CN117756911A - 一种溶质载体蛋白urat1及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种溶质载体蛋白URAT1及其制备方法和应用，所述溶质载体蛋白URA T1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的溶质载体蛋白URAT1比野生型URAT 1的蛋白产量提高了近三倍，且具有良好的聚集状态和均一性，适用于冷冻电镜结构解析，为该蛋白的结构解析及活性小分子药物的筛选提供了条件，进而为改造该蛋白及开发靶向性新型药物分子提供了研究基础。

Description

一种溶质载体蛋白URAT1及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白质表达技术领域，具体涉及一种溶质载体蛋白URAT1及其制备方法和应用。

背景技术

溶质载体超家族(SLC)是仅次于G蛋白偶联受体的第二大膜蛋白家族，负责膜上多种物质如离子、氨基酸、核苷酸和糖等的跨膜转运，溶质载体蛋白URAT1属于SLC22家族中有机阴离子转运体(0AT)亚家族的成员，是一种存在12个跨膜区的膜转运蛋白，主要在肾脏近端小管上皮细胞的顶端刷缘膜上表达，对于调节尿酸稳定性具有重要作用。

高尿酸血症是由尿酸在正常人体代谢中产生过多或排泄减少引起血尿酸水平升高而产生，其患病人数在全球范围内呈逐年稳步增长态势，高尿酸血症不仅是痛风的主要危害因素，与糖尿病、高血压以及高脂血症之间也存在着紧密相关性，并可诱发炎性反应，加重血管内皮损伤，最终加速冠心病和肾脏损伤的进展。

URAT1作为高尿酸血症发病的一个关键靶点，其抑制剂通过降低重吸收的方式，减少血液尿酸水平，常用于高尿酸血症与痛风的治疗，目前还没有批准上市的抑制剂，但是一些药物已经进入临床研究阶段如雷西纳德、Dotinurad等，基于结构的药物设计可以依据结构更好的优化设计药物，从而提供药物疗效，然而，膜蛋白是一类难以表达、纯化和表征的蛋白质，但获得高质量的蛋白样品是研究膜蛋白结构、功能等的前提，目前关于URAT1蛋白的结构还没有报道，这也有可能是限制其药物开发的原因之一。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种溶质载体蛋白URAT1及其制备方法和应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供一种溶质载体蛋白URAT1，所述溶质载体蛋白URAT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的溶质载体蛋白URAT1。

作为本发明的进一步优化方案，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组质粒，所述重组质粒为含有多核苷酸且能够翻译表达出溶质载体蛋白URAT1的表达载体。

作为本发明的进一步优化方案，所述表达载体带有eGFP-StrepⅡ-10His标签，所述标签的序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的进一步优化方案，所述表达载体为pcDNA3.1。

一种溶质载体蛋白URAT1的表达系统，为含有重组质粒或基因组中整合有多核苷酸的Expi 293F GnTI-细胞。

一种溶质载体蛋白URAT1的制备方法，包括以下步骤：

(1)将野生型URAT1蛋白进行突变，避开影响野生型URAT1蛋白构象的位点，获得突变蛋白的氨基酸序列，所述野生型URAT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述突变包括：第22位的甲硫氨酸突变成丙氨酸，第36位的甲硫氨酸突变成亮氨酸，第64位的亮氨酸突变成苏氨酸，第136位的天冬酰胺突变成天冬氨酸，第153位的亮氨酸突变成甲硫氨酸，第162位的丙氨酸突变成缬氨酸，第227位的丙氨酸突变成苏氨酸，第260位的亮氨酸突变成色氨酸，第354位的苏氨酸突变成丝氨酸，第356位的半胱氨酸突变成缬氨酸，第360位的苯丙氨酸突变成苏氨酸，第466位的甲硫氨酸突变成谷氨酰胺，第478位的甘氨酸突变成缬氨酸，第483位的甘氨酸突变成丙氨酸，第519位的谷氨酰胺突变成亮氨酸，第531位的谷氨酰胺突变成谷氨酸；突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)根据突变蛋白的氨基酸序列合成能够编码该氨基酸序列的核苷酸序列，并插入蛋白表达载体中，获得重组质粒；

