CN117659139B

CN117659139B - 一种检测禽呼肠孤病毒抗体的间接elisa试剂盒

Info

Publication number: CN117659139B
Application number: CN202311481727.1A
Authority: CN
Inventors: 侯力丹; 毛娅卿; 翟天舒; 陈晓春; 苏佳; 吴华伟
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2023-11-09
Filing date: 2023-11-09
Publication date: 2024-11-08
Anticipated expiration: 2043-11-09
Also published as: CN117659139A

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体的涉及一种检测禽呼肠孤病毒的间接ELISA抗体检测试剂盒。本发明通过分析Sigma‑B蛋白序列信息进行二级结构、亲疏水性、抗原性等分析，选取抗原重组表位，构建至原核表达载体，纯化制备蛋白质标准品并包被到ELISA酶标板上，用于检测禽血清，建立能检测ARV抗体的ELISA方法，以达到对ARV感染和疫苗免疫进行特异性鉴定的目的。

Description

一种检测禽呼肠孤病毒抗体的间接ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体的涉及一种检测禽呼肠孤病毒的间接ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avianreovirus,ARV)是呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属的成员。该病毒感染引起能够引起禽类多种疾病，主要有病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病、心包炎、肠炎、肝炎、法氏囊及胸腺萎缩等，其中以病毒性关节炎/腱鞘炎为主要特征，自然感染发病多见于4～7周龄。感染的鸡群精神沉郁，喜卧倦动，跗关节肿胀，严重者表现为跛行。此外，该病毒的感染不仅发生在肉鸡，在蛋鸡上也偶见发生。1日龄雏鸡对该病毒的易感性最高，感染后的死亡率能达到2％～9％，发病率在5％～60％，甚至100％。禽呼肠孤病毒流行于鸡、火鸡、鸭、鹦鹉和其它禽类，可水平传递亦可经卵垂直传递。呼肠孤病毒也能加剧由其它病原引起的疾病，如鸡贫血因子、大肠埃希氏杆菌和新城疫病毒。由于感染了呼肠孤病毒，使机体的免疫功能降低，导致对其它传染性病因的易感性增加。

ARV具有典型的呼肠孤病毒形态，病毒粒子为20面体对称，无囊膜，具有双层核衣壳结构，外部直径约为75nm。病毒基因组为双股RNA，共分为10个基因片段，大小约23Kb。基因组编码的蛋白质包括10个结构蛋白和4个非结构蛋白，其中S2基因编码的Sigma-A蛋白含416个氨基酸，是病毒内壳结构的主要成分，Sigma-A蛋白参与ARV的抗干扰素过程，可协助ARV应对宿主的免疫防御机制。有报道称，Sigma-A蛋白具备核苷酸焦磷酸水解酶活性，可为ARV的转录复制过程提供能量，Sigma-A蛋白具有ssRNA结合活性；S3基因编码的Sigma-B蛋白含367个氨基，是ARV外壳蛋白的主要成分，Sigma-B蛋白与感染细胞胞质中的μB和μBC蛋白结合形成多聚体复合物。Sigma-B蛋白与ARV的致病机理相关，可借助Sigma-C蛋白的作用增强ARV的感染能力；S1基因上第三个ORF编码的Sigma-C蛋白，含326个氨基酸，是分子量最小但对病毒感染具有重要作用的一种结构蛋白。Sigma-C蛋白参与ARV吸附过程，能介导病毒与特异性受体结合；Sigma-C蛋白可诱导细胞形成合胞体，呈现ARV典型CPE；此外，Sigma-C蛋白具有型特异性中和反应的表面抗原，可刺激宿主分泌中和抗体，其中Sigma-B具有群特异性抗原，Sigma-C具有型特异性抗原。

ARV感染一般根据流行病学调查、临床症状及病理变化来进行诊断。由于ARV易与多种病原微生物继发混合感染，因而需通过实验室手段进一步鉴定，包括病原分离鉴定、琼脂扩散试验、病毒中和试验、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验等分子生物学以及血清学检测方法。然ARV传播迅速，琼脂扩散试验无法检测滴度过低的抗体，在分子生物学诊断技术方面，由于ARV不同分离株具有较高的序列多样性，这在一定程度上限制了PCR方法的检测效果，因而建立一种广谱性的血清学诊断方法，是临床诊断、疫苗检验和流行病研究的迫切需求。

发明内容

本发明通过分析Sigma-B蛋白序列信息进行二级结构、亲疏水性、抗原性等分析，选取抗原重组表位，构建至原核表达载体，纯化制备蛋白质标准品并包被到ELISA酶标板上，用于检测禽血清，建立能检测ARV抗体的ELISA方法，以达到对ARV感染和疫苗免疫进行特异性鉴定的目的。

第一方面，本发明提供一种禽呼肠孤病毒Sigma-B蛋白抗原肽，所述Sigma-B蛋白抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

DGNYFPHHKCHQQQFRTDTPLLRYVRIGRTTEHLLDQYAVALESIADHYDEISQRMVDEPESDEVAPLDIVTRTESIRSDKAVDPDFWTYPLERRSDDSRRDIASACWRMIDASSRSLTLPNCLVSPSLHSRSVFGQMQTTTTIYDVAASGKAVKFSPMVATLSQRDAGPVMLANADPAEGVYSFWTSHFAFSPLIGGVGITGQYARESYHQVGHPVIGSGKKASHYRNLFMESWRGWSKSAFAYATGMEPAECESRLRGHARTMLGRSLPHVCDDEVAQQSGAVLTSLQKTNKF。

进一步的，所述禽呼肠孤病毒Sigma-B蛋白抗原肽还包括含有80％-100％的同源序列的多肽。

第二方面，本发明提供一种构建体，其包含第一方面所述禽呼肠孤病毒Sigma-B蛋白抗原肽的核酸分子。

进一步的，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的禽呼肠孤病毒Sigma-B蛋白抗原肽的核酸分子。

第三方面，本发明提供一种检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包括检测本发明第一方面所述的Sigma-B蛋白抗原肽。

进一步的，所述检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒还含有酶标二抗、洗涤液、样品稀释液、终止液等。

进一步的，所述样品稀释液和洗涤液是磷酸缓冲液(PBS)。

进一步的，所述抗体检测试剂盒还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。

第四方面，本发明提供一种Sigma-B蛋白抗原肽在制备检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒中的应用，所述应用是通过测定受试禽血清的S/P值来实现。

进一步的，所述S/P值＝(临床样品OD_450nm值－阴性对照血清OD_450nm均值)/(阳性对照血清OD_450nm均值－阴性对照血清OD_450nm均值)。

进一步的，当受试禽血清的S/P值≥0.35时，判定为阳性；当受试禽血清的S/P＜0.35时，判定为阴性。

附图说明

图1蛋白小量表达图；

图2蛋白表达形式检测图；

图3蛋白纯化图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1重组表达质粒的构建和蛋白纯化

1.重组表达质粒的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho I分别对本发明的序列SEQ ID NO.1和质粒pET-30a进行双酶切，将纯化回收的片段和表达载体酶切产物用DNA Ligation Kit连接后，转化至感受态细胞(BL21)。

2.重组蛋白的小量表达

挑取经PCR鉴定为阳性的克隆到1.5mL含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养；培养至OD＝0.6～0.8，IPTG(0.5mM)诱导，37℃，200r/min培养2h；取1mL诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50～100μL Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的2×loadingbuffer，100℃，5min，电泳检测。结果显示，在大小约43KD处出现重组Sigma-B蛋白的特定目的条带(图1)，说明Sigma-B蛋白表达成功。

3.重组蛋白的大量表达纯化

将培养的菌液按照1:50比例转接到500mL相应抗性LB液体培养基中，37℃震荡，200r/min，培养至OD＝0.6～0.8，IPTG(0.5mM)37℃诱导3h；收菌：8000rpm，离心6min。弃上清；超声破菌：菌体用20～30ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声波破碎(500W，70次，每次5s，间隔5s)；电泳确定表达形式：取100μL超声后的菌悬液，12000r/min，离心10min，取50μL上清至另一EP管，弃去上清后沉淀用50μL10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果在沉淀中检测到大量的目的蛋白，说明该重组菌表达形式为包涵体表达(图2)。将表达好的蛋白进行纯化，方法如下：将菌体超声破碎得到的沉淀，用10mM Tris(pH8.0)重悬，10000rpm，4℃，15min。再加20mL 2M尿素+10mMTris，混匀，10000rpm，4℃，15min洗涤沉淀。10mL 8M尿素+10mM Tris+0.5M NaCl，溶解沉淀，混匀，超声2～3min，10000rpm，4℃，15min，收集上清得到粗蛋白质。将粗蛋白质进行镍柱纯化，首先利用15mM咪唑+8M尿素+0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液，40mL洗脱杂蛋白。其次利用60mM咪唑+8M尿素+0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液，40mL洗脱杂蛋白。最后利用300mM咪唑+8M尿素+0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液，40mL洗脱目的蛋白质，读数上升到10时开始收集蛋白峰。取50μL样品进行SDS-PAGE电泳检测(图3)。以BCA法进行定量，纯化蛋白浓度为0.5mg/mL，纯度优于85％，命名为ARV-Sigma-B。

实施例2最佳工艺参数的确定

1.抗原抗体的最佳工作浓度确定

将纯化的Sigma-B重组蛋白用包被液稀释成0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml浓度，从左到右加入酶标板中，100μl/孔，4℃孵育过夜；次日，用PBST洗涤3次，每次5min；用5％脱脂乳200μl/孔37度封闭2h。将标准阴阳性血清作1:100、1:200、1:400、1:800梯度稀释，100μl/孔，自上而下加入酶标板，37℃作用1h，洗涤3次，每次5min；加入1：20000的酶标二抗，37℃孵育1h，洗涤3次，每次5min，拍干；每孔加入100μl TMB显色液，37℃避光作用10min；加入50μl终止液终止反应，立即使用酶标仪测定OD450nm值。根据OD450nm值和P/N值确定抗原抗体的最佳工作浓度。结果显示，当抗原包被浓度为2.0μg/ml，抗体稀释度为1：400时，阳性血清的OD450nm值接近于1.0，并且P/N值最大。因此，确定ELISA抗原的最佳包被浓度为2.0μg/ml，血清最佳稀释度为1：400，结果分别见表1～表2。

表1抗原抗体最佳工作浓度检测结果(OD_450nm值)

表2抗原抗体最佳工作浓度检测结果(P/N值)

2.酶标二抗最佳稀释度的确定

以最佳浓度的抗原包被酶标板，将阴阳性血清按最佳稀释度稀释，将酶标二抗作1：5000、1：10000、1：20000、1：40000稀释，每个稀释度做三个重复，通过OD450nm值和P/N值来确定酶标二抗的最佳工作浓度。结果显示，当酶标二抗浓度为1：20000时，P/N值最大，结果见表3～表4。

表3酶标二抗最佳稀释度检测结果(OD450nm值)

表4酶标二抗最佳稀释度检测结果(P/N值)

3.最佳包被时间的确定

以最佳浓度的抗原包被酶标板，设置三种包被条件：37℃孵育1h，4℃包被过夜；37℃孵育3h，4℃包被过夜；4℃包被过夜，每种包被条件设4个重复。以最佳稀释度稀释阴、阳性血清和酶标二抗，通过OD450nm值和P/N值来确定抗原的最佳包被时间。结果显示，最佳包被条件为4℃包被过夜，结果见表5～表6。

表5最佳包被条件检测结果(OD450nm值)

表6最佳包被条件检测结果(P/N值)

4.最佳封闭液的选择

以最佳浓度的抗原包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤后，分别以5％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉+酶标板稳定剂、3％明胶、3％明胶+酶标板稳定剂、1％BSA、1％BSA+酶标板稳定剂、酶标板稳定剂，每个孔做三个重复，以最佳稀释度稀释阴、阳性血清和酶标二抗，通过OD450nm值和P/N值来确定最佳封闭液。结果显示，当用5％脱脂奶粉封闭时，P/N值最大，因此选择5％脱脂奶粉为最佳封闭液，结果见表7～表8。

表7最佳封闭液的确定(OD450nm值)

表8最佳封闭液的确定(P/N值)

5.封闭时间的确定

以最佳浓度的抗原包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤后，以5％脱脂奶粉分别封闭30min、60min、90min、120min，每个条件设置3个重复。通过OD450nm值和P/N值来确定最佳封闭液。结果显示，最佳封闭时间为120min，结果见表9～表10。

表9封闭时间的确定(OD450nm值)

表10封闭时间的确定(P/N值)

6.血清及酶标二抗最佳反应时间的确定

以最佳稀释度稀释阴、阳性血清和酶标二抗，分别孵育30min、45min、60min、90min，每个梯度设置3个重复，进行最佳血清和酶标二抗孵育时间的摸索。通过OD450nm值和P/N值来确定血清及酶标二抗最佳反应时间。结果显示，最佳血清孵育时间为60min，最佳二抗孵育时间为60min，结果见表11～表12。

表11血清及酶标二抗最佳反应时间的确定(OD450nm值)

表12血清及酶标二抗最佳反应时间的确定(P/N值)

7.显色时间的确定

加入显色液，于37℃分别避光孵育3min、5min、10min、15min、20min，每个显色时间阴阳性血清各设置3个重复。通过OD450nm值和P/N值来确定最佳显色时间。结果显示，当反应时间为10min时，P/N值最大，因此底物最佳显色时间为10min，结果见表13～表14。

表13显色时间的确定(OD450nm值)

表14显色时间的确定(P/N值)

实施例3检测禽呼肠孤病毒间接ELISA试剂盒

通过以下步骤制备本发明的检测呼肠孤病毒间接ELISA试剂盒，其步骤如下：

(1)包被：用重组Sigma-B蛋白包被酶标板，Sigma-B的最佳包被浓度为2.0μg/ml，100μl/孔，4℃孵育过夜，次日用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干；

(2)封闭：加入含5％脱脂奶粉，100μl/孔，37℃封闭2h，洗涤3次，每次5min，拍干；

(3)血清孵育：加入1：400稀释的待检血清，37℃孵育60min，洗涤3次，每次5min，拍干；

(4)二抗孵育：加入1：20000的酶标二抗，37℃孵育60min，洗涤3次，每次5min，拍干；

(5)显色：加入TMB显色液100μl/孔，37℃避光显色10min；

(6)终止：加入终止液2M H₂SO₄，50ul/孔；

(7)读数：用酶标仪读取OD_450nm值。

实施例4禽呼肠孤病毒间接ELISA试剂盒的效果验证

本试剂盒的临界值判定标准是用建立的禽呼肠孤病毒间接ELISA抗体检测方法分别对阴性样品进行检测，根据临床阴性血清样品OD_450nm的测定结果，计算每个样品(N01～N92为禽呼肠孤病毒阴性血清)的S/P值，S/P值＝(临床样品OD_450nm值－阴性对照血清OD_450nm均值)/(阳性对照血清OD_450nm均值－阴性对照血清OD_450nm均值)(表15)，使用平均值+3倍标准差的方法，对检测结果进行数据分析，得出临界值，计算所得临界值为0.3466，取两位小数为0.35。为了对确定的临界值进行验证，我们对30份阳性样品(P1～P30为禽呼肠孤病毒抗体阳性血清)进行了检测，用确定的临界值对结果进行判定，均为阳性(表16)。根据以上试验结果，我们即将禽呼肠孤病毒间接ELISA抗体检测方法的临界值确定为0.35，即S/P≥0.35判为阳性，S/P<0.35判为阴性。

表15禽呼肠孤病毒间接ELISA抗体检测方法检测临床阴性血清样品结果

表16禽呼肠孤病毒间接ELISA抗体检测方法对阳性样品的检测结果

1、间接ELISA的特异性实验

用建立的间接ELISA方法分别检测已知的鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽正呼肠孤病毒等病原的阳性血清，同时设立ARV阳性血清和阴性血清对照，并以商品试剂盒作为对照，确定是否有交叉反应，分析此间接ELISA试剂盒的特异性。结果表明(表17)，S/P值均小于0.35，判定为阴性，表明Sigma-B蛋白与上述病毒的阳性血清无交叉方法，该间接ELISA试剂盒特异性良好。

表17禽呼肠孤病毒间接ELISA抗体检测方法特异性检测结果

2、间接ELISA的符合率测定

本发明的的间接ELISA试剂盒检测154份临床血清样品，与商品试剂盒相对比，分析该试剂盒的敏感性、特异性和符合率。

相对敏感性(％)＝阳性数/(阳性数+假阴性数)×100％

相对特异性(％)＝阴性数/(阴性数+假阳性数)×100％

总符合率(％)＝(阳性数+阴性数)/检测总数×100％

结果表明：本发明的间接ELISA试剂盒检测154份临床血清进行检测，其中阴性样品126份，阳性样品28份。用商品试剂盒检测结果154份临床血清进行检测，其中阳性样品29份，阴性样品125份(表18)。由此可知本发明的的间接ELISA方法的相对敏感性为93.10％，相对特异性为99.20％，总符合率为98.05％(表19)。

因此可见，本发明中的间接ELISA试剂盒的敏感性和特异性较高，与已有的商品化试剂盒相比具有较高的符合率。

表18禽呼肠孤病毒间接ELISA抗体检测方法与商品试剂盒检测结果

表19样品检测结果符合率

Claims

1.一种禽呼肠孤病毒Sigma-B蛋白抗原肽，所述Sigma-B蛋白抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

2.一种构建体，其包含编码如权利要求1所述的禽呼肠孤病毒Sigma-B蛋白抗原肽的核酸分子。

3.一种检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的Sigma-B蛋白抗原肽。

4.如权利要求3所述的检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒还含有酶标二抗、洗涤液、样品稀释液、终止液。

5.如权利要求3所述的检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述抗体检测试剂盒还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。

6.一种如权利要求1所述的Sigma-B蛋白抗原肽在制备检测禽呼肠孤病毒抗体的试剂盒中的应用，所述应用是通过测定受试禽血清的S/P值来实现。