CN117625519A - 促肌肉干细胞体外存活和增殖的无胎牛血清培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了促肌肉干细胞体外存活和增殖的无胎牛血清培养基及其应用，属于干细胞培养及培养基技术领域。本发明提供了一种可以保证肌肉干细胞生长存活的无胎牛血清的培养基SFBM，并在SFBM基础上开发了一款可以快速促进肌肉干细胞增殖的无胎牛血清的培养基SFPM，肌肉干细胞在其中可以正常生长，同时不影响其分化潜能。有效避免了胎牛血清可能带来的问题，利用分离肌肉干细胞时的废物(猪血)，大大降低了培养基成本，为细胞培养肉产业种子细胞和肌肉干细胞的研究提供充足的细胞来源，利于细胞的大规模生产和商业化使用。

Description

促肌肉干细胞体外存活和增殖的无胎牛血清培养基及其应用

技术领域

本发明涉及促肌肉干细胞体外存活和增殖的无胎牛血清培养基及其应用，属于干细胞培养及培养基技术领域。

背景技术

肌肉干细胞(Muscle Stem Cell，又称肌卫星细胞，Satellite Cell)是肌肉组织中的专能干细胞，可以从新鲜的肌肉中分离获取，因其来源丰富、易于分离、具有体外增殖能力并具有成肌分化、成脂分化和成骨分化等多向分化的潜能等特点，已广泛应用于组织工程、医学及细胞培养肉等领域。

在细胞培养过程中，培养基是维持细胞生存及增殖最重要的组成，现在常用的细胞培养基中大部分会添加胎牛血清/小牛血清/马血清等血清类物质，血清是一种成分复杂的混合物，由血浆去除纤维蛋白后获得，包含多种细胞所必需的蛋白质、多肽、维生素及生长因子等，对细胞的增殖和分化十分重要。其中胎牛血清(FBS)因其取自未接触外界环境的胎牛，其血清中所含抗体等对细胞有害的成分最少，富含丰富的营养物质及细胞生长必须的细胞因子，能够促进细胞高效增殖，品质最佳，因此在细胞培养中最常使用。然而，胎牛血清的产量少、成本高、批次间质量存在差异，同时也会带来一些动物伦理问题，不适宜细胞的大规模工业化和商业化使用。

因此亟待找到一种不使用胎牛血清，同时可以保证肌肉干细胞高效增殖的培养基，可以大大降低肌肉干细胞培养的成本，利于细胞的大规模生产和商业化使用。

发明内容

本发明的目的是提供两种不使用胎牛血清的肌肉干细胞高效增殖培养基及其应用，可以在不使用胎牛血清的条件下保证肌肉干细胞的快速增殖，同时保证其分化潜能不变。

本发明的第一个目的是提供一种可以保证肌肉干细胞生长增殖的无血清基础培养基SFBM(Serum-free basal medium)，所述无血清培养基包括基础培养基和添加剂。

所述基础培养基包括DMEM和/或F12。

所述基础培养基为DMEM和F12等比例混合得到的培养基。

所述添加剂包含组分A、组分B和组分C；组分A包括牛血清白蛋白(BSA)、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸盐、乙醇胺、L-谷氨酰胺和地塞米松，或包括牛血清白蛋白(BSA)、L-谷氨酰胺、糖皮质激素和1×胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)；组分B包括血小板衍生因子、碱性生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子；组分C包括无机盐、α-酮戊二酸、HPPES溶液和MEM氨基酸溶液。

