CN117756859A - 一种α-TOS修饰的环金属铱（III）配合物及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α‑TOS修饰的环金属铱(III)配合物及其合成方法和应用，本发明通过在环金属铱配合物前体中引入α‑TOS基团，构建得到了具有优异线粒体靶向能力和细胞荧光成像的配合物，本发明配合物能够有效抑制人源肿瘤细胞增殖，通过诱导肿瘤细胞内活性氧产生，最终诱导细胞凋亡和自噬，实现良好的抗肿瘤活性；此外，本发明配合物能够抑制肿瘤细胞线粒体呼吸和代谢，解决肿瘤细胞代谢适应的问题，具有广阔的应用前景。

Description

一种α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及一种α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物，还涉及上述配合物的合成方法和应用。

技术背景

线粒体处于能量代谢、氧化还原和细胞死亡途径的十字路口，在生理学和包括癌症在内的多种病理学环境中发挥着核心作用。与正常细胞相比，癌细胞表现出不同程度的线粒体功能差异，如：(1)线粒体数量增多；通常，细胞内线粒体的数量取决于这些细胞的代谢水平，癌症细胞表现出无限增殖和旺盛的新陈代谢，从而比正常细胞拥有更多的线粒体。(2)能量代谢变化；从通过氧化磷酸化产生ATP到在正常氧浓度下通过糖酵解产生ATP，功能失调的线粒体使肿瘤细胞能够在糖酵解和氧化磷酸化之间灵活切换，这些代谢适应将帮助癌症细胞生存和增殖，并逃避抗癌治疗。(3)线粒体膜电位升高和氧化应激增加；癌症细胞的线粒体膜电位高于正常细胞。线粒体作为选择性杀伤癌症细胞的药物靶向细胞器变得越来越有吸引力。

在非铂金属络合物的抗肿瘤研究中，铱(III)络合物被认为是铂类药物最有前途的替代品。一方面，环金属化Ir(III)配合物因其丰富的光物理性质，包括高量子产率、大斯托克斯位移、长荧光寿命、良好的光稳定性和强细胞穿透性，被广泛应用于生物成像和生物传感器。另一方面，环金属铱配合物由于自身携带正电荷而具有线粒体定位的先天优势。

天然产物或其衍生物具有多种生物活性，目前用于临床治疗的许多抗癌药物源自天然产物支架，如长春碱和紫杉醇。α-TOS(α-生育酚琥珀酸酯)，是天然维生素E的衍生物，被证明可以与线粒体呼吸链的复合体II相互作用，导致活性氧的形成。此外，α-TOS的促凋亡活性与其诱导线粒体不稳定的能力有关，通常涉及细胞色素c的释放和半胱天冬酶的激活。但单一的α-TOS存在用药剂量大的缺陷，这些限制了α-TOS作为候选抗癌药物或抗癌药物组分的应用。

发明内容

发明目的：本发明目的旨在提供一种α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物，该配合物具有优异的细胞摄取能力和线粒体靶向性，还能够诱导细胞凋亡和自噬；此外，本发明配合物还能够抑制肿瘤细胞线粒体呼吸和代谢，解决肿瘤细胞代谢适应的问题；本发明另一目的旨在提供上述α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法及其在用于制备抗肿瘤药物和抗肿瘤药物组分方面的应用。

技术方案：本发明所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物，所述配合物的化学结构式如下所示：

通过在环金属铱(III)配合物前体中引入α-TOS基团，构建得到了具有优异线粒体靶向能力和细胞荧光成像的配合物，α-TOS具有较好的脂溶性(高亲脂性)，将其与环金属铱(III)配合物前提结合，可提高肿瘤细胞对金属配合物的摄取量。

上述α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法，具体为：在惰性氛围下，将α-TOS修饰的联吡啶配体和环金属铱二聚体在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中加热回流反应，减压蒸馏除去溶剂，用NH₄PF₆置换得到粗产物，通过柱色谱对粗产物分离提纯得到α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物；

