获得较为纯净的扩增产物。
上述的应用，重组载体的原始载体为pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos，PaPDS基因编码区序列插在pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体上BsaⅠ限制性内切酶的切割位置处，PaPDS基因编码区序列为如SEQ ID NO.1所示序列。该重组载体可用于PaPDS基因的过表达，以加深杏果实的颜色和β-胡萝卜素的含量。除了pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体外，重组载体的原始载体也可以是基因工程领域中常用的载体，如病毒和其他的植物表达载体质粒等。
上述的应用，重组载体的原始载体为TRVⅡ-GFP，PaPDS基因编码区序列插在TRVⅡ-GFP载体的EcoRⅠ和XhoⅠ两限制性内切酶位点之间，PaPDS基因编码区序列为如SEQ IDNO.3所示的序列。SEQ ID NO.3所示的序列为PaPDS基因cDNA序列的一部分，其与TRVⅡ-GFP载体连接构成重组载体后，将使得重组载体转化的个体中的PaPDS基因转录出的mRNA的相应序列被降解，PaPDS基因不能正常表达。
一种加深杏果实颜色的方法，将上述的调控杏果实色泽的功能基因PaPDS或含有调控杏果实色泽的功能基因PaPDS基因编码区序列的重组载体转化至杏树幼苗或者杏果实。
上述的方法，重组载体的原始载体为pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos，PaPDS基因编码区序列插在pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体上BsaⅠ限制性内切酶的切割位置处，PaPDS基因编码区序列为如SEQ ID NO.1所示序列。重组pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体将在杏果实中介导PaPDS基因的过表达，提高杏果实的β-胡萝卜素含量，加深杏果实的颜色。
上述的方法，使用含重组pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体的GV3101农杆菌，将调控杏果实色泽的功能基因PaPDS转化至杏树幼苗或者杏果实。
一种减淡杏果实颜色的方法，使用含上述重组TRVⅡ-GFP载体的重组工程菌、以及含TRVⅠ载体的重组工程菌共同转化杏树幼苗或杏果实。TRVⅡ-GFP载体和TRVⅠ载体共同用于基因沉默，其将使JTY-PaPDS基因转录出的mRNA被降解，减少杏果实中β-胡萝卜素的合成，最终起到减淡杏果实颜色的目的。
上述的方法，含重组TRVⅡ-GFP载体的重组工程菌和含TRVⅠ载体的重组工程菌均为GV3101农杆菌。
本发明提供了从金太阳杏中克隆得到的PaPDS基因，该基因编码的蛋白能够参与杏果实中β-胡萝卜素的合成，将该基因在杏果实中过表达可以显著加深杏果实的颜色和β-胡萝卜素的含量，可用于杏树果实颜色的遗传改良。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
1、本发明根据β-胡萝卜素含量测定和转录组学分析结果，从“金太阳”杏的果肉总RNA中逆转录并克隆得到了能够调控杏果肉颜色的JTY-PaPDS基因的全长cDNA序列；进一步地，本发明利用基因工程技术，获得了含JTY-PaPDS基因的重组克隆载体和重组过表达载体，还获得了用于使JTY-PaPDS基因沉默的VIGS沉默载体。将含JTY-PaPDS基因的重组过表达载体和用于使JTY-PaPDS基因沉默的VIGS沉默载体分别转化杏果肉细胞后，分别增加了和减少了杏果肉细胞中的β-胡萝卜素含量，进而分别对杏果肉的颜色起到加深作用和减淡作用。
2、本发明中的JTY-PaPDS基因、重组过表达载体和VIGS沉默载体可用于杏果肉颜色以及杏果肉中β-胡萝卜素的含量进行遗传改良，重组克隆载体可用于构建其他类型的含JTY-PaPDS基因的载体，以期对JTY-PaPDS基因的功能进行进一步的研究。
附图说明
图1本发明实施例中不同品种橙、白果肉杏果实中β-胡萝卜素含量测测定结果图；
图2本发明实施例中X15与金太阳成熟果实颜色对比图；
图3本发明实施例中X15与金太阳不同发育阶段的果实示意图；
图4本发明实施例中X15与金太阳果实不同发育时期β胡萝卜素含量测定结果图；
图5本发明实施例中X15与金太阳果实转录组学分析结果图；
图6本发明实施例中X15与金太阳PaPDS基因序列比对结果图；
图7本发明实施例中X15与金太阳PaPDS基因编码蛋白质序列比对结果图；
图8本发明实施例中pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos的载体图谱；
图9本发明实施例中含过表达载体的农杆菌转化杏果实的实验结果图；
图10本发明实施例中含过表达载体的农杆菌转化杏果实中的物质含量测定结果图；
图11本发明实施例中构建VIGS沉默载体时的第一次PCR鉴定结果图；
图12本发明实施例中构建VIGS沉默载体时的第二次PCR鉴定结果图；
