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CN117603928A - 一种酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶sur2的突变体及其应用 - Google Patents

一种酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶sur2的突变体及其应用 Download PDF

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CN117603928A CN202311597439.2A CN202311597439A CN117603928A CN 117603928 A CN117603928 A CN 117603928A CN 202311597439 A CN202311597439 A CN 202311597439A CN 117603928 A CN117603928 A CN 117603928A
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Abstract

本发明公开了一种酵母二氢神经鞘氨醇C4‑羟化酶SUR2的突变体及其应用，该突变体是通过易错PCR等诱变技术改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，并筛选获得的，利用该突变体可以高效生产神经酰胺，而且在生产时，该生产方法的发酵条件较为简单，在工业上易于实现并控制，副产物较少，易于后续的神经酰胺提取，降低了生产成本，具有广阔的发展前景。

Description

一种酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶SUR2的突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶SUR2的突变体及其应用。
背景技术
神经酰胺作为一类鞘脂代谢产物，是构成细胞膜和细胞器膜的重要组分。神经酰胺存在于所有的真核细胞中，它对细胞分化、增殖、凋亡、衰老等生命活动都具有重要的调节作用。神经酰胺是人体中的固有组分，起到很好的皮肤屏障功能。既能防止有害物质入侵，又能隔绝皮肤中的水分流失。
随着护肤品成分的增多，用来保湿抗衰老的神经酰胺越来越火，全球神经酰胺市场稳步增长。目前，用于化妆品中的神经酰胺制品主要从植物中提取。但该方法受植物生长周期及环境限制，产量较低，且在工业水平上显然成本很高。而化学合成则步骤繁琐，副产物多，合成效率低，对环境十分不利，难以实现工业化生产。研究发现酿酒酵母可以直接产生神经酰胺，但产量较低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶SUR2的突变体及其应用，该突变体是通过易错PCR等诱变技术改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，并筛选获得的，利用该突变体可以高效生产神经酰胺。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶SUR2的突变体，其由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶发生突变得到，其中，突变的方式为如下(1)-(7)中的任意一种或几种的组合：
(1)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第153位的M突变为I、L或Y；
(2)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第127位的F突变为Y；
(3)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第124位的M突变为L；
(4)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第152位的Y突变为F；
(5)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第121位的P突变为I；
(6)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第123位的Y突变为M；
(7)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第224位的M突变为K。
酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶(yeast sphinganine C4-hydroxylase gene，SUR2)存在于酵母中。本发明通过对野生型SUR2突变，得到上述的SUR2突变体，该突变体能够用于合成神经酰胺。
SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为酿酒酵母来源的SUR2基因，其他来源的野生型SUR2经过上述突变方式(1)-(7)中的任意一种或几种的组合得到的SUR2突变体均可用于合成神经酰胺。
本发明中，氨基酸序列指构成蛋白质或多肽的氨基酸残基的种类以及排列方式，通常用本领域常规使用的三字母方式表示氨基酸残基，也可使用本领域常规使用的单字母方式表示氨基酸残基，本领域技术人员应当能够将三字母构成氨基酸序列与单字母构成的氨基酸序列进行转换。应当明确的是，无论本发明中采用哪种方式表示，本领域技术人员均能够理解以及转换。例如：丙氨酸，单字母为A，三字母为Ala；精氨酸，单字母为R，三字母为Arg；天冬氨酸，单字母为D，三字母为Asp；半胱氨酸，单字母为C，三字母为Cys；谷氨酰胺，单字母为Q，三字母为Gln；谷氨酸，单字母为E，三字母为Glu；组氨酸，单字母为H，三字母为His；异亮氨酸，单字母为I，三字母为Ile；甘氨酸，单字母为G，三字母为Gly；天冬酰胺，单字母为N，三字母为Asn；亮氨酸，单字母为L，三字母为Leu；赖氨酸，单字母为K，三字母为Lys；甲硫氨酸，单字母为M，三字母为Met；苯丙氨酸，单字母为F，三字母为Phe；脯氨酸，单字母为P，三字母为Pro；丝氨酸，单字母为S，三字母为Ser；苏氨酸，单字母为T，三字母为Thr；色氨酸，单字母为W，三字母为Trp；酪氨酸，单字母为Y，三字母为Tyr；缬氨酸，单字母为V，三字母为Val。
在一些实施例中，SUR2突变体的突变方式为：
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为I，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为I、第124位的M突变为L，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为L、第152位的Y突变为F，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为Y、第123位的Y突变为M以及第224位的M突变为K，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第127位的F突变为Y，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第127位的F突变为Y、第121为的P突变为I，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
也即是，本发明的突变体的氨基酸突变为M153I或M153I/M124L或M153L/Y152F或F127Y或F127Y/P121I或M153Y/Y123M/M224K。
第二方面，本发明提供了上述突变体的筛选方法，其包括：利用易错PCR技术在体外向SUR2基因引入核苷酸突变，通过多轮重组和随机突变，经定向进化获得目标突变体。
具体地，该筛选方法为：
(1)将易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，与经限制性内切酶BamHI和HindIII消化后的pESC-URA质粒进行连接，采用醋酸锂转化法转化至酿酒酵母感受态细胞；涂布于尿嘧啶营养缺陷固体培养基SD-URA平板，25～30℃倒置培养2-5d。
(2)利用步骤(1)的方法，以突变体基因为模板进行多轮易错PCR，构建突变文库。
(3)SUR2突变文库筛选：
将SD-URA平板上长出的转化子接到SD-URA液体培养基的96孔深孔板中，25～30℃，180～200rpm培养18～24h，将菌液转接至含有诱导培养基的96孔深孔板中，同时接入野生型酿酒酵母作为对照，25～30℃，600～800rpm摇床中培养2～3d，取诱导表达2～3天的发酵液，萃取神经酰胺后分析其产量，选择相同条件下神经酰胺产量明显比野生型酿酒酵母产量高的菌株为目的菌株。
(4)摇瓶复筛优势突变株：
将高产神经酰胺的酿酒酵母菌株从母板中蘸取菌落划线于SD-URA平板，将其倒置放在25～30℃培养箱培育2-5d长出单菌落；挑取活化后的单克隆至SD-URA液体培养基，25～30℃，220～250rpm过夜培养16～20h。取SD-URA液体中的菌液接种到发酵培养基中至初始OD600＝0.1～0.2，在25～30℃，220～250rpm条件下培养2～3d；培养结束后，取20～50μL菌液，去离子水稀释40～100倍，分光光度计中测定600nm波长处吸光度；同时取200～500μL发酵液，进行神经酰胺提取，测定神经酰胺产量。
通过上述筛选方法获得了6株产神经酰胺效率明显提高的菌株，用酵母质粒提取试剂盒提取其中的pESC-SUR2表达质粒，测定SUR2核苷酸序列，利用三联体密码子推测SUR2的氨基酸序列，氨基酸的改变方式及产神经酰胺相对活性如表1所示，以对照野生型酿酒酵母的产神经酰胺相对活性为100％，根据液相检测的分析结果确定SUR2突变文库中工程菌产神经酰胺的相对活性。
本发明采用的定向进化属于非理性设计，是指针对某一蛋白质酶的基因，通过易错PCR等诱变技术改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的天然酶。目前，定向进化技术已成功用于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。本发明酶活力的提高可以用表达突变型SUR2工程菌生产神经酰胺的效率表示，表达突变型SUR2工程菌产神经酰胺效率的提高，即代表了突变型SUR2产神经酰胺活性的提高。
第三方面，本发明提供了编码上述突变体的核酸分子。
第四方面，本发明提供了含有上述核酸分子的表达载体。
第五方面，本发明提供了一种重组菌，其是将上述核酸分子通过质粒导入宿主菌中或通过基因工程手段整合到宿主菌染色体上构建得到的。
在本发明中，宿主菌包括酿酒酵母。
在一些实施例中，宿主菌为酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae PK2-1D。
第六方面，本发明提供了含有上述重组菌的细胞催化剂。
第七方面，本发明提供了上述突变体、生物材料、重组菌或细胞催化剂在神经酰胺生产中的应用。
第八方面，本发明提供了一种高效合成神经酰胺的方法，其以葡萄糖为底物，利用上述重组菌全细胞转化合成神经酰胺。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：葡萄糖5-15g/L，半乳糖15-25g/L，酵母粉1-10g/L，蛋白胨5-15g/L，α-环糊精10-20g/L，CaCl2 0.5-1.0g/L，NH4SO4 0.5-1.0g/L，KH2PO4 0.5-1.0g/L，MgSO4 0.1-0.5g/L，FeSO4 7H2O 0.01-0.05g/L，烟酸10-50mg/L，重组菌体量1-20g/L；全细胞转化的温度为25-30℃，时间为2-3d。
在本发明中，利用含有上述突变体的重组菌全细胞转化合成神经酰胺时，该方法是以葡萄糖为底物，半乳糖主要作为诱导剂，烟酸是为了提供合成辅酶NADPH的前体。
本发明的有益效果：
本发明通过定向进化构建的高效生产神经酰胺的SUR2突变体，由酿酒酵母来源的ScSUR2基因，运用易错PCR方法，通过多轮重组和随机突变，经定向进化而获得的SUR2突变体，利用该突变体合成神经酰胺，其产量得到显著提高，而且在生产时，其发酵条件较为简单，在工业上易于实现并控制，副产物较少，易于后续的神经酰胺提取，降低了生产成本，具有广阔的发展前景。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明通过定向进化构建的高效生产神经酰胺的SUR2突变体，由酿酒酵母来源的ScSUR2基因(GenBank登录号U07171)SEQ ID NO.1，运用易错PCR方法，通过多轮重组和随机突变，经定向进化而获得的SUR2突变体，在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变为M153I、M153I/M124L、M153L/Y152F、F127Y、F127Y/P121I、M153Y/Y123M/M224K。以表达对应SUR2突变体的工程菌产神经酰胺的产量表示，相比表达野生型ScSUR2的对照工程菌，这些突变体生产神经酰胺的效率得到了提高。
在本发明的实施例中采用的宿主菌为酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiaePK2-1D。
本发明涉及到的培养基配方如下：
SD-URA液体培养基(酵母氮源基础(YNB)6.7g/L；葡萄糖2g/L，DO supplement-URA0.76g/L，pH 6.0)；
SD-URA固体培养基(酵母氮源基础(YNB)6.7g/L；葡萄糖2g/L，DO supplement-URA0.76g/L，琼脂粉2g/L，pH 6.0)；
发酵培养基(葡萄糖10g/L，半乳糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，α-环糊精15g/L，CaCl2 1g/L，NH4SO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO40.43g/L，FeSO4 7H2O 0.05g/L，烟酸50mg/L)。
以下实施例中的诱导培养基与发酵培养基配方是一样的。
高效液相色谱(HPLCELSD)条件：利用岛津LC-2050液相系统对所提取的神经酰胺进行定性和定量分析，产物通过反向色谱SHIMADZU C8(3μm；4.6×250mm)进行分离，洗脱液为100％的乙腈(溶液A)和含0.06％(v/v)的三氟乙酸水溶液(溶液B)。样品用50％的无水乙醇进行稀释，梯度洗脱程序如下：60％溶液A洗脱2min，60％ 75％溶液A线性洗脱11min，75％93％溶液A线性洗脱4min，93％溶液A洗脱3min，60％溶液A洗脱5min，流速为1mL/min，柱温40℃，进样体积10μL，漂移管温度50℃，干燥气(N2)压力350kPa，过滤常数10。
实施例1
本实施例为突变文库构建：本实施例通过定向进化构建的高效生产神经酰胺的SUR2突变体，由酿酒酵母来源的ScSUR2基因，运用易错PCR方法，通过多轮重组和随机突变，经定向进化而获得的SUR2突变体。
本实施例ScSUR2基因核苷酸突变方法：利用易错PCR技术在体外向ScSUR2基因引入核苷酸突变：
易错PCR的反应条件如下
上游引物F：
5’aggagaaaaaaccccggatccATGAACGTAACATCGAATGCAACT 3’；
下游引物R：
5’gctagccgcggtaccaagcttTTATTTCTCTTTCTTTACTTCATTTTCA3’
PCR扩增条件：94℃3min；94℃1min，59℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min；
将易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，与经限制性内切酶BamHI和HindIII消化后的pESC-URA质粒进行连接，采用醋酸锂转化法转化至酿酒酵母感受态细胞；涂布于尿嘧啶营养缺陷固体培养基SD-URA平板，30℃培养2d；
利用上述同样的方法，以突变体基因为模板进行多轮易错PCR，构建突变文库。
实施例2
本实施例为突变文库筛选：用灭菌牙签将SD-URA平板上长出的转化子接到含有1mL SD-URA液体培养基的96孔深孔板中，30℃，800rpm摇床培养24h，将菌液转接至含有诱导培养基的96孔深孔板中，同时接入酿酒酵母PK2-1D/pESC-ScSUR2-WT作为对照，30℃，800rpm摇床培养2d，发酵结束后，取诱导表达2d的96孔板发酵液500μL，超声破碎后用石油醚萃取神经酰胺，采用高效液相色谱HPLC-蒸发光散射器(ELSD)分析神经酰胺产量，相同条件下，对照工程菌PK2-1D/pESC-ScSUR2-WT仅产生微量神经酰胺，选择相同条件下神经酰胺产量明显比对照工程菌PK2-1D/pESC-ScSUR2-WT产量高的菌株为目的菌株。
实施例3
本实施例为摇瓶复筛优势突变株:将高产神经酰胺的酿酒酵母菌株从母板中用牙签蘸取菌落划线于SD-URA平板，将其倒置放在30℃培养箱培育2d长出单菌落；挑取活化后的单克隆至3mL SD-URA液体培养基，30℃，250rpm过夜培养16h。取SD-URA液体中的菌液接种到25mL诱导培养基中至初始OD600＝0.2，在30℃，250rpm条件下培养3d；培养结束后，取50μL菌液，去离子水稀释40倍，分光光度计中测定600nm波长处吸光度；同时取500μL发酵液，进行超声破碎后用石油醚提取神经酰胺，样品经0.22μm滤膜过滤后，HPLC-ELSD测定神经酰胺产量。
以易错PCR方法构建的突变文库为基础进行筛选，获得6株产神经酰胺效率明显提高的菌株，用酵母质粒提取试剂盒提取其中的pESC-SUR2表达质粒，测定SUR2核苷酸序列，利用三联体密码子推测SUR2的氨基酸序列，氨基酸的改变方式及产神经酰胺相对活性如表1所示，以对照工程菌PK2-1D/pESC-ScSUR2-WT的产神经酰胺相对活性为100％，根据液相检测的分析结果确定SUR2突变文库中工程菌产神经酰胺的相对活性；
表1高产神经酰胺突变体编号SUR2 1-6的测序结果以及植物神经酰胺的产量
注：表1中植物神经酰胺的产量为神经酰胺3和神经酰胺3B的总量，其中，神经酰胺3和神经酰胺3B的质量比例＝3:1。
根据表1可以看出，本发明获得的突变体，其包含的氨基酸突变为M153I、M153I/M124L、M153L/Y152F、F127Y、F127Y/P121I、M153Y/Y123M/M224K。突变体生产植物神经酰胺的产量为野生型的1.64～3.45倍。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶SUR2的突变体，其特征在于，所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶发生突变得到，其中，突变的方式为如下(1)-(7)中的任意一种或几种的组合：
(1)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第153位的M突变为I、L或Y；
(2)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第127位的F突变为Y；
(3)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第124位的M突变为L；
(4)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第152位的Y突变为F；
(5)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第121位的P突变为I；
(6)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第123位的Y突变为M；
(7)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶的氨基酸序列中第224位的M突变为K。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的突变方式为：
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为I；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为I、第124位的M突变为L；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为L、第152位的Y突变为F；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第153位的M突变为Y、第123位的Y突变为M以及第224位的M突变为K；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第127位的F突变为Y；或
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第127位的F突变为Y、第121为的P突变为I。
3.权利要求1或2所述突变体的筛选方法，其特征在于，利用易错PCR技术在体外向野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因引入核苷酸突变，通过重组和随机突变，经定向进化获得目标突变体。
4.编码权利要求1或2所述突变体的核酸分子。
5.含有权利要求3所述核酸分子的表达载体。
6.重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求3所述核酸分子通过质粒导入宿主菌中或通过基因工程手段整合到宿主菌染色体上构建得到的；
所述宿主菌包括酿酒酵母。
7.含有权利要求6所述的重组菌的细胞催化剂。
8.权利要求1或2所述突变体或权利要求5所述表达载体或权利要求6所述重组菌或权利要求7所述的细胞催化剂在神经酰胺生产中的应用。
9.一种高效合成神经酰胺的方法，其特征在于，以葡萄糖为底物，利用权利要求6所述的重组菌全细胞转化合成神经酰胺。
10.根据权利要求9所述的高效合成神经酰胺的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：葡萄糖5-15g/L，半乳糖15-25g/L，酵母粉1-10g/L，蛋白胨5-15g/L，α-环糊精10-20g/L，CaCl2 0.5-1.0g/L，NH4SO4 0.5-1.0g/L，KH2PO4 0.5-1.0g/L，MgSO4 0.1-0.5g/L，FeSO4 7H2O 0.01-0.05g/L，烟酸10-50mg/L，重组菌体量1-20g/L；
所述全细胞转化的温度为25-30℃，时间为2-3d。
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