(3)将重组质粒转染至蛋白表达系统中进行蛋白表达和纯化，获得所述溶质载体蛋白URAT1。

作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)的蛋白表达步骤包括：将重组质粒按照转染比例2：3与转染试剂混合孵育，形成的混合物瞬时转染到Expi 293F GnTI-细胞中进行表达；

作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中的蛋白纯化步骤包括：利用去垢剂提取膜蛋白，所述去垢剂的组分及其质量百分比包括：1％ DDM,0.1％ CHS。

一种溶质载体蛋白URAT1在URAT1结构解析、URAT1活性分析、基于结构的药物设计和药物筛选中的应用。

本发明提具有如下有益效果：

本发明提供的溶质载体蛋白URAT1-M1比野生型URAT1的蛋白产量提高了近三倍，且具有良好的聚集状态和均一性，电镜负染检测结果表明溶质载体蛋白URAT1-M1具有更好的均一性，适用于冷冻电镜结构解析，因此，本发明提供的溶质载体蛋白URAT 1-M1为该蛋白的结构解析及活性小分子药物的筛选提供了条件，进而为改造该蛋白及开发靶向性新型药物分子提供了研究基础。

附图说明

图1为含有HRV3C酶切位点和eGFP、Strep II、10His标签的pcDNA3.1表达载体图谱。

图2为野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2、URAT1-M3的AlphaFold2的蛋白结构预测结果图；

图3为野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2、URAT1-M3小量表达Western Blot检测结果；

图4为野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2、URAT1-M3小量表达的FSEC荧光检测结果；

图5为野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2的亲和纯化结果；

图6为野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2亲和后凝胶过滤层析的纯化结果；

图7为野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2的SDS-PAGE质量检测结果；

图8为野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2的负染图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料

本发明所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

2、方法

2.1重组质粒的构建

野生型URAT1(氨基酸序列见SEQ ID NO.4)以及突变型URAT1-M1(氨基酸序列见SEQ ID NO.1)、URAT1-M2(氨基酸序列见SEQ ID NO.5)、URAT1-M3(氨基酸序列见SEQ IDNO.6)的基因序列均是通过基因合成获得，具体为：

为了便于后续蛋白表达，将HRV3C酶切位点和eGFP、Strep II、10His标签构建在表达载体上，表达载体为pcDNA3.1，含有酶切位点和标签的表达载体图谱见图1，重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致；

酶切位点和标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中：

HRV3C酶切位点的蛋白序列具体为：LEVLFQGP；

标签eGFP的蛋白序列具体为：TAAAAVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSV SGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSGGG；

标签Strep II的蛋白序列具体为：WSHPQFEK；

标签10His的蛋白序列具体为：HHHHHHHHHH；

URAT1-M1在野生型URAT1的原始氨基酸序列基础上具有16个氨基酸突变位点，分别为：第22位的甲硫氨酸突变成丙氨酸，第36位的甲硫氨酸突变成亮氨酸，第64位的亮氨酸突变成苏氨酸，第136位的天冬酰胺突变成天冬氨酸，第153位的亮氨酸突变成甲硫氨酸，第162位的丙氨酸突变成缬氨酸，第227位的丙氨酸突变成苏氨酸，第260位的亮氨酸突变成色氨酸，第354位的苏氨酸突变成丝氨酸，第356位的半胱氨酸突变成缬氨酸，第360位的苯丙氨酸突变成苏氨酸，第466位的甲硫氨酸突变成谷氨酰胺，第478位的甘氨酸突变成缬氨酸，第483位的甘氨酸突变成丙氨酸，第519位的谷氨酰胺突变成亮氨酸，第531位的谷氨酰胺突变成谷氨酸；