图13本发明实施例中构建VIGS沉默载体时的第三次PCR鉴定结果图；
图14本发明实施例中含VIGS沉默载体的农杆菌转化杏果实的实验结果图；
图15本发明实施例中含VIGS沉默载体的农杆菌转化杏果实中的物质含量测定结果图；
图16本发明实施例中TRVⅡ-GFP载体图谱。
具体实施方式
已知β-胡萝卜素是杏果实主要的橙色物质，在此基础上，本实施例中技术人员采集了不同品种橙、白果肉杏果实，测定了果实中β-胡萝卜素含量，结果如图1所示。在所有采集到的杏果实中，筛选出了一种β-胡萝卜素含量最低且表型观测最白的品种“X15”。
分别以白果肉杏“X15”与橙果肉杏“金太阳”(JTY，或Sungold)为实验对象，进行不同发育时期β-胡萝卜素含量测定和转录组学分析。两种杏成熟果实的颜色对比如图2所示，其中颜色较深的为“金太阳”，颜色较浅的为“X15”。果实发育不同时期的照片如图3所示，果实不同发育时期的β-胡萝卜素含量测定结果如图4所示，转录组学的分析结果如图5所示。经过β-胡萝卜素含量测定和转录组学分析，技术人员获得了一个候选基因PaPDS。
分别以JTY和X15的总DNA为模板克隆了PaPDS基因(分别命名为JTY-PaPDS和X15-PaPDS)，对比两者的序列发现，与JTY-PaPDS相比，X15-PaPDS在第11外显子处有5bp的缺失，如图6所示。该缺失导致了X15-PaPDS的翻译被提前终止，如图7所示。根据CDD结构域预测，该突变发生在PaPDS phytoene-desaturase功能结构域上。
提取JTY和X15果肉总RNA，以反转录得到的cDNA作为模板，进行目的基因或片段的克隆。JTY-PaPDS和X15-PaPDS的cDNA序列如下：
JTY-PaPDS(SEQ ID NO.1)：
atgtctcagtgggcttgtgtctctgctgctaacttgagctgccaagctagcatcatcaacactcaaaagctacgaaacactcccagatgcgatgccttttcatttaaaggtagtgaatttatggctcaaagctgtagatttttaagcccacaagctatttatggaaggccgaggaatggtgcttgccctttgaaggtggtttgcgttgattatccaagaccagaccttgacaatactgctaatttcttagaagctgcatatttctcttccactttccgagcctctcctcgtccagctaagccgttgaaggtcgtgattgctggtgcaggtttggctggtcttgcaactgcaaaatatttggctgatgcaggtcataaacctatcttactggaagcaagagatgttctaggcggaaaggtggcagcatggaaagataaggatggagactggtacgaaacaggcctccatatcttctttggggcttatccgaatattcagaacctgtttggtgagcttggtattgatgatcgattgcagtggaaggagcattctatgatatttgcaatgccaaacaaaccaggagaattcagccggtttgatttccctgaagttttaccagcacccttaaatggaatatgggccatattgaagaacaatgagatgctgacttggccagagaaaataaagtttgcaattggactactgccagcaattcttggtgggcaggcttatgttgaagcccaagatggcttgagtgtaaaagattggatgaggaaacagggcataccggatcgagtgactactgaggtgtttattgccatgtcaaaggccctgaactttattaaccctgatgaactttcaatgcaatgcatattgattgctttgaaccgattccttcaggagaaacacggttccaagatggctttcttggatggtagtccccctgagagactctgtgcaccaattgttgatcatatccagtcattgggcggtgaagtccgaattaattcccgaatacagaaaattgagctaaataaagatgggaccgtgaagagttttgtactaaataatgggagcatgattgaagcagatgcctatgtatttgccactccagttgacatcctaaagcttctattgcctgataactggaaagagatcccatatttcaagaaattggagaaactaattggcgttccagttatcaatgttcacatatggtttgacagaaagctgaagaacacatatgatcatctactttttagcaggagtcctcttttaagtgtctatgctgacatgtctgtaacatgtaaggaatattataatccaaaccagtctatgctggagttggtttttgcaccagcagaagaatggatttcatgcagtgattcagaaattattgatgctacactcaaagaacttgcaaaactctttcctgatgagatagctgcagatcagagcaaagcaaagattttgaagtaccatgttgtgaaaacaccaaggtcggtttacaaaactgtaccagattgtgaaccttgccgtcccttgcaaagatctcccctagagggtttctatttagctggtgattacacaaaacaaaagtatttagcctcaatggaaggtgctgttctgtcagggaaactttgtgcacaagcaattgtacaggtaatttccatcaggactctggaatttatatggcatgatgaacacgcatgctcatctatgtctgaatttacttaa
