CN117659194B

CN117659194B - 靶向egfr的纳米抗体、药物偶联物及其用途

Info

Publication number: CN117659194B
Application number: CN202311625877.5A
Authority: CN
Inventors: 吴国祥; 蔡祥海; 华佳明; 王利; 张蕊蕊
Original assignee: Keyi Zhejiang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Xinke Medical Lianchuang Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2023-11-30
Filing date: 2023-11-30
Publication date: 2024-08-13
Anticipated expiration: 2043-11-30
Also published as: CN120058935A; CN117659194A; CN120058934A

Abstract

本发明公开了抗EGFR纳米抗体及其编码序列和用途。具体地，本发明公开一类抗人EGFR的特异性纳米抗体及其VHH链。还公开了编码上述纳米抗体或其VHH链的编码序列、相应的表达载体和宿主细胞，以及生产本发明纳米抗体的方法。本发明纳米抗体具有高内吞活性和高特异性，可用于针对EGFR的检测及靶向治疗。

Description

靶向EGFR的纳米抗体、药物偶联物及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及了可以靶向EGFR的纳米抗体及其应用。

背景技术

癌症仍然是全世界人类健康的最大威胁之一，每年在全世界造成超过1000万人死亡，尽管已经有很多癌症治疗方式包括手术，放化疗等，但在一定程度上这些传统治疗方式依然存在诸多问题，例如治疗效果有限，副作用大等。

与传统治疗方式相比，基于靶向治疗药物(例如抗体)的最新方法具有较小的副作用，同时将抗体偶联细胞毒性药物或毒素后，通过细胞内化作用可以极大的提高治疗效果，这些抗体-药物偶联剂也称为抗体偶联药物(ADC)。

纳米抗体是科学家1989年发现的一种来源于骆驼科动物体内、天然缺失轻链的重链抗体可变区。其蛋白质晶体结构长度为4.0nm，直径为2.5nm，是目前已知分子质量最小的抗体，因此称之为纳米抗体，与传统抗体相比，纳米抗体稳定性高，耐受性更强，此外，也具有易表达、易于基因工程改造的优点。基于其稳定性、穿透力等方面的优势，目前纳米抗体在疾病治疗、诊断及物质检测等领域广受关注。

噬菌体展示技术是将外源基因插入丝状噬菌体的基因组，使目的基因编码的蛋白或多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；与传统抗体相比，纳米抗体因其天然缺失轻链，无需轻重链组装配对，并且分子量更小，更易表达展示在噬菌体表面，结合噬菌体展示技术的巨大文库优势，在纳米抗体开发过程中更容易发现序列差异化和功能差异化的纳米抗体分子。

表皮生长因子受体(EGFR)由c-erbB原癌基因编码的一种跨膜受体，分子量约170KD，是细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族(EGF家族)成员的受体；EGFR在与其特异性配体包括表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)结合后，形成二聚化，进一步刺激胞内蛋白酪氨酸激酶活性并引发下游信号传导级联，导致DNA合成和细胞增殖。EGFR同时还参与诸如细胞迁移、黏附和增殖的表型调节。

EGFR过表达与许多恶性肿瘤相关，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌等，并且在这些癌症中，EGFR的过表达与患者的不良预后也有显著关联。

目前EGFR靶点药物开发主要基于功能阻断剂形式，具体分为两大类：一类属于小分子药物，基于胞内信号传导合成的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，包括吉非替尼、erlotinib等；另一类配体阻断剂，主要基于传统抗体开发阻断胞外配体信号传导的单克隆抗体药物，例如西妥昔单抗、帕尼单抗等；然而，对于癌症治疗，目前产品依然存在不少缺陷，例如疗效有限，耐药性高，毒副作用大等诸多问题，所带来的社会效益也十分有限。

基于EGFR靶点的ADC与通过抑制受体信号通路起作用的作用机理不同，ADC可直接将细胞毒素递送至EGFR高表达的肿瘤细胞中，通过细胞内化作用，从而将细胞毒素带入肿瘤细胞内，增强药物的杀伤作用，提高靶向治疗的有效性，所以理论上讲，ADC比传统疗法有更广的适应症和更加强大的药效；目前基于EGFR靶点的ADC大多处于临床在研状态，例如：AVID-100，ABT-414和ABBV-221等；以及相关专利例如：CN106470697、CN114585391、CN111295201等诸多专利中公布的抗体形式均为传统单克隆抗体，而传统单克隆抗体通常具有分子量大，稳定性差，制备工艺难，免疫原性高等诸多缺点，并且已有以EGFR为靶点的两个相关形式ADC IMGN-289和AMG-595也因毒性(如皮肤毒性、胃肠道毒性等)等问题在临床研究中被迫终止；基于毒性问题，阿斯利康AZD9592(专利号：US20230183358A1)也在EGFR端做了减弱亲和力的设计，目的是降低由EGFR驱动的组织毒性，所以以EGFR为靶点的ADC的研究在有效性和安全性方面依然存在诸多挑战。