在一种实施方式中，所述组分C中还可以含有抗坏血酸(VC)或其衍生物和/或氨基酸。

在一种实施方式中，所述糖皮质激素选自地塞米松或其盐、地塞米松溶剂化物、氢化可的松或其盐、氢化可的松溶剂化物中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述抗坏血酸(VC)或其衍生物选自维生素C(抗坏血酸)、抗坏血酸葡糖苷、乙基维生素C、维生素C磷酸镁、维生素C磷酸钠、抗坏血酸的其它溶剂化物的中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述无机盐选自氯化钙、氯化钾、硫酸铜、碳酸氢钠、硝酸铁、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、氯化镁、磷酸氢钠、硫酸镁、硫酸锌中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述添加剂中的各组分在无血清培养基中的浓度如下：1～8mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、0.5～5μg/mL胰岛素、10～200μg/mL转铁蛋白、1～20ng/mL亚硒酸盐、0.5～5μg/mL乙醇胺、1～5mM L-谷氨酰胺、10^-7～10^-6M地塞米松、1～50ng/mL血小板衍生因子、1～50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1～50ng/mL表皮生长因子、10～100ng/mL类胰岛素生长因子、2～10mM无机盐、10～100μg/mL抗坏血酸(VC)或其衍生物、5～100μM氨基酸、0.5～5mMα-酮戊二酸、1×HPPES溶液、1×MEM氨基酸溶液。

肌肉干细胞可以在SFBM培养基中贴壁及生长，在无FBS的条件下保证肌肉干细胞的正常生长。

在一种实施方式中，牛血清白蛋白使用浓度为5mg/mL、胰岛素使用浓度为2.5μg/mL、转铁蛋白浓度为100μg/mL、亚硒酸盐使用浓度为6.7ng/mL、乙醇胺使用浓度为2μg/mL、L-谷氨酰胺使用浓度为2mM、地塞米松使用浓度为10^-7M、血小板衍生因子使用浓度为10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子使用浓度为10ng/mL、表皮生长因子使用浓度为10ng/mL、类胰岛素生长因子使用浓度为50ng/mL、NaHCO₃无机盐使用浓度为6.5mM、抗坏血酸(VC)或其衍生物使用浓度为50μg/mL、氨基酸使用浓度为50μM、α-酮戊二酸使用浓度为2mM。

在一种实施方式中，所述肌肉干细胞包括但不限于哺乳动物或卵生动物的肌肉干细胞。

本发明的第二目的是提供一种促进肌肉干细胞快速增殖的无胎牛血清培养基SFPM，所述SFPM培养基是在所述无血清基础培养基的基础上添加1～10％(v/v)猪血冻融液。

在一种实施方式中，所述猪血冻融液的使用浓度为2％(v/v)。

在一种实施方式中，制备所述猪血冻融液的方法为将猪血液去除红细胞，反复冻融多次，取上清并过滤。

在一种实施方式中，所述猪血液为幼猪血液。

在一种实施方式中，反复冻融的条件为在-80℃冻存，在37℃融解。

本发明的第三个目的是提供一种培养肌肉干细胞的方法，所述方法为利用所述培养基SFBM和所述培养基SFPM培养肌肉干细胞。

本发明的第四个目的是提供所述培养基SFBM和所述培养基SFPM在细胞培养肉生产中的应用，在此两种培养基中，可以在无胎牛血清的添加情况下，肌肉干细胞仍具有分化潜能，可以融合形成多核肌管，形成肌纤维。

有益效果：

本发明通过在多种配方中筛选得到可以保证肌肉干细胞的正常生长及快速增殖的成分明确的物质，发明了一种可以保证肌肉干细胞生长存活的无血清的培养基SFBM，并在SFBM基础上开发了一款可以快速促进肌肉干细胞增殖的无胎牛血清的培养基SFPM，肌肉干细胞在其中可以正常生长，同时不影响其分化潜能。有效避免了胎牛血清可能带来的问题，大大降低了培养基成本，为细胞培养肉产业种子细胞和肌肉干细胞的研究提供充足的细胞来源，利于细胞的大规模生产和商业化使用。

附图说明

图1为肌肉干细胞在不同基础培养基中细胞形态变化；

图2为肌肉干细胞在不同基础培养基中细胞增殖活力MTT检测分析；

图3为肌肉干细胞在不同筛选组别中细胞形态变化；

图4为肌肉干细胞在不同筛选组别中细胞增殖活力MTT检测分析；

图5为肌肉干细胞在5％FBS、SFBM、SFPM组中细胞形态变化；

图6为肌肉干细胞在5％FBS、SFBM、SFPM组中细胞增殖活力MTT检测分析；

图7为肌肉干细胞在5％FBS、SFBM、SFPM组中分化时细胞形态及MyHC免疫荧光结果。

具体实施方式

实施例1肌肉干细胞无胎牛血清培养基开发

开发肌肉干细胞无胎牛血清培养基，首先确定了能够保证细胞生存的基础蛋白质、补充剂和细胞因子等成分，并考察了基础培养基DMEM及DMEM/F12在无胎牛血清培养基中的效果。基础组分及使用浓度如下：

表1肌肉干细胞的无胎牛血清基础培养基添加物组分及使用浓度

将原代肌肉干细胞分别以7000细胞/孔接种至96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下培养，在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中使肌肉干细胞贴壁，贴壁后吸去上清，分别更换培养基为DMEM+A+B、DMEM+2％FBS+A+B、DMEM/F12+A+B、DMEM/F12+2％FBS+A+B，每组培养基的添加量相同，每组均设置3个平行。每天观察细胞形态，培养3天后利用MTT方法检测活细胞量，具体操作如下：

1)吸净培养基，按1：4稀释MTT工作母液(无酚红DMEM)，每孔加入100μL，37℃培养4h；

2)去除MTT工作液，每孔加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，37℃摇床孵育15min；

3)使用酶标仪检测吸光度波(490nm)，分析数据。

肌肉干细胞在不同培养基中细胞形态变化如图1，细胞增殖活力检测分析(MTT吸光值检测)结果如图2。由图1及图2结果显示，肌肉干细胞在DMEM/F12作为基础培养基时生长更好，且在含有血清的情况下优于不含血清的培养条件，因此确定了后续开发的培养基将以DMEM/F12为基础培养基。

为了进一步保证肌肉干细胞在无胎牛血清培养基中生长及增殖能力，在DMEM/F12+A+B基础上考察了胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、NaHCO₃、MEM Amino Acids Solution、抗坏血酸(VC)、酪氨酸、α-酮戊二酸和B-27添加剂(B27(-VA))的作用，组别设置如表2，使用组分浓度如表3。

将原代肌肉干细胞分别以10⁴细胞/孔接种至96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下培养，在含10％FBS的DMEM培养基中使肌肉干细胞贴壁，贴壁后分别更换16个组别培养基，每组均设置3个平行，以含血清的培养基作为对照组(1，2，3)。每天观察细胞形态，培养3天后利用MTT方法检测活细胞量。

表2肌肉干细胞的无胎牛血清培养基筛选组别设置

表3肌肉干细胞的无胎牛血清培养基筛选组分使用浓度

肌肉干细胞在不同组别中细胞形态变化如图3，细胞增殖活力检测分析(MTT吸光值检测)结果如图4。由图3及图4结果显示，由细胞培养形态及MTT结果显示，细胞在6、7、10、11组中生长较好中生长情况较好，能够维持肌肉干细胞的生长和增殖。因此得到了一种可以实现肌肉干细胞无血清增殖的培养基(SFBM)：牛血清白蛋白(BSA)5mg/mL、胰岛素μg/mL、转铁蛋白100μg/mL、亚硒酸钠6.7ng/mL、乙醇胺2μg/mL、L-谷氨酰胺2mM、地塞米松10^-7M、PDGF-BB 10ng/mL、bFGF 10ng/mL、EGF 10ng/mL、LR³-IGF1 50ng/mL、NaHCO₃ 6.5mM、抗坏血酸(VC)50μg/mL、酪氨酸50μM、α-酮戊二酸2mM、1X HPPES溶液、1X MEM氨基酸溶液；其中2.5μg/mL胰岛素、100μg/mL转铁蛋白、6.7ng/mL亚硒酸钠、2μg/mL乙醇胺可以与1×ITS-X互相替代。

将SFBM培养基中牛血清白蛋白(BSA)浓度调整为1～8mg/mL、胰岛素浓度调整为0.5～5μg/mL、转铁蛋白浓度调整为10～200μg/mL、亚硒酸钠浓度调整为1～20ng/mL、乙醇胺浓度调整为0.5～5μg/mL、L-谷氨酰胺浓度调整为1～5mM、地塞米松浓度调整为10^-7～10^-6M、PDGF-BB浓度调整为1～50ng/mL、bFGF浓度调整为1～50ng/mL、EGF浓度调整为1～50ng/mL、LR³-IGF1浓度调整为10～100ng/mL、NaHCO₃浓度调整为2～10mM、抗坏血酸(VC)浓度调整为10～100μg/mL、酪氨酸浓度调整为5～100μM、α-酮戊二酸浓度调整为0.5～5mM，按照相同方法培养肌肉干细胞，仍能保证其正常生长及增殖。

实施例2肌肉干细胞高效增殖无胎牛血清培养基开发

为了进一步提高肌肉干细胞在SFBM培养基中的增殖率，收集分离肌肉干细胞时幼猪血液，去除红细胞后，在-80℃冻存，接着快速在37℃溶解。反复冻融3-4次后，取上清，0.22μm过滤器过滤，得到猪血冻融液。在SFBM培养基基础上添加2％(v/v)猪血冻融液，得到一款可以快速促进肌肉干细胞增殖的无胎牛血清的培养基SFPM。

将原代肌肉干细胞分别以7000细胞/孔接种至96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下培养，在含10％FBS的DMEM培养基中使肌肉干细胞贴壁，贴壁后分别更换5％FBS的DMEM培养基、SFBM培养基、SFPM培养基，每组均设置3个平行。每天观察细胞形态，培养2天后利用MTT方法检测活细胞量。

肌肉干细胞在三组中细胞形态如图5，细胞增殖活力检测分析(MTT吸光值检测)结果如图6。由图5及图6结果显示，细胞在培养基SFPM中能够实现快速增殖，效果远优于5％FBS组。因此得到了一款可以快速促进肌肉干细胞增殖的无胎牛血清的培养基SFPM。

将SFPM培养基中猪血冻融液使用浓度调整为1～10％(v/v)，按照相同方法培养肌肉干细胞，仍能保证其高效增殖。选择不同批次的猪血冻融液，按照相同方法培养肌肉干细胞，仍能保证其高效增殖。

实施例3两种无胎牛血清的肌肉干细胞培养基在细胞培养肉制作的应用

本发明提供了两种无胎牛血清的肌肉干细胞培养基(SFBM、SFPM)，肌肉干细胞可以在其中生长及增殖。作为细胞培养肉的种子细胞，要保证其具有高效分化能力，因此考察了肌肉干细胞在两种培养基中的分化潜能。

将具有分化潜能的原代肌肉干细胞(体外培养第5代，P5)分别以10⁴细胞/孔接种至96孔板中，分别设置5％FBS组(含5％FBS的DMEM培养基)、SFBM组和SFPM组，每组均设置3个平行。在含10％FBS的DMEM培养基中使肌肉干细胞贴壁，在37℃、5％CO₂条件下培养，待细胞密度长至80～90％时，吸去上清，根据组别分别更换培养基，诱导分化5天后，进行肌球蛋白重链(MyHC)免疫荧光染色。

分化培养基(按体积百分比)：98％DMEM培养基、2％马血清。

免疫荧光鉴定：

(1)吸去待处理孔的培养基，用PBS缓冲液小心清洗2次，洗去大部分未贴壁细胞；

(2)用150μL，4％多聚甲醛(4℃预冷)固定，室温下通透15min后除去多聚甲醛，用PBS缓冲液小心清洗3次；

(3)加入150μL，0.5％TritonX-100的PBS处理15min后，去除溶液，用PBS缓冲液小心清洗3次；

(4)加150μL封闭液(1％BSA、含终浓度22.52mg/mL甘氨酸的PBST；PBST为含0.1％Tween20的PBS)，室温孵育30min；去除溶液，用PBS缓冲液小心清洗3次；

(5)加入在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释的抗体100μL，用锡箔纸包被后室温孵育1h后4℃过夜；

(6)过夜处理后，放至室温1h后，用PBS清洗3次，每次5min。加入在1％BSA的PBS溶液中1：200稀释的荧光标记的二抗100μL，用锡箔纸包住后，室温孵育1-1.5h。

(7)用PBS洗三次，加入20μM DAPI 100μL，室温避光孵育10min，用PBS洗三次，每次5min，加入100μL PBS。在荧光显微镜下观察拍照。

三组细胞形态及MyHC免疫荧光情况如图7。由结果可知，在三组条件下，肌肉干细胞均可正常增殖，SFPM组细胞在3～4小时实现贴壁，另外两组细胞在8小时以上才实现贴壁。在SFPM培养基中细胞形态及贴壁情况显著变好，能够更快贴壁展现正常细胞形态。在5％FBS组、SFBM组和SFPM组中，均可自发融合形成多核肌管，不影响其成肌分化能力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种可以保证肌肉干细胞生长增殖的无血清基础培养基SFBM，其特征在于，所述无血清培养基包括基础培养基和添加剂。

2.根据权利要求1所述的无血清基础培养基SFBM，其特征在于，所述基础培养基包括DMEM和/或F12。

3.根据权利要求1所述的无血清基础培养基SFBM，其特征在于，所述添加剂包含组分A、组分B和组分C；组分A包括牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸盐、乙醇胺、L-谷氨酰胺和地塞米松，或包括牛血清白蛋白、L-谷氨酰胺、糖皮质激素和1×胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇；组分B包括血小板衍生因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子；组分C包括无机盐、α-酮戊二酸、HPPES溶液和MEM氨基酸溶液。

4.根据权利要求3所述的无血清基础培养基SFBM，其特征在于，所述组分C中还可以含有抗坏血酸或其衍生物和/或氨基酸。

5.根据权利要求3或4所述的无血清基础培养基SFBM，其特征在于，所述糖皮质激素选自地塞米松或其盐、地塞米松溶剂化物、氢化可的松或其盐、氢化可的松溶剂化物中的一种或多种；所述抗坏血酸或其衍生物选自维生素C抗坏血酸葡糖苷、乙基维生素C、维生素C磷酸镁、维生素C磷酸钠、抗坏血酸的其它溶剂化物的中的一种或多种；所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的一种或多种；所述无机盐选自氯化钙、氯化钾、硫酸铜、碳酸氢钠、硝酸铁、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、氯化镁、磷酸氢钠、硫酸镁、硫酸锌中的一种或多种。

6.根据权利要求3～5任一所述的无血清基础培养基SFBM，其特征在于，所述添加剂中的各组分在无血清培养基中的浓度如下：1～8mg/mL牛血清白蛋白、0.5～5μg/mL胰岛素、10～200μg/mL转铁蛋白、1～20ng/mL亚硒酸盐、0.5～5μg/mL乙醇胺、1～5mM L-谷氨酰胺、10^-7～10^-6M地塞米松、1～50ng/mL血小板衍生因子、1～50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1～50ng/mL表皮生长因子、10～100ng/mL类胰岛素生长因子、2～10mM无机盐、10～100μg/mL抗坏血酸或其衍生物、5～100μM氨基酸、0.5～5mMα-酮戊二酸、1×HPPES溶液、1×MEM氨基酸溶液。

7.一种促进肌肉干细胞快速增殖的无胎牛血清培养基SFPM，其特征在于，所述SFPM培养基是在权利要求1～6任一所述无血清基础培养基SFBM的基础上添加体积比为1～10％猪血冻融液；制备所述猪血冻融液的方法为将猪血液去除红细胞，反复冻融多次，取上清并过滤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，反复冻融的条件为在-80℃冻存，在37℃融解。

9.一种培养肌肉干细胞的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1～6任一所述无血清基础培养基SFBM或权利要求7或8所述无胎牛血清培养基SFPM培养肌肉干细胞。

10.权利要求1～6任一所述无血清基础培养基SFBM或权利要求7或8所述无胎牛血清培养基SFPM在细胞培养肉生产中的应用。