URAT1-M2在野生型URAT1的原始氨基酸序列基础上具有14个氨基酸突变位点，分别为：第25位的甲硫氨酸突变成丝氨酸，第35位的丝氨酸突变成天冬酰胺，第134位的赖氨酸突变成谷氨酸，第142位的组氨酸突变成精氨酸，第166位的丙氨酸突变成亮氨酸，第245位的组氨酸突变成谷氨酰胺，第272位的半胱氨酸突变成苯丙氨酸，第309位的甘氨酸突变成赖氨酸，第383位的甲硫氨酸突变成缬氨酸，第384位的苯丙氨酸突变成异亮氨酸，第385位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸，第442位的亮氨酸突变成赖氨酸，第453位的苏氨酸突变成酪氨酸，第520位的丝氨酸突变成天冬酰胺；

URAT1-M3在野生型URAT1的原始氨基酸序列基础上具有13个氨基酸突变位点，分别为：第32位的半胱氨酸突变成丙氨酸，第107位的丝氨酸突变成天冬酰胺，第133位的丙氨酸突变成苏氨酸，第195位的丙氨酸突变成丝氨酸，第226位的丙氨酸突变成脯氨酸，第246位的甘氨酸突变成甲硫氨酸，第248位的苏氨酸突变成亮氨酸，第259位的苏氨酸突变成精氨酸，第294位的色氨酸突变成谷氨酸，第312位的谷氨酰胺突变成甘氨酸，第339位的苏氨酸突变成天冬氨酸，第343位的甲硫氨酸突变成苏氨酸，第348位的苯丙氨酸突变成精氨酸。

2.2URAT1蛋白结构预测

根据野生型URAT1蛋白的结构进行突变体设计，设计时避开影响野生型URAT1蛋白活性的位点，通过AlphaFold 2软件对野生型URAT1、突变型URAT1-M1、URAT1-M2、URAT1-M3的结构进行预测(官网：https://alphafold.ebi.ac.uk/)，验证这些突变位点是否会影响蛋白的活性。预测的结果见图2，根据预测的结构可知，URAT1-M1、URAT 1-M2和URAT1-M3的整体结构与野生型URAT1的结构基本无差异，说明突变没有改变溶质载体蛋白URAT1的构象变化，活性不会受到影响。

2.3URAT1蛋白表达及纯化

2.3.1、小量表达

采用瞬时转染技术，将野生型URAT1、URAT1-M1、URAT1-M2、URAT1-M3四种类型的重组质粒分别按照转染比例2：3、2：4与转染试剂PEI混合孵育，孵育形成的混合物瞬时转染到Expi 293F GnTI-细胞(Thermofisher，A39242CN)中，在37℃,115rpm，8％ CO₂条件下培养进行小量表达，转染后48小时各取样进行Western Blot检测和FS EC荧光检测；

如图3所示，根据小量表达的Western Blot检测结果可知，野生型URAT1表达不明显，URAT1-M1、URAT1-M2和URAT1-M3均有明显表达；

如图4所示，根据FSEC荧光检测结果可知，三种URAT1突变体的荧光吸收均比野生型URAT1高，则说明URAT1突变体比野生型URAT1的表达量高，其中，URAT1-M3表达量提高较低，URAT1-M1产量提高的最多，其中URAT1-M1在转染比例为2:3的条件下表达量最高。

2.3.2、大量表达

为了进一步比较URAT1突变体与野生型URAT1的产量，将表达量提高明显的URAT

1-M1和URAT1-M2与野生型URAT1进行大量表达及纯化；

根据小量表达检测的结果，选取野生型URAT1和URAT1-M1、URAT1-M2三种类型的重组质粒，分别按照转染比例(重组质粒：转染试剂PEI)为2：3瞬时转染到Expi 293FGnTI-细胞中，放入培养箱，在37℃，115rpm，8％ CO₂条件下培养细胞，野生型URAT1和URAT1-M1、URAT1-M2瞬时转染的细胞培养体积各为1.6L，在转染后48小时进行收取细胞。

2.3.3、蛋白纯化

2.3.3.1、将步骤2.3.2中收取的细胞加入相应体积的裂解缓冲液(20mM HEPESpH7.5，150mM NaCl,非特异性核酸内切酶(Serratia marcescens non-specificendonuclease,SMNE)和蛋白酶抑制剂Protease inhibitor(Biortus))，用磁力搅拌器将颗粒充分混合；使用高压均质机破碎细胞后以离心力10000g离心10分钟收集上清，上清液再以40000rpm离心30分钟，弃上清，收集细胞沉淀，加入裂解缓冲液重悬细胞，研磨管研磨后形成匀浆液，再加入1％十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside,DDM),0.1％胆固醇琥珀酸单酯(Cholesteryl hemisuccinate,CHS)孵育2小时进行溶膜；溶膜结束后，40000rpm离心30分钟后收集上清液；使用亲和层析柱Anti-GFP nanobody和Strep富集纯化蛋白，纯化前先用缓冲液Buffer A平衡Anti-GFP nanobody亲和层析柱，将所有细胞上清液加载到Anti-GFP nanobody亲和柱上，缓冲液Buffer A和缓冲液Buffer B洗脱去除杂蛋白，再使用HRV3C酶在Anti-GFP nanobody亲和柱上过夜酶切以去除C端标签，酶切后的样品加载到已用Buffer B平衡好的Strep亲和柱上，最终收集为上样Strep亲和柱时的流穿液和Buffer B清洗下来的蛋白样品，即酶切后去除标签的目的蛋白的样品；每个步骤的蛋白样品均取样进行SDS-PAGE检测；

缓冲液Buffer A为：50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.1％ DDM,0.01％CHS,5mMATP,10mM MgCl₂；

缓冲液Buffer B为：50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.1％ DDM,0.01％CHS；

如图5所示，根据SDS-PAGE结果可知，三种重组蛋白均能被富集到，其中野生型URAT1表达最低，URAT1-M2比野生型略高，URAT1-M1蛋白获得的产量最高，在胶图上条带显示明显。

2.3.3.2、为了获得纯度高、聚集状态良好的蛋白，将步骤2.3.3.1中收集的去除标签后的野生型URAT1和URAT1-M1、URAT1-M2蛋白样品进行凝胶过滤层析，凝胶层析柱的型号为：Superose 6Increase 10/300GL；

凝胶层析的buffer为：50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.003％十二烷基麦芽糖新戊基乙二醇(Lauryl maltose neopentyl glycol,LMNG),0.0003％ CHS；

分别收集野生型URAT1峰Peak 3(目标蛋白)、URAT1-M1峰Peak 3(目标蛋白)，URAT1-M2峰Peak 2的样品(目标蛋白)，将收集的凝胶过滤层析后的样品浓缩后分别进行SDS-PAGE质量检测，并用Nanodrop测定蛋白浓度，计算蛋白产量。

如图6所示，根据凝胶过滤层析峰图结果可知，URAT1-M1突变体蛋白UV-280吸收峰值高(峰Peak 3约为110mAU)，且峰较窄，野生型URAT1和URAT1-M2突变体蛋白UV-280吸收峰值低(URAT1峰Peak 3约为32mAU；URAT1-M2峰Peak 2约为35mAU)且峰较宽，说明URAT1-M1蛋白产量高，且均一性好；

根据图7的SDS-PAGE结果可知，URAT1-M1蛋白的目的条带在胶图上显示明显，产量和纯度都较高。根据Nanodrop测定的蛋白浓度计算蛋白总产量可知，野生型URAT1的蛋白浓度为1.56mg/mL，体积为0.05mL，因此，野生型URAT1的蛋白总产量为0.08mg/1.6L；URAT1-M2突变体的蛋白浓度为1.05mg/mL，体积为0.05mL，因此，URAT1-M2突变体的蛋白总产量为0.05mg/1.6L；而URAT1-M1突变体的蛋白浓度为1.09mg/mL,体积为0.2mL，计算得到的URAT1-M1突变体的蛋白总产量为0.22mg/1.6L，URAT1-M1突变体的蛋白产量较野生型URAT1和URAT1-M2突变体的蛋白产量提高了近三倍。

