CN117716048A

CN117716048A - 用于生产视黄醇乙酸酯的方法

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Publication number: CN117716048A
Application number: CN202180100922.8A
Authority: CN
Inventors: 彼得·路易斯·休斯顿; 瓦尔米克·卡努拜·维亚斯; 安娜·西姆博尔-纳格拉布斯卡; 里德·查德伯恩·多滕; 克里斯托弗·马克·法雷尔; 伊桑·拉姆
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2021-07-27
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2024-03-15
Also published as: KR20240036074A; US20240279706A1; EP4352243A1

Abstract

本发明涉及一种用于在宿主细胞，特别是产油酵母例如耶氏酵母属(Yarrowia)中生产视黄醇乙酸酯的新颖方法，其中产物纯度可随着不希望的副产物的减少而增大。特别地，所述新颖方法包括例如在补料分批发酵过程中，在乙醇存在下发酵。这种方法在用于生产维生素A的生物技术方法中特别有用。

Description

用于生产视黄醇乙酸酯的方法

目前用于类视黄醇(包括维生素A及其前体)的化学生产方法具有一些不期望的特性，诸如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了其他制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的方法，所述方法包括微生物转换步骤，这将导致更经济以及更环保的维生素A生产。

通常，产生类视黄醇的生物系统在工业上难以处理，且/或以低水平产生化合物，使得商业规模的分离是不实际的。最大的限制因素包括此类生物系统中中间体的不稳定性和/或副产物(例如脂肪酸视黄酯(FARE))的相对较高产量，特别是当使用在作为碳源的植物油或葡萄糖上生长的产油宿主细胞时。

虽然可以经由在宿主细胞中表达高度特异性的乙酰化酶(ATF)从而导致增加的视黄醇乙酸酯累积来解决不稳定性，但是对于维生素A生产来说相对较高百分比的视黄醇仍然“损失”，即转换为难以纯化并且不会形成晶体，而是形成蜡的不期望副产物，包括FARE。因此，高浓度的FARE限制了纯产物的大规模工业生产。

因此，强烈需要提高使用酵母，特别是产油宿主细胞例如耶氏酵母属生产视黄醇乙酸酯的纯度和/或生产率。

令人惊讶的是，我们现在发现，特别是在补料分批发酵过程中，经由在乙醇存在下发酵，类视黄醇的生产得到改善，从而导致包括FARE在内的杂质的减少或消除、视黄醇乙酸酯和/或总类视黄醇的增加。

特别地，本发明涉及一种用于在真菌宿主细胞，优选地产油酵母细胞例如耶氏酵母属中生产视黄醇乙酸酯的方法，所述方法包括在于发酵期间，特别是在补料分批发酵过程中添加的乙醇存在下培养所述宿主细胞，其中与没有乙醇的发酵相比，特别是与在如本文所定义的甘油三酯，特别是植物油存在下的(发酵)过程相比，包括FARE在内的副产物的形成被减少或消除，优选地基于总类视黄醇减少了约50-100％。

如本文所用，在本文中可互换使用的与类视黄醇的发酵生产相关的术语“副产物(by-product)”和“副产物(side-product)”意指在发酵过程期间生成的类视黄醇，但视黄醇乙酸酯除外。在发酵期间待减少或消除的副产物的形成特别包括FARE的形成，任选地另外在培养基中存在的视黄醇或视黄醛的存在下FARE的形成，并且所述FARE可以从视黄醇乙酸酯中纯化。

如本文所用，在“乙醇存在”或“在发酵期间添加的乙醇”下发酵特别是指补料分批发酵过程，其中分批阶段包含浓度为约5％(v/v)或更少的乙醇，例如在发酵的分批阶段期间添加到培养基中的约5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％的量。如本领域已知的，经由测量pH和/或DO来控制乙醇进料，通常进料约100％乙醇并且DO设定点为约40％至20％。任选地，分批阶段或进料进一步包含葡萄糖，例如在发酵的分批阶段期间添加到培养基中的约20％、15％、10％、8％、5％、3％、2％或更少的量的葡萄糖，或者乙醇与葡萄糖的比率在约9:1、8:2、7:3的范围内。

如本文所用，在“甘油三酯，特别是植物油存在”或“在发酵期间添加的甘油三酯，特别是植物油”下的发酵特别是指补料分批发酵过程，其中分批阶段包含约10％(v/v)或更少，例如在发酵的分批阶段期间添加到培养基的约10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的量的甘油三酯，特别是植物油。待使用的油特别是植物油，例如源自玉米、大豆、橄榄、向日葵、芥花籽(canola)、棉籽、油菜籽、芝麻、红花、葡萄籽或它们的混合物的油，包括相应的游离脂肪酸，例如油酸、棕榈酸或亚油酸。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种如本文所述的用于减少视黄醇乙酸酯生产过程中的FARE产生的方法，其中包括FARE在内的副产物的百分比可以减少约100％，即或多或少被消除，所述方法包括如本文所定义在乙醇存在下发酵。与如本文所定义的在甘油三酯存在下的发酵过程相比，FARE的形成可减少至少约50％，例如约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，即消除FARE形成。

优选地，本发明涉及一种如本文所定义的视黄醇乙酸酯生产方法，其中基于总类视黄醇，发酵期间形成的FARE的产量小于约25％，例如小于约20％、15％、10％、8％、5％、3％、2％、1％。

此外，本发明涉及一种用于在真菌宿主细胞，优选地产油酵母细胞例如耶氏酵母属中生产视黄醇乙酸酯的方法，所述方法包括如本文定义在乙醇存在下进行发酵，其中与在不存在乙醇的情况下的相应方法相比，特别是与如本文定义的在甘油三酯存在下的发酵方法相比，基于总类视黄醇，视黄醇乙酸酯形成的百分比可增加至少约25％，例如约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。

因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种如本文所述的用于在如本文所定义的真菌宿主细胞中生产视黄醇乙酸酯的方法，其中基于总类视黄醇，在发酵期间形成的视黄醇乙酸酯的百分比在至少约50-80％的范围内，例如所述百分比为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、95％、98％或高达100％，所述方法包括如本文所定义在乙醇存在下的发酵。

在另一方面中，本发明涉及一种用于增加总类视黄醇的方法，其中与在不存在乙醇的情况下的相应方法相比，特别是与如本文所定义在甘油三酯存在下的发酵方法相比，类视黄醇的增加在至少约30％的范围内，例如增加了约30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或更多，所述方法包括如本文所定义在乙醇存在下的发酵。

在一个实施方式中，本发明涉及一种如本文定义的方法，其中在合适的培养条件下培养产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，优选地产油酵母细胞，例如耶氏酵母属，所述合适的培养条件包括如本文所定义在乙醇存在下发酵，其中基于总类视黄醇，在发酵期间形成的FARE的百分比在小于25％的范围内，优选地小于约10％，并且视黄醇乙酸酯的百分比在至少约50-80％的范围内，优选地在至少约70％、80％、85％、87％、90％、95％、98％的范围内。与发酵期间不存在乙醇的方法相比，特别地其中如本文所定义在甘油三酯，特别是植物油存在下在发酵过程中培养宿主细胞，基于总类视黄醇，视黄醇乙酸酯的百分比可增加约100％或更多，并且FARE的百分比可以降低到约10％至1％的范围，或甚至到低于约1％，或甚至被消除。

本发明涉及产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，优选地产油酵母细胞，例如红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、油脂酵母属(Lipomyces)或耶氏酵母属，优选地耶氏酵母属，更优选地解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在如本文所定义的方法中，例如在包括如本文所定义在发酵期间添加乙醇的发酵方法中的用途，其中所述方法特别地是补料分批发酵，其中所述分批阶段包含浓度为约5％(v/v)或更少的乙醇，特别是在分批阶段中2％(v/v)至1％(v/v)的乙醇。特别地，合适的宿主细胞表达编码催化视黄醇酶促转换成视黄醇乙酸酯的异源酶EC类别[EC 2.3.1.84]的基因。表达此类ATF的合适菌株描述于例如WO2019058001或WO2020141168中。

优选地，待用于本发明的宿主细胞表达异源ATF，特别是真菌ATF，所述ATF包含选自[NDEHCS]-H-x(3)-D-[GA]的至少7个氨基酸残基的高度保守的部分氨基酸序列(如在https://prosite.expasy.org/scanprosite/scanprosite_doc.html中所定义，基序采用Prosite语法)，其中“x”表示任意氨基酸，并且中心组氨酸是酶的结合口袋的部分，优选地其中所述7个氨基酸基序选自[NDE]-H-x(3)-D-[GA]，更优选地选自[ND]-H-x(3)-D-[GA]，最优选地选自与根据SEQ ID NO:18的多肽中的位置N218至G224对应的N-H-x(3)-D-[GA]。此类酶的示例可以特别地选自L.mirantina、发酵性拉茜斯酵母(L.Fermentati)、贝酵母(S.bayanus)或异常威客汉姆酵母(W.anomalus)，例如如在WO2019058001中所公开的根据SEQ ID NO:18的LmATF1、SbATF1、LffATF1、LfATF1、Wa1ATF1或Wa3ATF1，更优选地，所述ATF在序列中包含一个或多个氨基酸取代，所述序列与SEQ ID NO:18具有至少约20％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或高达100％的同一性，其中所述一个或多个氨基酸取代位于与选自由以下组成的组的氨基酸残基对应的位置处：位置68、69、72、73、171、174、176、178、291、292、294、301、307、308、311、312、320、322、334、362、405、407、409、480、483、484、490、492、520、521、522、524、525、526以及它们的组合，并且如WO2020141168的表4中具体例示的；更优选地在与SEQ ID NO:18中的氨基酸残基69、407、409、480、484以及它们的组合对应的位置上包含一个或多个氨基酸取代。