而具有更小分子量的纳米抗体体积小，稳定性高，免疫原性低，组织渗透性更强，生产成本低等诸多方面均优于传统抗体。

因此基于羊驼纳米抗体形式开发靶向EGFR的纳米抗体及抗体相关药物具有十分重要的意义。

因此，本领域迫切需要开发出一种能够靶向EGFR的高特异性、低亲和力、高内吞活性、并且具有较强的肿瘤细胞杀伤活性的纳米抗体及纳米抗体偶联药物。

发明内容

本发明提供了一种能够靶向EGFR的高特异性、低亲和力、高内吞活性、并且具有较强的肿瘤细胞杀伤活性的纳米抗体及纳米抗体偶联药物。

在本发明的第一方面，提供了一种抗EGFR的纳米抗体，所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：

(1)SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:6所示的CDR2、SEQ ID NO:9所示的CDR3；

(2)SEQ ID NO:5所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2、SEQ ID NO:10所示的CDR3；

(3)SEQ ID NO:5所示的CDR1、SEQ ID NO:8所示的CDR2、SEQ ID NO:11所示的CDR3。

在另一优选例中，所述的纳米抗体VHH链的CDR区包含与上述序列中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的序列相似性的氨基酸序列。

在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留EGFR结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-3个，较佳地为1-2个，更佳地为1个。

在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链还包括框架区(FR)。

在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。

在另一优选例中，所述的框架区FR为人源、鼠源、兔源或骆驼源的。

在另一优选例中，所述的纳米抗体结合人源、鼠源或猴源的EGFR。

在另一优选例中，所述的纳米抗体在表达EGFR抗原的细胞中能够发生内吞。

在另一优选例中，所述靶向EGFR的纳米抗体的VHH链具有与SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列同源性≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、或≥99％的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗EGFR的纳米抗体的VHH链具有一条或多条如SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗EGFR纳米抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。

在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。

在本发明的第二方面，提供了一种纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白从N端到C端具有如式I所示的结构：

Z1-Z2-L-Z3(式I)

式中，

Z1为如本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体的VHH链；

Z2为免疫球蛋白的Fc段；

L为接头序列；

Z3为免疫调节分子部分。

在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的抗EGFR的纳米抗体。

在另一优选例中，所述多核苷酸包括DNA、RNA或cDNA。

在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒。

在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种产生抗EGFR纳米抗体的方法，包括步骤：

(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含有所述抗EGFR纳米抗体的培养物；和

(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗EGFR纳米抗体；和

(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗EGFR纳米抗体。

在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。

在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。

在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。

在另一优选例中，特别有用的细胞毒性药物的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。

在另一优选例中，所述的毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。

在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体。所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体。

在本发明的第八方面，提供了一种本发明所述的抗EGFR纳米抗体的用途，它被用于制备(a)用于检测EGFR分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。

在本发明的第九方面，提供了一种抗EGFR纳米抗体的一种或多种的用途：

(i)用于检测人EGFR分子；

(ii)用于流式检测；

(iii)用于细胞免疫荧光检测；

(iv)用于治疗肿瘤；

(v)用于肿瘤诊断。

在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。

在本发明的第十方面，提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含：本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体。

在另一优选例中，所述多特异性抗体还包含抗体的Fc段。

在本发明的第十一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的纳米抗体的序列；和

(ii)任选的Fc段；和

(iii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签和HA标签

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于EGFR蛋白。

在本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的纳米抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中EGFR蛋白；

其中，所述药剂用于治疗或预防表达EGFR蛋白(即EGFR阳性)的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、或肾癌。

在本发明的第十三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(i)本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或如本发明第十一方面所述的重组蛋白；和

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤包括选自下组的癌症：膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤包括选自下组的癌症：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、或其组合。

在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。

在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有其他的治疗免疫系统疾病或肿瘤疾病的药物。

在另一优选例中，所述其他的治疗免疫系统疾病或肿瘤疾病的药物选自下组：布地奈德、氟替卡松、倍氯米松、糠酸莫米松、沙丁胺醇、茶碱、福莫特罗、噻托溴铵、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、环磷酰胺、氟尿嘧啶、博来霉素、阿那曲唑、或其组合。

在本发明第十四方面，提供了如本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或如本发明第十一方面所述的重组蛋白、或如本发明第十三方面所述的药物组合物的用途，用于：