其中，所述α-TOS修饰的联吡啶配体的化学结构式如下所示：

其中，所述环金属铱二聚体的化学结构式如下所示：

其中，所述α-TOS修饰的联吡啶配体制备方法如下：在惰性氛围下，将α-TOS和桥联配体4-甲基-4’-氨基甲基-2,2’-联吡啶、EDCI和HOBT溶于干N，N-二甲基甲酰胺中，反应混合物在常温下反应，反应后将粗产物通过柱层析方法分离纯化即可。

上述桥联配体4-甲基-4’-氨基甲基-2,2’-联吡啶采用文献Bioactive ruthenium(II)-arene complexes containing modified 18beta-glycyrrhetinic acidligands.J.Inorg.Biochem.,2018,182,194-199.报道的方法制备得到。

其中，所述惰性氛围是利用氮气或氩气作为保护气。

其中，所述α-TOS修饰的联吡啶配体与环金属铱二聚体的反应摩尔比为1.2：1。

其中，所述混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为2：1。

其中，所述回流反应时间为12h；反应温度为45℃。

上述α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物在用于制备抗肿瘤药物和抗肿瘤药物组分方面的应用。

有益效果：相比于现有技术，本发明具有如下显著的效果：(1)本发明配合物能够解决单一的金属配合物前体或天然产物分子作为抗肿瘤药物时存在的药效低、用药剂量大、无靶向性、无法细胞成像的问题；(2)本发明配合物对多种肿瘤细胞均表现出优异的细胞毒性，其对人源宫颈癌细胞(HeLa)的IC₅₀值为10.7μM，说明其能够有效抑制肿瘤细胞的增殖；(3)本发明配合物有着优异的细胞摄取能力和线粒体靶向性，通过诱导肿瘤细胞内活性氧产生，最终诱导细胞凋亡和自噬，实现良好的抗肿瘤活性；(4)本发明配合物还能抑制肿瘤细胞线粒体呼吸和代谢，解决肿瘤细胞代谢适应的问题。

附图说明

图1为实施例1配合物Ir-TOS在HeLa细胞中的定位图；

图2为实施例1配合物Ir-TOS在HeLa细胞中促进细胞内活性氧生成的激光共聚焦荧光成像图和流式细胞图；其中，图2a为共聚焦荧光成像图，图2b为细胞流式图，图2c为荧光定量图；

图3为实施例1配合物Ir-TOS在HeLa细胞诱发线粒体膜电位变化的细胞流式图及其共聚焦荧光成像图；其中，图3a为共聚焦荧光成像图；图3b为不同浓度下的细胞流式图；

图4为实施例1配合物Ir-TOS在HeLa细胞中诱导凋亡和自噬蛋白的免疫印迹蛋白图；

图5为实施例1配合物Ir-TOS在HeLa细胞抑制线粒体呼吸和糖酵解代谢图。

具体实施方式

实施例1

本发明α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物(简称Ir-TOS)的合成方法，包括以下步骤：

步骤1：制备α-TOS修饰的联吡啶配体L1：将α-TOS(0.96g，1.8mmol)、4-甲基-4’-氨基甲基-2,2’-联吡啶(0.2g，1.0mmol)、EDCI(0.2g，1.2mmol)和HOBT(0.14g，0.8mmol)溶于干N，N-二甲基甲酰胺(DMF，25mL)中，反应混合物在常温氩气气氛下搅拌24小时，然后用冰冷水处理，过滤出白色沉淀物；以二氯甲烷/甲醇(25:1，v/v)为洗脱柱色谱法，将所得的固体溶于二氯甲烷中，然后用硅胶进行纯化，得到α-TOS修饰的联吡啶配体L1，产物质量为0.42g，产率为59％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.44(dd,J＝15.2,5.0Hz,2H),8.18–8.10(m,2H),7.06(dt,J＝15.6,3.2Hz,2H),4.35(d,J＝6.0Hz,2H),2.92(t,J＝6.8Hz,2H),2.58(t,J＝6.7Hz,2H),2.34(s,3H),2.04(s,3H),1.91(d,J＝19.6Hz,6H),1.73(dq,J＝12.7,6.6Hz,2H),1.41–1.36(m,2H),1.33–1.21(m,11H),1.17–1.04(m,7H),0.86(t,J＝6.0Hz,12H).

步骤2：将α-TOS修饰的联吡啶配体L1(0.043g,0.06mmol)与二氯桥联双核铱前体(0.063g,0.05mmol)加入到CH₂Cl₂/CH₃OH(2:1，v/v)的混合溶剂中，在氩气气氛下反应12h，反应温度为45℃，然后用NH₄PF₆进行阴离子交换分离，配合物的纯化产物以硅胶柱色谱法和CH₂Cl/CH₃OH作为洗脱剂进一步纯化，得到黄色的固体Ir-TOS，产率为80％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.27–8.14(m,4H),8.08–7.98(m,5H),7.93(dd,J＝5.7,1.6Hz,1H),7.75(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.69(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.37(q,J＝7.0Hz,2H),7.26(dd,J＝9.3,5.2Hz,2H),7.19–7.11(m,4H),7.06–6.93(m,2H),6.82(ddd,J＝9.4,5.4,1.7Hz,2H),6.60–6.49(m,2H),4.53(s,2H),3.06–2.67(m,4H),1.92(d,J＝28.3Hz,5H),1.58–1.06(m,35H),0.92–0.85(m,12H).ESI-MS(positive mode,m/z):calculated:1312.6,found:1312.7.

本发明方法的反应方程式为：

未进行α-TOS修饰的对照配合物Ir-COOH的结构式为：

未进行α-TOS修饰的对照配合物Ir-COOH的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：制备丁二酸酐修饰的联吡啶配体L2：将4-甲基-4’-氨基甲基-2,2’-联吡啶(0.2g，1.0mmol)溶于CH₂Cl₂，并加入溶于1mL DMF的丁二酸酐(0.2g，2.0mmol)；所得的混合物在室温下在氩气气氛下搅拌12小时，产生一种浅粉红色的浑浊液体，上清液离心后丢弃，沉淀物用水和乙醚洗涤三次，然后真空干燥得到浅粉红色固体，产率为53％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.16(s,1H),8.58(d,J＝4.9Hz,1H),8.54(d,J＝4.9Hz,1H),8.28(s,1H),8.23(s,1H),7.30(ddd,J＝7.7,5.1,1.5Hz,2H),4.38(d,J＝6.0Hz,2H),2.49–2.39(m,7H).

步骤2：将丁二酸酐修饰的联吡啶配体L2(0.028g,0.09mmol)与二氯桥联双核铱前体(0.06g,0.047mmol)加入到CH₂Cl₂/CH₃OH(2:1，v/v)的混合溶剂中，在氩气气氛下反应，然后用NH₄PF₆进行阴离子交换分离，配合物的纯化产物以硅胶柱色谱法和CH₂Cl/CH₃OH作为洗脱剂进一步纯化，得到橘红色的固体Ir-COOH，产率为71％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),8.60–8.52(m,4H),8.47(t,J＝5.9Hz,1H),8.34–8.22(m,4H),8.00–7.91(m,4H),7.51(t,J＝5.2Hz,2H),7.43(t,J＝7.5Hz,2H),7.29–7.03(m,6H),6.81(t,J＝7.5Hz,2H),6.39(dd,J＝10.2,7.7Hz,2H),4.38(d,J＝5.8Hz,2H),2.41(d,J＝4.3Hz,5H),1.23–1.07(m,2H).ESI-MS(positive mode,m/z):calculated:900.25,found:900.20.

将实施例1制得的配合物Ir-TOS与不含α-TOS的环金属铱(III)配合物Ir-COOH进行以下实验：

实施例1配合物对人源肺癌细胞HeLa及人肺成纤维样细胞HLF的细胞毒性：

采用MTT比色法来分析α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物Ir-TOS、α-TOS、不含α-TOS的环金属铱(III)配合物Ir-COOH以及顺铂CDDP的抗增殖效果。MTT(噻唑蓝)是一种四唑盐，可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原，生成一种蓝紫色产物甲臜(产物可溶于DMSO)，且该产物在570nm处有吸收峰，故可用A_{570 nm}来分析细胞增殖情况。

具体实验步骤如下：

(1)先复苏一管肿瘤细胞，用新鲜培养液(DMEM培养基+10％胎牛血清+1％盘尼西林和链霉素)培养，传代2次后使用；

(2)待细胞到达对数生长期时，以5000个/孔的细胞密度接种至96孔板中(每孔100μL培养液)，随即置于恒温箱(37℃，5％ CO₂)中培养；

(3)待细胞贴壁后，每孔分别加入100μL含不同浓度梯度的化合物Ir-TOS、含不同浓度梯度的α-TOS、含不同浓度梯度的化合物Ir-COOH及含不同浓度梯度的顺铂CDDP的新鲜培养液，随即置于恒温箱中继续孵育；

(4)孵育48小时后，在每孔中加入20μL MTT(5mg/mL)于37℃温箱中继续孵育4小时后，吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，使用酶联免疫检测仪检测A_570nm，计算细胞增殖抑制率，求出IC₅₀值(抑制率等于50％时对应的药物浓度)。化合物α-TOS、Ir-COOH、Ir-TOS及顺铂CDDP的MTT测试结果如表1所示。

表1为化合物α-TOS、Ir-COOH、Ir-TOS及顺铂CDDP的IC₅₀值(μM)

结果表明：配合物Ir-TOS对HeLa的增殖抑制活性高于天然产物α-TOS、化合物Ir-COOH和CDDP，表明经过α-TOS修饰的配合物Ir-TOS的抗肿瘤活性提高；同时配合物Ir-TOS对正常细胞依然具有较低的毒性。

实施例2

实施例1制得的环金属铱配合物Ir-TOS在细胞中的定位。

方法：HeLa细胞接种于35mm的Corning激光共聚焦培养皿中，当细胞密度生长至70％时，加入浓度为10μM的Ir-TOS处理6h后，吸出培养基，使用PBS洗两次，加入500μL配置好的线粒体绿色荧光探针，于37℃恒温箱中孵育30min后吸出探针，使用PBS清洗两次后更换新鲜预热的无血清培养基，随后立刻用共聚焦显微镜观察。

实施例1合成的环金属铱配合物Ir-TOS细胞内定位如图1所示，结果表明：环金属铱配合物Ir-TOS可以短时间内大量透过细胞膜被HeLa细胞摄取，且主要分布在线粒体中，共定位系数为0.92。

实施例3

实施例1制得的环金属铱配合物Ir-TOS对诱发细胞内活性氧生成的应用：

方法1：共聚焦显微镜检测癌细胞内的ROS。HeLa细胞接种于35mm的Corning激光共聚焦培养皿中，当细胞密度生长至70％时，分别加入浓度为10μM、20μM的Ir-TOS和20μMIr-COOH处理24h后，然后细胞用含10μM的H₂DCFH-DA的无血清培养基于37℃下避光染色30min，随后立刻用共聚焦显微镜观察，激发波长为488nm，发射波长为530±20nm。

方法2：流式细胞仪检测肿瘤细胞内的ROS。HeLa细胞分别加入浓度为10μM、20μM的Ir-TOS以及浓度为20μM的Ir-COOH处理24h后，用含10μM的H₂DCFH-DA的无血清培养基于37℃下避光染色30min，离心弃上清，用无血清的培养基洗涤三次，除去未进入细胞内的H₂DCFH-DA；收集细胞后半小时内用流式细胞仪测定绿色荧光强度；激发波长为488nm，发射波长为530±20nm。绿光的平均荧光强度用FlowJo 7.6(Tree Star,OR,USA)软件分析。

环金属铱配合物Ir-TOS对诱发细胞内活性氧生成的结果如图2所示。结果表明，与对照组相比，经过Ir-TOS处理后流式细胞术和共聚焦结果都显示绿色荧光明显增强，表明配合物Ir-TOS有效诱发细胞内活性氧含量升高。

实施例4

实施例1制得的环金属铱配合物Ir-TOS对诱发细胞内线粒体膜电位变化的应用：

方法1：共聚焦显微镜检测肿瘤细胞内线粒体膜电位的变化。HeLa细胞接种于35mm的Corning激光共聚焦培养皿中，当细胞密度生长至70％时，分别加入浓度为10μM、20μM的Ir-TOS以及浓度为20μM的Ir-COOH处理24h后，然后细胞用预先配置好的JC-1工作液在37℃下避光染色30min，随后立刻用共聚焦显微镜观察。

方法2：流式细胞仪检测肿瘤细胞内线粒体膜电位的变化。将含有10μM、20μM浓度的Ir-TOS以及浓度为20μM的Ir-COOH的细胞培养液分别加至接种有形态良好且长势正常的HeLa细胞的6孔板中，药物处理24h后，收取细胞，PBS洗涤，随后加入配制好的JC-1工作液染色30min；用buffer洗涤细胞并重悬，立即使用BD FACS verse流式细胞仪检测待测样品，并用FlowJo 7.6软件处理所得结果并进行分析。检测荧光通道为λex＝488nm，λem＝530±30nm；λex＝488nm，λem＝590±30nm。

环金属铱配合物Ir-TOS对诱发细胞内线粒体膜电位变化的结果如图3所示。结果表明：与对照组相比，经过配合物处理后可以观察到绿色荧光明显增强，红色荧光明显减弱，表明配合物Ir-TOS能有效诱发线粒体膜电位下降。通过流式细胞术的结果也表明了同样的结果。

实施例5

实施例1制得的环金属铱配合物Ir-TOS对诱导HeLa细胞凋亡和自噬的应用：

方法：利用蛋白免疫印迹(WB)检测相关蛋白含量变化。往已贴壁生长HeLa细胞的100mm培养皿中加入预先配制好的含有配合物Ir-TOS(5、10、20μM)，和Ir-COOH(20μM)的细胞培养液，待药物处理24h后，离心收集细胞，PBS洗涤以去除残留培养液中的血清，加入含有PMSF的碧云天RIPA强裂解液进行20min的全细胞裂解，在这整个过程中保证4℃低温环境以确保蛋白不变性。结束后在低温条件下以13400rpm转速离心20min，吸取离心所得上清液即是实验所需的细胞全蛋白样品；使用BCA蛋白含量检测试剂盒确定上述蛋白样品中的蛋白浓度；利用SDS-PAGE凝胶电泳对样品内不同蛋白表达含量进行检测。制好胶之后，向每个孔中加入相同体积的蛋白样品进行凝胶电泳实验，适当分离后立即停止电泳；使用湿法将目的蛋白转至PVDF膜上，结束后，将膜置于含有5％脱脂奶粉中封闭2h。根据抗体的使用说明按照相应的比例用脱脂奶粉对一抗进行稀释，将封闭好的膜置于一抗孵育液中室温孵育一段时间使其与目的蛋白特异性地结合。结束后，用PBST洗涤(5×6min/次)。将洗干净的膜置于预先配制好的二抗孵育液中孵育一段时间使其与一抗结合，同样用PBST进行洗涤。配制等体积的ECL显影液，将其覆盖于PVDF膜上，处理2min后利用化学发光成像系统进行拍摄。

环金属铱配合物Ir-TOS对HeLa细胞诱导细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的实验结果如图4所示。结果表明：与未加药处理的对照组相比，细胞经过配合物Ir-TOS处理后标志性蛋白Cytochrome c和LC3-II蛋白含量呈浓度依赖性增加，Cleaved Caspase 3和p62蛋白含量呈浓度依赖性降低，说明配合物Ir-TOS可以诱导HeLa细胞凋亡和自噬。