在一个具体实施方式中，待用于根据本发明的方法的宿主细胞在与根据SEQ IDNO:18的多肽中的残基69对应的位置处包含氨基酸取代，从而例如经由用天冬酰胺取代组氨酸(H69N)、丝氨酸取代组氨酸(H69S)或丙氨酸取代组氨酸(H69A)，优选地H69A在所述残基处产生天冬酰胺、丝氨酸或丙氨酸。所述经修饰的酶可以源自酵母，例如L.mirantina、发酵性拉茜斯酵母、异常威客汉姆酵母或贝酵母，优选地源自L.mirantina，任选地与在与根据SEQ ID NO:18的多肽中的残基407对应的位置处的氨基酸取代组合，从而例如经由用异亮氨酸取代缬氨酸(V407I)在所述残基处产生异亮氨酸；任选地与在与根据SEQ ID NO:18的多肽中的残基409对应的位置处的氨基酸取代组合，从而例如经由用丙氨酸取代甘氨酸(G409A)在所述残基处产生丙氨酸；任选地与在与根据SEQ ID NO:18的多肽中的残基480对应的位置处的氨基酸取代组合，从而例如经由用谷氨酸取代丝氨酸(S480E)、赖氨酸取代丝氨酸(S480L)、甲硫氨酸取代丝氨酸(S480M)、苯丙氨酸取代丝氨酸(S480F)或谷氨酰胺取代丝氨酸(S480Q)在所述残基处产生谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺；任选地与在与根据SEQ ID NO:18的多肽中的残基484对应的位置处的氨基酸取代组合，从而例如经由用亮氨酸取代异亮氨酸(I484L)在所述残基处产生亮氨酸。所述经修饰的酶可以源自酵母，例如L.mirantina、发酵性拉茜斯酵母、异常威客汉姆酵母或贝酵母，优选地源自L.mirantina。在最优选的实施方式中，待用于根据本发明的方法的ATF是包含氨基酸取代S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L的经修饰的ATF并且可从Lachancea mirantina获得。

如本文所用，术语“宿主细胞”包括产生视黄醇乙酸酯的细胞，即能够合成视黄醇并表达如本文所定义的ATF，从而以如本文所定义的基于由所述宿主细胞产生的总类视黄醇的百分比产生视黄醇乙酸酯的细胞。任选地，此类宿主细胞另外能够产生类胡萝卜素。“真菌宿主细胞”特别地包括酵母细胞，即产生视黄醇乙酸酯的酵母细胞，包括但不限于耶氏酵母属、红冬孢酵母属或油脂酵母属。

任选地，能够从视黄醇转换产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，例如耶氏酵母属，表达用于生物合成β-胡萝卜素和/或另外用于催化将β-胡萝卜素转换成视黄醛和/或将视黄醛转换成视黄醇的另外的酶。技术人员知道哪些基因待用于β-胡萝卜素的生物合成和/或β-胡萝卜素至视黄醇的生物转换。此类宿主细胞进一步能够表达如本文所定义的ATF基因和/或生物合成维生素A所需的另外基因，在需氧或厌氧条件下并且如本领域技术人员已知的在任选地补充有适当的营养物的包含在发酵期间添加的乙醇的含水培养基中培养，以使得能够产生视黄醇乙酸酯。优选地，发酵以补料分批方式进行，其中所述分批阶段包含浓度为约5％或更少的乙醇，特别是2％至1％的乙醇，并且进料为100％乙醇，如本文特别例示的。特别地，发酵在分批补料搅拌釜反应器中运行。发酵可以运行5至14天，例如约118h。包括视黄醇乙酸酯在内的发酵产物可以在合适的时刻(例如当罐由于进料添加而充满时)从培养中收获。如本领域技术人员已知的，取决于宿主细胞，优选地类视黄醇(例如维生素A)、其前体和/或衍生物(例如视黄醛、视黄醇、视黄醇乙酸酯)，特别是视黄醇乙酸酯的产生可以变化。包括但不限于视黄醇、视黄醇乙酸酯、维生素A的类视黄醇可用作食物、饲料、制药或化妆品行业中的成分/制剂。选自酵母属(Saccharomyces)的产生β-胡萝卜素和类视黄醇的宿主细胞的培养和分离描述于例如WO2008042338中。

在一个实施方式中，待用于根据本发明的方法的宿主细胞可包含另外的修饰，例如导致视黄醇转换成FARE的内源酶活性修饰。特别地，此类修饰包括缺失内源脂肪酶活性，即涉及将甘油三酯油例如植物油预消化成通常在产油宿主细胞中表达的甘油和脂肪酸的酶的活性。用于如本文所定义的方法的宿主细胞中待修饰的合适酶可以选自属于EC类别3.1.1.-的内源酶，包括但不限于具有与耶氏酵母属LIP2、LIP3、LIP4、LIP8、TGL1、LIP16、LIP17或LIP18活性对应的活性的一种或多种酶，优选地减少或消除编码具有与耶氏酵母属LIP2和/或LIP3和/或LIP4和/或LIP8活性对应的活性的酶的内源基因。

如本文所用，具有与耶氏酵母属中的相应LIP活性对应的活性的酶不仅包含源自耶氏酵母属(例如解脂耶氏酵母，例如根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15的耶氏酵母属LIP2、LIP3、LIP4、LIP8、TGL-1、LIP16、LIP17、LIP18或它们的组合)的基因，而且还包括具有等同酶活性但源自另一来源生物体，特别是产生视黄醇乙酸酯的产油宿主细胞的酶。优选地，所述宿主细胞包含缺失与解脂耶氏酵母脂肪酶活性2、3、4、8或它们的组合对应的内源性脂肪酶活性，特别地其中所述宿主细胞是包含缺失内源性脂肪酶活性(例如lip8或lip8的组合、例如lip8与lip2的组合、lip8与lip2和lip3的组合、或lip8与lip2、lip3和lip4的组合)的解脂耶氏酵母。

可以以不同的方式来执行核酸或氨基酸中的突变产生，即诱变，诸如通过随机化或定点诱变，由诸如辐射等试剂引起物理损伤、化学处理，或插入遗传元件。技术人员知道如何引入突变。

术语“序列同一性”、“同一性％”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此限定，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性的百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。该氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,Longden和Bleasby,Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。

如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。如果所比较的两个氨基酸序列在他们的任何氨基酸上都没有差异，则它们是相同的或具有100％的同一性。

如本文所定义的待在待用于本发明的合适宿主细胞中表达的酶还包括携带不改变酶活性的(另外的)氨基酸取代的酶，即所述酶显示与关于本文所定义的酶相同的性质。这种突变也被称为“沉默突变”，所述突变不改变根据本发明的酶的(酶促)活性。

关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(International Code of Nomenclature)(Melbourne法)所限定的。因此，例如，菌株Lachancea mirantina是来源于日本的菌株接合酵母属IFO 11066的同义词。

本发明涉及一种用于生产视黄醇乙酸酯的方法，其中所述视黄醇乙酸酯是通过如所述的改性/非改性ATF的作用经由如本文所公开的视黄醇(特别是至少65％作为反式视黄醇)的乙酰化而生成的，其中所述乙酰化酶在如本文所述的合适条件下在合适的宿主细胞中异源表达，并且其中所述宿主细胞在包含在发酵期间添加的有效量的乙醇的培养基中培养。可以从培养基和/或宿主细胞中分离并任选地进一步纯化所产生的视黄醇乙酸酯。本文所定义的所述乙酰化类视黄醇可以用作产生维生素A的多步骤过程中的结构单元。如本领域中已知的，可以从培养基和/或宿主细胞中分离维生素A，并任选地进一步纯化。

如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”是指其催化活性，即其催化从给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内和在限定温度下每限定量的蛋白质消耗的底物和/或产生的产物的量。通常，比活性表示为每mg蛋白质每分钟消耗的底物或形成的产物的μmol数。通常，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，在本文件全文中可互换地使用μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性单位定义。如果酶在体内(即在如本文所定义的宿主细胞内)或在合适的底物存在下的合适的(无细胞)系统内执行其催化活性，则所述酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性。评估如本文所定义的合适ATF(野生型或经修饰的)用于视黄醇乙酸酯生产(即视黄醇的乙酰化)的能力的分析方法，或如本文所定义的具有脂肪酶活性的酶是本领域中已知的，例如描述于WO2014096992的实施例4中。简而言之，产物(例如视黄醇乙酸酯、视黄醇、反式视黄醛、顺式视黄醛、β-胡萝卜素等)的滴度可通过HPLC测量。