2.4野生型URAT1和URAT1突变体(URAT1-M1、URAT1-M2)的电镜负染检测

在获得纯度高且均一性好的URAT1突变体蛋白(步骤2.3.3.2所获得的URAT1突变体蛋白)后，为了进一步鉴定该蛋白是否可以用于结构解析，先用负染的方法对样品进行了检测，具体操作如下：

将野生型URAT1的Peak 3峰尖、突变体URAT1-M1的Peak 3峰尖、突变体URAT1-M2的Peak 2峰尖样品稀释至0.01-0.05mg/mL,吸取3μl蛋白样品滴加到铜网上，放置40秒，滤纸吸去多余样品，立即滴加3μl甲酸铀染料，清洗铜网上残留样品(重复一次)，立即滴加3μl甲酸铀染料，染色30秒，滤纸吸去多余染料，放置2分钟，grid干燥，将晾干后的grid放到200kvTF20电镜下观察并采集图像。

如图8所示，根据负染图显示，与野生型URAT1和URAT1-M2突变体相比，URAT1-M1蛋白聚集状态良好，均一性高，可用于进一步的结构解析，为URAT1结构的解析以及筛选小分子的应用提供了研究基础。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种溶质载体蛋白URAT1，其特征在于，所述溶质载体蛋白URAT1的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的溶质载体蛋白URAT1。

3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ IDNO.2所示。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为含有如权利要求2-3任一所述的多核苷酸且能够翻译表达出如权利要求1所述的溶质载体蛋白URAT1的表达载体。

5.根据权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述表达载体带有eGFP-Stre pⅡ-10His标签，所述标签的序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pcDNA3.1。

7.一种溶质载体蛋白URAT1的表达系统，其特征在于，为含有如权利要求4-6任一所述的重组质粒或基因组中整合有如权利要求2-3任一所述的多核苷酸的Expi 293FGnTI-细胞。

8.一种溶质载体蛋白URAT1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将野生型URAT1蛋白进行突变，避开影响野生型URAT1蛋白活性的位点，获得突变蛋白的氨基酸序列，所述野生型URAT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述突变包括：第22位的甲硫氨酸突变成丙氨酸，第36位的甲硫氨酸突变成亮氨酸，第64位的亮氨酸突变成苏氨酸，第136位的天冬酰胺突变成天冬氨酸，第153位的亮氨酸突变成甲硫氨酸，第162位的丙氨酸突变成缬氨酸，第227位的丙氨酸突变成苏氨酸，第260位的亮氨酸突变成色氨酸，第354位的苏氨酸突变成丝氨酸，第356位的半胱氨酸突变成缬氨酸，第360位的苯丙氨酸突变成苏氨酸，第466位的甲硫氨酸突变成谷氨酰胺，第478位的甘氨酸突变成缬氨酸，第483位的甘氨酸突变成丙氨酸，第519位的谷氨酰胺突变成亮氨酸，第531位的谷氨酰胺突变成谷氨酸；突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)根据突变蛋白的氨基酸序列合成能够编码该氨基酸序列的核苷酸序列，并插入蛋白表达载体中，获得重组质粒；

(3)将重组质粒转染至蛋白表达系统中进行蛋白表达和纯化，获得所述溶质载体蛋白URAT1。

9.根据权利要求8所述的一种溶质载体蛋白URAT1的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的蛋白表达步骤包括：将重组质粒按照转染比例2：3与转染试剂混合孵育，形成的混合物瞬时转染到Expi 293F GnTI-细胞中进行表达。

10.根据权利要求8所述的一种溶质载体蛋白URAT1的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的蛋白纯化步骤包括：利用去垢剂提取膜蛋白，所述去垢剂的组分及其质量百分比包括：1％DDM,0.1％CHS。

11.一种如权利要求1所述的溶质载体蛋白URAT1在URAT1结构解析、URAT1活性分析、基于结构的药物设计和药物筛选中的应用。