(a)制备预防和/或治疗与EGFR相关的疾病的药物；和/或

(b)制备检测EGFR的试剂、检测板或试剂盒。

在另一优选例中，所述EGFR为人EGFR。

在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂。

在另一优选例中，所示诊断试剂为造影剂

在另一优选例中，所述试剂用于检测样品中的EGFR蛋白或其片段。

在另一优选例中，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或治疗性和/或非治疗性的。

在本发明的第十五方面，提供了一种检测样品中EGFR蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第一方面所述的纳米抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在EGFR蛋白。

在本发明的第十六方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用本发明第一方面所述纳米抗体或本发明第七方面所述的免疫偶联物。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的方法。

在本发明的第十七方面，提供了一种EGFR蛋白检测试剂，所述的检测试剂包含：

(i)本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体、或本发明第七方面所述的免疫偶联物、或本发明第十一方面所述的重组蛋白；和

(ii)检测学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。

在另一优选例中，所述的检测学上可接受的载体为无毒的、惰性的水性载体介质。

在另一优选例中，所述的检测试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂用于体内检测。

在另一优选例中，所述的检测试剂的剂型为液态或粉状(如水剂、针剂、冻干粉、片剂、含服剂、吸雾剂)。

在本发明的第十八方面，提供了一种EGFR蛋白的试剂盒，所述试剂盒含有本发明第七方面所述的免疫偶联物或本发明第十七方面所述的检测试剂，以及说明书。

在另一优选例中，所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的EGFR的表达。

在本发明第十九方面，提供了本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备体内检测EGFR蛋白的造影剂。

在另一优选例中，所述检测用于与EGFR相关的疾病或病症的诊断或预后。

在本发明的第二十方面，提供了一种治疗与EGFR相关的疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗EGFR纳米抗体、或本发明第七方面所述的免疫偶联物、或本发明第十一方面所述的重组蛋白、或本发明第十三方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如鼠、兔)、非人灵长类动物(如猴)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的总体技术路线。

图2显示了EGFR-His蛋白电泳。

图3显示了EGFR抗原与BMK结合活性验证。

图4显示了羊驼血清效价检测。

图5显示了羊驼纳米抗体文库构建技术路线。

图6显示了靶向EGFR纳米抗体的淘选。

图7显示了纳米抗体表达制备技术路线。

图8显示了纯化后纳米抗体SEC检测。

图9A显示了KY303-01至KY303-10纳米抗体ELISA活性检测。

图9B显示了KY303-11至KY303-20纳米抗体ELISA活性检测。

图9C显示了KY303-21至KY303-30纳米抗体ELISA活性检测。

图9D显示了KY303-31至KY303-40纳米抗体ELISA活性检测。

图9E显示了KY303-41至KY303-50纳米抗体ELISA活性检测。

图9F显示了KY303-51至KY303-57纳米抗体ELISA活性检测。

图10A显示了KY303-01至KY303-10纳米抗体FACS活性检测。

图10B显示了KY303-11至KY303-20纳米抗体FACS活性检测。

图10C显示了KY303-21至KY303-30纳米抗体FACS活性检测。

图10D显示了KY303-31至KY303-40纳米抗体FACS活性检测。

图10E显示了KY303-41至KY303-50纳米抗体FACS活性检测。

图10F显示了KY303-51至KY303-57纳米抗体FACS活性检测。

图11A显示了KY303-01至KY303-30纳米抗体特异性结合检测。

图11B显示了KY303-31至KY303-57纳米抗体特异性结合检测。

图12A显示了纳米抗体在HCT116细胞上内吞率检测。

图12B显示了纳米抗体在769-P细胞上内吞率检测。

图12C显示了纳米抗体在786-O细胞上内吞率检测。

图13显示了纳米抗体偶联MMAE技术路线。

图14A显示了ADC对NCI-H1975细胞杀伤作用。

图14B显示了ADC对HCT116细胞杀伤作用。

图14C显示了ADC对BxPC-3细胞杀伤作用。

图14D显示了ADC对MDA-MB-468细胞杀伤作用。

图14E显示了ADC对NCI-H1993细胞杀伤作用。

图14F显示了ADC对HT29细胞杀伤作用。

图14G显示了ADC对MDA-MB-231细胞杀伤作用。

图15A显示了小鼠HCT116模型肿瘤体积变化。

图15B显示了HCT116模型小鼠体重变化。

图15C显示了小鼠NCI-H1975模型肿瘤体积变化。

图15D显示了NCI-H1975模型小鼠体重变化。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，意外地获得具有优异的内吞活性和特异性的抗EGFR纳米抗体。

实验结果表明，本发明的纳米抗体具有较好的结合活性，且具有较高的内吞功能活性。此外，本发明的纳米抗体偶联细胞毒素(MMAE)后均具有较强的肿瘤细胞杀伤活性，能够显著抑制肿瘤生长，并具有较好的体内安全性。在此基础上完成了本发明。