关于包含参与β-胡萝卜素的生物合成且在体内表达并有活性从而导致产生类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)的合适宿主细胞，用于生成产生类胡萝卜素的宿主细胞的基因和方法是本领域中已知的，参见例如WO2006102342。取决于要产生的类胡萝卜素，可以涉及不同的基因。

如本文所用，“产生视黄醇的宿主细胞”是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并有活性，从而经由如本文所述的ATF的酶活性产生类视黄醇，例如维生素A及其前体，包括视黄醇。维生素A途径的基因和用于生成产生类视黄醇的宿主细胞的方法是本领域中已知的。术语类视黄醇包括视黄醇，其用作如本文所定义的经修饰的乙酰化酶的底物。“产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞”是能够将视黄醇乙酰化成视黄醇乙酸酯的相应宿主细胞。

如本文所用的类视黄醇包括β-胡萝卜素切割产物，也称为脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、视黄酸甲醇盐(retinoicmethoxide)、视黄醇乙酸酯、视黄酯、4-酮-类视黄醇、3羟基-类视黄醇，或它们的组合。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008042338中。

如本文所用的视黄醛是以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯醛已知的。视黄醛在本文中可互换地称为维生素A醛，并且包括顺式同种型和反式同种型两者，诸如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。

如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域中众所周知的。它包括通过两个具有20个碳的香叶基香叶基焦磷酸酯分子的连接而自然形成的长的40个碳缀合的类异戊二烯多烯。这些类胡萝卜素包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，诸如β-胡萝卜素，所述类胡萝卜素可以在4-酮位置或3-羟基位置上被氧化以产生角黄素、玉米黄质或虾青素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006102342中。

如本文所用的“维生素A”可以是在溶液、固体和制剂中存在的任何化学形式的维生素A，包括视黄醇、视黄醇乙酸酯和视黄酯。它还包括视黄酸，例如未解离的。游离酸形式的视黄酸，或解离为阴离子的视黄酸。

还令人惊讶地发现，其他类异戊二烯衍生的产物(例如甜菊糖苷)的生产是在乙醇存在下，经由重组真菌宿主细胞，特别是酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞，更特别地产油酵母细胞，例如重组耶氏酵母属细胞(经适当修饰以能够产生甜菊糖苷)的发酵得到改善。发现当与不存在乙醇的相应方法相比时，当提供乙醇作为碳源时，特别是在补料分批发酵过程中，所述产物的产量增加。更具体地，在生长的分批阶段之后，通过使用纯乙醇进料或混合乙醇进料(例如乙醇/葡萄糖混合物)来增加所述产物的产量。

因此，本发明涉及一种用于在重组真菌宿主细胞，优选地酵母细胞，例如酿酒酵母细胞，更优选地产油酵母细胞，例如重组耶氏酵母属细胞，更优选地解脂耶氏酵母(经适当修饰以能够产生甜菊糖苷)中生产甜菊糖苷的方法，所述方法包括如本文所定义在乙醇存在下发酵。本公开还涉及产生甜菊糖苷的宿主细胞，优选地酵母细胞，例如酿酒酵母细胞，更优选地产油酵母细胞，例如重组耶氏酵母属细胞，更优选地解脂耶氏酵母(经适当修饰以能够产生甜菊糖苷)在包括如本文所定义在发酵期间添加乙醇的发酵方法中的用途。

用于生产甜菊糖苷的合适真菌宿主细胞是本领域中已知的并且描述于例如WO2011153378、WO2013022989、WO2014122227、WO2013110673和WO2015007748中。

所产生的甜菊糖苷可根据本领域技术人员已知的方法从培养基和/或宿主细胞中分离并任选地进一步纯化。

以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。贯穿本申请所引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开专利申请的内容据此以引用方式并入本文，特别是WO2019058001、WO2020141168、WO2008042338、WO2014096992、WO2006102342、WO2016172282、WO2011153378、WO2013022989、WO2014122227、WO2013110673和WO2015007748。

实施例

实施例1：通用方法和质粒

本文所述的所有基本分子生物学和DNA操纵程序通常是根据Sambrook等人(编著)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:New York(1989)或Ausubel等人(编著)Current Protocols in MolecularBiology.Wiley:New York(1998)执行的。

DNA转化.通过在YPD板培养基上过夜生长来转化菌株，从板上刮下50μl细胞，然后通过在含有1μg转化DNA(通常是用于整合转化的线性DNA)、40％PEG 3550MW、100mM乙酸锂、50mM二硫苏糖醇、5mM Tris-Cl pH 8.0、0.5mM EDTA的500μl中在40℃下孵育60分钟来转化，随后直接铺板到选择性培养基上，或者在显性抗生素标记物选择的情况下，使细胞在30℃下在YPD液体培养基上生长4小时，然后再铺板到选择性培养基上。使用5-氟乳清酸(FOA)执行URA3标记物回收。通过在非选择性培养基上传代来固化附加型潮霉素抗性标记质粒，并通过将来自非选择性培养基的菌落复制铺板到含有潮霉素(100μg/mL)的培养基来鉴定Hyg敏感菌落。

DNA分子生物学.在Genscript(Piscataway,NJ,USA)合成含有用于DrBCO、LmATF-S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L和FfRDH(SEQ ID NO:17)的表达系统的质粒MB9523。质粒MB9523含有‘URA3’以用于解脂耶氏酵母转化中的标记物选择。对于通过基因和标记物的随机非同源末端连接进行的基因插入，通过凝胶电泳和Qiagen凝胶纯化柱来纯化感兴趣的经SfiI消化的MB9523质粒片段。通过测序验证克隆。通常，基因是通过GenScript(Piscataway,NJ)的合成生物学合成的。

质粒列表.表1、表2和序列表中列出了所使用的质粒、菌株、核苷酸和氨基酸序列。一般而言，本文提及的所有未修饰的序列与数据库中参考菌株CLIB122的登录序列相同(Dujon B等人，Nature.2004 Jul 1；430(6995):35-44)。

表1：用于构建菌株的质粒列表，所述菌株用于过表达或缺失被指示为“插入片段”的相应基因。“LmATF1-mut”是指携带aa取代S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L的Lachanceamirantina(LmATF1；WO2019058001中的SEQ ID NO:13)。“DrBCO”是指源自斑马鱼(Daniorerio)的BCO(参见WO2020141168中的SEQ ID NO:16)；“FfRDH”是指源自藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)的RDH(参见WO2020141168中的SEQ ID NO:22)。更多解释请参见文本。

质粒	插入片段	标记物	SEQ ID NO
				MB9523	DrBCO；LmATF1-mut；RDH	URA3	17

表2：所使用的解脂耶氏酵母菌株的列表。ML17544的构建描述于WO2020141168的表2中。有关更多详细信息，请参见文本。

菌株	描述
		ML18812	用MB9523转化的ML17544

发酵条件.补料分批发酵与之前描述的条件相同，不同之处为使用Drakeol 5(Penreco,Karns City,PA,USA)或另一覆盖层和搅拌罐，将玉米油、葡萄糖或乙醇补料到总体积为0.5L至5L的台式反应器中(参见WO2016172282)。分批培养基碳源组成和补料培养基列于表3中。在初始批次碳已被消耗后开始补料，其中以受控方式添加补料以维持溶氧水平(DO)设定点。

简而言之，发酵在玻璃New Brunswick或Eppendorf发酵系统中以3.0L的溢流体积(flood volume)运行。发酵器用以下组分进行分批：2228mL的去离子水、1.96g/kg的MgSO₄·7H₂O、10.46mL的0.20g/kg NaCl、1.04g的CaCl₂-2H₂O、26.18g的(NH₄)2SO₄、27.10g的KH₂PO₄、19.62g的Tastone酵母提取物(Marcor,Leominster,MA)，26mL的DF204消泡剂、0.654μL的4mg/ml盐酸硫胺素、3.27ml/L的微量元素储备溶液，所述微量元素储备溶液含有：200g/kg的柠檬酸、27.3g/kg的FeSO₄·7H₂O、19.6g/kg的Na₂MoO₄·2H₂O、18.7g/kg的CuSO₄·5H₂O、4.9g/kg的H₃BO₃、21.9g/kg的MnSO₄·H₂O、30.2g/kg的ZnSO₄·7H₂O；并高压灭菌。在冷却后，将碳源与800mL的Drakeol 5或其他第二相一起添加。将发酵物接种于200ml的YP培养基过夜摇瓶培养物中，在30℃以250RPM搅动生长，并且具体碳源在表3中显示。发酵参数为以1000RPM搅动，气流对于乙醇来说为4.6LPM并且对于油和混合脂肪酸来说为2.3LPM，用NH₄OH将pH控制在5.5，并且将温度设定为30℃。在补料开始时，添加补料以将DO设定点维持在40％。在接下来的24小时内，通过增大补料速率，使DO设定点以线性方式斜降至20％。然后，在剩余的发酵中，通过添加补料将DO维持在20％。