X15-PaPDS：
atgtctcagtgggcttgtgtctctgctgctaacttgagctgccaagctagcatcatcaacactcaaaagctacgaaacactcccagatgcgatgccttttcatttaaaggtagtgaatttatggctcaaagctgtagatttttaagcccacaagctatttatggaaggccgaggaatggtgcttgccctttgaaggtggtttgcgttgattatccaagaccagaccttgacaatactgctaatttcttagaagctgcatatttctcttccactttccgagcctctcctcgtccagctaagccgttgaaggtcgtgattgctggtgcaggtttggctggtcttgcaactgcaaaatatttggctgatgcaggtcataaacctatcttactggaagcaagagatgttctaggcggaaaggtggcagcatggaaagataaggatggagactggtacgaaacaggcctccatatcttctttggggcttatccgaatattcagaacctgtttggtgagcttggtattgatgatcgattgcagtggaaggagcattctatgatatttgcaatgccaaacaaaccaggagaattcagccggtttgatttccctgaagttttaccagcacccttaaatggaatatgggccatattgaagaacaatgagatgctgacttggccagagaaaataaagtttgcaattggactactgccagcaattcttggtgggcaggcttatgttgaagcccaagatggcttgagtgtaaaagattggatgaggaaacagggcataccggatcgagtgactactgaggtgtttattgccatgtcaaaggccctgaactttattaaccctgatgaactttcaatgcaatgcatattgattgctttgaaccgattccttcaggagaaacacggttccaagatggctttcttggatggtagtccccctgagagactctgtgcaccaattgttgatcatatccagtcattgggcggtgaagtccgaattaattcccgaatacagaaaattgagctaaataaagatgggaccgtgaagagttttgtactaaataatgggagcatgattgaagcagatgcctatgtatttgccactccagttgacatcctaaagcttctattgcctgataactggaaagagatcccatatttcaagaaattggagaaactaattggcgttccagttatcaatgttcacatatggtttgacagaaagctgaagaacacatatgatcatctactttttagcaggagtcctcttttaagtgtctatgctgacatgtctgtaacatgaatattataatccaaaccagtctatgctggagttggtttttgcaccagcagaagaatggatttcatgcagtgattcagaaattattgatgctacactcaaagaacttgcaaaactctttcctgatgagatagctgcagatcagagcaaagcaaagattttgaagtaccatgttgtgaaaacaccaaggtcggtttacaaaactgtaccagattgtgaaccttgccgtcccttgcaaagatctcccctagagggtttctatttagctggtgattacacaaaacaaaagtatttagcctcaatggaaggtgctgttctgtcagggaaactttgtgcacaagcaattgtacaggtaatttccatcaggactctggaatttatatggcatgatgaacacgcatgctcatctatgtctgaatttacttaa
二者编码的蛋白质的氨基酸序列分别为：
JTY-PaPDS(SEQ ID NO.2)：