本发明基于羊驼纳米抗体和噬菌体展示技术开发了靶向EGFR的纳米抗体分子，该分子具有肿瘤细胞株高结合和高内吞功能活性，并且开发为抗体偶联药物具有较好的肿瘤细胞杀伤作用，具备开发为ADC抗肿瘤药物的潜力。本发明的总的技术路线如图1所示。

如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗EGFR纳米抗体”、“本发明EGFR纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于EGFR(包括人EGFR)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1-3中任一所示的纳米抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗EGFR蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。CDR的分区方法目前有多种，包括IMGT法、Kabat法、Chothia法、VBASE2法等。本专利所提及的CDR分区方法均使用IMGT法。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合EGFR蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有EGFR蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合EGFR蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

标记的纳米抗体

在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗EGFR的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。

本发明的抗EGFR纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测方法

本发明还涉及检测EGFR蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中EGFR蛋白的水平。

本

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

试剂盒

本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明还提供了用于检测EGFR水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别EGFR蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

应用

如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与EGFR相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对EGFR的临床诊断和靶向治疗。

本发明的主要优点：

(a).本发明基于羊驼纳米抗体开发的靶向EGFR纳米抗体具有较高的内吞活性。

(b)本发明开发纳米抗体偶联药物能够直接高效杀伤肿瘤细胞。

(c)与目前市面开发传统抗体相比，本发明开发的纳米抗体分子量更小，人体内免疫原性更低，易改造，稳定性更高，易工程化，在商业化过程中能够进一步降低成本，带来更好的社会效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.抗原制备

构建hEGFR-His蛋白表达载体，在293细胞系中培养进行诱导表达纯化，制备hEGFR-His纯化后蛋白；将纯化后hEGFR-His蛋白电泳验证，验证蛋白纯度见图2：蛋白纯度＞90％。

验证纯化后EGFR蛋白活性：hEGFR-His蛋白稀释至1μg/mL，酶标板过夜包被，BMK分子稀释至4μg/mL，按照4倍比8梯度检测结合活性；其中BMK1：西妥昔单抗；BMK2：再生元，专利号US10047160B2；BMK3：艾伯维，专利号US20200405878A1，实验结果见图3：hEGFR-His蛋白与BMK1和BMK3具有较好的结合活性。

实施例2.hEGFR-His蛋白进行羊驼免疫

按照表1羊驼免疫策略进行羊驼免疫；

表1羊驼免疫策略

周期	实验	剂量
			第1天	第一次免疫	800μg
第14天	第二次免疫	400μg
			第28天	第三次免疫	400μg
第42天	第四次免疫	800μg
			第56天	第五次免疫	800μg

第一次免疫采用弗氏完全佐剂，第二至五次免疫采用弗氏不完全佐剂，共进行五次免疫。每次免疫后取血制备抗血清进行血清效价滴度检测：

滴度检测试验：hEGFR-His蛋白稀释至1μg/mL，抗血清稀释至1：1000按照3倍比8梯度稀释进行效价检测，其中Im.0：免疫前羊驼血清；Im.2：第二次免疫后羊驼血清；Im.3：第三次免疫后羊驼血清；Im.4：第四次免疫后羊驼血清。检测结果见图4：羊驼经过四次免疫后获得了较高的血清效价。

实施例3.羊驼第五次免疫后取血分离PBMC，技术方法如下：

1.羊驼进行颈静脉采血，获得100mL外周血；

2.等体积加入100mL生理盐水，稀释外周血；

3.在离心管底部加入PBMC分离液，上层加入稀释的外周血。

4.室温离心分离PBMC细胞。

5.离心结束后，小心吸取PBMC层(即白膜层)并转移至50mL离心管中。

6.加入30mL生理盐水，离心收集细胞，清洗去除残留液，获得羊驼外周血PBMC。

实施例4.羊驼RNA提取和cDNA制备：

以羊驼PBMC为原材料提取羊驼RNA并反转录为cDNA；

羊驼RNA提取使用商业化试剂盒(名称：NucleoSpin RNA Plus，品牌：MN，货号：740984.5)进行，RNA提取步骤均按照试剂盒步骤进行。

cDNA制备使用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit(品牌：Takara，货号：6110A)进行，cDNA制备过程按照试剂盒说明书进行，完成cDNA制备。

实施例5：纳米抗体文库构建

按照图5所示技术路线进行羊驼纳米抗体文库构建。具体包括：

1.设计羊驼纳米抗体上下游引物进行羊驼VHH片段扩增，获得羊驼VHH片段；

2.制备噬菌粒载体并同时酶切VHH片段和载体；

3.回收并连接酶切后的VHH片段和载体制备VHH连接产物；

4.制备大肠杆菌电转感受态细胞，电转连接产物完成纳米抗体文库构建。

实施例6：进行文库淘选和靶向EGFR纳米抗体筛选；

按照图6所示技术路线进行靶向EGFR纳米抗体的淘选和筛选。

具体实施步骤：

1.培养扩增纳米抗体文库，感染辅助噬菌体进行文库包装；

2.包装后的文库进行噬菌体纯化获得噬菌体文库；

3.采用EGFR蛋白固相包被方式进行富集淘选获得阳性文库；

4.挑选阳性文库单克隆菌株进行单克隆ELISA上清验证；

5.阳性单克隆菌株进行基因测序获得靶向EGFR纳米抗体序列。

实验结果：单克隆ELISA检测结果见表2，挑取数值0.3以上阳性克隆测序；

表2A单克隆B1板ELISA结果

表2B单克隆B2板ELISA结果

B2	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	1.0699	0.0295	0.0169	0.0129	1.2256	0.0134	1.2001	0.0254	0.0204	1.2186	0.0198	0.0184
B	0.0268	1.2621	0.019	1.2931	1.2687	1.3181	1.2335	1.232	1.3101	0.0186	0.0187	0.0139
													C	1.2778	0.0201	0.0123	0.0167	0.014	0.0195	1.1854	0.0149	1.206	0.0121	0.0117	0.015
D	0.0278	1.2144	1.2362	0.012	0.013	0.0197	1.2263	0.0117	0.02	0.0131	0.0131	0.0159
													E	1.2819	0.023	0.0225	0.0142	0.0213	0.0139	0.0143	1.2032	0.0122	1.2236	0.0122	0.0165
F	1.1998	1.2078	1.1738	1.206	0.0197	0.0128	1.1763	0.0159	0.0172	0.0172	0.0121	0.0152
													G	0.0172	1.2286	0.0195	0.0143	1.1887	0.0131	1.1581	0.0145	0.0219	1.1399	0.0199	0.0421
H	1.1312	0.038	0.0204	0.0257	0.0271	1.2099	0.0234	0.017	1.1917	0.0204	0.0179	0.0438

表2C单克隆B3板ELISA结果

B3	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.0228	1.3234	0.0163	1.4661	0.0154	1.4029	0.0115	1.4554	0.016	0.016	1.378	0.0945
B	0.0198	0.0244	0.0165	1.286	1.4205	0.0239	0.0139	1.2047	1.4229	0.0133	0.0121	1.4311
													C	0.0182	1.1727	1.3418	0.0164	0.0148	1.2393	0.0145	1.1813	0.0248	0.0148	0.0138	0.0165
D	1.36	0.0246	0.0249	0.0237	0.0259	0.0229	1.2731	1.2955	1.2676	0.0163	1.2319	0.0178
													E	0.7862	0.0211	0.015	0.0149	1.392	1.3779	0.0243	0.1391	1.2565	1.3445	0.02	0.0165
F	0.0299	0.0154	0.0242	0.0163	0.0248	1.2882	0.0165	0.0166	1.3415	0.0193	0.0155	0.0178
													G	0.0225	1.3481	0.0175	1.2672	0.017	0.0153	1.26	0.0145	1.2378	1.3023	0.0156	0.0395
H	0.0306	1.3523	0.0342	0.026	0.0225	0.0239	0.0198	0.0275	1.2926	1.3669	0.0296	0.0532

表2D单克隆B4板ELISA结果

B4	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	1.3937	0.0998	1.4029	1.4371	0.02	1.1429	0.026	0.0336	0.0343	0.6302	1.4793	1.6108
B	1.3725	1.5723	0.4543	0.0509	1.1362	0.1054	0.0273	0.0539	0.0443	1.7301	0.9597	1.0655
													C	0.0771	0.0322	0.0504	0.0946	0.0633	0.0384	0.0526	1.2999	1.4369	0.0451	1.3102	0.115
D	1.5908	1.1695	1.0614	0.0776	1.4472	1.4836	0.1105	0.1119	0.0211	0.0316	0.8277	0.0468
													E	0.0531	1.3958	0.0646	0.0476	0.0571	0.8217	0.0209	0.9121	0.1253	1.4179	1.2701	1.4456
F	1.6853	1.4822	1.1447	0.2767	1.4296	1.4325	1.5065	1.1178	0.1478	1.2886	0.0383	1.4705
													G	1.7481	0.0728	0.5414	0.0527	0.1422	0.9068	1.6295	1.4971	1.218	1.4568	1.5908	0.114
H	1.2997	1.5126	1.8319	1.7626	0.1041	1.3744	0.0767	0.0546	0.4076	0.0687	0.1562	0.1458

实施例7

采用哺乳动物细胞表达系统进行纳米抗体的表达制备，技术路线见图7。

根据上述路线表达制备57株纳米抗体，使用CHO细胞系统表达20mL体系，纯化后获得纳米抗体；纯化后纳米抗体信息见表3。

表3纳米抗体表达纯化

57株纳米抗体SEC纯度检测结果见图8。

实施例8：ELISA检测57株纳米抗体结合活性

实验原理：将hEGFR-His蛋白连接在固相的载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体一酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比；

具体实验过程：

1.将目标蛋白hEGFR-His稀释至1μg/mL，按每孔100μL加入酶标板孔过夜包被；

2.将待测纳米抗体稀释至4μg/mL起始，按4倍比6梯度进行稀释，每孔加入100μl；

3.在37℃静置孵育60分钟；

4.将酶标二抗1：10000稀释后，按每孔加入100μL酶标二抗，在37℃静置孵育30分钟；

5.每孔加入100μL TMB显色液，室温显色5分钟，加入50μL终止液，终止后读数；

实验结果见图9A-F所示：其中KY303-23、KY303-26、KY303-27结合活性较弱外，其余纳米抗体均与EGRF蛋白具有较好的结合活性。

结果分析见表4：纳米抗体ELISA结合EC50。

表4纳米抗体ELISA结合EC50

抗体	KY303-01	KY303-02	KY303-03	KY303-04	KY303-05	KY303-06	KY303-07	KY303-08	KY303-09	KY303-10
											EC50	0.8665	0.8917	0.8658	0.7792	0.8285	0.8619	0.8521	0.8765	0.914	0.9620
抗体	KY303-11	KY303-12	KY303-13	KY303-14	KY303-15	KY303-16	KY303-17	KY303-18	KY303-19	KY303-20
											EC50	0.7795	0.8829	0.8697	0.8153	1.009	0.4923	0.4848	0.8350	0.8312	0.7642
抗体	KY303-21	KY303-22	KY303-23	KY303-24	KY303-25	KY303-26	KY303-27	KY303-28	KY303-29	KY303-30
											EC50	0.8452	0.8292	1.1690	0.8513	0.8460	1.7990	0.9715	0.5505	0.6071	0.8749
抗体	KY303-31	KY303-32	KY303-33	KY303-34	KY303-35	KY303-36	KY303-37	KY303-38	KY303-39	KY303-40
											EC50	0.3598	0.7144	0.4236	0.4112	0.5816	0.6529	0.5571	0.8380	0.3271	0.4079
抗体	KY303-41	KY303-42	KY303-43	KY303-44	KY303-45	KY303-46	KY303-47	KY303-48	KY303-49	KY303-50
											EC50	0.8922	0.7665	0.6611	0.5964	0.8014	0.8470	0.7894	0.8519	0.7821	0.6329
抗体	KY303-51	KY303-52	KY303-53	KY303-54	KY303-55	KY303-56	KY303-57	BMK2
											EC50	0.7032	0.7915	0.7786	0.8238	0.8072	0.8247	0.7394	0.8175

实施例9：FACS检测57株纳米抗体结合活性

具体实施步骤如下：

1.实验前准备：提前准备好处于对数生长期的EGFR-CHO-K1细胞；

2.细胞处理：消化收集细胞，用PBS重悬细胞后调整细胞数量至3E6/mL的浓度；

3.细胞铺板：在96孔(V底)细胞培养板中加入100μL/孔的细胞悬液；

4.抗体准备：抗体提前用PBS+1％BSA的缓冲液稀释，首孔20μg/mL，再4倍梯度稀释，共8个浓度梯度；

5.孵育一抗：向加入细胞悬液的细胞板中加入100μL/孔的抗体稀释液，加完后用排枪吹打混匀，4℃避光孵育60分钟；

6.洗涤：孵育结束后500g离心5分钟，弃上清。加入200μL/孔的PBS+1％BSA清洗细胞两次；

7.孵育二抗：加入100μL/孔的PE-anti-human-Fc抗体稀释液(1：100稀释)，吹打混匀后4℃避光孵育30分钟；

8.洗涤：孵育结束后500g离心5分钟，弃上清；加入200μL/孔的PBS+1％BSA清洗细胞两次；

9.重悬：每孔用200μL的PBS+1％ BSA重悬细胞；

10.FACS检测：待测细胞中表达的荧光强度中位值(Median-PE)，根据荧光强度制作曲线；

实验结果见图10A-F所示：其中KY303-12、KY303-16、KY303-20、KY303-23、KY303-24、KY303-25、KY303-26、KY303-27、KY303-28、KY303-29、KY303-30、KY303-31、KY303-54纳米抗体在FACS水平上无结合，其余均具有较强结合。

结果分析见表5：纳米抗体FACS结合EC50。

表5纳米抗体FACS结合EC50

抗体

KY303-01

KY303-02

KY303-03

KY303-04

KY303-05

KY303-06

KY303-07

KY303-08

KY303-09

KY303-10

EC50

0.0867

0.0934

0.3647

0.0894

1.4400

0.5697

0.3633

0.6145

0.4715

0.9081

抗体

KY303-11

KY303-12

KY303-13

KY303-14

KY303-15

KY303-16

KY303-17

KY303-18

KY303-19

KY303-20

EC50

0.7651

/

1.0420

0.7982

0.02631

/

0.7553

0.1986

0.0455

/

抗体

KY303-21

KY303-22

KY303-23

KY303-24

KY303-25

KY303-26

KY303-27

KY303-28

KY303-29

KY303-30

EC50

0.7292

2.1510

/

抗体

KY303-31

KY303-32

KY303-33

KY303-34

KY303-35

KY303-36

KY303-37

KY303-38

KY303-39

KY303-40

EC50

/

0.3191

0.3576

1.7710

0.4261

0.5227

0.2982

0.4126

1.8820

0.9408

抗体

KY303-41

KY303-42

KY303-43

KY303-44

KY303-45

KY303-46

KY303-47

KY303-48

KY303-49

KY303-50

EC50

1.1030

1.0120

0.7126

0.7766

0.5865

0.2845

0.8605

1.5050

0.7054

5.0920

抗体

KY303-51

KY303-52

KY303-53

KY303-54

KY303-55

KY303-56

KY303-57

BMK1

EC50

1.3010

0.6983

0.8519

/

0.8785

0.6381

0.3918

0.06213

实施例10：57株纳米抗体FACS特异性结合检测

具体实施步骤如下：

1.实验前准备：提前准备好处于对数生长期的CHO-K1细胞；

4.抗体准备：抗体提前用PBS+1％BSA的缓冲液稀释。稀释抗体至20μg/mL；

6.洗涤：孵育结束500g离心5分钟，弃上清。加入200μL/孔的PBS+1％BSA清洗细胞两次；

8.洗涤：孵育结束500g离心5分钟，弃上清；加入200μL/孔的PBS+1％BSA清洗细胞两次；

9.重悬：每孔用200μL的PBS+1％BSA重悬细胞；

10.FACS检测：待测细胞中表达的荧光强度中位值(Median-PE)。

实验结果见图11A-B所示：其中KY303-25，KY303-28，KY303-29，KY303-30与CHO-K1有非特异性结合。

实施例11：EGFR高结合活性纳米抗体在不同肿瘤细胞株内吞活性检测具体实施步骤如下：

1.提前准备好处于对数生长期的待测细胞(HCT116，769-P，786-O)；

2.细胞稀释至2E6/mL浓度，转移到1.5mL EP管中；

3.在96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，以500g的速度离心5分钟，弃上清；

4.制备待检测抗体：待测抗体用完全培养基稀释至10μg/mL，加入100μL/孔的待测抗体，4℃孵育60分钟，500g的速度离心5分钟，弃掉上清；

5.每孔加入200μL的PBS+1％牛血清白蛋白(BSA)，洗除未结合抗体，并以500g的速度离心5分钟，弃上清液，重复2次；

6.每孔加入100μL/孔的完全培养基，检测内化效率的细胞在37℃下孵育2h，对照细胞在4℃冰箱中孵育以作对照；

7.500g的速度离心5分钟，弃掉上清；

8.每孔加入100μL/孔的完全培养基稀释的PE-anti-human-Fc抗体；

9.放置4℃避光孵育30分钟，以500g的离心5分钟，弃掉上清；

10.每孔加入200μL的PBS+1％牛血清白蛋白(BSA)洗涤细胞，以500g的速度离心5分钟，弃上清液，重复2次；

11.每孔添加200μL的PBS+1％牛血清白蛋白(BSA)重悬细胞；

12.用FACS检测待测细胞中表达的平均荧光强度(MFI)。

实验结果见图12A-C所示：KY303-39、KY303-50、KY303-52在细胞上具有较高的内吞活性。

实施例12：三株高内吞活性纳米抗体与EGFR蛋白结合亲和力检测

结果见表6：KY303-39的亲和力为2.61E-8；KY303-50的亲和力为2.50E-7；KY303-52的亲和力分别为2.72E-7。

表6高内吞活性纳米抗体亲和力检测

抗体	Ka(1/Ms)	Kd(1/Ms)	KD(M)
				KY303-39	1.47E+5	3.82E-3	2.61E-8
KY303-50	2.36E+3	5.88E-4	2.50E-7
				KY303-52	1.06E+4	2.89E-3	2.72E-7

三株高内吞活性纳米抗体KY303-39、KY303-50、KY303-52序列见表7。

表7KY303-39、KY303-50、KY303-52纳米抗体序列

实施例13：三株高内吞活性纳米抗体KY303-39、KY303-50、KY303-52偶联MMAE

纳米抗体偶联MMAE技术路线如图13所示。

具体实施步骤如下：

1.抗体还原：固定还原体系，于37℃金属浴200rpm中还原4小时；

2.毒素偶联：固定Vc-MMAE投料量，于4℃金属浴中200rpm反应2小时；

3.反应终止：加入L-Cysteine溶液终止反应；

4.ADC纯化：偶联后的溶液用10kDa的超滤管反复离心换液；

5.活性检测：DAR值及游离毒素检测。

实验结果见表8：偶联后纳米抗体KY303-39-MMAE的DAR值为2.76；KY303-50-MMAE的DAR值为2.93；KY303-52-MMAE的DAR值为2.99。

表8KY303-39、KY303-50、KY303-52纳米抗体和BMK3抗体偶联MMAE

实施例11：三株偶联MMAE的纳米抗体体外杀伤活性检测

具体实施步骤：

1.实验准备：提前准备好处于对数生长期的待测细胞；

2.细胞铺板：将待测细胞进行消化收集处理，并用完全培养基配制成细胞悬液。在96孔黑色透明平底板中加入100μL/孔的细胞悬液。细胞板边缘孔弃用并加入100μL/孔的PBS。将铺好细胞的细胞板放入培养箱，过夜待细胞贴壁；

3.ADC准备：ADC用完全培养基稀释。首孔120μg/mL，再4倍梯度稀释，共6个浓度；

4.孵育ADC：在96孔细胞培养板中加入20μL/孔的ADC稀释液，于37℃、5％CO2培养6天；

5.检测：孵育结束后，向96孔细胞培养板中加入100μL/孔的检测液，静置15分钟，待细胞完全裂解；

6.读板：酶标仪检测待测发光值，根据发光值计算细胞活率，制作曲线，计算IC50。

7.实验结果见图14A-G所示：三株纳米抗体偶联药物对七株肿瘤细胞均具有较强的杀伤活性；

结果分析见表9：3株ADC分别对7株肿瘤细胞杀伤IC50，KY303-39-MMAE，KY303-50-MMAE和KY303-52-MMAE在NCI-H1975，BxPC-3，MDA-MB-468，NCI-H1993细胞上杀伤效果均优于BMK3-MMAE。

表9 3株ADC分别对7株肿瘤细胞杀伤IC50

实施例12

三株ADC的体内药效评价，技术细节如下：

1.将肿瘤细胞HCT116和NCI-H1975(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)接种于雌性NCG小鼠(购自：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，5-6周龄，18-21g)；

2.肿瘤生长至100-150mm³左右时尾静脉注射ADC和对照PBS；

3.接种HCT116肿瘤细胞株小鼠分别注射给予纳米抗体偶联药物4.5mg/kg剂量，BMK药物0.9mg/kg剂量和PBS；接种NCI-H1975肿瘤细胞株小鼠分别注射给予纳米抗体偶联药物3mg/kg剂量，BMK药物5.6mg/kg剂量和PBS；

4.测量肿瘤体积变化并计算抑瘤率；

试验结果如图15A-D所示：在Day18，4.5mg/kg剂量下，HCT116肿瘤生长得到显著抑制，抑瘤率为60.2％，小鼠体重无明细变化；在Day14，3mg/kg剂量下，NCI-H1975肿瘤生长抑制率分别为93.5％，小鼠体重无明细变化。

上述结果表明，KY303-39-MMAE，KY303-50-MMAE，KY303-52-MMAE能够显著地抑制肿瘤生长，并且具备较好的体内安全性，具备开发为ADC抗肿瘤药物的潜力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种抗EGFR的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR如下所示：

SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:6所示的CDR2、SEQ ID NO:9所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的抗EGFR纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链的氨基酸序列为：SEQ ID NO:1。

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的抗EGFR的纳米抗体。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种产生抗EGFR纳米抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而获得含有所述抗EGFR纳米抗体的培养物；和

(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗EGFR纳米抗体；和

(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗EGFR纳米抗体。

7.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物由以下组成：

(a)如权利要求1所述的抗EGFR纳米抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、MMAE或其组合。

8.如权利要求7所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的可检测标记物包括：放射性核素、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒。

9.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白由以下组成：

(i)如权利要求1所述的纳米抗体的序列；和

(ii)任选的Fc段；和

(iii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

(i)权利要求1所述的抗EGFR纳米抗体、或如权利要求7所述的免疫偶联物、或如权利要求9所述的重组蛋白；和

(ii)药学上可接受的载体。

11.如权利要求1所述的抗EGFR纳米抗体、或如权利要求7所述的免疫偶联物、或如权利要求9所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于：

(a)制备预防和/或治疗EGFR阳性肿瘤的药物，所述肿瘤选自下组：膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌；和/或

(b)制备检测EGFR的试剂、检测板或试剂盒。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌。