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CN117616048A - Cd19抗体及其应用 - Google Patents

Cd19抗体及其应用 Download PDF

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CN117616048A
CN117616048A CN202280047529.1A CN202280047529A CN117616048A CN 117616048 A CN117616048 A CN 117616048A CN 202280047529 A CN202280047529 A CN 202280047529A CN 117616048 A CN117616048 A CN 117616048A
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CN
China
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seq
antibody
antigen
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Application number
CN202280047529.1A
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辛莲
王琼
杨翠青
曹卓晓
唐任宏
任晋生
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Xiansheng Zaiming Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Xiansheng Zaiming Pharmaceutical Co ltd
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Publication date
Application filed by Xiansheng Zaiming Pharmaceutical Co ltd filed Critical Xiansheng Zaiming Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

CD19抗体及其应用，特异性结合人CD19的抗体或抗原结合片段、多特性抗原结合分子、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸分子、载体、细胞、制备方法、药物组合物、制药用途和疾病的治疗方法，对于开发治疗CD19相关疾病的药物具有重要意义。

Description

CD19抗体及其应用
本公开要求于2021年7月9日、向中国专利局提交的、发明名称为“CD19抗体及其应用”、申请号为202110780438.6的中国发明专利申请的优先权，该申请的全文通过引用的方式结合至本公开。
技术领域
本公开涉及抗体领域，具体而言，涉及CD19抗体及其应用。
背景技术
CD19抗原属于免疫球蛋白超家族，是一个95kDa的I型跨膜糖蛋白，具有单个跨膜结构域，胞质C末端以及细胞外N末端。细胞外结构域由两个C2型Ig样结构域组成，高度保守的胞质结构域由242个氨基酸以及C末端附近9个酪氨酸残基组成。CD19在固有B细胞信号传导阈值的建立过程中发挥重要作用，这一作用是通过调节B细胞受体依赖性和非依赖性的信号传导来完成。CD19通过与其它的B细胞受体或者表面分子相互作用来直接或者间接招募和结合各种下游蛋白激酶，包括Src家族(Lyn，Fyn)，Ras家族，Abl，Btk，衔接子分子(Vav，Grb2)和PI3K蛋白激酶。CD19与补体受体CD21，四跨膜蛋白CD81(TAPA-1)和CD225一起，是成熟B细胞表面上多分子复合物的主要信号传导成分。
CD19在正常B细胞，以及滤泡树突细胞中特异性表达，而不表达于多能血液干细胞。在B淋巴细胞生成过程中，CD19的细胞表面表达最早发生在免疫球蛋白基因重排时，其细胞表面表达水平的高度调控贯穿整个B细胞发育成熟过程，直至终末分化的浆细胞丢失表达。CD19也表达于大多数的B细胞淋巴瘤，套细胞巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞性白血病以及一部分急性髓细胞性白血病。
B细胞通过分泌抗体以及与T细胞相互作用和产生趋化因子以及细胞因子，提供适应性免疫系统的体液免疫成分，从而在宿主防御中发挥关键作用。B细胞亚群，特别是浆细胞和浆母细胞，长期以来被认为是抗体产生的主要来源。B细胞与许多自身免疫性疾病的发病机制有关，包括中枢神经系统(CNS)疾病、多发性硬化症(MS)和视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)。在实验动物和人类中CD19的缺失会导致体液反应受损，导致对感染的易感性增加。而人CD19的过表达会导致皮肤紧致(TSK/+)小鼠(人类系统性硬化症(SSc)的模型)发生自身免疫性疾病。目前已经有一些靶向CD19的抗体在进行自身免疫性疾病相关的临床试验。XmAb5871已完成中重度类风湿关节炎的Ib/IIa期临床试验，并进入治疗IgG4相关疾病和系统性红斑狼疮(SLE)的II期开发。
综上，CD19可以作为治疗B细胞相关白血病和自身免疫性疾病的标志性靶点。需要与人CD19具有良好亲和力的抗体。
发明内容
本公开提供特异性结合人CD19的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、嵌合 抗原受体、免疫效应细胞、核酸分子、载体、细胞、制备方法、药物组合物、制药用途和疾病的治疗方法，其与人CD19具有良好的结合能力，改善人CD19相关的检测、治疗或其他与人CD19结合相关的应用。
在第一方面，本公开公开一种特异性结合人CD19的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1-3，所述轻链可变区包含LCDR1-3，
所述HCDR1包含SEQ ID NO：115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、265、271、277、283、289、295、301、307、313、319、325、331、337、343、349、355、361、367、373、379、385、391、397、403、409、415、421或427任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
所述HCDR2包含SEQ ID NO：116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362、368、374、380、386、392、398、404、410、416、422或428任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
所述HCDR3包含SEQ ID NO：117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219、225、231、237、243、249、255、261、267、273、279、285、291、297、303、309、315、321、327、333、339、345、351、357、363、369、375、381、387、393、399、405、411、417、423或429任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
所述LCDR1包含SEQ ID NO：118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418、424或430任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
所述LCDR2包含SEQ ID NO：119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221、227、233、239、245、251、257、263、269、275、281、287、293、299、305、311、317、323、329、335、341、347、353、359、365、371、377、383、389、395、401、407、413、419、425或431任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
和所述LCDR3包含SEQ ID NO：120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366、372、378、384、390、396、402、408、414、420、426或432任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列。
在一些具体的实施方式中，所述HCDR1-3包含SEQ ID NO：115-117、121-123、127-129、 133-135、139-141、145-147、151-153、157-159、163-165、169-171、175-177、181-183、187-189、193-195、199-201、205-207、211-213、217-219、223-225、229-231、235-237、241-243、247-249、253-255、259-261、265-267、271-273、277-279、283-285、289-291、295-297、301-303、307-309、313-315、319-321、325-327、331-333、337-339、343-345、349-351、355-357、361-363、367-369、373-375、379-381、385-387、391-393、397-399、403-405、409-411、415-417、421-423或427-429所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；和/或，
所述LCDR1-3包含SEQ ID NO：118-120、124-126、130-132、136-138、142-144、148-150、154-156、160-162、166-168、172-174、178-180、184-186、190-192、196-198、202-204、208-210、214-216、220-222、226-228、232-234、238-240、244-246、250-252、256-258、262-264、268-270、274-276、280-282、286-288、292-294、298-300、304-306、310-312、316-318、322-324、328-330、334-336、340-342、346-348、352-354、358-360、364-366、370-372、376-378、382-384、388-390、394-396、400-402、406-408、412-414、418-420、424-426或430-432所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含所述重链可变区和所述轻链可变区，所述HCDR1-3和所述LCDR1-3包含选自下组的序列：
