CN117716040A - 用于抑制神经生长因子和治疗/预防房颤的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于抑制神经生长因子(NGF)和治疗/预防房颤的组合物和方法。特别地，将NGF表达抑制剂施用于受试者的心肌组织以治疗或预防房颤和/或心房中的自主神经芽生。

Description

用于抑制神经生长因子和治疗/预防房颤的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年6月14日提交的美国临时专利申请号63/210,338和2021年8月27日提交的美国临时专利申请号63/237,933的优先权，这两个申请均以引用方式并入本文。

序列表

与本申请一起提交的2022年6月14日创建的标题为“39552-601_SEQUENCE_LISTING_ST25”、文件大小为652字节的计算机可读序列表的文本以引用方式全文并入本文。

关于联邦资助的声明

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的HL140061的政府支持下完成的。政府对本发明具有某些权利。

技术领域

本文提供了用于抑制神经生长因子(NGF)和治疗/预防房颤的组合物和方法。特别地，将NGF表达抑制剂施用于受试者的心肌组织以治疗或预防房颤和/或心房中的自主神经芽生。

背景技术

房颤(AF)是最常见的心律紊乱(Benjamin E J,Levy D,Vaziri S M,D'AgostinoR B,Belanger AJ,Wolf P A."Independent risk factors for atrial fibrillation ina population-based cohort.The Framingham Heart Study,"JAMA1994；271:840-4；其以引用方式全文并入)，并且是中风和HF的主要危险因素(Balasubramaniam R,Kistler PM.AF and"Heart failure:the chicken or the egg？"Heart 2009；95:535-9；Lakshminarayan K,Anderson D C,Herzog C A,Qureshi A I."Clinical epidemiologyof atrial fibrillation and related cerebrovascular events in the UnitedStates,"Neurologist 2008；14:143-50；Lip G Y,Kakar P,Watson T."Atrialfibrillation--the growing epidemic"[comment],Heart 2007；93:542-3；其以引用方式全文并入)。目前用于解决AF的策略(诸如电消融)并未解决AF的具体潜在机制(BenMorrison T,Jared Bunch T,Gersh B J."Pathophysiology of concomitant atrialfibrillation and heart failure:implications for management,"Nat.Clin.Pract.Cardiovasc.Med 2009；6:46-56；其以引用方式全文并入)。因此，最近的研究试图更好地定义AF的潜在机制，以便改善消融的成功并开发AF的新生物疗法。

发明内容

本文提供了用于抑制神经生长因子(NGF)和治疗/预防房颤的组合物和方法。特别地，将NGF表达抑制剂施用于受试者的心肌组织以治疗或预防房颤和/或心房中的自主神经芽生。

在一些实施方案中，本文提供治疗和/或预防受试者的房颤(AF)的方法，其包括向所述受试者施用有效量的神经生长因子(NGF)抑制剂。在一些实施方案中，所述受试者患有AF。在一些实施方案中，所述受试者处于AF的升高的风险下。在一些实施方案中，NGF抑制剂抑制NGF的表达。在一些实施方案中，NGF抑制剂包括核酸。在一些实施方案中，施用核酸包括施用编码核酸并允许核酸在受试者的细胞内表达的载体(例如质粒、病毒载体、非病毒载体等)和/或转基因。在一些实施方案中，施用核酸包括将核酸直接施用于受试者。在一些实施方案中，将NGF抑制剂施用于受试者的心肌组织。在一些实施方案中，心肌组织包括心房或心室组织。在一些实施方案中，将NGF抑制剂施用于左心耳。在一些实施方案中，所述核酸是反义RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一些实施方案中，所述核酸是与SEQ ID NO:1包含至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或它们之间的范围)序列同一性的NGF shRNA。在一些实施方案中，施用NGF抑制剂包括将NGF抑制剂注射到受试者的组织中。在一些实施方案中，注射通过无针注射进行。在一些实施方案中，注射通过微针注射进行。在一些实施方案中，所述方法还包括评估受试者的心肌组织(例如，心房组织)状态的参数。在一些实施方案中，评估受试者的心房组织状态的参数包括在向受试者施用NGF抑制剂之前和/或之后监测与AF相关的电生理测量值或评估心肌组织的区域的神经芽生。在一些实施方案中，评估受试者的心房组织状态的参数包括监测与选自AF发作、AF持续时间、AF发病诱导性、有效不应期、传导性和传导性不均匀性指数的AF相关的电生理测量值。

在一些实施方案中，本文提供了包含能够抑制神经生长因子(NGF)的表达的核酸的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，所述核酸是反义RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一些实施方案中，所述核酸是编码反义RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)的载体(例如，质粒、病毒载体、非病毒载体等)或转基因。在一些实施方案中，所述核酸是编码针对NGF mRNA的小发夹RNA的分离的核酸。在一些实施方案中，NGF shRNA与SEQ ID NO:1包含至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或它们之间的范围)序列同一性。

在一些实施方案中，本文提供了包含本文的NGF抑制剂的组合物(例如，药物组合物)在治疗或预防AF中的用途。在一些实施方案中，本文提供了包含本文的NGF抑制剂的组合物(例如，药物组合物)作为药物的用途。在一些实施方案中，本文提供了包含本文的NGF抑制剂的组合物(例如，药物组合物)在制造药物中的用途。

附图说明

图1.在左心耳中靶向注射NGF shRNA预防RAP诱导的AF。

图2A-B.在左和右心房中靶向注射NGF shRNA预防RAP诱导的AF超过(A)28天和(B)12周的时间间隔。

定义

尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本文描述的实施方案的实践或测试中，但本文描述了一些优选的方法、组合物、装置和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，应了解的是本发明不限于本文描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些可以根据常规实验和优化而变化。还应了解，在本说明书中使用的术语是出于仅描述特定版本或实施方案的目的，并且不意图限制本文所述的实施方案的范围。

除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明领域内的普通技术人员对于本发明所属的通常理解的意义相同的意义。然而，在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。因此，在本文描述的实施方案的上下文中，以下定义适用。

除非上下文另外明确指示，否则如本文和所附权利要求中使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，提及“抑制剂”是指本领域技术人员已知的一种或多种抑制剂及其等同物，等等。

如本文所用，术语“和/或”包括所列项目的任何和所有组合，包括单独所列的项目中的任一个。例如，“A、B和/或C”包括A、B、C、AB、AC、BC和ABC，它们中的每一个被认为是由表述“A、B和/或C”单独描述的。

如本文所用，术语“包含”及其语言变型表示存在所列举的特征、要素、方法步骤等，而不排除存在另外的特征、要素、方法步骤等。相反，术语“由……组成”及其语言变型指示存在所列举的特征、要素、方法步骤等，并且排除任何未列举的特征、要素、方法步骤等，通常相关联的杂质除外。短语“基本上由……组成”表示所列举的特征、要素、方法步骤等以及不会对组合物、系统或方法的基本性质产生实质性影响的任何另外的特征、要素、方法步骤等。本文的许多实施方案使用开放性“包含”语言进行描述。此类实施方案涵盖可另选地使用此类语言来要求保护或进行描述的多个封闭性“由……组成”和/或“基本上由……组成”实施方案。

如本文所用，术语“受试者”广泛地指任何动物，包括人和非人动物(例如，狗、猫、牛、马、羊、家禽、鱼、甲壳类动物等)。如本文所用，术语“患者”通常是指正治疗疾病或疾患的受试者。

如本文所用，术语“预防”是指减少受试者(例如，处于风险下的受试者)发展或罹患特定疾病、病症或疾患(例如，AF)的可能性所采取的预防性步骤。在受试者中发生疾病、病症或疾患的可能性不需要降低至零以进行预防；相反，如果所述步骤降低人群中疾病、病症或疾患的风险，则所述步骤预防本文范围和含义内的个体受试者的疾病、病症或疾患。

如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得针对特定疾病、病症或疾患的所需药理学和/或生理学效应。优选地，所述作用是治疗性的，即所述作用部分或完全治愈患有疾病/疾患/症状的受试者的疾病/疾患/症状。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的组合物的量。有效量可以一个或多个施用、应用或剂量来施用并且不旨在限于具体制剂或施用途径。

如本文所用，术语“施用(administration/administering)”是指向受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官给予药物、前药或其他药剂或治疗性治疗的行为。向人体施用的示例性途径可以通过脑或脊髓的蛛网膜下的空间(鞘内)、眼睛(眼部)、口(口服)、皮肤(局部或经皮)、鼻子(经鼻)、肺(吸入剂)、口腔粘膜(经颊)、耳朵、直肠、阴道、通过注射(例如，静脉内、皮下、肿瘤内、腹膜内等)等进行。

如本文所用，术语“共施用(co-administration/co-administering)”是指向受试者施用至少两种药剂(例如，NGF抑制剂和一种或多种另外的治疗剂)或疗法。在一些实施方案中，两种或更多种药剂或疗法的共施用是同时的(例如，在单一制剂/组合物中或在分开的制剂/组合物中)。在其他实施方案中，第一药剂/疗法在第二个药剂/疗法之前施用。本领域的技术人员理解，制剂和/或所使用的各种药剂或疗法的施用途径可以变化。共施用的适当剂量可由本领域技术人员容易地确定。在一些实施方案中，当共施用药剂或疗法时，相应药剂或疗法以比适于其单独施用的剂量更低的剂量施用。因此，在药剂或疗法的共施用降低潜在有害(例如，毒性)药剂的必需剂量的实施方案中和/或当两种或更多种药剂的共施用通过另一种药剂的共施用导致受试者对药剂中的一种药剂的有益作用敏感时，共施用是特别期望的。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载剂的组合，使得组合物尤其适用于体外、体内或离体诊断或治疗用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当向受试者施用时基本上不产生不良反应，例如毒性、过敏或免疫反应的组合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指标准药物载体中的任何标准药物载剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，诸如油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、月桂基硫酸钠、等渗剂和吸收延迟剂、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羧甲淀粉钠)，等等。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于载剂、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，Remington'sPharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publ.Co.,Easton、Pa.(1975)，其全文以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐(例如，酸或碱)，其在施用于受试者后能够提供本发明化合物或其活性代谢物或残余物。如本领域技术人员已知的，本发明化合物的“盐”可以衍生自无机或有机酸和碱。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸(诸如草酸)虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备用作获得本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐的中间体的盐。

如本文所用，术语“用于向受试者施用所述化合物的说明书”及其语法等效物包括用于使用试剂盒中所含的组合物来治疗疾患的说明书(例如，提供给药、施用途径、治疗医师用于将患者特定的特征与治疗作用过程联系起来的决策树)。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸上的核酸序列的缔合，使得序列中的一个的功能受另一个的影响。例如，如果两个序列的位置使得调节DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下)，则称调节DNA序列与编码RNA(“RNA编码序列”或“shRNA编码序列”)或多肽的DNA序列“可操作地连接”。编码序列可以以有义或反义取向与调节序列可操作地连接。RNA编码序列指可用作用于合成RNA分子(诸如shRNA)的模板的核酸。优选地，RNA编码区是DNA序列。

如本文所用，术语“启动子”是指通常在其编码序列上游(5')的核苷酸序列，其通过提供对RNA聚合酶和正确转录所需的其他因子的识别来指导和/或控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，它是由TATA-盒和用于指定转录起始位点的其他序列组成的短DNA序列，其中添加了调控元件以控制表达。“启动子”也指包括最小启动子加上能够控制编码序列或功能性RNA的表达的调控元件的核苷酸序列。这种类型的启动子序列由近侧和更远侧的上游元件组成，后者通常称为增强子。因此，“增强子”是刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的天然元件或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。它能够在两个取向(有义或反义)上操作，并且即使在启动子上游或下游移动时也能够起作用。增强子和其他上游启动子元件都结合介导其作用的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以全部来源于天然基因，或由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或甚至由合成的DNA片段构成。启动子也可以包含参与蛋白质因子结合的DNA序列，所述蛋白质因子控制响应于生理或发育条件的转录起始的有效性。本领域已知的调节shRNA或RNA编码序列的表达的任何启动子在本发明的实践中是预想的。

如本文所用，术语“报告元件”或“标记”是指编码能够在筛选测定中检测到的多肽的多核苷酸。由报告元件编码的多肽的实例包括但不限于lacZ、GFP、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶。参见例如美国专利号7,416,849。许多报告元件和标记基因是本领域已知的，并且被设想用于本文公开的发明。

如本文所用，术语“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。“信使RNA转录物(mRNA)”是指不含内含子并且可被细胞翻译成蛋白质的RNA。

如本文所用，术语“shRNA”(小发夹RNA)是指RNA双链体，其中RNA的一部分是发夹结构(shRNA)的部分。除了双链体部分，发夹结构可以含有位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个核苷酸。发夹结构还可以含有3'或5'突出端部分。在一些方面，突出端是长度为0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸的3'或5'突出端。在本发明的一个方面，载体中的核苷酸序列用作表达小发夹RNA的模板，其包含有义区、环区和反义区。在表达后，有义区和反义区形成双链体。正是这种形成shRNA的双链体与例如NGF mRNA杂交并降低NGF的表达，减少神经芽生和/或治疗和/或预防AF。

如本文所用，术语“敲低”或“敲低技术”是指基因沉默技术，其中靶基因或感兴趣基因的表达与引入siRNA之前的基因表达相比降低，这可导致抑制靶基因产物的产生。“双敲低”是两个基因的敲低。本文使用的术语“降低”表示靶基因表达降低0.1-100％。例如，所述表达可以降低0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％。表达可以在这些间隔内减少降低量(％)，例如2-4、11-14、16-19、21-24、26-29、31-34、36-39、41-44、46-49、51-54、56-59、61-64、66-69、71-74、76-79、81-84、86-89、91-94、96、97、98或99。基因表达的敲低可以通过使用shRNA来引导。

如本文所用，术语“载体”是指任何病毒或非病毒载体，以及双链或单链线性或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或二元载体，其可以是或可以不是自身可传播的或可移动的，并且可以通过整合到细胞基因组中或可以存在于染色体外来转化原核或真核宿主细胞(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。本领域已知的任何载体都可用于本发明的实践。

具体实施方式

本文提供了用于抑制神经生长因子(NGF)和治疗/预防房颤的组合物和方法。特别地，将NGF表达抑制剂施用于受试者的心肌组织以治疗或预防房颤和/或心房中的自主神经芽生。

本文的实施方案提供了用于抑制患有房颤的受试者中的NGF表达和/或活性的组合物和方法。某些实施方案包括抑制NGF的表达以减少/抑制/预防心房中的自主神经芽生。在本文实施方案的开发期间，使用基于RNA干扰(RNAi)的NGF抑制剂，用针对NGF mRNA的小发夹RNA(NGF shRNA)进行实验。基于NGF shRNA的药物组合物抑制NGF基因的表达，导致AF的发生率较低。用于治疗AF的NGF抑制原理可容易地从本文证明的示例性NGF shRNA扩展到其他NGF抑制剂，而无需过度实验。药物组合物和方法的细节在本公开中更详细地呈现。

在一个方面，提供了用于治疗/预防房颤的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包括针对NGF基因的小发夹RNA(shRNA)("NGF shRNA")。shRNA可以是包括有义序列、环区域和反义序列(有时称为第一区域和第二区域)(它们一起形成发夹环结构)的单分子RNA。优选地，反义序列和有义序列基本上彼此互补(约80％互补或更多)，其中在某些实施方案中，反义序列和有义序列彼此100％互补。在某些实施方案中，反义序列和有义序列太短而不能被Dicer加工，因此通过较长双链RNA(例如，具有长度为约16至约22个核苷酸(例如，长度在18和19个核苷酸之间)的反义序列和有义序列的shRNA，例如sshRNA)的替代途径起作用。另外，本发明的单分子RNA内的反义序列和有义序列的长度可以相同，或长度相差小于约9个碱基。环可以是任何长度，优选的长度是0至4个核苷酸的长度或非核苷酸接头的等效长度，并且更优选2个核苷酸或非核苷酸接头的等效长度(例如，非核苷酸环具有等于2个核苷酸的长度)。在一个实施方案中，环是：5'-UU-3'(rUrU)或5'-tt-3'，其中“t”代表脱氧胸苷(dTdT)。在任何shRNA发夹内，多个核苷酸是核糖核苷酸。在零核苷酸环的情况下，反义序列直接连接到有义序列，其中一条或两条链的一部分形成环。在零nt环shRNA的优选实施方案中，反义序列约为18或19nt，并且有义序列比反义序列短，因此反义序列的一端形成环。

代表性shRNA的发夹可以组织成左手(L)发夹(即，5'-反义-环-有义-3')或右手(R)发夹(即，5'-有义-环-反义-3')。此外，shRNA也可在有义序列或反义序列的5'或3'端包含突出端，这取决于发夹的组织。优选地，如果有任何突出端，则它们位于发夹的3'端并且包含1个至6个碱基。R型发夹优选存在突出端，在这种情况下优选2-nt突出端，并且最优选UU或tt突出端。

可以添加修饰以增强shRNA的稳定性、功能性和/或特异性，并使免疫刺激特性最小。例如，突出端可以是未修饰的，或者可以包含一个或多个特异性或稳定修饰(诸如2'位置的卤素或O-烷基修饰)或核苷酸间修饰(诸如硫代磷酸酯修饰)。突出端可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核糖核酸的组合。

在可以应用于左手发夹的修饰的另一个非限制性实例中，可将2'-O-甲基修饰(或其他2'修饰，包括但不限于其他2'-O-烷基修饰)添加到从发夹的5'反义末端起第15、17或19位处的核苷酸，或者这些位置中的任何两个或所有三个，以及环核苷酸和有义序列的除从有义序列的最5'核苷酸起第9、10和11个核苷酸之外的每个其他核苷酸(也称为第9、第10和第11核苷酸)，这些核苷酸应没有阻止“切片”活性的修饰。前一句中描述的任何单个修饰或修饰组可以单独使用或与所引用的任何其他修饰或修饰组结合使用。

Ui-Tei,K.等人(Nucl.Acids Res.(2008)36(22):7100-7109；其以引用方式全文并入)观察到可以通过修饰一条或两条链的种子区域来增加siRNA的特异性。此类修饰适用于本公开的shRNA。在可以应用于发夹的修饰的另一个非限制性实例中，可以对反义序列的nt 1-6和有义序列的nt 14-19进行2'-O-甲基化以减少脱靶效应。在优选的实施方案中，仅将nt 1-6从2'-OH修饰为2'-H或2'-O-烷基。

由于shRNA的有义序列可能进入RISC并与反义(靶向)链竞争，因此防止有义序列磷酸化的修饰对于最大限度地减少脱靶特征是有价值的。因此，防止本发明的右手shRNA的最5'核苷酸的5'碳磷酸化的理想化学修饰可以包括但不限于以下修饰：(1)将阻断基团(例如，5'-O-烷基)添加到5'碳；或(2)去除5'-羟基基团(例如，5'-脱氧核苷酸)(参见例如WO2005/078094；其以引用方式全文并入)。

除了增强特异性的修饰外，还可以添加增强稳定性的修饰。在一些实施方案中，可以将包含2'-O-烷基基团的修饰(或其他2'修饰)添加到有义序列的一个或多个、优选所有嘧啶(例如，C和/或U核苷酸)上。修饰(诸如分别为有义序列/区域的一些或所有C和U的2'F或2'-O-烷基)或环结构可以增强shRNA分子的稳定性，而不会明显改变目标特异性沉默。应当注意的是，虽然这些修饰增强了稳定性，但可能需要避免将这些修饰模式添加到发夹中的关键位置，以避免破坏RNAi(例如，干扰“切片”活性)。

在本发明的一些实施方案中，shRNA中可包括对磷酸骨架的另外的稳定化修饰。例如，可用至少一种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯取代shRNA骨架中核苷酸的一些或所有3'位置处或任何特定的核苷酸子集(例如，寡核苷酸骨架的有义序列中的任何或所有嘧啶)处的磷酸基团，以及存在的任何突出端和/或环结构中的磷酸基团。这些修饰可独立使用或与本文公开的其他修饰组合使用。

对感兴趣的修饰的shRNA的描述可以在以下参考文献(这两篇参考文献全文通过引入并入本文)中找到：Q.Ge,H.Eves,A.Dallas,P.Kumar,J.Shorenstein,S.A.Kazakov和B.H.Johnston(2010)Minimal-length short hairpin RNAs:The Relationship ofStructure and RNAi Activity.RNA 16(1):106-17(2009年12月1日电子版)；以及Q.Ge,A.Dallas,H.Ilves,J.Shorenstein,M.A.Behlke和B.H.Johnston(2010)Effects ofChemical Modification on the Potency,Serum Stability,and ImmunostimulatoryProperties of Short shRNAs.RNA 16(1):118-30(2009年11月30日电子版)。

根据本发明的方面的修饰的shRNA可包括用于多种目的中的任何目的的另外的化学修饰，包括3'帽结构(例如，反向脱氧胸苷)、与shRNA中一个或多个位置缀合的可检测标记(例如，荧光标记、质量标记、放射性标记等)或其他可以增强递送、检测、功能、特异性或稳定性的缀合物(例如，氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、聚合物、核苷酸、多核苷酸等)。使用者可根据需要采用另外的化学修饰的组合。

合适的NGF shRNA包括长度为约20个核苷酸至约80个核苷酸的那些核酸，其中一部分核酸具有长度为约15个核苷酸至约25个核苷酸的双链结构域。在一些方面，shRNA可以包括修饰的碱基或磷酸二酯骨架以赋予组织和细胞内shRNA的稳定性。示例性NGF shRNA包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，能够抑制NGF表达的任何shRNA可用于本文的组合物和方法中。在某些实施方案中，提供了相对于SEQ ID NO:1具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个取代或缺失的NGF shRNA。

如本领域通常已知的，通常使用的寡核苷酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸的低聚物或聚合物，其具有天然存在的嘌呤和嘧啶碱基、糖和核苷之间的共价键的组合，包括磷酸二酯键中的磷酸基团。然而，应注意，术语“寡核苷酸”还涵盖如本文所述的天然存在的寡核苷酸的各种非天然存在的模拟物和衍生物，即修饰形式。

本发明的shRNA分子可以通过本领域已知的用于合成DNA和RNA分子的任何方法制备。这些包括本领域熟知的化学合成寡脱氧-核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术，例如固相亚磷酰胺化学合成。可另选地，RNA分子可通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录产生。这种DNA序列可以掺入多种载体中，所述载体掺入了合适的RNA聚合酶启动子，诸如T7或SP6聚合酶启动子。可另选地，根据所用的启动子，组成型或诱导型合成反义RNA的反义cDNA构建体可稳定地引入细胞系中。

可以使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成shRNA分子。定制shRNA合成服务可从诸如Ambion(Austin,Tex.,USA)和Dharmacon Research(Lafayette,Colo.,USA)的商业供应商处获得。

可以引入对DNA分子的各种众所周知的修饰作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于在分子的5'和/或3'端添加核糖或脱氧核苷酸的侧翼序列，或在寡脱氧核糖核苷酸骨架内使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶键。本发明的反义核酸可以使用化学合成或酶连接反应，使用本领域已知的方法构建。反义寡核苷酸可使用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸化学合成，所述经修饰的核苷酸经设计以增加分子的生物稳定性或增加反义与有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性(例如，可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。

本文的shRNA分子可以是任何NGF shRNA结构的各种修饰等同物。“修饰的等同物”是指具有相同靶特异性(即，识别与未修饰的特定shRNA分子互补的相同mRNA分子)的特定shRNA分子的修饰形式。因此，未修饰的shRNA分子的修饰的等同物可具有修饰的核糖核苷酸，即，在未修饰的核苷酸碱基、糖和/或磷酸(或磷酸二酯键)的化学结构中含有修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，修饰的shRNA分子含有修饰的骨架或非天然核苷间键，例如修饰的含磷骨架和非含磷骨架，诸如吗啉代骨架；硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、磺酸盐、磺酰胺和氨基磺酸盐骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；酰胺骨架等。

修饰的含磷骨架的实例包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酰胺酯、硫代烷基磷酸三酯和硼基磷酸酯及它们的各种盐形式。上述不含磷的骨架的实例是本领域已知的，例如美国专利号5,677,439，其各自以引用方式并入本文。

shRNA化合物的修饰形式还可以含有修饰的核苷(核苷类似物)，即修饰的嘌呤或嘧啶碱基，例如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-(羧羟甲基)尿苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基亚氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、4-乙酰基胞苷、3-甲基胞苷、丙炔、辫苷(quesosine)、怀丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、β-D-半乳糖基辫苷、N-2、N-6和O-取代的嘌呤、肌苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、2-甲基硫代-N-6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基辫苷、尿苷-5-氧乙酸、2-硫代胞苷、苏氨酸衍生物，等等。另外，修饰shRNA化合物也可具有取代或修饰的糖部分，例如2'-O-甲氧基乙基糖部分。

优选地，修饰本发明的shRNA的3'突出端以提供对细胞核酸酶的抗性。在一个实施方案中，3'突出端包括2'-脱氧核糖核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供了靶向对应于NGF的mRNA的不同位点的shRNA化合物。另外，为了帮助设计用于任何靶基因的有效RNA干扰(RNAi)介导的沉默的shRNA，若干shRNA供应公司维持基于网络的设计工具，当与靶基因的mRNA或编码DNA序列一起呈现时，所述设计工具利用这些用于“挑选”shRNA的一般指导。这种工具的实例可以在Dharmacon,Inc.(Lafayette,Colo.)、Ambion,Inc.(Austin,Tex.)的网站上找到。例如，挑选shRNA涉及选择靶基因独特的位点/序列(即，与被靶向的基因以外的基因不具有显著同源性的序列)，使得其他基因不会被为这种特定靶序列设计的相同shRNA无意中靶向。

另一个要考虑的标准是靶序列是否包括已知的多态性位点。如果这样的话，设计用于靶向一个特定等位基因的shRNA可能不能有效地靶向另一个等位基因，因为在给定的shRNA中靶序列和其互补链之间的单碱基错配大大降低由所述shRNA诱导的RNAi的有效性。考虑到靶序列和此类设计工具和设计标准，本公开的普通技术人员应能够设计和合成可用于降低NGF的mRNA水平的另外的sihRNA化合物。

在一些实施方案中，本发明提供了聚合物或赋形剂和编码一种或多种shRNA分子的一种或多种载体的组合物。载体可以与合适的载剂一起配制成药物组合物并使用任何合适的施用途径施用于哺乳动物中。由于这种精确性，可以减少或消除通常与传统药物相关的副作用。另外，shRNA是相对稳定的，并且像反义一样，它们也可以被修饰以实现改善的药物特征，诸如增加的稳定性、递送能力和易于制造。此外，因为shRNA分子利用了天然细胞途径，即RNA干扰，所以它们在破坏靶mRNA分子方面是高度有效的。结果，在受试者中相对容易获得治疗有效浓度的shRNA化合物。

shRNA化合物可通过各种方法经不同途径施用于哺乳动物。它们也可以通过任何合适的局部施用方法直接递送到特定器官或组织，诸如直接注射到靶组织中。在一些实施方案中，shRNA化合物在直接注射到靶组织后电穿孔到细胞中。可另选地，它们可以通过离子电渗疗法或通过掺入其他载体(诸如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊和生物粘附性微球)中而包封在脂质体中递送。

通过静脉内注射RNAi对特定基因表达的体内抑制已经在包括哺乳动物在内的生物体中实现。参见例如，Song E.等人"RNA interference targeting Fas protects micefrom fulminant hepatitis,"Nature Medicine,9:347-351(2003)；其以引用方式全文并入。本发明的shRNA分子的一种施用途径包括将载体直接注射到所需的组织部位，诸如进入患病或非患病的心脏组织，进入纤维化的心脏组织，诸如纤维化的PLA组织。然而，通常将NGF shRNA或编码NGF shRNA的表达载体直接注射到心肌组织(例如心房组织)中以有效地敲低NGF蛋白表达，抑制神经生长和/或减少或完全消除受试者中AF的存在。

在一些实施方案中，包含本发明的一种或多种shRNA的一种或多种载体在第一次施用后以任何时间间隔或在第一次施用后的多个时间间隔重新施用。

在一些实施方案中，编码shRNA的核酸被配制在药物组合物中，所述药物组合物根据常规的药物复合技术制备。参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)。本发明的药物组合物包含治疗有效量的编码shRNA的载体。除载体外，这些组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域熟知的其他材料。这些物质应该是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。根据施用所需的制剂形式，载剂可以采用多种形式，例如静脉内、口服、肌内、皮下、鞘内、硬膜外或肠胃外。

当制备本发明的载体以用于施用时，它们可以与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合以形成药物制剂或单位剂型。这些制剂中的总活性成分包括0.1重量％至99.9重量％的制剂。

在一些实施方案中，合适地配制载体并通过允许足够部分的样品进入细胞以诱导基因沉默(如果发生的话)的任何方式将其引入细胞环境中。载体的许多制剂是本领域已知的，并且可以使用，只要载体进入靶细胞以使得其可以起作用。例如，载体可以配制在缓冲液中，诸如包含脂质体、胶束结构和衣壳的磷酸盐缓冲盐水溶液。本发明的载体的药物制剂还可以采用水性或无水溶液或分散体的形式，或可另选地乳剂或悬浮液的形式。本发明载体的药物制剂可包括作为任选成分的增溶剂或乳化剂，以及本领域公知类型的盐。可用于本发明药物制剂的载剂和/或稀释剂的具体非限制性实例包括水和生理上可接受的盐水溶液。用于制备施用于个体的组合物的其他药学上可接受的载剂包括例如溶剂或媒介物，诸如二醇、甘油或可注射的有机酯。药学上可接受的载剂可以含有生理上可接受的化合物，其作用是例如稳定或增加编码shRNA的载体的吸收。其他生理上可接受的载剂包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂；盐水；右旋糖溶液；果糖溶液；乙醇；或动物、植物或合成来源的油。载剂还可以含有其他成分，例如防腐剂。

应认识到，药学上可接受的载剂(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如组合物的施用途径。含有载体的组合物还可以含有第二种药剂，诸如诊断试剂、营养物质、毒素或另外的治疗剂。可用于治疗心脏疾病的许多药剂是本领域已知的，并且预期与本发明的载体联合使用。

具有阳离子脂质的载体制剂可用于促进载体转染到细胞中。例如，可以使用阳离子脂质(诸如脂质体)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(诸如聚赖氨酸)。合适的脂质包括例如Oligofectamine和Lipofectamine(Life Technologies)，其可根据制造商的说明书使用。

在一些实施方案中，引入合适量的载体并且这些量可以使用标准方法凭经验确定。通常，单个载体种类在细胞环境中的有效浓度为约50纳摩尔或更低、10纳摩尔或更低，或可以使用浓度为约1纳摩尔或更低的组合物。在其他方面，所述方法使用约200皮摩尔或更低的浓度，甚至在许多情况下可使用约50皮摩尔或更低的浓度。本领域技术人员可以使用标准方法确定任何特定哺乳动物受试者的有效浓度。

在一些实施方案中，以治疗有效量施用shRNA。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的疾患、疾病或病症的性质和严重程度。治疗的处方(例如对剂量、时间等的决定)在普通医师或专家的责任范围内，并且通常考虑待治疗的病症、疾患或疾病、个体哺乳动物受试者的疾患、递送部位、施用方法和医师已知的其他因素。技术和方案的实例可见于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)中。

可另选地，通过使用靶向系统(诸如抗体或细胞特异性配体)，靶向疗法可用于将编码shRNA的载体更特异性地递送至某些类型的细胞。由于多种原因，例如如果药剂毒性不可接受，或如果它需要过高的剂量，或如果它不能进入靶细胞，靶向可能是期望的。

在一些实施方案中，使用DNA载体通过基因治疗方法将shRNA递送到哺乳动物细胞，特别是人细胞中，从所述DNA载体可以直接转录例如小发夹形式(shRNA)的shRNA化合物。最近的研究已经证明，虽然双链shRNA在介导RNAi方面非常有效，但是短的单链发夹形RNA也可以介导RNAi，可能是因为它们折叠成分子内双链体，所述双链体通过细胞酶加工成双链shRNA。这个发现具有显著和深远的意义，因为这种shRNA的产生可以通过用携带由指导这种小发夹RNA转录的少量(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个)核苷酸分开的短反向重复的DNA载体转染细胞或组织而容易地在体内实现。可另选地，如果包括指导载体或载体片段整合到宿主细胞基因组中或确保转录载体的稳定性的机制，则由编码的shRNA引起的RNAi可以是稳定的和可遗传的。这些技术不仅已经用于“敲低”哺乳动物细胞中特定基因的表达，而且它们现在已经成功地用于敲低外源性表达的转基因以及活小鼠脑和肝脏中内源性基因的表达。

根据本领域已知的普遍接受的方法进行基因治疗。参见例如美国专利号5,837,492和5,800,998以及其中引用的参考文献；其以引用方式全文并入。基因治疗中的载体包括那些含有足以表达编码多核苷酸的序列的多核苷酸序列。如果多核苷酸编码shRNA，则表达将产生反义多核苷酸序列。因此，在本文中，表达不需要合成蛋白质产物。除了载体中编码的shRNA之外，载体还含有在真核细胞中有功能的启动子。shRNA序列在这个启动子的控制下。合适的真核启动子包括本文别处描述的和本领域已知的那些。表达载体还可以包括序列，诸如选择标记、报告基因和其他常规使用的调节序列。

因此，通过控制诸如用于指导核酸序列转录的启动子的性质(即，启动子是组成型的还是可调节的、强的还是弱的)和细胞中编码shRNA序列的核酸序列的拷贝数等因素来调节原位产生的shRNA的量。示例性的启动子包括被pol I、pol II和pol III识别的启动子。在一些方面，优选的启动子是pol III启动子，诸如U6 pol III启动子。

在一些实施方案中，本文提供了用于抑制细胞中靶基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括如本文所述的化学修饰的shRNA。“试剂盒”是指用于实施本发明方法的递送材料或试剂的任何系统。在反应测定法的情况下，这类递送系统包括允许存储反应试剂(例如适当容器中的化学修饰shRNA、培养基等)和/或支持材料(例如，缓冲液、关于进行测定法的书面说明书等)、将其从一个位置运输或递送至另一个位置的系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个外壳(例如，盒)。这些内容物可共同或单独递送至预定接受者。例如，第一容器可以含有用于测定中的化学修饰的shRNA，而第二容器含有培养基RNA递送剂(例如，转染试剂)。

如上所述，主题试剂盒可还包括使用试剂盒组分实施主题方法的说明书。用于实践主题方法的说明书通常记录在适合的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基底上，例如纸或塑料等。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒容器或其组分的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在其他实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在。在其他实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但提供了用于从远程来源(例如经由因特网)获得说明书的手段。此实施方案的实例为包括网址的试剂盒，在所述网址中可查看说明书和/或从所述网址可下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的此装置记录在适合的基底上。

除了主题数据库、程序和说明书之外，试剂盒还可以包括一种或多种对照试剂，例如非化学修饰的shRNA。

本文所述的药物组合物在治疗/预防AF中具有治疗功效。包含NGF shRNA的药物组合物在本领域接受的人AF犬模型中具有可证明的活性。NGF shRNA研究的结果证明了使用NGF抑制剂治疗/预防AF来抑制NGF活性或表达的一般策略的可行性。这样的抑制剂包括靶向NGF mRNA或蛋白质的基于寡核苷酸的化合物，诸如针对NGF mRNA的RNAi分子、反义RNA、shRNA等，以及针对NGF多肽的基于寡核苷酸的适体。此外，通过与NGF蛋白功能性特异性结合或以其他方式干扰NGF蛋白质功能性而具有抗NGF活性的小分子有机化合物、肽、抗体或其他药剂也可用于治疗和/预防AF。上文关于NGF shRNA的施用、配制、给药和用途描述的实施方案还发现与其他药剂一起用于抑制NGF活性或表达。

在一些实施方案中，NGF抑制剂包括任何合适的生物活性分子(例如，能够抑制NGF功能的分子)。在一些实施方案中，MGF抑制剂包括大分子、聚合物、分子复合物、蛋白质、肽、多肽、核酸、碳水化合物、小分子等。

在一些实施方案中，NGF抑制剂是NGF抑制性肽。在一些实施方案中，本发明提供了能够抑制NGF的一个或多个等位基因的任何合适的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，由本发明的实施方案的组合物提供或编码的肽可包含任何标准氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)或非标准氨基酸(例如，D-氨基酸、常见氨基酸的化学或生物产生的衍生物、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸等)的任何排列。在一些实施方案中，NGF抑制性肽是NGF的抑制剂。

在一些实施方案中，NGF抑制性肽作为分离的或纯化的肽提供给受试者。在一些实施方案中，NGF抑制性肽作为编码这些肽的核酸分子提供给受试者。在一些实施方案中，对肽进行优化以增强细胞渗透(例如，序列优化、序列标签、用小分子标记等)。

在一些实施方案中，NGF抑制剂由包含小基因的分离的核酸提供，其中所述小基因编码修饰的NGF肽，其中所述肽阻断细胞(诸如人细胞)中NGF与NGF结合配偶体之间的相互作用位点。另外，小基因可以还包含启动子、核糖体结合位点、翻译起始密码子和翻译终止密码子中的一种或多种。

在一些实施方案中，NGF抑制剂以分离的或纯化的多肽提供。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制细胞或组织中NGF介导的信号传导事件的方法。这些方法包括向细胞或组织、优选人细胞或组织施用修饰的NGF肽和包含编码修饰的NGF肽的小基因的分离的核酸中的一种，由此在施用后，NGF肽抑制细胞或组织中NGF介导的信号传导事件。

在一些实施方案中，NGF抑制剂包括小分子。在一些实施方案中，本发明提供了NGF的小分子抑制剂。在一些实施方案中，本发明提供了一种被构造成或能够抑制NGF活性、功能表达等的小分子药物或药物化合物。

在一些实施方案中，本发明提供了RNAi分子(例如改变NGF表达的RNAi分子)作为NGF抑制剂。在一些实施方案中，本发明使用基于核酸的疗法靶向NGF基因的表达。例如，在一些实施方案中，本发明使用包含寡聚反义或RNAi化合物，特别是寡核苷酸的组合物，其用于调节编码NGF基因的核酸分子的功能，最终调节所表达的NGF蛋白的量。在一些实施方案中，RNAi用于抑制NGF基因功能。RNAi代表一种在进化上保守的细胞防御，用于在大多数真核生物(包括人)中控制外源基因的表达。RNAi通常由双链RNA(dsRNA)触发，并且引起响应于dsRNA的同源单链靶RNA的序列特异性mRNA降解。mRNA降解的介导物是小干扰RNA双链体(siRNA)，它们通常通过细胞中的酶促裂解由长dsRNA产生。siRNA的长度一般为大约二十一个核苷酸(例如，长度为21-23个核苷酸)，并且具有以两个核苷酸的3'突出端为特征的碱基配对结构。在将小RNA或RNAi引入细胞后，据信该序列被递送到称为RISC的酶复合物(RNA诱导的沉默复合物)。RISC识别靶标并用核酸内切酶将其裂解。值得注意的是，如果将较大RNA序列递送到细胞，则RNA酶III酶(Dicer)会将较长的dsRNA转化为21-23nt ds siRNA片段。在一些实施方案中，siRNA是18个至30个核苷酸，优选19个至25个核苷酸，最优选21个至23个核苷酸或甚至更优选21个核苷酸长的双链RNA分子。siRNA参与RNA干扰(RNAi)途径，其中siRNA干扰特定基因(例如NGF)的表达。天然存在于自然界中的siRNA具有明确定义的结构：在任一端具有2-nt 3'突出端的短双链RNA(dsRNA)。每条链都有一个5'磷酸基团和一个3'羟基(--OH)基团。这个结构是由dicer加工的结果，dicer是将长dsRNA或小发夹RNA转化为siRNA的酶。还可以将siRNA外源地(人工地)引入细胞中以引起感兴趣的基因(例如NGF)的特异性敲低。因此可以基于与适当定制的siRNA的序列互补性来靶向基本上任何已知序列的基因。双链RNA分子或其代谢加工产物能够介导靶特异性核酸修饰，特别是RNA干扰和/或DNA甲基化。外源引入的siRNA可以在其3'和5'端没有突出端，然而，在一些实施方案中，至少一条RNA链具有5'突出端和/或3'突出端。优选地，双链的一端具有1-5个核苷酸，更优选1-3个核苷酸，最优选2个核苷酸的3'突出端。另一端可以是平端或具有多达6个核苷酸的3'突出端。通常，在本发明中设想了适于用作siRNA和抑制NGF的任何RNA分子。在一些实施方案中，提供了由21-nt有义和21-nt反义链组成的siRNA双链体，其以具有2-nt 3'突出端的方式配对。2-nt 3'突出端的序列对限于与第一碱基对相邻的未配对核苷酸的靶识别的特异性贡献很小。3'突出端中的2'-脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但合成通常更便宜且可能更具核酸酶抗性。可以使用本领域已知的任何方法实现siRNA的递送，例如通过将siRNA与盐水组合并且静脉内或鼻内施用所述组合，或通过将siRNA配制在葡萄糖(诸如5％葡萄糖)中，或阳离子脂质和聚合物可以用于通过全身途径静脉内(IV)或腹膜内(IP)体内递送siRNA。在一些实施方案中，本文提供了靶向和抑制NGF的表达(例如敲低)的siRNA分子。

将siRNA转染到动物细胞中导致特异性基因的有效、持久的转录后沉默(Caplen等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.2001；98:9742-7；Elbashir等人,Nature.2001；411:494-8；Elbashir等人,Genes Dev.2001；15:188-200；和Elbashir等人,EMBO J.2001；20:6877-88，其皆以引用方式并入本文)。用siRNA进行RNAi的方法和组合物描述于例如美国专利号6,506,559中，其以引用方式并入本文。

siRNA在降低靶RNA的量方面是特别有效的，并且通过延伸蛋白，常常达到不可检测的水平。沉默效应可以持续几个月，并且是非常特异性的，因为靶RNA和siRNA的中心区域之间的一个核苷酸错配经常足以防止沉默(Brummelkamp等人,Science 2002；296:550-3；和Holen等人,Nucleic Acids Res.2002；30:1757-66，其皆以引用方式并入本文)。

实现RNAi(且在本文中用于抑制NGF的表达)的其他分子包括例如微小RNA(miRNA)。所述RNA种类是单链RNA分子。内源性存在的miRNA分子通过与互补mRNA转录物结合并通过类似于RNA干扰的过程触发所述mRNA转录物的降解来调节基因表达。因此，外源miRNA可在导入靶细胞后用作NGF的抑制剂。在一些实施方案中，本文提供了靶向和抑制NGF的表达(例如敲低)的miRNA分子。

吗啉代(或吗啉代寡核苷酸)是合成的核酸分子，其长度为约20个至30个核苷酸，通常为约25个核苷酸。吗啉代通过标准核酸碱基配对与靶转录物(例如NGF)的互补序列结合。它们具有与吗啉环而不是脱氧核糖环结合并通过二氨基磷酸酯基团而不是磷酸酯连接的标准核酸碱基。由于将阴离子磷酸盐置换成不带电荷的二氨基磷酸酯基团，防止了在通常的生理pH范围内的电离，使得生物体或细胞中的吗啉代是不带电荷的分子。吗啉代的整个骨架由这些修饰的亚基构成。与抑制性小RNA分子不同，吗啉并不降解其靶RNA分子。相反，它们在空间上阻断与RNA内的靶序列的结合，并防止可能与RNA相互作用的分子进入。在一些实施方案中，本文提供了靶向和抑制NGF的表达(例如敲低)的吗啉代寡核苷酸。

核酶(核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化它们自身的裂解或其他RNA的裂解，但也发现它们催化核糖体的氨基转移酶活性。充分表征的小自裂解RNA的非限制性实例是锤头状、发夹状、丁型肝炎病毒和体外选择的铅依赖性核酶，而组I内含子是较大核酶的实例。催化自裂解的原理已得到很好的确立。因为已经显示锤头状结构可以整合到异源RNA序列中，并且核酶活性可以由此转移到这些分子中，所以可以针对几乎任何靶序列工程化催化反义序列，只要靶序列含有潜在的匹配裂解位点。构建锤头状核酶的基本原理如下：选择含有GUC(或CUC)三联体的RNA的感兴趣区域(例如，NGF的一部分)。取两条寡核苷酸链，每条链通常具有6个至8个核苷酸，并且将催化锤头状序列插入它们之间。在一些实施方案中，本文提供了NGF的核酶抑制剂。

在一些实施方案中，使用与一种或多种编码NGF的核酸特异性杂交的反义化合物来调节NGF表达。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交会干扰核酸的正常功能。这种通过与其特异性杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常称为“反义”。

在一些实施方案中，本发明涉及用于调节NGF基因表达的任何遗传操作的用途。遗传操作的实例包括但不限于基因敲除(例如，使用例如重组从染色体去除NGF基因)，具有或不具有诱导型启动子的反义构建体的表达等。核酸构建体在体外或体内递送至细胞可使用任何合适的方法进行。合适的方法是将核酸构建体引入细胞中，使得所需事件发生(例如，反义构建体的表达)。遗传疗法也可用于递送在体内表达的siRNA或其他干扰分子(例如，通过诱导型启动子刺激)。

在一些实施方案中，通过修饰靶细胞中的NGF序列来抑制NGF表达(和/或抑制NGF活性)。在一些实施方案中，NGF的改变使用一种或多种DNA结合核酸来进行，诸如经由RNA指导的核酸内切酶(RGEN)进行改变。例如，可以使用成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白进行改变。通常，“CRISPR系统”共同地指参与CRISPR相关("Cas")基因的表达或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-伴侣序列(在内源CRISPR系统的情形中包括“直接重复序列”和tracrRNA加工的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的情形中也称为“间隔区”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括序列特异性地结合DNA的非编码RNA分子(指导)RNA，以及具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。CRISPR系统的一个或多个元件可以衍生自I型、II型或III型CRISPR系统，例如衍生自包含内源性CRISPR系统的特定生物体，诸如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。在一些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列(例如NGF内的序列)具有特异性的crRNA和固定的tracrRNA的融合体)引入细胞中。通常，gRNA的5'端的靶位点使用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向至靶位点，例如NGF。靶位点可基于其紧接原型间隔区相邻基序(PAM)序列(诸如典型地NGG或NAG)的5'的位置来选择。在这方面，通过修饰指导RNA的前20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、14个、12个、11个或10个核苷酸以对应于靶DNA序列(例如NGF内的序列)，将gRNA靶向所需序列。一般而言，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列位点处形成CRISPR复合物的元件。典型地，“靶序列”通常是指指导序列被设计成与其具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进形成CRISPR复合物。不一定需要完全互补性，条件是存在足够的互补性以引起杂交并促进形成CRISPR复合物。CRISPR系统可以在SRC-3靶位点处诱导双链断裂(DSB)，随后是如本文所讨论的破坏或改变。在其他实施方案中，被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点(例如，在NGF内)切口单链。可以使用成对的切口酶，例如以改善特异性，每个切口酶由一对不同的gRNA靶向序列引导，使得在同时引入切口时，引入5'突出端。在其他实施方案中，催化失活的Cas9与异源效应结构域(诸如转录阻遏物或活化因子)融合，以影响基因表达(例如，抑制NGF的表达)。在一些实施方案中，CRISPR系统用于改变NGF、抑制NGF的表达和/或使NGF的表达产物失活。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas9或相关系统改变受试者中的NGF基因以降低NGF基因或所得蛋白质的表达和/或活性。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas9系统将编码NGF肽或多肽或NGF抑制剂的核酸插入宿主的遗传物质中。CRISPR是包含碱基序列的短重复的DNA基因座。每个重复后面是来自先前暴露于病毒的“间隔子DNA”的短片段。CRISPR通常与编码与CRISPR相关的蛋白质的Cas基因相关。CRISPR/Cas系统是一种原核免疫系统，可赋予对外来遗传元件诸如质粒和噬菌体的抗性，并提供获得性免疫的形式。CRISPR间隔子以类似于真核生物体中的RNAi的方式识别和切割这些外源遗传元件。CRISPR/Cas系统可用于基因编辑。通过将Cas9蛋白和适当的引导RNA递送到细胞中，可以在任何所需位置切割生物体的基因组。使用CRISPR/Cas9系统和其他系统将基因插入宿主细胞以产生工程化细胞的方法描述于例如美国公开号20180049412中；其以引用方式全文并入本文。

在一些实施方案中，本发明提供了靶向NGF蛋白的抗体。任何合适的抗体(例如，单克隆、多克隆或合成的)可用于本文公开的治疗方法中。在优选的实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体的方法是本领域熟知的(参见例如美国专利号6,180,370、5,585,089、6,054,297和5,565,332；其各自以引用方式全文并入本文)。

在一些实施方案中，本发明提供了增强NGF抑制剂进入细胞或组织中的方法。在一些实施方案中，本发明提供了与电穿孔、电渗透或声穿孔联合施用NGF抑制剂。在一些实施方案中，本发明提供了与电穿孔施用NGF抑制剂。在一些实施方案中，本发明提供了受试者组织的共注射/电穿孔。在一些实施方案中，本发明提供了在电穿孔之前、同时和/或之后施用NGF抑制剂。在一些实施方案中，电穿孔提供了将药物或核酸(例如，DNA)递送到细胞中的方法。在一些实施方案中，在施加药物或DNA(例如，NGF抑制剂)的同时或之后不久电刺激组织。在一些实施方案中，电穿孔增加细胞渗透性。渗透性或孔足够大以允许药物和/或DNA进入细胞。在一些实施方案中，细胞膜中的孔闭合并且细胞再次变得不可渗透或较少渗透。用于共注射/电穿孔的某些装置是本领域已知的(美国专利号7,328,064，其以引用方式全文并入本文)。

以下专利申请包含可在本文实施方案中使用的组合物、装置、系统和方法：美国公开号20210038501；美国公开号20200237929；美国公开号20200206498；美国公开号20200185062；美国公开号20190111241；美国公开号20190076417；美国公开号20190032058；美国公开号20170172440；美国公开号20150366477；美国公开号20110137284；和美国公开号20090281019；其各自以引用方式全文并入本文。

此外，虽然犬模型使用PLA作为模型心房组织，但所述方法适用于所有心房组织。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防房颤的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了对选自以下项的列表的心脏病或疾患的治疗或预防：主动脉夹层、心律失常(例如房性心律失常(例如期前房性收缩、游走性房性起搏、多源性房性心动过速、心房扑动、房颤等)、交界性心律失常(例如室上性心动过速、AV结折返性心动过速、阵发性室上性心动过速、交界性心律、交界性心动过速、期前交界性收缩等)、房室性心律失常、室性心律失常(例如期前室性收缩、加速性自发室性心律、单形性室性心动过速、多形性室性心动过速、室颤等)等)、先天性心脏病、心肌梗塞、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、主动脉瓣反流、主动脉瓣狭窄、二尖瓣回流、二尖瓣狭窄、埃利斯-范克雷维尔德综合征(Ellis-van Creveldsyndrome)、家族性肥厚型心肌病、霍尔特-奥拉姆斯综合征(Holt-Orams Syndrome)、马凡综合征(Marfan Syndrome)、沃德-罗马诺综合征(Ward-Romano Syndrome)和/或类似疾病和疾患。

实验

经历超过几周的快速心房起搏(RAP)的犬表现出来自左心耳(LAA)的神经生长因子(NGF)分泌增加，这被认为是由于AF在这个区域更规则/有组织，从而导致更规则的肌细胞活化(参考文献30；其以引用方式全文并入本文)。由于越来越多的研究表明LAA在持续性AF发展中的重要作用，预期LAA中优先的NGF分泌，通过向心房神经节丛和星状神经节的逆行转运，导致心房中的弥散性自主神经芽生。在本文的实施方案的开发期间进行的实验中，在犬受试者的LAA中靶向注射NGF shRNA(SEQ ID NO:1或2)，随后进行4周的RAP，导致AF持续时间的显著减少。与对照动物不同，接受NGF shRNA的狗在随访期间没有发展为AF(图1)。

在左心房和右心房中注射NGF shRNA后，对动物进行长达12周，随后12周至12个月的延长实验在28天(图2A)和12周(图2B)的时间段内类似地产生抑制的AF持续时间。

预期在靶向基因注射后对两个心房中神经支配的详细评估将揭示在LAA中NGF的靶向抑制防止RAP诱导的神经芽生，并且由此防止阵发性进展为持续性AF。

序列

SEQ ID NO:1–CACTGGACTAAACTTCAGCAT

SEQ ID NO:2–GCATAGCGTAATGTCCATGTT

序列表

<110> 西北大学(NORHTWESTERN UNIVERSITY)

<120> 用于抑制神经生长因子和治疗/预防房颤的组合物和方法

<130> NWEST-39552.601

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 1

cactggacta aacttcagca t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 2

gcatagcgta atgtccatgt t 21

Claims (24)

1.一种治疗和/或预防受试者的房颤(AF)的方法，其包括向所述受试者施用有效量的神经生长因子(NGF)抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有房颤。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述NGF抑制剂抑制NGF的表达。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述NGF抑制剂包括核酸。

5.如权利要求4所述的方法，其中施用所述核酸包括施用编码所述核酸并允许所述核酸在所述受试者的细胞内表达的载体和/或转基因。

6.如权利要求4所述的方法，其中施用所述核酸包括将所述核酸直接施用于所述受试者。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述核酸是反义RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。

8.如权利要求4所述的方法，其中所述核酸是与SEQ ID NO:1包含70％序列同一性的NGF shRNA。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述NGF shRNA与SEQ ID NO:1包含100％序列同一性。

10.如权利要求1所述的方法，其中将所述NGF抑制剂施用于所述受试者的心肌组织。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述心肌组织包括心房或心室组织。

12.如权利要求11所述的方法，其中将所述NGF抑制剂施用于左和/或右心房组织。

13.如权利要求12所述的方法，其中将所述NGF抑制剂施用于左心耳。

14.如权利要求1所述的方法，其中施用所述NGF抑制剂包括将所述NGF抑制剂注射到所述受试者的组织中。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述注射通过无针注射进行。

16.如权利要求1所述的方法，其还包括评估所述受试者的心房组织状态的参数。

17.如权利要求16所述的方法，其中评估所述受试者的心房组织状态的参数包括在向所述受试者施用所述NGF抑制剂之前和/或之后监测与AF相关的电生理测量值或评估所述心肌组织的区域的神经芽生。

18.如权利要求17所述的方法，其中评估所述受试者的心房组织状态的参数包括监测与选自AF发作、AF持续时间、AF发病诱导性、有效不应期、传导性和传导性不均匀性指数的AF相关的电生理测量值。

19.一种组合物，其包含能够抑制神经生长因子(NGF)的表达的核酸。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述核酸是反义RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。

21.如权利要求19所述的组合物，其中所述核酸是编码反义RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)的载体或转基因。

22.如权利要求19所述的组合物，其中所述核酸是编码针对NGF mRNA的小发夹RNA的分离的核酸。

23.如权利要求22所述的组合物，其中所述核酸是与SEQ ID NO:1包含70％序列同一性的NGF shRNA。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述NGF shRNA与SEQ ID NO:1包含100％序列同一性。