表3：发酵补料方案。发酵第2阶段始终为约20重量％的Drakeol 5。更多解释请参见文本。

类视黄醇定量.如其他地方所述(WO2020141168)，使用C4反相类视黄醇方法(参见下文)和C18进行类视黄醇分析。所有加入的中间体的加总给出了类视黄醇的总量。

C4反相色谱法.为了准确测定离散的类视黄醇，使用长运行反相系统。我们通过具有YMC Pro C4、150×3.0mm的3μm柱(YMC America,Devens,MA)固定相、和5μl的进样环体积以及控制在23℃的柱和样品托盘的Agilent 1290仪器，以表4B所述的梯度，分离了230nm和325nm处的分析物。在230nm和325nm处检测分析物，并用LCMS验证峰身份。所述分析物被分离为根据表4A指定的离散峰。

表4A：使用C4反相方法的分析物列表。所有加入的中间体的加总给出了类视黄醇的总量。“RT”是指保留时间。有关更多详细信息，请参见文本。

表4B：使用1000:25:1的溶剂A：乙腈；溶剂B：水；溶剂C：水/乙腈/甲磺酸的UPLC方法梯度。有关更多详细信息，请参见文本。

方法校准.所述方法使用从DSM Nutritional Products,Kaiseraugst,CH接收的高纯度视黄醇乙酸酯进行校准。视黄醇和视黄醛根据视黄醇乙酸酯进行定量。如下制备稀释液。将40mg的视黄醇乙酸酯称入100mL容量瓶中并用乙醇溶解，从而得到400μg/mL的溶液。根据需要对这种溶液进行超声处理以确保溶解。使用50/50甲醇/甲基叔丁基醚(MTBE)作为稀释剂，将5mL的400μg/mL溶液稀释成50mL(1/10稀释，终浓度40μg/mL)，将5mL稀释成100mL(1/20稀释，终浓度20μg/mL)，将5mL的40μg/mL稀释成50mL(1/10稀释，终浓度4μg/mL)，将5mL的20μg/mL稀释成50mL(1/10稀释，2μg/mL)。所有稀释均在容量瓶中进行。通过将400μg/mL储备溶液在乙醇中进一步稀释100倍(使用2mL大肚移液管和200mL容量瓶)来测定视黄醇乙酸酯的纯度。使用乙醇将这种溶液在325nm处的吸光度作为空白，并使用方程(吸光度*稀释度(100)*分子量(328.5)/51180＝浓度(mg/mL))调整初始浓度。由于视黄醇乙酸酯的紫外线(UV)吸光度快速最大化，因此浓度越低越好。

样品制备.如果需要的话，将每个菌株的顶部第二相层样品以25倍或更高的稀释度稀释到四氢呋喃(THF)中。使用2mL Precellys(Bertin Corp,Rockville,MD)试管，通过添加25μl充分混合的发酵液和975μl的THF来制备发酵全发酵液。Precellys(3×15×7500rpm)进行两个循环，其中在各循环之间在-80℃冷冻10分钟。经由以13000rpm离心1分钟将细胞碎片离心沉淀。将这些样品在THF中稀释10倍以供分析。

实施例2：碳源对使用耶氏酵母属的分批补料发酵中的类视黄醇产量的影响

为了评估碳源对解脂耶氏酵母中类视黄醇产量的影响，运行在乙醇或油存在下的发酵(参见表3)，并经由测量来自菌株ML18812的FARE的百分比来评定视黄醇乙酸酯的纯度和百分比。

与在玉米油存在下的发酵相比，在乙醇存在下的发酵导致FARE形成显著减少。与玉米油发酵相比，总类视黄醇以及视黄醇乙酸酯的百分比也可增大。结果在表5中显示。

表5：乙醇对使用菌株ML18812生产FARE、类视黄醇和视黄醇乙酸酯(“retAc”)的影响。“+++”是最大值的最高四分位数，“++”是中四分位数，并且“+/-”指示观察到痕量，而“---”指示未观察到，“retAc”意指视黄醇乙酸酯。更多解释请参见文本。

碳源	总类视黄醇	retAc	FARE
				乙醇	+++	+++	---
玉米油	++	+/-	+++

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 (DSM IP Assets B.V.)

<120> 新颖方法

<130> 案号33799

<160> 18

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 334

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

<400> 1

Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys

20 25 30

Arg Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr

35 40 45

Asn Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val

50 55 60

Gly Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys

65 70 75 80

Ala His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg

85 90 95

Leu Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys

100 105 110

Gln Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile

115 120 125

Thr Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala

130 135 140

Ala Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn

145 150 155 160

Gly Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys

165 170 175

Leu Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr

180 185 190

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu

195 200 205

Lys Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile

210 215 220

Val Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly

225 230 235 240

Gln Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr

245 250 255

Arg Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp

260 265 270

Gly Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile

275 280 285

His Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys

290 295 300

Gln Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly

305 310 315 320

Asn His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile

325 330

<210> 2

<211> 1005

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

<400> 2

atgaagcttt ccaccatcct cttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc cctcccttcc 60

cccatcactc cttctgaggc cgcagttctc cagaagcgag tgtacacctc taccgagacc 120

tctcacattg accaggagtc ctacaacttc tttgagaagt acgcccgact cgcaaacatt 180

ggatattgtg ttggtcccgg cactaagatc ttcaagccct tcaactgtgg cctgcaatgt 240

gcccacttcc ccaacgttga gctcatcgag gagttccacg acccccgtct catctttgat 300

gtttctggtt acctcgctgt tgatcatgcc tccaagcaga tctaccttgt tattcgagga 360

acccactctc tggaggacgt cataaccgac atccgaatca tgcaggctcc tctgacgaac 420

tttgatcttg ctgctaacat ctcttctact gctacttgtg atgactgtct tgtccacaat 480

ggcttcatcc agtcctacaa caacacctac aatcagatcg gccccaagct cgactctgtg 540

attgagcagt atcccgacta ccagattgct gtcaccggtc actctctcgg aggagctgca 600

gcccttctgt tcggaatcaa cctcaaggtt aacggccacg atcccctcgt tgttactctt 660

ggtcagccca ttgtcggtaa cgctggcttt gctaactggg tcgataaact cttctttggc 720

caggagaacc ccgatgtctc caaggtgtcc aaagaccgaa agctctaccg aatcacccac 780

cgaggagata tcgtccctca agtgcccttc tgggacggtt accagcactg ctctggtgag 840

gtctttattg actggcccct gatccaccct cctctctcca acgttgtcat gtgccagggc 900

cagagcaata aacagtgctc tgccggtaac actctgctcc agcaggtcaa tgtgattgga 960

aaccatctgc agtacttcgt caccgagggt gtctgtggta tctaa 1005

<210> 3

<211> 498

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

<400> 3

Met Pro Leu Glu Leu Pro Ser Leu Asn Ala Ser Ile Val Gly Asn Thr

1 5 10 15

Val Gln Asn Gly Ala Val Glu Gln Phe Leu Asn Ile Arg Tyr Ala Asp

20 25 30

Ile Pro Gly Lys Phe Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Asp Trp Asn Gly

35 40 45

Ala Glu Ile Asp Ala Thr Lys Val Gly Pro Val Cys Pro Gln Pro Arg

50 55 60

Thr Pro Phe Asn Phe Phe Ser Val Pro Asp Asp Leu Trp Glu Lys Val

65 70 75 80

Asn Val Asp Thr Tyr Gln Asp Gly Leu Leu Cys Asp Asn Leu Ile Val

85 90 95

Thr Arg Pro Lys Gly Val Ser Ala Asn Ala Arg Leu Pro Thr Val Val

100 105 110

Trp Ile His Gly Gly Ser Asn Ile Glu Gly Ser Ile Tyr Asn Leu Ile

115 120 125

Tyr Glu Pro Gln Phe Leu Val Ala Glu Ser Val Arg Val Gly Lys Pro

130 135 140

Ile Val His Val Cys Ile Glu Tyr Arg Leu Gly Leu Ala Gly Phe Leu

145 150 155 160

Thr Lys Asn Gly Lys Gly Asn Trp Gly Thr Trp Asp Gln Tyr Thr Gly

165 170 175

Cys Gln Trp Val Asn Arg His Ile Gln Asp Phe Gly Gly Asp Pro Leu

180 185 190

Asn Val Thr Leu Thr Gly Glu Ser Ala Gly Ser Val Ala Val His Asn

195 200 205

Met Leu Ile Lys Asp Ser Met Asn Gly Arg Lys Leu Phe Arg Asn Ala

210 215 220

Val Met Met Ser Gly Thr Leu Glu Thr Ile Thr Pro Gln Pro Pro Lys

225 230 235 240

Trp His Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Ala Lys Val Thr Gly Lys Glu

245 250 255

Val Ala Asp Leu Ala Ser Leu Ser Asp Lys Glu Leu Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Ile Lys Leu Asn Val Ala Val Cys Met Thr Cys Asp Asp Gly Asp Phe

275 280 285

Phe Glu Pro Gly Trp Lys Gln His Leu Thr Pro Asp Trp Leu Asp Lys

290 295 300

Leu Ile Ile Ser Asp Cys Lys Asp Glu Gly Met Leu Tyr Phe Leu Pro

305 310 315 320

Val Asn Ala Gln Asp Asp Glu Glu Leu Leu Ala Lys Val Ala Lys Ser

325 330 335

Pro Val Gly Lys Glu Ile Ser Glu Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Gly Gly