(1)SEQ ID NO：115-120或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(2)SEQ ID NO：121-126或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(3)SEQ ID NO：127-132或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(4)SEQ ID NO：133-138或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(5)SEQ ID NO：139-144或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(6)SEQ ID NO：145-150或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(7)SEQ ID NO：151-156或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(8)SEQ ID NO：157-162或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(9)SEQ ID NO：163-168或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(10)SEQ ID NO：169-174或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(11)SEQ ID NO：175-180或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(12)SEQ ID NO：181-186或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(13)SEQ ID NO：187-192或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(14)SEQ ID NO：193-198或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(15)SEQ ID NO：199-204或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(16)SEQ ID NO：205-210或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(17)SEQ ID NO：211-216或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(18)SEQ ID NO：217-222或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(19)SEQ ID NO：223-228或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(20)SEQ ID NO：229-234或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(21)SEQ ID NO：235-240或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(22)SEQ ID NO：241-246或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(23)SEQ ID NO：247-252或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(24)SEQ ID NO：253-258或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(25)SEQ ID NO：259-264或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(26)SEQ ID NO：265-270或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(27)SEQ ID NO：271-276或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(28)SEQ ID NO：277-282或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(29)SEQ ID NO：283-288或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(30)SEQ ID NO：289-294或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(31)SEQ ID NO：295-300或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(32)SEQ ID NO：301-306或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(33)SEQ ID NO：307-312或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(34)SEQ ID NO：313-318或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(35)SEQ ID NO：319-324或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(36)SEQ ID NO：325-330或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(37)SEQ ID NO：331-336或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(38)SEQ ID NO：337-342或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(39)SEQ ID NO：343-348或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(40)SEQ ID NO：349-354或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(41)SEQ ID NO：355-360或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(42)SEQ ID NO：361-366或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(43)SEQ ID NO：367-372或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(44)SEQ ID NO：373-378或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(45)SEQ ID NO：379-384或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(46)SEQ ID NO：385-390或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(47)SEQ ID NO：391-396或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(48)SEQ ID NO：397-402或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(49)SEQ ID NO：403-408或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(50)SEQ ID NO：409-414或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(51)SEQ ID NO：415-420或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(52)SEQ ID NO：421-426或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
(53)SEQ ID NO：427-432或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列。
在一些具体的实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、439-442任一项所述序列，或其相比具有至少70％同一性或至多15个氨基酸差异的序列；
所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、436、437或438任一项所述序列，或其相比具有至少70％同一性或至多15个氨基酸差异的序列。
在一些具体的实施方式中，所述至少70％同一性优选为至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；所述至多3个突变优选为至多3、2、1或0个突变；所述至多15个突变优选为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个突变；优选地，所述突变为插入、缺失或替换，所述替换优选为保守氨基酸替换，所述突变优选为回复突变或热点突变。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区选自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；所述IgG可选自人IgG，例如人IgG1或人IgG4；所述轻链恒定区选自κ链或λ链，优选为κ链；
优选地，所述重链恒定区可选自SEQ ID NO：433或448；
优选地，所述轻链恒定区可选自SEQ ID NO：434-435或449。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、完整抗体的片段、裸抗体、缀合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段还包括缀合物；所述缀合物可选自治疗剂或示踪剂，所述治疗剂可选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂可选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
在一些具体的实施方式中，，所述抗体或抗原结合片段与人CD19结合的KD值小于1E-08M、1E-09M、1E-10M或1E-11M；优选地，所述抗体或抗原结合片段还结合猴CD19，更优选地，所述抗体或抗原结合片段与猴CD19结合的KD值小于1E-8M、1E-9M、1E-10M、1E-11M或1E-12M。
在第二方面，本公开还公开一种多特异抗原结合分子，所述多特异性抗原结合分子至少包括第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含前述的抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合模块结合与第一抗原结合模块不同的其他靶点或结合相同靶点的不同表位；优选地，所述第二抗原结合模块为抗体或抗原结合片段；
优选地，所述其他靶点选自下组：(1)肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)； (2)免疫检查点；(3)募集和/或激活免疫细胞的靶点。
在第三方面，本公开还公开一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体至少包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包括前述抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
在第三方面，本公开还公开一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达前述嵌合抗原受体和/或包含编码前述嵌合抗原受体的核酸分子；
优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，更优选地，所述T细胞选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；
优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
在第四方面，本公开还公开一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码前述抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子或嵌合抗原受体。
在第五方面，本公开还公开一种载体(vector)，所述载体包括前述核酸分子。
在第六方面，本公开还公开一种细胞，所述细胞包含前述载体。
在第七方面，本公开还公开一种制备前述抗体、抗原结合片段或多特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括：(1)培养前述细胞和/或(2)分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或多特异性抗原结合分子。
在第八方面，本公开还公开一种制备前述免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码前述嵌合抗原受体的核酸分子导入所述免疫效应细胞，和/或启动所述免疫效应细胞表达所述嵌合抗原受体。
在第九方面，本公开还公开一种药物组合物，所述药物组合物包含前述抗体或抗原结合分子、多特异性抗原结合分子、免疫效应细胞、核酸分子、载体、细胞或根据前述方法制备得到的产品；优选地，所述组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂。
在第十方面，本公开还公开前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、免疫效应细胞、核酸分子、载体、细胞、药物组合物、或根据前述方法制备得到的产品，在制备用于治疗CD19相关疾病的药物中的用途；优选地，所述CD19相关疾病选自或自身免疫性疾病；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自神经系统自身免疫性疾病，类风湿，系统性红斑狼疮、IgG4相关疾病、多发性硬化症或视神经脊髓炎谱系疾病。
在第十一方面，本公开还公开一种治疗CD19相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的药物，所述药物包括前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、免疫效应细胞、核酸分子、载体、细胞、药物组合物、或根据前述方法制备得到的产品，优选地，所述CD19相关疾病选自肿瘤或自身免疫性疾病；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自神经系统自身免疫性疾病，类风湿，系统性红斑狼疮、IgG4相关疾病、多发性硬化症 或视神经脊髓炎谱系疾病。
在第十二方面，本公开还公开前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、免疫效应细胞、核酸分子、载体、细胞、药物组合物、或根据前述方法制备得到的产品，用于治疗CD19相关疾病的药物，优选地，所述CD19相关疾病选自肿瘤或自身免疫性疾病；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自神经系统自身免疫性疾病，类风湿，系统性红斑狼疮、IgG4相关疾病、多发性硬化症或视神经脊髓炎谱系疾病。
本公开所述CD19抗体及其抗原结合片段与人CD19具有良好的结合能力，其中，部分抗体还能够交叉结合猴CD19，对开发CD19相关的抗体产品或细胞治疗产品具有重要意义，具有良好的应用前景。
术语定义和说明
除非本公开另外定义，与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。示例性地，“一种组合物，包括A和B”，应当理解为以下技术方案： 由A和B组成的组合物，以及 除A和B外，还含有其 他组分的组合物，均落入前述“一种组合物”的范围内。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
本文术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约10 -7M或更低、约10 -8M或更低、约1×10 -9M或更低、约1×10 -10M或更低、1×10 -11M或更低或1×10 -12M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定，示例性地，可参见本文实施例8所示KD值获得方法。
本文术语“抗原结合分子”按最广义使用，是指特异性结合抗原的分子。示例性地，抗原结合分子包括但不限于抗体或抗体模拟物。“抗体模拟物”是指能够与抗原特异性结合，但与抗体结构无关的有机化合物或结合域，示例性地，抗体模拟物包括但不限于affibody、affitin、affilin、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、核酸适体或Kunitz型结构域肽。
本文术语“抗体”按最广义使用，是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或 来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列，从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性。本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可以包括非抗体衍生的支架，例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。
本文“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugnapacos)等产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、完整抗体的片段、裸抗体、缀合抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
本文术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异体(例如含有天然存在的突变或在制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体或抗原结合分子。举例来说，单克隆抗体可通过多种技术制得，包括(但不限于)杂交瘤技术、重组DNA方法、噬菌体库展示技术和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法和其它本领域已知的方法。
本文术语“天然抗体”是指通过多细胞生物体的免疫系统制造和配对的抗体。本文术语 “工程化抗体”的抗体是指通过基因工程、抗体工程等技术获得的非天然抗体，示例性地，“工程化抗体”包括人源化抗体、小分子抗体(例如scFv等)、双特异性抗体等等。
本文术语“单特异性”是指表示具有一个或多个结合位点，其中每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
本文术语“多特异性抗体”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
本文“抗原结合片段”和“抗体片段”在本文中可互换使用，其不具备完整抗体的全部结构，仅包含完整抗体的局部或局部的变体，所述局部或局部的变体具备结合抗原的能力。本文“抗原结合片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段，称作“Fab”片段，每个含有重和轻链可变域，还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,本文术语“Fab片段”指包含轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’) 2片段。
本文术语“Fd”是指由VH和CH1结构域组成的抗体。本文术语“Fv”是指由单臂VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
本文术语“scFv”(single-chain variable fragment)是指包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS) 4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键，形成二硫键连接的Fv(dsFv)。
本文术语“双抗体(diabody)”，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
本文术语“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)、“VHH”和“纳米抗体(nanobody)”具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。单域抗体可以衍生自骆驼科重链抗体或软骨纲鱼类IgNAR。
本文术语“裸抗体”是指不与治疗剂或示踪剂缀合的抗体；术语“缀合抗体”是指与治疗剂或示踪剂缀合的抗体。
本文术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。
本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。本文术语“互补决定区” 与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。“CDR”可由Kabat编号系统加以定义，工具网站包括abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由ElvinA.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自CH1、Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文术语“Fc”是指完整抗体经木瓜蛋白酶水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据Kabat编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，Fc区可包括或不包括Lys447。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸属于彼此的保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
示例性地，以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文术语“同一性”可通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。又例如，使用GCG软件包中的GAP程序(在www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本公开所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)执行此类检索。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12执行，以获得与本公开核酸(SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3执行，以获得与本公开蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那样使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖 (即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本公开的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
本文术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。本文所述药物组合物可包括多种活性成分，示例性地，除本公开第一方面至第六方面所述抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、免疫效应细胞、核酸分子、载体、细胞或根据第七方面至第八方面所述方法制备得到的产品外，所述药物组合物还可以包括其他活性成分，例如化疗药物或免疫检查点抑制剂。
本文术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如癌症的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“受试者”是指接受对如本公开所述的特定疾病或病症的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物(例如，猴)或非灵长类哺乳动物。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度，可通过本领域已知方法测量。
附图说明
图1为人CD19 exon1-3-his蛋白样品SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测结果，泳道M为蛋白marker，泳道1为非还原条件，泳道2为还原条件；