实施例6

实施例1制得的环金属铱配合物Ir-TOS对诱导HeLa细胞抑制线粒体呼吸和糖酵解代谢的应用：

方法：用海马细胞外通量分析仪研究了Ir-TOS对线粒体生物能量的影响。将总共3×10⁴个细胞/孔接种于专用的XF24细胞培养板中待贴壁后，加入含有10μM浓度的Ir-TOS和Ir-COOH的细胞培养液孵育24h。随后，将含有25mM葡萄糖，1mM丙酮酸和2mM谷氨酰胺的XF测定培养基(Seahorse Bioscience)加入到孔中以维持刺激环境。然后将细胞培养板放置于不含CO₂培养箱中在37℃下温育1小时。在使用Seahorse XF24细胞外通量分析仪(Agilent)测量氧气消耗速率(OCR)期间，每24分钟依次注射1μM寡霉素、2μM FCCP(羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙)和1μM鱼藤酮以及1μM抗霉素A。细胞外酸化率(ECAR)检测步骤与OCR类似，每24分钟依次注射10mM葡萄糖、1μM寡霉素和50mM 2-DG。测试结束后，使用BCA蛋白定量检测试剂盒对XF24细胞培养板中的蛋白定量，OCR(耗氧率)和ECAR(细胞外酸化率)数据标准化为微克蛋白质。数据分析采用了四个基线率和最多五个测试率的平均值，计算线粒体呼吸功能参数。

环金属铱配合物Ir-TOS对诱导HeLa细胞抑制线粒体呼吸和糖酵解代谢的实验结果如图5所示，在Ir-TOS处理的细胞中检测到基础OCR，ATP产生，最大呼吸和非线粒体呼吸的减少。除此之外，Ir-TOS处理HeLa细胞的ECAR显著降低，说明配合物可以有效解决肿瘤细胞代谢适应的问题。

本发明通过在环金属铱配合物前体中引入α-TOS基团，构建得到了具有优异线粒体靶向能力和细胞荧光成像的配合物，本发明配合物能够有效抑制人源肿瘤细胞增殖，通过诱导肿瘤细胞内活性氧产生，最终诱导细胞凋亡和自噬，实现良好的抗肿瘤活性；此外，本发明配合物能够抑制肿瘤细胞线粒体呼吸和代谢，解决肿瘤细胞代谢适应的问题，具有广阔的应用前景。

Claims (8)

1.一种α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物，其特征在于，所述配合物的化学结构式为：

2.权利要求1所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法，其特征在于，具体为：在惰性氛围下，将α-TOS修饰的联吡啶配体和环金属铱二聚体在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中加热回流反应，减压蒸馏除去溶剂，用NH₄PF₆置换得到粗产物，通过柱色谱对粗产物分离提纯得到α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物；

其中，所述α-TOS修饰的联吡啶配体的化学结构式为：

所述环金属铱二聚体的化学结构式为：

3.根据权利要求2所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法，其特征在于，所述α-TOS修饰的联吡啶配体制备方法如下：在惰性氛围下，将α-TOS和桥联配体4-甲基-4’-氨基甲基-2,2’-联吡啶、EDCI和HOBT溶于干N，N-二甲基甲酰胺中，反应混合物在常温下反应，反应后将粗产物通过柱层析方法分离纯化即可。

4.根据权利要求2所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法，其特征在于：所述惰性氛围是利用氮气或氩气保护。

5.根据权利要求2所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法，其特征在于：所述α-TOS修饰的联吡啶配体与环金属铱二聚体的反应摩尔比为1.2：1。

6.根据权利要求2所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法，其特征在于：所述混合溶剂中，二氯甲烷和甲醇的混合体积比为2：1。

7.根据权利要求2所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物的合成方法，其特征在于：所述回流反应时间为12小时；反应温度为45℃。

8.权利要求1所述的α-TOS修饰的环金属铱(III)配合物在用于制备抗肿瘤药物和抗肿瘤药物组分中的应用。