340 345 350

Asp Ile Lys Ser Ala Cys Leu Asp Leu Lys Thr Asp Ala Thr Phe Asn

355 360 365

Tyr Phe Asn His Leu Leu Phe Lys Lys Met Glu Glu Ala Arg Asn Asn

370 375 380

Gly Ser Thr Ser Arg Val Tyr Arg Leu Ala Val Asp Glu Pro Asn Pro

385 390 395 400

His Asn Pro Asp Gln Arg Ala His His Ala Val Asp Val Leu Tyr Met

405 410 415

Phe Asn Ser Thr Lys Phe Asn Glu His Gly Asp Lys Leu Ser Arg Leu

420 425 430

Phe Gln Ser His Phe Leu Arg Leu Ala Tyr Gly Leu Glu Pro Trp Asp

435 440 445

His Arg Asn Phe Gly Val Tyr Arg Asn Gly Gly Tyr Gln Gln Leu Pro

450 455 460

Leu Ser Glu Leu Asn Lys Val Arg Pro Val Glu Arg Tyr Glu Ala Leu

465 470 475 480

Ser Lys Met Asp Phe Gly Gln Val Gly Arg Leu Ser Asn Ala Leu Ser

485 490 495

Arg Leu

<210> 4

<211> 1497

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

<400> 4

atgcctctcg aactcccctc gctcaacgcc tcgattgtcg gcaacaccgt tcagaacggc 60

gctgttgagc agtttctcaa catccgatac gccgacattc ctggcaagtt tgagaagccc 120

gtgctcaaga acgattggaa cggcgcggag atcgacgcca ccaaggtcgg tcccgtgtgc 180

ccccaacccc gcaccccatt caacttcttc tccgtgccag acgacctctg ggagaaagtc 240

aatgtggaca cgtaccagga cggtctgctg tgcgacaacc tgattgtgac gcgaccgaag 300

ggcgtgtctg ccaacgcccg gctgcccact gttgtgtgga tccacggcgg ctccaatatt 360

gagggcagta tctacaacct catctatgag ccccagttcc tggtggcaga gtcggtgcga 420

gtaggcaagc cgattgtgca cgtgtgtatc gagtaccgac tgggtctcgc gggcttcctc 480

accaagaacg gcaagggcaa ctggggcacg tgggatcagt acacgggctg ccagtgggtc 540

aaccgccaca ttcaggactt tggaggcgat cctttgaacg tgacattgac cggtgagtct 600

gccggctctg tagcagtcca taacatgctc atcaaggact ccatgaacgg ccgaaagttg 660

ttccgaaatg ccgtcatgat gagtggcact ctcgagacca tcactcctca gcctcccaag 720

tggcatgctc gtttggagga gaaggtggcc aaggtcactg gcaaggaagt ggccgacctt 780

gcttctctgt ccgataagga gctgctcgac gcccagatca agctcaatgt ggctgtgtgc 840

atgacttgcg acgacggcga ctttttcgag cccggatgga agcagcatct gactcctgac 900

tggctcgaca agctcatcat ctccgattgc aaggacgagg gcatgctgta tttcctgcca 960

gtcaacgcgc aggacgacga ggagctgttg gcaaaggtgg ccaagtcgcc cgtgggtaag 1020

gagatttccg agctttacgg catcaaggag ggtggcgata tcaagtctgc gtgtctcgat 1080

ctcaagactg acgccacctt caattacttt aaccatctgc tgttcaagaa gatggaggag 1140

gcccgaaaca acggctccac ttctcgagtt taccgtctgg ccgtcgatga gcccaacccc 1200

cacaaccccg accagcgggc ccaccacgcc gtcgacgtgc tgtacatgtt caactcgacc 1260

aagttcaacg agcacggcga caagctgtct cggctgttcc agagccactt tttgcggctg 1320

gcgtatggcc tggagccctg ggaccatcga aactttggag tgtacagaaa cggcggctac 1380

cagcagctgc cgctgagtga gttgaacaag gtccgacccg tcgagcggta cgaggcgctg 1440

tccaagatgg actttggcca ggttgggcgt ttgtccaatg cgctttcgcg cctatga 1497

<210> 5

<211> 406

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

<400> 5

Met Ala Gly Phe Asn Phe Thr Phe Gly Gln Val Ile Ser Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Ser Met Leu Tyr Gly Gln Val Asp Ala Thr Ser Ser Ser Thr Arg Ile

20 25 30

Gln Ala Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Phe Thr Ala Lys Phe Ser Arg Leu

35 40 45

Ser Asn Ile Ala Tyr Cys Ile Asn Ala Pro Phe Thr Pro Leu Arg Thr

50 55 60

Asp Phe Thr Cys Gly Glu Ser Cys Arg Tyr Phe Pro Asp Leu Gln Leu

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Asp Ser Val Phe Gly Gly Asn Phe Ser Ser Ala Ser Thr Thr Gly Tyr

85 90 95

Ile Ala Tyr Asp His Lys Lys Lys Glu Lys Tyr Ile Val Phe Arg Gly

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Thr Phe Ser Ile Pro Asp Ile Ile Thr Asp Ile Gln Phe Gln Thr Ala

115 120 125

Pro Trp Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Leu Ile Pro Thr Lys Glu Asp

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Phe Glu His Lys Gln Ala Ile Leu Lys His Tyr Ala Ala Glu Asn Lys

145 150 155 160

Gly Leu Ser Asn Leu Glu Glu Arg Gln Asp Val Val His Glu Asp Pro

165 170 175

Ser Leu Val Pro Lys Lys Met Asp Lys Cys Glu Asn Cys Gln Ile His

180 185 190

Asp Gly Phe Ala Lys Gly Phe Asn Glu Thr Ile Glu His Ala Gly Pro

195 200 205

Gln Ile Glu Lys Phe Leu Gly Asn Asn Thr Asp Tyr Lys Met Phe Val

210 215 220

Val Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Gln Ala Gln Leu Phe Ala Thr Gln

225 230 235 240

Phe Lys Leu Leu Gly Phe Asp Pro Tyr Met Ile Asn Phe Gly Gln Pro

245 250 255

Arg Leu Gly Asn Pro Glu Phe Ala Ala Tyr Ile Asn Gln Leu Trp Phe

260 265 270

Asn Asp Thr Gly Leu Val Val Asn Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Val

275 280 285

Thr His Trp Asn Asp Ile Val Val Gly Val Pro Asp Trp Leu Asn Tyr

290 295 300

Thr His Ser Ile Gly Glu Val Phe Ile Asp Glu Glu Ser Val Tyr Pro

305 310 315 320

Lys Leu Asp Lys Val Val Val Cys Glu Gly Gly Glu Asn Pro Leu Cys

325 330 335

His Arg Gly Thr Phe Asn Leu Trp Ser Arg Ile Asn Phe Leu Gln Asn

340 345 350

His Leu Ala Tyr Ile Phe Tyr Ile Gly Leu Cys Ala Phe Asn Ile Gly

355 360 365

Arg Arg Asp Val Leu Asn Met Pro Gln Tyr Gln Gly Asn Phe Ser Tyr

370 375 380

Gln His Asn Ile Asp Pro Asn Tyr Asn Tyr Asp Thr Lys Val Pro Thr

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Arg Ile Ser Lys Ser Asn

405

<210> 6

<211> 1221

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

<400> 6

atggcagggt tcaacttcac tttcgggcag gtgatttcgt acctggcttc catgctctat 60

ggacaggtgg atgccacttc atcctccact cgaatccagg ccacccagga tctgtacgac 120

ttcacagcca agttttcgcg actctcaaac atcgcgtact gcatcaatgc ccccttcacg 180

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aagatgtttg ttgttggcca ctctctagga gctgctcagg cccagctgtt tgctacacag 720

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<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

<400> 7

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20 25 30

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85 90 95

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<213> 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)

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<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 含有用于DrBCO、LmATF-S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L和FfRDH的表达系统的质粒