图2为FMC63抗体和9G8抗体检测Raji细胞CD19表达量的FACS结果，其中A为FMC63抗体的检测结果，B为9G8抗体的检测结果；
图3为转染人CD19的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果；
图4为9G8抗体检测转染猴CD19的HEK293T细胞的FACS结果；
图5为ELISA检测CD19嵌合抗体与人CD19-His蛋白的结合反应；
图6为FACS检测CD19嵌合抗体与Raji细胞的结合反应；
图7为FACS检测CD19嵌合抗体与CHO-K1-人CD19的结合反应；
图8A为FACS检测CD19嵌合抗体与MOLT-4、Raji细胞的结合反应；
图8B为FACS检测CD19嵌合抗体与MOLT-4、Raji细胞的结合反应；
图9A为FACS检测CD19嵌合抗体与CHO-K1、CHO-K1-人CD19细胞的结合反应；
图9B为FACS检测CD19嵌合抗体与CHO-K1、CHO-K1-人CD19细胞的结合反应；
图10为ELISA检测CD19嵌合抗体与猴CD19-his蛋白的结合反应；
图11为FACS检测CD19嵌合抗体与HEK293T-猴CD19细胞的结合反应；
图12A为FACS检测CD19嵌合抗体与HEK293T、HEK293T-猴CD19细胞的结合反应；
图12B为FACS检测CD19嵌合抗体与HEK293T、HEK293T-猴CD19细胞的结合反应
图13为FACS检测CD20抗体和1nM嵌合抗体双染色食蟹猴外周血单核细胞散点图，CD20为B细胞标记物，图中所示比例为嵌合抗体标记的阳性细胞占CD20阳性细胞比例，抗CD19对照抗体为9G8，阴性对照为hIgG1；
图14为ELISA检测CD19嵌合抗体与人CD19 exon1-3-his蛋白的结合反应；
图15为ELISA检测F3.121.4人源化抗体与人CD19蛋白的结合反应；
图16A为FACS检测F3.121.4人源化抗体与CHO-K1-人CD19细胞的结合反应；
图16B为FACS检测F3.121.4人源化抗体与CHO-K1细胞的结合反应；
图16C为FACS检测F3.121.4人源化抗体与Raji细胞的结合反应；
图16D为FACS检测F3.121.4人源化抗体与MOLT-4细胞的结合反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本公开，本公开的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本公开实施例仅是范例性的，并不对本公开的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本公开的精神和范围下可以对本公开技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本公开的保护范围内。
实施例1 CD19抗原以及阳性抗体的制备
1.1人CD19 exon1-3-His标签蛋白的制备
将含有编码人CD19 exon1-3氨基酸序列(NP_001171569.1所示序列的第20位Pro至第186位Gln)且带有His标签的核苷酸序列克隆到pTT5载体(由通用生物系统安徽有限公司完成)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)进行瞬时转染(PEI，Polysciences，货号：24765-1)并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下进行扩大培养。6天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含人CD19 exon1-3的培养上清液。将培养上清液上样到镍离子亲和层析柱HisTrap TMExcel(GE Healthcare，货号：GE17-3712-06)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)清洗镍离子亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用bufferA：20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)和buffer B：20mM PB，0.5MNaCl，500mM咪唑进行梯度洗脱(2％,4％,8％,16％,50％,100％)，收集从镍离子亲和层析柱上洗脱下来的带His标签的人CD19 exon1-3蛋白，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃透析过夜。透析后的蛋白经0.22μm滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的人CD19 exon1-3蛋白，SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测样品目的条带如图1所示。
1.2人CD19对照抗体的制备
FMC63和9G8克隆是识别人CD19的抗体，两者的抗原结合表位位于近膜端。FMC63克隆的重链可变区和轻链可变区序列根据专利WO2016033570A1获得，9G8克隆的重链可变区和轻链可变区序列根据专利WO2018083535A1获得。由泰州市百英生物科技有限公司将FMC63和9G8克隆的轻链可变区序列分别克隆到包含信号肽和人、鼠源抗体IgG1的轻链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HLK，重链可变区序列分别克隆到包含信号肽和人、鼠源抗体 IgG1的重链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HH1，获得FMC63-hIgG1、FMC63-mIgG1和9G8-hIgG1、9G8-mIgG1，对应的氨基酸序列信息如下表1所示。并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press。将表达载体按照PEI(购自Polysciences，货号：24765-1)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)，并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成分，获得含抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆，货号分别为：AA0273和B-1620)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl(pH 7.2)进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的蛋白经0.22μm滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存。
表1对照抗体序列信息
实施例2内源表达细胞株的鉴定、过表达人CD19以及猴CD19的细胞株构建和鉴定
2.1内源性表达CD19细胞株的鉴定
将Raji细胞(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)在T-25细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用FMC63-mIgG1和9G8-mIgG1抗体作为一抗，Alexa Fluor 647标记的二抗(Jackson，货号：115-605-003)进行FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测。结果如表2、图2所示，Raji细胞均可与FMC63-mIgG1和9G8-mIgG1结合。
表2内源细胞系Raji细胞的FACS检测结果
2.2 CHO-K1稳转人CD19单克隆细胞株的制备
编码人CD19全长氨基酸序列(NCBI：NP_001761.3)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院上海生命科学研究院)进行质粒转染( 3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/ml嘌呤霉素和含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用FMC63-mIgG1抗体作为一抗，Alexa Fluor 647标记的二抗(Jackson，货号：115-605-003)在流式细胞仪FACS AriaII(BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO 2细胞培养箱中培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高的单克隆细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
具体结果如表3和图3所示，IgG亚型对照为鼠IgG1对照。结果表明已制得人CD19高表达水平的CHO-K1单克隆细胞株：CHO-K1-人CD19-2C8、CHO-K1-人CD19-1C4、CHO-K1- 人CD19-2G4、以及CHO-K1-人CD19 1C9，后续实验选择了克隆CHO-K1-人CD19-2C8，如无特别说明，后续实施例中采用的CHO-K1-人CD19细胞均为CHO-K1-人CD19-2C8。
表3人CD19蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
2.3 HEK293T稳转猴CD19细胞株的制备
编码猴CD19全长氨基酸序列(NCBI：XM_005591542.1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Thermofisher scientific)并制备质粒。对HEK293T细胞系用 HD(Promega，货号：#E2311)进行质粒转染后，在含10μg/ml puromycin、10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO 2培养，大约2周后选择部分多克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用具有猴交叉活性的CD19抗体9G8-mIgG1抗体作为一抗，Alexa Fluor 647标记的二抗(Jackson，货号：115-605-003)进行FACS筛选，选择长势较好、荧光强度高的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。结果如表4和图4所示，表明已筛选获得过表达猴CD19的阳性细胞峰，可用于检测抗体的交叉活性。
表4猴CD19蛋白的HEK293T稳转细胞系FACS检测结果
实施例3抗人CD19杂交瘤单克隆抗体的制备
3.1动物免疫
抗人CD19单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用6～8周龄BALB/c AnNCrl小鼠(购自北京维通利华公司)或SJL/JorllcoCrl小鼠(购自上海斯莱克公司)，雌性。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为人CD19(aa20～291)-huFc蛋白购自ACRO Biosystems(货号：CD9-H5251)或人CD19蛋白的CHO-K1稳转细胞株。蛋白组初次免疫时，免疫原用TiterMax(购自Sigma，货号：T2684)乳化后皮下(SC)与腹腔(IP)分别注射0.1ml，即每只小鼠注射50μg免疫原；加强免疫时，免疫原用Imject Alum Adjuvant(购自Thermofisher scientific，货号：77161)皮下多点注射0.1ml，即每只小鼠注射25μg免疫原。细胞组初次免疫时，TiterMax与生理盐水乳化后腹腔注射0.1ml，15分钟后腹腔注射0.1ml细胞悬液，即每只小鼠注射1E7细胞；加强免疫时，腹腔注射细胞量为1E7的细胞悬液。免疫频次每周一次，于第-3，19，34，47天取血，用ELISA、FACS方法检测小鼠血清抗体滴 度。蛋白组和细胞组小鼠血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应。表5-6为编号为708、709、711、712的小鼠在第47天的血清抗体效价检测结果，空白对照为1％(w/v)BSA。
表5 ELISA检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价
表6 FACS检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价
3.2脾细胞融合和杂交瘤筛选
选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天冲击免疫，皮下、腹膜内(IP)按50μg/只注射由生理盐水配制的抗原溶液。
加入ACK Lysing Buffer(购自Gibco，货号：A1049201)，裂解脾细胞中掺杂的红细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM(购自Gibco，货号：10566016)基础培养基在1500r/min转速下离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目2:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC，CRL-1581)混合，采用BTX ECM2001+高效电融合方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清(ExCell Bio，货号FSD500)、1×HAT(购自Sigma，货号：H0262)的DMEM培养基中。按2×10 4/200μl/孔加入到96孔细胞培养板中，5％CO 2，37℃条件下培养。14天后用ELISA筛选融合细胞的上清，将阳性克隆扩增到24孔板扩大培养，培养基为含10％(v/v)胎牛血清和1×HT(购自Sigma，货号：H0137)的DMEM，培养条件为37℃，5％(v/v)CO 2。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液，离心收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，用ELISA、FACS确定对人CD19蛋白和人CD19阳性细胞的结合活性(结合活性的检测方法参照实施例5.1-5.2)。
根据24孔板筛选结果，挑选ELISA和FACS实验均为阳性的杂交瘤细胞，用Medium D(购自STEMCELL，货号：03810)在6孔板进行亚克隆，亚克隆7天左右挑取单克隆于含10％FBS、1×HT的DMEM培养基中，37℃，5％CO 2条件下培养2天，用ELISA进行初步筛选，挑选阳性单克隆扩增到24孔板继续培养，2天后用ELISA、FACS确定抗原结合阳性活性，挑选出最优的克隆，并于含10％(v/v)FBS的DMEM培养基中(购自Gibco)在37℃，5％(v/v)CO 2条件下将该最优的克隆进行扩大培养，液氮冻存即得本公开杂交瘤细胞。
实施例4杂交瘤阳性克隆轻重链可变区氨基酸序列测定和嵌合抗体的制备
4.1杂交瘤抗体序列信息
收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)充分裂解细胞后于-80℃保存待测。样品委托苏州金唯智生物科技有限公司完成杂交瘤阳性克隆轻重链可变区氨基酸序列测定，获得53个克隆，具体序列如表7所示：
表7杂交瘤阳性克隆重链可变区和轻链可变区序列
采用Kabat编号规则分析前述53个克隆重链可变区和轻链可变区的CDR(http://www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)，具体结果详见表8。
表8抗体重链/轻链可变区CDR
4.2嵌合抗体的制备
由泰州市百英生物科技有限公司将前述53个克隆的重链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的重链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HH1(重链恒定区序列SEQ ID NO：433)，将轻链为Kappa链的克隆的轻链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的Kappa轻链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HLK(轻链恒定区序列SEQ ID NO：434)，将轻链为Lambda链的轻链可变区克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的Lambda轻链恒定区的表达载体pcDNA3.4-BIHL5(轻链恒定区序列SEQ ID NO：435)，获得人鼠嵌合抗体的表达载体并参照实施例1.2的方法制备抗体。重、轻链恒定区序列信息如下所示：
实施例5 CD19嵌合抗体的鉴定
5.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测嵌合抗体与人CD19蛋白的结合
将人CD19-his蛋白(购自ACROBiosystems，货号：CD9-H52H2)用PBS稀释到终浓度4μg/mL，然后以100μl/孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，以50μl/孔加入100nM梯度稀释的CD19嵌合抗体或对照抗体。37℃孵育2小时后，用PBS洗板3次。加入 HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Jackson Immuno，货号：109-035-088)，37℃孵育1小时后，用PBS洗板5次。按50μl/孔加入TMB底物。室温孵育10分钟后，按50μl/孔加入终止液(1.0N HCl)。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值，嵌合抗体与人CD19的ELISA结果如图5和表9-10所示。结果表明，嵌合抗体均能与人CD19在ELISA水平结合。如无特别说明，实施例5、实施例6、实施例7和实施例8在鉴定或检测CD19嵌合抗体过程中使用的对照抗体hIgG1为针对鸡卵溶菌酶的抗体anti-hel-hIgG1(购自百英，货号：B117901)，FMC63抗体为实施例1.2制备的FMC63-hIgG1，9G8为实施例1.2制备的9G8-hIgG1。
表9.ELISA检测嵌合抗体与人CD19蛋白的结合反应
表10.ELISA检测嵌合抗体与人CD19蛋白的结合反应
5.2流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与不同CD19表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期。对于贴壁细胞CHO-K1吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，然后用胰酶消化细胞，终止消化后用PBS缓冲液洗涤细胞2次；对于悬浮细胞Raji直接离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。对上一步的细胞进行细胞计数后将细胞沉淀用[PBS+2％(w/w)BSA]封闭液重悬至2×10 6个细胞/ml，按50μl/孔加入到96孔FACS反应板中，按50μl/孔加入待测样品，冰上孵育2小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入50μl/孔Alexa Fluor 647标记的二抗(购自Jackson Immuno，货号：109-605-088)，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤5次，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(FlowJo)进行数据分析，得到细胞的平均荧光强度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50值。分析结果如表11以及图6-7所示，嵌合抗体均可结合Raji细胞和CHO-K1-人CD19细胞表面的人CD19蛋白。使用同样的方法同时检测了嵌合抗体与内源CD19阴性的细胞MoLT4细胞(购自ATCC，CRL-1582)以及CHO-K1细胞的结合，结果如图8A-8B、9A-9B所示，所有嵌合抗体均不结合MoLT4细胞以及CHO-K1细胞，具有很好的特异性。
表11.FACS检测嵌合抗体与Raji和CHO-K1-人CD19细胞的结合反应
实施例6嵌合抗体的种属交叉结合活性检测
6.1 ELISA检测嵌合抗体与不同种属CD19蛋白的结合
为检测嵌合抗体的种属交叉活性，将商品化的鼠CD19(ACROBiosystems，货号：50510-M08H)和猴CD19(ACROBiosystems，货号：90051-C08H)分别包被ELISA板，参照实施例5.1的方法进行ELISA检测。嵌合抗体与鼠CD19蛋白在ELISA水平均无结合。
嵌合抗体与猴CD19的ELISA结果如图10和表12所示，结果表明F5.11.2、F3.77.6、F3.118.14、F3.124.7、F3.148.10与猴CD19蛋白有结合活性。hIgG1为阴性对照，NB151-89为能结合猴CD19-His蛋白的阳性血清。
表12 ELISA检测嵌合抗体与猴CD19蛋白的结合反应
6.2 FACS检测嵌合抗体与猴CD19表达细胞的结合
将HEK293T-猴CD19细胞参照实施例5.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表13-14以及图11所示，除了F3.23.10，F3.40.14，F3.74.4，F3.109.1，F3.113.16，F3.121.4，F3.148.10，F4.4.6，F4.33.12，F4.35.5，F4.37.6，F4.41.1，F4.58.6，F4.96.6，F4.145.9，F4.152.7，F4.180.1，F4.276.12，F5.7.1和F6.5.20外，其余嵌合抗体与过表达猴CD19的293T细胞均有结合活性，EC50显示结合活性最高达到0.73nM。使用同样的方法同时检测了嵌合抗体与与HEK293T细胞的结合，结果如图12A-12B所示所有嵌合抗体均不结合HEK293T细胞。
表13 FACS检测CD19抗体与293T-猴CD19细胞的结合反应
表14 FACS检测CD19抗体与293T-猴CD19细胞的结合反应
6.3 FACS检测嵌合抗体与食蟹猴(拉丁名：Macaca fascicularis)外周血B细胞的结合
从新鲜食蟹猴外周血(购自上海美迪西生物医药股份有限公司)中按照Ficoll-Paque Plus(购自GE Healthcae，货号:171440-02)说明书提取猴外周血单核细胞，细胞悬液离心后以含1％BSA的PBS重悬细胞后计数，同时加入有猴CD20交叉结合活性的鼠源抗体Brilliant Violet 605 anti-human CD20(货号:302334，购自Biolegend)和待测嵌合抗体(1nM、10nM和100nM)。室温孵育1小时。清洗细胞三次后加入APC标记的二抗anti-human IgG Fc(货号：409306，购自Biolegend)，避光室温孵育30分钟后清洗细胞5次，用含1％BSA的PBS轻轻重悬细胞，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析，其中CD20作为B细胞的标记物，对CD20阳性的B细胞群进行圈门，分析其中嵌合抗体标记的阳性细胞所占比例，分别计算100nM，10nM和1nM浓度下的嵌合抗体处理的嵌合抗体阳性细胞群占B细胞群的比例，具体结果如表15和图13所示。由结果可知，F1-mab003，F3.3.10，F3.83.9，F3.114.12，F3.124.7，F3.126.15，F4.49.11，F4.78.1，F4.82.11，F4.107.12，F5.2.9，F5.10.6，F5.11.2和F6.12.12即使在1nM低浓度条件下依然与食蟹猴B细胞有较高比例的结合，且相比于阳性抗体9G8有相当或者更好的结合活性；其它抗体与食蟹猴CD19无结合或者相对较弱结合。
表15.FACS检测嵌合抗体与食蟹猴B细胞的结合反应
实施例7 CD19抗体亲和力测定
7.1嵌合抗体与人CD19-His蛋白亲和力测定
使用ProteinA芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获抗人CD19抗体。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用ProteinA芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的CD19抗原蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的重组人CD19-His持续240秒来测量结合，其中流速为30μl/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μl/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。嵌合抗体与人CD19-His蛋白的结合速率(ka)、解离速率(kd)及结合亲和力(KD)如表16所示，其中抗体FMC63作为对照。
表16.SPR(biacore)检测嵌合抗体与人CD19的亲和力
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
F1-mab003 4.50E+05 1.11E-04 2.47E-10
F2.15.26 2.73E+05 2.29E-04 8.39E-10
F3.3.10 7.34E+04 6.21E-04 8.47E-09
F3.5.1 1.56E+05 8.47E-05 5.43E-10
F3.13.2 6.47E+04 5.26E-04 8.13E-09
F3.23.10 3.54E+04 1.86E-04 5.24E-09
F3.40.14 8.43E+04 1.43E-04 1.70E-09
F3.64.4 1.91E+05 3.13E-04 1.64E-09
F3.74.4 4.71E+04 8.79E-04 1.87E-08
F3.77.6 8.44E+04 1.69E-04 2.00E-09
F3.81.2 1.35E+05 1.04E-04 7.66E-10
F3.83.9 8.51E+04 3.12E-04 3.67E-09
F3.109.1 1.90E+05 1.08E-03 5.67E-09
F3.113.16 8.48E+04 1.05E-03 1.24E-08
F3.114.12 7.70E+04 4.65E-04 6.03E-09
F3.118.14 5.39E+04 3.26E-04 6.05E-09
F3.121.4 3.27E+05 3.75E-04 1.15E-09
F3.124.7 6.93E+04 1.38E-04 1.99E-09
F3.126.15 6.13E+04 7.99E-04 1.30E-08
F3.133.14 9.08E+04 8.84E-05 9.74E-10
F3.148.10 2.24E+05 1.19E-03 5.32E-09
F4.4.6 2.01E+05 1.90E-03 9.47E-09
F4.15.9 3.48E+05 9.49E-04 2.72E-09
F4.18.13 4.72E+05 1.71E-04 3.62E-10
F4.21.2 1.85E+05 1.67E-04 9.04E-10
F4.22.6 2.48E+05 1.47E-03 5.94E-09
F4.33.12 1.31E+05 4.52E-04 3.45E-09
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
F4.35.5 2.29E+05 3.51E-03 1.53E-08
F4.37.6 3.59E+05 3.27E-03 9.11E-09
F4.41.1 1.79E+05 2.39E-03 1.34E-08
F4.48.12 2.64E+05 1.29E-04 4.87E-10
F4.49.11 7.30E+04 1.28E-03 1.76E-08
F4.58.6 1.43E+05 2.00E-03 1.39E-08
F4.78.1 1.84E+05 1.70E-04 9.26E-10
F4.82.11 3.41E+04 7.74E-04 2.27E-08
F4.96.6 2.47E+05 9.18E-04 3.71E-09
F4.107.12 2.00E+05 2.17E-04 1.09E-09
F4.125.12 2.78E+05 2.04E-04 7.34E-10
F4.145.9 1.61E+05 5.91E-04 3.68E-09
F4.152.7 2.64E+05 8.90E-05 3.37E-10
F4.180.1 2.37E+05 8.52E-05 3.59E-10
F4.191.1 2.05E+05 3.88E-04 1.90E-09
F4.272.13 2.21E+05 6.51E-05 2.94E-10
F4.276.12 2.43E+05 8.10E-04 3.33E-09
F5.2.9 2.57E+04 4.02E-04 1.57E-08
F5.3.6 3.51E+04 1.22E-04 3.49E-09
F5.7.1 1.92E+05 2.25E-04 1.18E-09
F5.8.6 1.81E+05 1.08E-03 5.98E-09
F5.10.6 8.21E+04 1.51E-04 1.84E-09
F5.11.2 3.66E+04 6.15E-05 1.68E-09
F6.2.9 1.52E+05 3.30E-03 2.17E-08
F6.5.20 3.55E+05 1.87E-03 5.28E-09
F6.12.12 1.67E+05 2.45E-04 1.46E-09
FMC63 1.82E+05 3.33E-04 1.83E-09
7.2嵌合抗体与猴CD19-His蛋白亲和力测定
参照实施例7.1的方法对嵌合抗体抗体与猴CD19(ACROBiosystems，货号：90051-C08H)蛋白进行亲和力测定，结果如表17所示。
表17.SPR(biacore)检测嵌合抗体抗体与猴CD19的亲和力
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
F3.77.6 1.84E+04 1.40E-07 7.59E-12
F3.118.14 1.67E+04 9.72E-08 5.83E-12
F3.124.7 7.00E+04 5.62E-05 8.03E-10
NB151-89 2.82E+04 6.55E-06 2.33E-10
实施例8嵌合抗体与抗原结合区域的鉴定
CD19蛋白胞外有4个外显子(exons)，其中exon1-3位于远膜端，exon4位于近膜端，FMC63的抗原结合表位是CD19蛋白膜外区的近膜端(exon4)。为了鉴定嵌合抗体的抗原结合表位分布，参照实施例5.1中的ELISA方法，将人CD19 exon 1-3-His(远膜端)以2μg/mL包被，如图14和表18所示，除F3.23.10，F3.74.4，F3.77.6，F3.109.1，F3.118.14，F3.124.7，F3.148.10，F5.11.2以外其余抗体均与人CD19 exon 1-3-His没有结合活性，如实施例5.1所示， 除F3.3.10，F3.13.2，F3.113.16，F6.2.9与人CD19-His为弱结合外，其余嵌合抗体与人CD19-His有很好的结合活性。可以将抗体分为两类：第一类与人CD19 exon 1-3-His不结合，与人CD19-His有结合活性，结合表位位于非远膜端，如F1-mab003；第二类与人CD19 exon 1-3-His有结合活性且与人CD19-His有很好的结合活性，结合表位位于远膜端，如F3.23.10。
表18 ELISA方法对嵌合抗体进行表位分类
实施例9抗人CD19嵌合抗体的人源化
9.1嵌合抗体的人源化设计
通过比对IMGT(http://imgt.cines.fr)人类抗体重轻链可变区种系基因数据库，分别挑选与鼠源抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。根据需要，将骨架序列中关键氨基酸回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，即得到人源化单克隆抗体。其中抗体的CDR氨基酸残基由kabat编号系统确定并注释。
9.1.1 F3.121.4的人源化
鼠源抗体F3.121.4的人源化轻链模板为IGKV6-21*01/IGKV3-11*01和IGKJ2*01，人源化重链模板为IGHV1-3*01和IGHJ6*01，将鼠源抗体F3.121.4的CDR分别移植到其人源模板中，即获得对应的人源化版本。根据需要，将F3.121.4的人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，如抗体存在易发生化学修饰的位点，对这些位点进行突变以消除修饰风险。具体回复突变设计见表19。
表19 F3.121.4的人源化抗体回复突变设计
注：Graft代表将鼠源抗体CDR植入人种系模板FR区序列；L46F表示将Graft第47位L突变成F，其它依此类推。回复突变氨基酸的编号为Kabat编号。
F3.121.4人源化抗体可变区具体序列如下所示，其中，下划线表示经Kabat编号系统确定的CDR区，带字符边框为回复突变：
人源化模板序列如下所示：
本公开分别从上述F3.121.4的人源化抗体轻链和重链可变区的回复突变设计中，选择不同的轻链和重链序列进行交叉组合，最终获得多种F3.121.4人源化抗体，详见表20。
表20 F3.121.4人源化抗体可变区组合
Fv F3.121.4.VH1 F3.121.4.VH2 F3.121.4.VH3 F3.121.4.VH4
F3.121.4.VL1 F3.121.4-L1H1 F3.121.4-L1H2 F3.121.4-L1H3 F3.121.4-L1H4
F3.121.4.VL2 F3.121.4-L2H1 F3.121.4-L2H2 F3.121.4-L2H3 F3.121.4-L2H4
F3.121.4.VL3 F3.121.4-L3H1 F3.121.4-L3H2 F3.121.4-L3H3 F3.121.4-L3H4
9.2 F3.121.4人源化抗体制备
由泰州市百英生物科技有限公司将F3.121.4人源化抗体的重链可变区序列克隆到包含信号肽和鼠源抗体IgG1的重链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HH1(重链恒定区序列SEQ ID NO：448)，轻链可变区序列克隆到包含信号肽和鼠源抗体IgG1的轻链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HLK(轻链恒定区序列SEQ ID NO：449)，获得F3.121.4人源化抗体的表达载体，并按实施例1.2所示方法制备人源化抗体。抗体重链、轻链恒定区序列如下所示：
实施例10 F3.121.4人源化抗体的鉴定
10.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测人源化抗体与CD19蛋白的结合
参照实施例5.1的方法进行ELISA检测与数据分析(使用的二抗购自Jackson Immuno，货号：115-035-003)。分析结果如表21和图15所示，结果表明F3.121.4人源化抗体均能与人CD19在ELISA水平结合。如无特别说明，实施例10-13在人源化抗体鉴定或检测过程中使用的对照抗体mIgG1为针对鸡卵溶菌酶的抗体anti-hel-mIgG1(购自百英，货号：B118301)，FMC63抗体为实施例1.2制备的FMC63-mIgG1，9G8为实施例1.2制备的9G8-mIgG1。
表21 ELISA检测F3.121.4人源化抗体与人CD19蛋白的结合反应
10.2流式细胞实验(FACS)检测人源化抗体与不同CD19表达细胞的结合
参照实施例5.2的方法进行FACS检测与数据分析(使用的二抗购自Jackson Immuno，货号：115-605-003)。分析结果如表22和图16A-16D所示，表22说明，F3.121.4人源化抗体均可结合Raji细胞和CHO-K1-人CD19细胞(2C8)表面的人CD19蛋白(表22，图16A、16C)。使用同样的方法同时检测了F3.121.4人源化抗体与CHO-K1细胞以及内源CD19阴性的细胞MOLT-4细胞(购自ATCC，CRL-1582)的结合，结果如图16B、16D所示，F3.121.4人源化抗体均不结合MoLT4细胞以及CHO-K1细胞，具有很好的特异性。
表22 FACS检测F3.121.4人源化抗体与Raji和CHO-K1-人CD19细胞的结合反应
实施例11种属交叉结合活性检测
参照实施例6.1的方法进行ELISA检测与数据分析。分析结果说明F3.121.4人源化抗体与鼠CD19蛋白以及猴CD19蛋白在ELISA水平均无结合。
参照实施例6.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果说明F3.121.4人源化抗体与293T-猴CD19细胞无结合。
实施例12 F3.121.4人源化抗体的亲和力测定
参照实施例7.1的方法进行SPR(biacore)检测与数据分析。结果如表23所示，F3.121.4人源化抗体与人CD19的亲和力都在1 E-08M以上。
表23.SPR(biacore)检测F3.121.4人源化抗体与人CD19的亲和力
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
F3.121.4-L1H1 1.21E+05 3.45E-06 2.84E-11
F3.121.4-L1H2 1.18E+05 6.84E-08 5.80E-13
F3.121.4-L1H3 1.23E+05 6.17E-07 5.02E-12
F3.121.4-L1H4 9.11E+04 1.86E-08 2.05E-13
F3.121.4-L2H1 1.30E+05 1.86E-04 1.43E-09
F3.121.4-L2H2 1.34E+05 1.95E-04 1.46E-09
F3.121.4-L2H3 1.37E+05 1.88E-04 1.38E-09
F3.121.4-L2H4 1.22E+05 1.86E-04 1.53E-09
F3.121.4-L3H1 1.30E+05 3.18E-05 2.44E-10
F3.121.4-L3H2 1.13E+05 5.65E-09 4.98E-14
F3.121.4-L3H3 1.18E+05 1.04E-06 8.80E-12
F3.121.4-L3H4 1.12E+05 2.51E-05 2.25E-10
F3.121.4 3.27E+05 3.75E-04 1.15E-09
FMC63 1.82E+05 3.33E-04 1.83E-09
实施例13 F3.121.4人源化抗体与抗原结合区域的鉴定
为鉴定F3.121.4人源化抗体的抗原结合表位分布，参照实施例5.1中的ELISA方法，将人CD19 exon 1-3-His(远膜端)以2μg/mL包被，如表24所示，F3.121.4人源化抗体与人CD19 exon 1-3-His蛋白均无结合活性。因此可判断F3.121.4人源化抗体与嵌合抗体F3.121.4均属于非远膜端。
表24.ELISA方法检测F3.121.4人源化抗体与人CD19 exon 1-3-His蛋白

Claims (21)

  1. 一种特异性结合人CD19的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1-3，所述轻链可变区包含LCDR1-3，
    所述HCDR1包含SEQ ID NO：115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、265、271、277、283、289、295、301、307、313、319、325、331、337、343、349、355、361、367、373、379、385、391、397、403、409、415、421或427任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    所述HCDR2包含SEQ ID NO：116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362、368、374、380、386、392、398、404、410、416、422或428任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    所述HCDR3包含SEQ ID NO：117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219、225、231、237、243、249、255、261、267、273、279、285、291、297、303、309、315、321、327、333、339、345、351、357、363、369、375、381、387、393、399、405、411、417、423或429任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    所述LCDR1包含SEQ ID NO：118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418、424或430任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    所述LCDR2包含SEQ ID NO：119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221、227、233、239、245、251、257、263、269、275、281、287、293、299、305、311、317、323、329、335、341、347、353、359、365、371、377、383、389、395、401、407、413、419、425或431任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    和所述LCDR3包含SEQ ID NO：120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366、372、378、384、390、396、402、408、414、420、426或432任一项所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列。
  2. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述HCDR1-3包含SEQ ID NO：115-117、121-123、127-129、133-135、139-141、145-147、151-153、157-159、163-165、169-171、175-177、181-183、187-189、193-195、199-201、205-207、211-213、217-219、223-225、229-231、235-237、241-243、247-249、253-255、259-261、265-267、271-273、277-279、283-285、289-291、 295-297、301-303、307-309、313-315、319-321、325-327、331-333、337-339、343-345、349-351、355-357、361-363、367-369、373-375、379-381、385-387、391-393、397-399、403-405、409-411、415-417、421-423或427-429所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；和/或，
    所述LCDR1-3包含SEQ ID NO：118-120、124-126、130-132、136-138、142-144、148-150、154-156、160-162、166-168、172-174、178-180、184-186、190-192、196-198、202-204、208-210、214-216、220-222、226-228、232-234、238-240、244-246、250-252、256-258、262-264、268-270、274-276、280-282、286-288、292-294、298-300、304-306、310-312、316-318、322-324、328-330、334-336、340-342、346-348、352-354、358-360、364-366、370-372、376-378、382-384、388-390、394-396、400-402、406-408、412-414、418-420、424-426或430-432所示序列，或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列。
  3. 根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含所述重链可变区和所述轻链可变区，所述HCDR1-3和所述LCDR1-3包含选自下组的序列：
    (1)SEQ ID NO：115-120或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (2)SEQ ID NO：121-126或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (3)SEQ ID NO：127-132或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (4)SEQ ID NO：133-138或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (5)SEQ ID NO：139-144或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (6)SEQ ID NO：145-150或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (7)SEQ ID NO：151-156或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (8)SEQ ID NO：157-162或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (9)SEQ ID NO：163-168或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (10)SEQ ID NO：169-174或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (11)SEQ ID NO：175-180或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (12)SEQ ID NO：181-186或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (13)SEQ ID NO：187-192或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (14)SEQ ID NO：193-198或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (15)SEQ ID NO：199-204或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (16)SEQ ID NO：205-210或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (17)SEQ ID NO：211-216或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (18)SEQ ID NO：217-222或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (19)SEQ ID NO：223-228或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (20)SEQ ID NO：229-234或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (21)SEQ ID NO：235-240或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (22)SEQ ID NO：241-246或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (23)SEQ ID NO：247-252或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (24)SEQ ID NO：253-258或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (25)SEQ ID NO：259-264或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (26)SEQ ID NO：265-270或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (27)SEQ ID NO：271-276或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (28)SEQ ID NO：277-282或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (29)SEQ ID NO：283-288或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (30)SEQ ID NO：289-294或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (31)SEQ ID NO：295-300或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (32)SEQ ID NO：301-306或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (33)SEQ ID NO：307-312或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (34)SEQ ID NO：313-318或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (35)SEQ ID NO：319-324或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (36)SEQ ID NO：325-330或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (37)SEQ ID NO：331-336或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (38)SEQ ID NO：337-342或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (39)SEQ ID NO：343-348或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (40)SEQ ID NO：349-354或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (41)SEQ ID NO：355-360或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (42)SEQ ID NO：361-366或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (43)SEQ ID NO：367-372或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (44)SEQ ID NO：373-378或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (45)SEQ ID NO：379-384或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (46)SEQ ID NO：385-390或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (47)SEQ ID NO：391-396或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (48)SEQ ID NO：397-402或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (49)SEQ ID NO：403-408或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (50)SEQ ID NO：409-414或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (51)SEQ ID NO：415-420或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (52)SEQ ID NO：421-426或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列；
    (53)SEQ ID NO：427-432或与其相比具有至少70％同一性或至多3个突变的序列。
  4. 根据权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、 87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、439-442任一项所述序列，或其相比具有至少70％同一性或至多15个氨基酸差异的序列；
    所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、436、437或438任一项所述序列，或其相比具有至少70％同一性或至多15个氨基酸差异的序列。
  5. 根据权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述至少70％同一性优选为至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；所述至多3个突变优选为至多3、2、1或0个突变；所述至多15个突变优选为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个突变；优选地，所述突变为插入、缺失或替换，所述替换优选为保守氨基酸替换，所述突变优选为回复突变或热点突变。
  6. 根据权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区；
    优选地，所述重链恒定区选自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；所述IgG可选自人IgG，例如人IgG1或人IgG4；所述轻链恒定区选自κ链或λ链，优选为κ链；
    优选地，所述重链恒定区可选自SEQ ID NO：433或448；
    优选地，所述轻链恒定区可选自SEQ ID NO：434-435或449。
  7. 根据权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、完整抗体的片段、裸抗体、缀合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
  8. 根据权利要求1-7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段还包括缀合物；所述缀合物可选自治疗剂或示踪剂，所述治疗剂可选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂可选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
  9. 根据权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与人CD19结合的KD值小于1E-08M、1E-09M、1E-10M或1E-11M；优选地，所述抗体或抗原结合片段还结合猴CD19，更优选地，所述抗体或抗原结合片段与猴CD19结合的KD值小于1E-8M、1E-9M、1E-10M、1E-11M或1E-12M。
  10. 一种多特异抗原结合分子，其中，所述多特异性抗原结合分子至少包括第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含权利要求1-10任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合模块结合与第一抗原结合模块不同的其他靶点或结合相同靶点的不同表位；优选地，所述第二抗原结合模块为抗体或抗原结合片段；
    优选地，所述其他靶点选自下组：(1)肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)； (2)免疫检查点；(3)募集和/或激活免疫细胞的靶点。
  11. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其中，所述嵌合抗原受体至少包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包括权利要求1-9任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求10所述多特异性抗原结合分子。
  12. 一种免疫效应细胞，其中，所述免疫效应细胞表达权利要求11所述嵌合抗原受体和/或包含编码权利要求11所述嵌合抗原受体的核酸分子；
    优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，更优选地，所述T细胞选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；
    优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
  13. 一种分离的核酸分子，其中，所述核酸分子编码权利要求1-9所述抗体或抗原结合片段、权利要求10所述多特异性抗原结合分子或权利要求11所述嵌合抗原受体。
  14. 一种载体(vector)，其中，所述载体包括权利要求13所述核酸分子。
  15. 一种细胞，其中，所述细胞包含权利要求14所述载体。
  16. 一种制备权利要求1-9所述抗体或抗原结合片段，或权利要求10所述多特异性抗原结合分子的方法，其中，所述方法包括：(1)培养权利要求15所述细胞和/或(2)分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或多特异性抗原结合分子。
  17. 一种制备权利要求12所述免疫效应细胞的方法，其中，所述方法包括将编码权利要求11所述嵌合抗原受体的核酸分子导入所述免疫效应细胞，和/或启动所述免疫效应细胞表达所述嵌合抗原受体。
  18. 一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1-9任一项所述抗体或抗原结合分子，或权利要求10所述多特异性抗原结合分子，或权利要求12所述免疫效应细胞，或权利要求13所述核酸分子，或权利要求14所述载体，或权利要求15所述细胞，或根据权利要求16-17任一项所述方法制备得到的产品；优选地，所述组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂。
  19. 权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的细胞、权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求16-17任一项所述方法制备得到的产品，在制备用于治疗CD19相关疾病的药物中的用途；优选地，所述CD19相关疾病选自肿瘤或自身免疫性疾病；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自神经系统自身免疫性疾病，类风湿，系统性红斑狼疮、IgG4相关疾病、多发性硬化症或视神经脊髓炎谱系疾病。
  20. 一种治疗CD19相关疾病的方法，其中，所述方法包括向受试者施用有效量的药物，所述药物包括权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10述的多特异性抗原结合分子、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14 所述的载体、权利要求15所述的细胞、权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求16-17任一项所述方法制备得到的产品，优选地，所述CD19相关疾病选自肿瘤或自身免疫性疾病；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自神经系统自身免疫性疾病，类风湿，系统性红斑狼疮、IgG4相关疾病、多发性硬化症或视神经脊髓炎谱系疾病。
  21. 权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的细胞、权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求16-17任一项所述方法制备得到的产品，其中，用于治疗CD19相关疾病的药物，优选地，所述CD19相关疾病选自肿瘤或自身免疫性疾病；更优选地，所述肿瘤选自淋巴瘤或白血病，例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自神经系统自身免疫性疾病，类风湿，系统性红斑狼疮、IgG4相关疾病、多发性硬化症或视神经脊髓炎谱系疾病。
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