MSQWACVSAANLSCQASIINTQKLRNTPRCDAFSFKGSEFMAQSCRFLSPQAIYGRPRNGACPLKVVCVDYPRPDLDNTANFLEAAYFSSTFRASPRPAKPLKVVIAGAGLAGLATAKYLADAGHKPILLEARDVLGGKVAAWKDKDGDWYETGLHIFFGAYPNIQNLFGELGIDDRLQWKEHSMIFAMPNKPGEFSRFDFPEVLPAPLNGIWAILKNNEMLTWPEKIKFAIGLLPAILGGQAYVEAQDGLSVKDWMRKQGIPDRVTTEVFIAMSKALNFINPDELSMQCILIALNRFLQEKHGSKMAFLDGSPPERLCAPIVDHIQSLGGEVRINSRIQKIELNKDGTVKSFVLNNGSMIEADAYVFATPVDILKLLLPDNWKEIPYFKKLEKLIGVPVINVHIWFDRKLKNTYDHLLFSRSPLLSVYADMSVTCKEYYNPNQSMLELVFAPAEEWISCSDSEIIDATLKELAKLFPDEIAADQSKAKILKYHVVKTPRSVYKTVPDCEPCRPLQRSPLEGFYLAGDYTKQKYLASMEGAVLSGKLCAQAIVQVISIRTLEFIWHDEHACSSMSEFT
X15-PaPDS：
MSQWACVSAANLSCQASIINTQKLRNTPRCDAFSFKGSEFMAQSCRFLSPQAIYGRPRNGACPLKVVCVDYPRPDLDNTANFLEAAYFSSTFRASPRPAKPLKVVIAGAGLAGLATAKYLADAGHKPILLEARDVLGGKVAAWKDKDGDWYETGLHIFFGAYPNIQNLFGELGIDDRLQWKEHSMIFAMPNKPGEFSRFDFPEVLPAPLNGIWAILKNNEMLTWPEKIKFAIGLLPAILGGQAYVEAQDGLSVKDWMRKQGIPDRVTTEVFIAMSKALNFINPDELSMQCILIALNRFLQEKHGSKMAFLDGSPPERLCAPIVDHIQSLGGEVRINSRIQKIELNKDGTVKSFVLNNGSMIEADAYVFATPVDILKLLLPDNWKEIPYFKKLEKLIGVPVINVHIWFDRKLKNTYDHLLFSRSPLLSVYADMSVT
在对目的基因(PaPDS基因)进行克隆时，需要向相应的特异性引物上加入合适的酶切位点和同源重组所需序列，以备后续通过同源重组法构建表达载体。其中酶切位点根据目的基因的序列和所需的表达载体的序列进行选择，最终确定在起始密码子的上游添加BamHⅠ酶切位点，在终止密码子下游添加XbaⅠ酶切位点。本实施例中两种PaPDS基因cDNA可用相同的引物进行扩增。最后使用到的PaPDS基因克隆扩增引物为：
正向扩增引物：
5'-CTCTCTCTCAAGCTTGGATCCATGTCTCAGTGGGCTTGTGTCTC-3'
反向扩增引物：
5'-GATACGAACGAAAGCTCTAGATTAAGTAAATTCAGACATAGATGAGCATG-3'
使用以上引物、按照本领域惯常技术手段对两种杏的PaPDS基因进行PCR克隆，而后进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带大小，对大小正确的条带进行切胶回收，分别得到第一回收产物(含X15-PaPDS序列)和第二回收产物(含JTY-PaPDS序列)。将第一回收产物和第二回收产物分别与克隆载体pMD19-T连接(使用擎科生物T载试剂盒pClone007 BluntSimple Vector Kit)，即得到了两种含目的基因的重组克隆载体。
使用两种重组克隆载体分别转化大肠杆菌感受态，涂布平板(氨苄抗性)后挑取10～20个单克隆进行PCR鉴定。挑克隆时，用灭菌后的移液枪枪头于超净工作台中随机挑取平板上的菌落，放入10～20μL无菌水中吹打数次，得到待测菌液，每种待测菌液取2μL为模板，进行菌液PCR，并向余留的待测菌液中加入600μL液体LB培养基，于37℃、220rpm的条件下继续培养一段时间，作为保种菌液。
根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果筛选出阳性克隆，并对阳性克隆进行测序。阳性克隆测序引物为(含两种序列的重组克隆载体通用)：
M13F：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'
M13R：5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'
测序结束后，选择测序正确的克隆的保种菌液留用。
为了进行PaPDS瞬时过表达分析，需要构建两种含分别含X15-PaPDS和JTY-PaPDS基因的PaPDS过表达载体。本实施例中以上述测序正确的克隆的菌液为模板，通过PCR的方法来获得X15-PaPDS基因的序列和JTY-PaPDS基因序列，PCR时使用的引物如下。每对引物上均添加了同源重组法构建载体时所需的序列。
X15-PaPDS：
D3669_0S1(+):5'-ACGGCATGGACGAGCTCTACATGTCTCAGTGGGCTTGTGTCTCTG-3'
D3669_0S1(-):5'-TGAAGACAGAGCTAGTTACATTAAGTAAATTCAGACATAGATGAGCATGCGTGTTC-3'
JTY-PaPDS：
D3668_0S1(+):5'-ACGGCATGGACGAGCTCTACATGTCTCAGTGGGCTTGTGTCTCTG-3'
D3668_0S1(-):5'-TGAAGACAGAGCTAGTTACATTAAGTAAATTCAGACATAGATGAGCATGCGTGTTC-3'
PCR时使用的反应体系及程序如分别如表1和表2所示。
表1PCR反应体系
| 成分 | 体积 |
| 无核酸酶水 | 20uL |
| Biorun Pfu PCR Mix | 25uL |
| 引物(+) | 2uL |
| 引物(-) | 2uL |
| 模板 | 1uL |
| 总体积 | 50uL |
表2PCR程序
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 94℃ | 5分钟 | 1 |
| 94℃ | 30秒 | 30 |
| 50℃ | 45秒 | 30 |
| 72℃ | 104秒 | 30 |
| 72℃ | 10分钟 | 1 |
| 16℃ | 30分钟 | 1 |
PCR反应结束后，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，分别得到第三回收产物(含X15-PaPDS序列)和第四回收产物(含JTY-PaPDS序列)。对于第三和第四回收产物，分别取出一部分进行测序。测序时使用的引物为：
JTY-PaPDS：
正向引物:5'-CCATTTAAGGGTGCTGGTAAAAC-3'
反向引物:5'-CACTTAAAAGAGGACTCCTGCTA-3'
X15-PaPDS：
正向引物:5'-CCATTTAAGGGTGCTGGTAAAAC-3'
反向引物:5'-CACTTAAAAGAGGACTCCTGCTA-3'
本次PCR使用的模板为上述测序正确的阳性克隆的保种菌液，且构建重组过表达载体后还需要进一步测序鉴定，故而本次测序不需要测通，只需通过测序确定回收的条带正确即可。测序完成后，将正确的回收产物留用。
接下来对过表达载体pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos进行酶切，以使其线性化，线性化后的载体可分别与上述第三回收产物和第四回收产物进行连接，以构建重组过表达载体。pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos的酶切反应在37℃条件下进行，酶切时间为1小时，反应体系如表3所示，重组过表达载体pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos的图谱如图8所示。
表3pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos酶切反应体系
| 成分 | 体积 |
| 无核酸酶水 | 13μL |
| 10×限制酶缓冲液 | 2μL |
| BsaⅠ/Eco31Ⅰ | 1μL |
| pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos | 4μL |
| 总计 | 20μL |
pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体经BsaⅠ酶单酶切后，载体将形成两个平末端。将酶切后线性化的载体用PCR纯化试剂盒纯化，以备用于同源重组反应。本实施例中进行体外同源重组反应，在其他的一些实施例中，也可以选择在大肠杆菌体内进行同源重组反应。同源重组反应的温度条件为37℃，孵育时间为30小时，有关反应体系为如表4所示。
表4重组反应体系
| 成分 | 体积 |
| 无核酸酶水 | 0uL |
| Biorun 2×EasyClone Mix | 10uL |
| 第三或第四回收产物 | 5uL |
| pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos(已线性化) | 5uL |
| 总计 | 20uL |
取10uL第三回收产物与线性化载体的重组反应产物(即X15-PaPDS重组过表达载体pBWA-X15)和10uL第四回收产物与线性化载体的同源重组反应产物(即JTY-PaPDS重组过表达载体pBWA-JTY)，分别转化大肠大肠杆菌感受态，转化后涂卡那霉素抗性平板，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。菌斑鉴定时挑取10个克隆同时进行1.5mL EP管接菌和PCR鉴定，具体操作方法同上述重组克隆载体挑克隆及PCR鉴定方法。测序时使用的两条引物根据pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos的序列设计，两条引物分别位于载体上重组片段的上游和下游。
X15-PaPDS PCR鉴定引物：
正向引物:5'-ttcatttggagagaacacgggggac-3'
反向引物:5'-ccatttaagggtgctggtaaaac-3'
JTY-PaPDS PCR鉴定引物：
正向引物:5'-ttcatttggagagaacacgggggac-3'
反向引物:5'-ccatttaagggtgctggtaaaac-3'
测序结束后，两种重组过表达载体各选出一个选择测序正确的克隆，对其进行摇菌，而后提取质粒。
对于每一种重组过表达载体，取1μL质粒加入50μL GV3101农杆菌感受态细胞中，充分混匀后吸取至电转杯中，电转后加1mL LB液体培养基，充分混匀后吸取至1.5mL离心管中，于摇床30℃、180rpm振荡培养30min进行性活化。而后吸取50μL活化好的农杆菌菌液接种于LB固体培养基上，30℃暗培养48h。此外，将1μL pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos空载体(pBWA)以同样的方法转化相同的农杆菌，转入空载体的农杆菌将用于对对照组进行处理。
暗培养结束后，对LB固体培养基上的单菌落进行PCR鉴定。对于进行鉴定的单菌落，挑取其一半作为PCR模板，另一半留在平板上继续培养。鉴定引物同上述重组过表达载体转化的大肠杆菌菌落的PCR鉴定引物。鉴定结束后，挑取阳性克隆留在平板上的菌落，置于3mL的LB培养基(含100mg/mL卡那霉素+50mg/mL利福平)中，于28℃温度下，摇床200rpm转速下振荡培养24h。24h后，将上述3mL菌液接入200mL的LB培养基(含100mg/mL卡那霉素+50mg/mL利福平)中，于28℃温度下，摇床200rpm转速下振荡培养10～12h至OD600＝0.6～0.8，将离心机转速设置为5000rpm，室温下将菌液离心5min，弃上清,收集菌体。对于收集到的菌体，用1mL渗透缓冲液先润洗菌体，5000rpm室温下离心5min，弃去液体，之后再用新的渗透缓冲液将菌体重悬至OD600＝0.6～0.8，得到待注射菌液。
渗透缓冲液的配方如表5所示。
表5渗透缓冲液配方
| 试剂 | 使用体积 | 终浓度 |
| 100mmol/L AS | 75μL | 150μmol/L |
| 1mol/L MES | 500μL | 10mmol/L |
| 1mol/L MgCl2 | 500μL | 10mmol/L |
| ddH2O | 定容至50mL |
100mmol/L乙酰丁香酮(AS)的配制方法：称量0.3924g乙酰丁香酮粉末直接溶于20mL DMSO，滤膜除菌后分装，于-20℃条件下冻存。
1mol/L MES的配制方法：称量4.265g MES粉末溶于20mL超纯水。用1mol/L NaOH调节pH为5.6～5.7。
1mmol/L MgCl2的配制方法：称量1.9042g MgCl2粉末溶于20mL超纯水。
本实施例中，根据农杆菌含有的载体的种类不同(分别为pBWA-JTY、pBWA-X15和空载体pBWA)，待注射菌液共分为3种。将3种待注射菌液在室温下放置2～3h后对即将转色的杏果实进行注射，每个果实挑选4-6个不同的位置进行注射，并用记号笔圈出注射部位，5-7天后观察表型并取样。
如图9为3种农杆菌注射后，发育至成熟的果实的实物图，品种为银白。从图中可以明显看出，注射了含pBWA-JTY农杆菌的果实，其针孔附近的果肉明显变红，注射了另外两种农杆菌的果实，其针孔附近的果肉颜色变化不明显，由此说明，PaPDS控制了杏果实颜色的深浅，当该基因表达量提高时，杏果实的颜色变深。技术人员进一步测量了果实内的β-胡萝卜素等物质的含量，结果如图10所示。根据图10可知，与对照pBWA-X15和pBWA相比，注射含有pBWA-JTY的农杆菌混悬液促进了杏果实中PaPDS的表达和β-胡萝卜素及其上游代谢产物的积累。
为进一步验证X15-PaPDS和JTY-PaPDS基因的功能，构建VIGS沉默载体，对PaPDS进行瞬时VIGS沉默分析。VIGS沉默载体将使目的基因转录出的mRNA被降解，mRNA无法正常翻译。
首先进行目的基因的克隆，以上述含有JTY-PAPDS重组克隆载体的大肠杆菌菌液为模板，通过PCR法克隆目的基因，使用的引物为：
TRVⅡ-GFP-F：5'-TGAGTAAGGTTACCGAATTCTCCCGAATACAGAAAATTGAGCTA-3'
TRVⅡ-GFP-R：5'-GGACATGCCCGGGCCTCGAGACATGTTACAGACATGTCAGCA-3'
其中，TRVⅡ-GFP-F引物向目的片段的一端添加了同源重组序列和EcoRⅠ识别序列，TRVⅡ-GFP-R引物向目的片段的另一端添加了同源重组序列和XhoⅠ识别序列，以便后续使用同源重组法构建重组质粒。使用的PCR反应体系如表6所示，PCR程序如表7所示。
表6沉默载体克隆用PCR反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 2×P515酶 | 20μL |
| TRVⅡ-GFP-F(10μM) | 1μL |
| TRVⅡ-GFP-R(10μM) | 1μL |
| 模板 | 1uL |
| 灭菌ddH2O | 17μL |
表7沉默载体克隆用PCR反应程序
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 95℃ | 5分钟 | 1 |
| 95℃ | 30秒 | 33 |
| 56℃ | 30秒 | 33 |
| 72℃ | 120秒 | 33 |
| 72℃ | 10分钟 | 1 |
| 4℃ | 30分钟 | 1 |
最终扩增得到的PCR产物中，包含的JTY-PaPDS的编码区序列为(SEQ ID NO.3)：
tcccgaatacagaaaattgagctaaataaagatgggaccgtgaagagttttgtactaaataatgggagcatgattgaagcagatgcctatgtatttgccactccagttgacatcctaaagcttctattgcctgataactggaaagagatcccatatttcaagaaattggagaaactaattggcgttccagttatcaatgttcacatatggtttgacagaaagctgaagaacacatatgatcatctactttttagcaggagtcctcttttaagtgtctatgctgacatgtctgtaacatgt
对于得到的PCR产物，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。将PCR产物加入凝胶的点样孔中，在电压60～100V条件下进行电泳，样品中的DNA由负极向正极方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。电泳结果如图11所示，图中左侧为Marker,右侧最亮的条带即为目的片段的条带。在紫外灯下快速切取含有目的条带的凝胶，转移到2.0mL的离心管中，按照Magen胶回收试剂盒(HiPure Gel Pure DNA Mini Kit)的说明书，进行目的片段回收，得到第五回收产物，置于-20℃保存备用。
接下来对TRVⅡ-GFP载体进行线性化，使用的限制酶为EcoRⅠ和XhoⅠ，反应体系如表8所示,TRVⅡ-GFP载体如图16所示。酶切时，在37℃条件下孵育40min；孵育结束后，将反应体系置于65℃条件下20min，以使得限制酶失活。
表8TRVⅡ-GFP载体双酶切反应体系
| 反应体系 | 使用量 |
| 5×Tango buffer | 4.0μl |
| EcoRⅠ | 2μL |
| XhoⅠ | 1μL |
| 质粒(TRVⅡ-GFP) | 8μg |
| ddH2O | 定容至40μL |
酶切后，对酶切产物琼脂糖凝胶电泳，切取线性化后的TRVⅡ-GFP载体大片段对应条带的凝胶，按照Magen胶回收试剂盒的说明书，对线性化的TRVⅡ-GFP载体的大片段进行回收，回收产物置于-20℃保存备用。EcoRI和XhoI共同从载体上切下的短片段为小片段，小片段不能被回收。
接下来将第五回收产物和线性化的TRVⅡ-GFP载体进行连接。本实施例中采用同源重组的方法构建重组载体，方法为：在PCR管中加入反应缓冲液，向反应缓冲液中加入2μL目的DNA片段(第五回收产物)和3μL线性化载体，最后加入同源重组酶。混匀后在37℃保温30min，即得到重组TRVⅡ-GFP载体。
使用重组TRVⅡ-GFP载体转化大肠杆菌，转化方法如下：
a.冰上融化一管50uL的大肠感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入10uL的重组TRVⅡ-GFP载体到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育30min。
b.42℃水浴中热激50s后快速放入冰上2min。
c.加入700uL LB液体培养基，37℃摇床孵育60min。
d.在超净台中取400uL菌液均匀涂板(卡那霉素抗性)，待平板干后37℃倒置过夜。
37℃倒置培养过夜后，挑取10个单克隆，使用PCR法进行阳性克隆鉴定，方法同上述含重组克隆载体的大肠杆菌PCR鉴定方法。PCR时使用的引物为：
pTRV2-seq-F:5'-GAGTCCCACATATTCGCACG-3'
pTRV2-seq-R:5'-CCCCCCAACAATCTCTTAGC-3'
PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图12所示，图中右侧的条带为目的条带，挑选了3个阳性克隆送测序，选择一个测序正确的克隆进行摇菌，并利用Plasmid Mini KitⅠ(OMEGA，货号：D6943-01)提取质粒，提取到的质粒即重组TRVⅡ-GFP载体。
使用重组TRVⅡ-GFP载体和配套的TRVⅠ载体分别转化农杆菌，并另外使用TRVⅡ-GFP空载体转化农杆菌。转化农杆菌的方法如下：
a.取出GV3101感受态细胞50uL，冰上融化；
b.加入5uL质粒，轻微混匀，冰浴15min；
c.液氮速冻5min；
d.37℃水浴5min；
e.冰浴5min；
f.加入700uL无抗性LB液体培养基，28℃摇2h；
g.取400uL菌液涂平板(平板中添加卡那霉素和利福平，两种抗生素的终浓度均为50mg/L),28℃倒置培养；
h.待单菌落长出后，每种载体选5个单菌落做菌落PCR验证，验证时使用引物pTRV2-seq-F和pTRV2-seq-R。验证PCR结果如图13所示，每种质粒挑选一个经验证为正确的克隆进行摇菌，以用于收集农杆菌菌体。
按照上述收集含重组过表达载体农杆菌菌体的方法，分别对转入TRVⅠ载体的农杆菌菌体、转入重组TRVⅡ-GFP载体的农杆菌菌体和转入TRVⅡ-GFP空载的农杆菌菌体进行收集，并用30mL左右的渗透缓冲液悬浮，使终浓度OD600值为0.6～0.8。而后将转入TRVⅠ的农杆菌悬浮液与转入TRVⅡ-GFP空载的农杆菌悬浮液等体积混匀，用于侵染对照组果实；将转入TRVⅠ的农杆菌悬浮液与转入重组TRVⅡ-GFP载体的农杆菌悬浮液等体积混匀，用于侵染实验组果实。侵染果实的方法同上述重组过表达载体侵染果实的方法。被侵染的果实(品种为苹果杏)照片如图14所示。图中TRV1+TRV2为对照组果实，对照组果实被注射农杆菌的区域的颜色正常，TRV1+TRV2：PaPDS为实验组果实，实验组果实被注射农杆菌的区域的橙色明显浅于未被注射的区域，说明实验组果实中PaPDS基因被沉默后，果实的橙色变浅，即PaPDS基因控制了杏果实橙色的深浅。技术人员进一步测定了果实内的β-胡萝卜素等物质的含量，结果如图15所示。由图15可知，与对照(TRV1+TRV2)相比，实验组(TRV1+TRV2：PaPDS)杏果实中PaPDS的表达和β-胡萝卜素及其上游代谢产物的积累均受到了抑制。
本实施例中，上述重组过表达载体和重组TRVⅡ-GFP载体均直接用于转化杏果实细胞，在其他的一些实施例中，也可以用这两种载体转化杏树幼苗，并将幼苗培养成完整的个体，以改变该幼苗所结的果实的颜色。此外，也可以将JTY-PaPDS基因的cDNA与其他植物表达载体构成重组载体，并将重组载体转化杏树幼苗或者杏果实，以加深杏果实的颜色。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种调控杏果实色泽的功能基因PaPDS，其特征在于，PaPDS基因的序列如SEQ IDNO.1所示，PaPDS基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.含有调控杏果实色泽的功能基因PaPDS基因编码区序列的过表达重组载体在加深杏果实颜色中的应用，其特征在于，PaPDS基因编码区序列为SEQ ID NO.1所示的序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，重组载体的原始载体为pMD19-T，PaPDS基因编码区序列位于pMD19-T载体的SalⅠ和XbaⅠ两限制性内切酶位点之间，PaPDS基因编码区序列为如SEQ ID NO.1所示的序列。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，重组载体的原始载体为pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos，PaPDS基因编码区序列插在pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体上BsaⅠ限制性内切酶的切割位置处，PaPDS基因编码区序列为如SEQ ID NO.1所示序列。
5.含有调控杏果实色泽的功能基因PaPDS基因编码区序列的重组载体在减淡杏果实颜色中的应用，其特征在于，重组载体的原始载体为TRVⅡ-GFP，PaPDS基因编码区序列插在TRVⅡ-GFP载体的EcoRⅠ和XhoⅠ两限制性内切酶位点之间，PaPDS基因编码区序列为如SEQID NO.3所示的序列。
6.一种加深杏果实颜色的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的调控杏果实色泽的功能基因PaPDS的过表达重组载体转化至杏树幼苗或者杏果实。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，重组载体的原始载体为pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos，PaPDS基因编码区序列插在pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体上BsaⅠ限制性内切酶的切割位置处，PaPDS基因编码区序列为如SEQ ID NO.1所示序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用含重组pBWA(V)HS-osgfp-ccdb-tnos载体的GV3101农杆菌，将调控杏果实色泽的功能基因PaPDS转化至杏树幼苗或者杏果实。
9.一种减淡杏果实颜色的方法，其特征在于，使用含重组载体的重组工程菌、以及含TRVⅠ载体的重组工程菌共同转化杏树幼苗或杏果实，所述重组载体为TRVⅡ-GFP，PaPDS基因编码区序列插在TRVⅡ-GFP载体的EcoRⅠ和XhoⅠ两限制性内切酶位点之间，PaPDS基因编码区序列为如SEQ ID NO.3所示的序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，含重组TRVⅡ-GFP载体的重组工程菌和含TRVⅠ载体的重组工程菌均为GV3101农杆菌。
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