<400> 17

gcggagccta ggccggccag cgtggcgcgt ggccatattg gccagcagct tactacagct 60

cagccaaagt ggatcatgat ggacggaaat atcggactgg aggccaaaaa ggaggtgctc 120

aaatacgcac gggacaagtc tgcacaggtg gcattcgaac ccacgtctgt ccccaaagcc 180

gctgctcttt ccgagctcaa tctgcccgtt taccccaaca actccattgc cttagccacc 240

cccaacactg cagagctcga ggccatgttc gaggcattcc acgagaaggg ccgatttgac 300

gttgacgact ggtttccagt catagacggt cttgctctcg gagctgactt tagaaacgga 360

gccaccatgt tgtcgcacca acatcgtgga ctcaaagcta ttctcgaaca aggaactctg 420

gcccaggcaa tccacatgct accatacatc ccaactttga tcatcaaggg cggagccaac 480

ggcgtcgtcg tcttccaact cattgatgat atcgagtctg ccattcattc acagcgttct 540

gcttccaata aaacgcctgg cctgttccag aagggcaacg ctgcgagtgg aaacaccaag 600

gtcggcgtct acatgcagta ctttgagccc gaagaagtgg gcagtcagtc gattgtaagc 660

gtgactggag ctggagacac tctgtttgga accctggcca tggagattgt caaggacgag 720

tcctggttga acgatatggg agacaagaag agtgcagttg tttctcgagc catgaacaat 780

gctgtgaaga ctattcagag taaggacgct gtctgcaaga gcatccttta agtgatttgc 840

catgctttct cttcttccac gatgtaaata cttattttac acactactgt gcagtagcaa 900

atacagaaca agagttgtcg cctattgaca gtacagtacg agtagtgtat gtacagtagt 960

tatacaatat ctatgtgaaa ttcgtcggca gctttcggct gatgaactac gagttcttcg 1020

taataaatca tcaacgtaat aagcttggta ccagagacgg gttggcggcg tatttgtgtc 1080

ccaaaaaaca gccccaattg ccccaattga ccccaaattg acccagtagc gggcccaacc 1140

ccggcgagag cccccttcac cccacatatc aaacctcccc cggttcccac acttgccgtt 1200

aagggcgtag ggtactgcag tctggaatct acgcttgttc agactttgta ctagtttctt 1260

tgtctggcca tccgggtaac ccatgccgga cgcaaaatag actactgaaa atttttttgc 1320

tttgtggttg ggactttagc caagggtata aaagaccacc gtccccgaat tacctttcct 1380

cttcttttct ctctctcctt gtcaactcac acccgaaatc gttaagcatt tccttctgag 1440

tataagaatc attcgctagc cacaaaaatg ggtgatctcg atgcccgagg aacctctgct 1500

caccccgagc tctctgagcg accttctatt atgccttcta tgtctgatat tcaggaccct 1560

tctggtgatg acaaggctac tccccgagga tctgctgctg gtctgcccca gcttgagctt 1620

gctggacacg cccgacgact tggccacctt gagaacttct ttgctgtcca ggctcgacag 1680

cagatttact cttcttttgc tgttttttgt gagtttgaca ctgcttgttc tctcgctcag 1740

cttgcttctg ctgtgcgaaa cgtttgtctt tctaaccccc ttctccttca cactgttgag 1800

cctaagcacc ctgacatcgc tggattctac cactctgacg agtacctttc ccgaccttgg 1860

cctcagcacg attacatgcg agttcttcga gaggttcacg tcgctgacgt tgttatgaac 1920

ggacagaagg agcacgctca cgttgttcga gatgctgttg acgtttttca ggctcacgga 1980

aaccaggtta cttctgagct ccttgagctt atgactcaga ttgagattcc tcacgcttct 2040

cagactcgac cctcttggcg acttctctgt tttccccacg gagaggctaa ccgatggcga 2100

acctttgctt ttgtttctaa ccactgttct tctgatggtc tttctggtct taacttcttt 2160

cgagatctcc agaaggagct tgctcacggc cccacctctg gtgctcctgg tgcccccgga 2220

gcttccggag ttattttcga ttacgctcag gacgctgcta ccctgcccaa gctgccccct 2280

cccattgatc agaagctcga ttaccgacct tctaagaagg ctcttctcgg ccttctcgct 2340

ggcaagttcg ttcgagagaa gctcggttac gtttctgctg ctcctcccac tacccctacc 2400

tctgaccttg ctcaccctga gggtcaccag tactactgtt accttgttaa cgttcccact 2460

tcttctgttg cccacattaa gactcaggtg cgagagaacg ttcctcacaa gtgtactctc 2520

actccctttc tccaggcttg ttggcttgtt tctctgttca agtacggtcg agttttttct 2580

ggttcttggc ttgagcgata caccgatgtt cttgttgcta tgaacactcg acagcttctc 2640

cccgaggacc ttgagcttca gcgacagtac cgatacggtt ctaacattgg agctgttcga 2700

tacaactacc ctattgctcc ccttgacgtt cgagataacg atcagaagtt ctggtccctt 2760

gttgagtctt accgacttgc cctttctgat gcccgagata agaacgatta cctttacgct 2820

cttggtgctc ttatgctccc tgagatttac gagaagaaga acgttgatgc tgttgttaac 2880

gataccattc ttaaccagcg acgacaggga acccttcttt ctaacgttgg ttacgttcga 2940

gatgagcagc ccactgcttt tgctattaag aaccacgttt tttctcaggg agttggagct 3000

aaccgaaacg cttttgttct taacatttgt gctaccgatc agggtggtct taacatcgct 3060

atttctattg ctaagggaac ccttgcttct cgacaggagg gacaggagct ttgtgatatt 3120

tttaagtcta ctctccttcg attttaaacg cgtctatccg aagatcaaga gcgaagcaag 3180

ttgtaagtcc aggacatgtt tcccgcccac gcgagtgatt tataacacct ctcttttttg 3240

acacccgctc gccttgaaat tcatgtcaca taaattatag tcaacgacgt ttgaataact 3300

tgtcttgtag ttcgatgatg atcatatgat tacattaata gtaattactg tatctgtacc 3360

tgctgtggac cacgcacggc ggaacgtacc gtacaaatat tttcttgctc acatgactct 3420

ctctcggccg cgcacgccgg tggcaaattg ctcttgcatt ggctctgtct ctagacgtcc 3480

aaaccgtcca aagtggcagg gtgacgtgat gcgacgcacg aaggagatgg cccggtggcg 3540

aggaaccgga cacggcgagc cggcgggaaa aaaggcggaa aacgaaaagc gaagggcaca 3600

atctgacggt gcggctgcca ccaacccaag gaggctattt tgggtcgctt tccatttcac 3660

attcgccctc aatggccact ttgcggtggt gaacatggtt tctgaaacaa ccccccagaa 3720

ttagagtata ttgatgtgtt taagattggg ttgctatttg gccattgtgg gggagggtag 3780

cgacgtggag gacattccag ggcgaattga gcctagaaag tggtaccatt ccaaccgtct 3840

cagtcgtccg aattgatcgc tataactatc acctctctca catgtctact tccccaacca 3900

acatccccaa cctcccccac actaaagttc acgccaataa tgtaggcact ctttctgggt 3960

gtgggacagc agagcaatac ggaggggaga ttacacaacg agccacaatt ggggagatgg 4020

tagccatctc actcgacccg tcgacttttg gcaacgctca attacccacc aaatttgggc 4080

tggagttgag gggaccgtgt tccagcgctg taggaccagc aacacacacg gtatcaacag 4140

caaccaacgc ccccgctaat gcacccagta ctgcgcaggt gtgggccagg tgcgttccag 4200

atgcgagttg gcgaacccta agccgacagt gtactttttg ggacgggcag tagcaatcgt 4260

gggcgtagac cccggtgtat ataaaggggt ggagaggacg gattattagc accaacacac 4320

acacttatac tacatgctag ccacaaaaat gctctctttc ttctggcgaa acggtatcga 4380

gactcccgag cccctcaagg ctgacgtttc cggctctatc cctccctggc ttcagggaac 4440

ccttctccga aacggtcctg gtctgttctc cgttggcaac acttcctaca agcactggtt 4500

cgatggtatg gctctcattc actccttcac ctttaaggat ggtgaggttt tttaccgatc 4560

taagtacctg aagtctgaga cttacaagaa gaacatcgct gccgaccgaa tcgttgtgtc 4620

tgagttcgga accatggtgt accccgatcc ctgcaagaac attttctccc gagccttctc 4680

ttacatgatg aacgccattc ctgactttac cgataacaac ctcattaaca tcattaagta 4740

cggtgaggat tactacgcct cctctgaggt caactacatc aaccagattg accccctgac 4800

ccttgagact ctcggacgaa ctaactaccg aaaccacatt gccatcaacc ttgccactgc 4860

tcaccctcac tacgacgagg agggtaacac ttacaacatg ggcactgcta ttatgaacct 4920

cggtcgaccc aagtacgtga ttttcaaggt gcccgccaac acctctgata aggagaacaa 4980

gaagcctgcc ctctctgagg tggagcaggt ttgctccatt cccatccgac cctcccttta 5040

cccttcttac ttccactctt ttggcatgac tgagaactac atcatcttcg ttgagcaggc 5100

cttcaagctg gacatcgtca agctggctac tgcttacttc cgagatatta actggggatc 5160

ttgccttaag ttcgaccagg atgacattaa cgtgttccac ctggtcaaca agaagactgg 5220

taaggctgtg tccgtgaagt actacactga cccctttgtt accttccacc acatcaacgc 5280

ttacgaggac gatggccacg tcgtcttcga tctcattact tacaaggact ctaagctgta 5340

cgatatgttc tacattcaga acatgaagca ggacgtcaag cgatttattg agactaacaa 5400

ggacttcgct cagcccgtgt gccagcgatt tgtccttccc gtcaacgttg ataaggagac 5460

tcctcaggac atcaaccttg tcaagctgca ggacaccact gccactgctg tcctgaagga 5520

ggacggctct gtctactgca cccctgacat catttttaag ggtcttgagc tccctgctat 5580

caactacaag tttaactcta agaagaaccg atacttctac ggcacccgag tggagtggtc 5640

cccttaccct aacaaggtcg ctaaggtgga cgttgttact cgaacccaca agatttggac 5700

tgaggaggag tgttaccctt ctgagcctgt ctttattgcc tcccctgacg ccgttgatga 5760

ggatgacggt gtgattcttt cttctgtggt ttctttcaac ccccagcgac cccctttcct 5820

ggttgtcctc gatgctaagt ccttcaagga gattgctcga gctaccatcg atgcctctat 5880

tcacatggac cttcacggcc ttttcatcca cgacaagtct acctaagttt tttgatcaat 5940

gatccaatgg ctttcacata cccccccacg cctataatta aaacacagag aaatataatc 6000

taacttaata aatattacgg agaatctttc gagtgttcag cagaaatata gccattgtaa 6060

caaaagccgg ctatcgaccg ctttatcgaa gaatatttcc cgccccccag tggccaaacg 6120

atatcggtca gaaggggcag ctctaaacga agaactgcgg tcaggtgaca caactttttc 6180

catctcaggg tgtgtcgcgt gtgcttcatc caaactttag ttggggttcg ggttcgcgcg 6240

agatgatcac gtgccctgat ttggtgtcgt cccccgtcgc gctgcgcacg tgatttattt 6300

atttccggtg gctgctgtct acgcggggcc ttctctgccc ttctgtttca accttcgggc 6360

ggttctcgta accagcagta gcaatccatt tcgaaactca aagagctaaa aacgttaaac 6420

ctcagcagtc gctcgacgaa tgggctgcgg ttgggaagcc cacgaggcct atagccagag 6480

cctcgagttg acaggagccc agacgccttt tccaacggca acttttatat aaaatggcaa 6540

tgtattcatg caattgcggc cgtgtcaggt tggagacact ggaccacact ctccattgct 6600

tcctgaggag atggatcatt gctagtgcat ctacgcgcag caatcccgca agctcgacaa 6660

ccgtagatgg gctttggtgg gccaatcaat tacgcaaccc gcacgttaaa ttgtatgagg 6720

aaggaaggcc acggtacaaa gtgggtggtc ttcacccagt ggttgttggt ggcgtcatgc 6780

agaccatgca ttggggatag cacagggttg gggtgtcttg tggactcaat gggtgaaagg 6840

agatggaaaa gggcggtgaa aagtggtaga atcgaaatcc ctgacgtcaa tttataaagt 6900

aaaatgcgtt tctgccattt tgctcccctc cttctttcgc aatcgcctcc ccaaaagttg 6960

tcgtggcagt acacatgctt gcatacaatg aagctaatcc ggcttgctca gtagttgcta 7020

tatccaggca tggtgtgaaa cccctcaaag tatatatagg agcggtgagc cccagtctgg 7080

ggtcttttct ctccatctca aaactacttt ctcacatgct agccacaaaa atgaccacta 7140

agtacacttc cgttcacgag tctcccaacg gccctggtga cgctcgaccc accgcttccc 7200

agattatcga cgattacaac cttgagggag agctttctgg caagactgtt ctcgtcaccg 7260

gctgttcctc tggtattggt gttgagactg cccgagctat ttaccgaact ggtgccaccc 7320

tttacctcac tgcccgagat gtcgataagg ccaagaccgt tcttcccgac cttgttgaca 7380

cttcccgagt ccactttctc caccttgacc ttaactctct ggagtctgtt cgaggttttg 7440

ctgagaactt caagtctaag tccactcagc ttcacattct catcgagaac gctggcgtga 7500

tggcctgtcc cgagggccga accgtcgatg gttttgagac tcagtttggt atcaaccacc 7560

ttgctcactt tctcctcttt tacctcctca aggataccct tctcaactct tctacccccg 7620

ctttcaactc ccgagttgtc atcctctctt cttgtgctca ccaggctggt tccgttcacc 7680

ttaacaacct gtctcttgag ggtggatacg agccttggaa gtcttacggc cagtccaaga 7740

ctgccaacct ttggactgcc cgagagatcg agaagcgatt tggtgcttcc ggtatccact 7800

cttgggctgt tcaccccggt tccatcgcta ctgagcttca gcgacacgtt tccgacgagc 7860

ttaagcagaa gtgggctgac gataaggagg gtgccaagct gtggaagtcc accgagcagg 7920

gtgccgccac cactgtcctt gctgctgttt cccctgagct tgagggtaag ggcggtcttt 7980

accttgagga tacccaggtt gccaagcccc ctgcccgagg aatgtttggt gttgctgact 8040

gggcttacga tgaggatggc ccctctaagc tctgggccaa gtctcttgag ctccttaagc 8100

tccagtaaag gttagactat ggatatgtaa tttaactgtg tatatagaga gcgtgcaagt 8160

atggagcgct tgttcagctt gtatgatggt cagacgacct gtctgatcga gtatgtatga 8220

tactgcacaa cctgtgtatc cgcatgatct gtccaatggg gcatgttgtt gtgtttctcg 8280

atacggagat gctgggtaca agtagctaat acgattgaac tacttatact tatatgaggc 8340

ttgaagaaag ctgacttgtg tatgacttat tctcaactac atccccagtc acaataccac 8400

cactgcacta ccactacaca ctagtggtgt gttctgtgga gcattctcac ttttggtaaa 8460

cgacattgct tcaagtgcag cggaatcaaa aagtataaag tgggcagcga gtatacctgt 8520

acagactgta ggcgataact caatccaatt accccccaca acatgactgg ccaaactgat 8580

ctcaagactt tattgaaatc agcaacaccg attctcaatg aaggcacata cttcttctgc 8640

aacattcact tgacgcctaa agttggtgag aaatggaccg acaagacata ttctgctatc 8700

cacggactgt tgcctgtgtc ggtggctaca atacgtgagt cagaagggct gacggtggtg 8760

gttcccaagg aaaaggtcga cgagtatctg tctgactcgt cattgccgcc tttggagtac 8820

gactccaact atgagtgtgc ttggatcact ttgacgatac attcttcgtt ggaggctgtg 8880

ggtctgacag ctgcgttttc ggcgcggttg gccgacaaca atatcagctg caacgtcatt 8940

gctggctttc atcatgatca catttttgtc ggcaaaggcg acgcccagag agccattgac 9000

gttctttcta atttggaccg atagccgtat agtccagtct atctataagt tcaactaact 9060

cgtaactatt accataacat atacttcact gccccagata aggttccgat aaaaagttct 9120

gcagactaaa tttatttcag tctcctcttc accaccaaaa tgccctccta cgaagctcga 9180

gctaacgtcc acaagtccgc ctttgccgct cgagtgctca agctcgtggc agccaagaaa 9240

accaacctgt gtgcttctct ggatgttacc accaccaagg agctcattga gcttgccgat 9300

aaggtcggac cttatgtgtg catgatcaag acccatatcg acatcattga cgacttcacc 9360

tacgccggca ctgtgctccc cctcaaggaa cttgctctta agcacggttt cttcctgttc 9420

gaggacagaa agttcgcaga tattggcaac actgtcaagc accagtacaa gaacggtgtc 9480

taccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc 9540

attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa actgtctctg aacagaagaa ggaggacgtc 9600

tctgactacg agaactccca gtacaaggag ttcctggtcc cctctcccaa cgagaagctg 9660

gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag 9720

tactccaagc agaccattga gcttgcccga tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt 9780

gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag gactggctta ttctgacccc cggggtgggt 9840

cttgacgaca agggagacgc tctcggacag cagtaccgaa ctgttgagga tgtcatgtct 9900

accggaacgg atatcataat tgtcggccga ggtctgtacg gccagaaccg agatcctatt 9960

gaggaggcca agcgatacca gaaggctggc tgggaggctt accagaagat taactgttag 10020

aggttagact atggatatgt aatttaactg tgtatataga gagcgtgcaa gtatggagcg 10080

cttgttcagc ttgtatgatg gtcagacgac ctgtctgatc gagtatgtat gatactgcac 10140

aacctgtgta tccgcatgat ctgtccaatg gggcatgttg ttgtgtttct cgatacggag 10200

atgctgggta caagtagcta atacgattga actacttata cttatatgag gcttgaagaa 10260

agctgacttg tgtatgactt attctcaact acatccccag tcacaatacc accactgcac 10320

taccactaca cctcgagcat gcacactatt atcacattac tacatccaaa cccctacagg 10380

gggaggagct ctccaatcaa atatgtacat taactatctc tcgtaaatca ttgttataag 10440

accgtccgtg actgtctaaa tcggttcatt cgttgtaaca aatcagtgta acaactcgtg 10500

gtacgcccgg tttgcttcgc tcacgctccc ctagattttc cgtctaggac acaacaagcc 10560

ctggtggatg acgttcaacg ccttcagcgc gtctttttcc tcaataacac acgagatgtt 10620

aatttcgttg gctccctgag aaatcatctc aatgttaata cctgcctggg ccagagtaga 10680

gaagaacatg cctgcacatc cgaccatggc cttcattctc gttccgatca gcgacacaat 10740

ggtcatgcct cgcttcacat ctactgtgcc gtactttcgc agctcctcca cagcctgctt 10800

gaggttggag tcgggagcat ggaaggccat cgacacatgg acctcagaag tggagatgag 10860

atcgacgaca agtttctgct ggtcgagagt agcaaagatc ttgttcaaga agccatgact 10920

cttggttcgc ttattcgaat gaacgttgag aacggtgata ttcgatttgg tagtgacagc 10980

tgtaggcttc ttctcgtcat ctacaggagc agacacctgg ggagtgaatg agccagagga 11040

cagagaagtt agcgagtcgg tggaagaagc cagatcctgg acattgtttt tcgttttcag 11100

gttgcccgag ccgtcagcag atgggtagat gatagttcct cctcccaggg ggttttccac 11160

gtttttgatt cggataggaa tatgggcctt aatgacctgc tccatggtga aggggtggat 11220

gacttcagat ccgtagtagg tcaactcagc ggcctcctcg ggggtaatga tgggcagcag 11280

acgggcagtg gacacctttc tgggatcggc agtgaagaca ccatcgactt ctttccagat 11340

ctgaagctcc ttggcgtcca gacccacagc caccagagca gcacacagat cggtgtatcc 11400

tcgtccgatc tggcttagga ggcctccctt gacggggcca aagaaaccgg tcaacacggg 11460

caccatgttt cccttgacag gagcagagtc cgtgttagga gagccgggaa gagtgatgat 11520

ctcgcccaga acacgtccga ggtccgaata gaacttggga tcttcggcat tggtggtggt 11580

aactgcgtga gacaggtcaa agtaccgtgc gttaacacca gcgtcccgca taactgcagt 11640

catgtacatg caactgagct tctccccaat ggccatgatg gagtcgagtg ttcgggggga 11700

gatctcagaa atgatttcag cagcagccag gattcgcaac agctggtcgc actcgccgtt 11760

gatgtcggca ttgaggtttt cgagcagttc ggggttcttg acgtcacgct tagcagctgc 11820

aagatggtct tctcggatag actcaatgat ggggttgtag gcgtctgatc cgagaagagc 11880

agagtcagca gcagcaataa gacgggtggt ggttccctcg gccttggtgg cctctagatg 11940

gcctccttgg ccccattcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 12000

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 12060

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 12120

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 12180

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 12240

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 12300

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 12360

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 12420

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 12480

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 12540

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 12600

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 12660

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 12720

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 12780

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 12840

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 12900

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 12960

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 13020

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 13080

gctgcaatga taccgcgaga gccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 13140

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 13200

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 13260

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 13320

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 13380

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 13440

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 13500

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 13560

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 13620

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 13680

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 13740

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 13800

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 13860

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 13920

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 13980

acctataaaa ataggcgtat cacgag 14006

<210> 18

<211> 559

<212> PRT

<213> Lachancea mirantina

<400> 18

Met Gly Asp Leu Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ala His Pro Glu Leu Ser

1 5 10 15

Glu Arg Pro Ser Ile Met Pro Ser Met Ser Asp Ile Gln Asp Pro Ser

20 25 30

Gly Asp Asp Lys Ala Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Gly Leu Pro Gln

35 40 45

Leu Glu Leu Ala Gly His Ala Arg Arg Leu Gly His Leu Glu Asn Phe

50 55 60

Phe Ala Val Gln His Arg Gln Gln Ile Tyr Ser Ser Phe Ala Val Phe

65 70 75 80

Cys Glu Phe Asp Thr Ala Cys Ser Leu Ala Gln Leu Ala Ser Ala Val

85 90 95

Arg Asn Val Cys Leu Ser Asn Pro Leu Leu Leu His Thr Val Glu Pro

100 105 110

Lys His Pro Asp Ile Ala Gly Phe Tyr His Ser Asp Glu Tyr Leu Ser

115 120 125

Arg Pro Trp Pro Gln His Asp Tyr Met Arg Val Leu Arg Glu Val His

130 135 140

Val Ala Asp Val Val Met Asn Gly Gln Lys Glu His Ala His Val Val

145 150 155 160

Arg Asp Ala Val Asp Val Phe Gln Ala His Gly Asn Gln Val Thr Ser

165 170 175

Glu Leu Leu Glu Leu Met Thr Gln Ile Glu Ile Pro His Ala Ser Gln

180 185 190

Thr Arg Pro Ser Trp Arg Leu Leu Cys Phe Pro His Gly Glu Ala Asn

195 200 205

Arg Trp Arg Thr Phe Ala Phe Val Ser Asn His Cys Ser Ser Asp Gly

210 215 220

Leu Ser Gly Leu Asn Phe Phe Arg Asp Leu Gln Lys Glu Leu Ala His

225 230 235 240

Gly Pro Thr Ser Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Ser Gly Val Ile

245 250 255

Phe Asp Tyr Ala Gln Asp Ala Ala Thr Leu Pro Lys Leu Pro Pro Pro

260 265 270

Ile Asp Gln Lys Leu Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Lys Ala Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Leu Ala Gly Lys Phe Val Arg Glu Lys Leu Gly Tyr Val Ser Ala

290 295 300

Ala Pro Pro Thr Thr Pro Thr Ser Asp Leu Ala His Pro Glu Gly His

305 310 315 320

Gln Tyr Tyr Cys Tyr Leu Val Asn Val Pro Thr Ser Ser Val Ala His

325 330 335

Ile Lys Thr Gln Val Arg Glu Asn Val Pro His Lys Cys Thr Leu Thr

340 345 350

Pro Phe Leu Gln Ala Cys Trp Leu Val Ser Leu Phe Lys Tyr Gly Arg

355 360 365

Val Phe Ser Gly Ser Trp Leu Glu Arg Tyr Thr Asp Val Leu Val Ala

370 375 380

Met Asn Thr Arg Gln Leu Leu Pro Glu Asp Leu Glu Leu Gln Arg Gln

385 390 395 400

Tyr Arg Tyr Gly Ser Asn Val Gly Gly Val Arg Tyr Asn Tyr Pro Ile

405 410 415

Ala Pro Leu Asp Val Arg Asp Asn Asp Gln Lys Phe Trp Ser Leu Val

420 425 430

Glu Ser Tyr Arg Leu Ala Leu Ser Asp Ala Arg Asp Lys Asn Asp Tyr

435 440 445

Leu Tyr Ala Leu Gly Ala Leu Met Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Lys

450 455 460

Asn Val Asp Ala Val Val Asn Asp Thr Ile Leu Asn Gln Arg Arg Ser

465 470 475 480

Gly Thr Leu Ile Ser Asn Val Gly Tyr Val Arg Asp Glu Gln Pro Thr

485 490 495

Ala Phe Ala Ile Lys Asn His Val Phe Ser Gln Gly Val Gly Ala Asn

500 505 510

Arg Asn Ala Phe Val Leu Asn Ile Cys Ala Thr Asp Gln Gly Gly Leu

515 520 525

Asn Ile Ala Ile Ser Ile Ala Lys Gly Thr Leu Ala Ser Arg Gln Glu

530 535 540

Gly Gln Glu Leu Cys Asp Ile Phe Lys Ser Thr Leu Leu Arg Phe

545 550 555

Claims

1.一种用于在真菌宿主细胞，特别是产油酵母细胞，优选地耶氏酵母属中生产视黄醇乙酸酯的方法，所述方法包括在乙醇存在下发酵所述宿主细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵是补料分批发酵。

3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括在所述分批阶段期间将浓度为约5％(v/v)或更低的乙醇添加到所述培养基中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法包括在不存在甘油三酯，优选地植物油的情况下发酵所述宿主细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中包括脂肪酸视黄酯(FARE)在内的副产物的形成被减少或消除，优选地与包括在不存在乙醇的情况下发酵所述宿主细胞的方法相比，基于总类视黄醇减少至少约50％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与包括在不存在乙醇的情况下发酵所述宿主细胞的方法相比，基于总类视黄醇的视黄醇乙酸酯的百分比增大，优选地增大了至少约25％。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中与包括在不存在乙醇的情况下发酵所述宿主细胞的方法相比，总类视黄醇的产量增大，优选地增大至少约30％。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞用异源基因转化并表达所述异源基因，优选地编码催化将视黄醇转换成视黄醇乙酸酯的乙酰化酶，更优选地真菌酶，最优选地源自Lachancea mirantina的真菌酶的基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述乙酰化酶在序列中包含一个或多个氨基酸取代，所述序列与SEQ ID NO:18具有至少约20％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或高达100％的同一性，其中所述一个或多个氨基酸取代位于与选自由以下组成的组的氨基酸残基对应的位置处：在根据SEQ ID NO:18的多肽中的位置68、69、72、73、171、174、176、178、291、292、294、301、307、308、311、312、320、322、334、362、405、407、409、480、483、484、490、492、520、521、522、524、525、526以及它们的组合。

10.一种用于减少视黄醇到FARE的酶促转换的方法，优选地其中基于总类视黄醇的FARE的百分比小于25％，所述方法包括在乙醇存在下发酵产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞。