CN117604135A - 一种沙门菌检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种沙门菌的检测方法及其应用，是以沙门菌保的毒力基因hilA为靶标，首次利用重组酶介导链替换核酸扩增技术结合双链DNA特异性核酸酶，在紫外灯和侧向横流试纸条的辅助下，可直接肉眼观察的沙门菌检测方法；该方法设备要求低，可肉眼直接观察，对检测人员的专业度要求交低，检测环境要求低，且具有较高的特异性和灵敏性，便于推广应用。

Description

一种沙门菌检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及了沙门菌的检测领域，具体涉及了一种沙门菌检测方法及其应用。

背景技术

沙门菌是一种高爆发的食源性病原体，不仅能引起人和动物食物中毒，而且还能导致耐药性的传播，从而造成严重的经济损失，已成为一个危害全球的公共卫生问题。目前已报道了超过2600多种沙门菌血清型，众多的血清型导致其检测力度巨大，给沙门菌的防控带来了巨大的挑战。

近年来，DNA分子检测技术已被广泛开发用于沙门菌诊断，如PCR(RT-PCR)、LAMP、RPA和Crispr/Cas系统等。传统的细菌培养方法被誉为沙门菌检测的“金标准”，然而该方法过程极为繁琐耗时耗力；核酸扩增检测(NAATs)技术的发展，基于NAATs的检测方法在沙门菌检测中发挥着重要的作用，如聚合酶链反应(PCR)、实时定量PCR(qPCR)和Crispr/Cas13a等已被广泛应用于沙门菌检测。然而，不可避免的是这些方法存在一些固有缺陷，如需要昂贵的仪器设备，较高的环境要求以及专业的操作人员，因此这大大限制了它们应用范围。环介导的等温扩增技术(LAMP)也被开发用于沙门菌的检测，然而该种方法需要复杂的引物设计。

因此开发出一款操作简单，设备要求低、肉眼可见、不需要较高环境要求且可用于多种血清型沙门菌检测对沙门菌防控具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术沙门菌的检测方法存在设备要求高、对检测人员专业性要求高、引物设计较为复杂或检测过程中需要RNA参与导致检测环境要求较高的问题以及无法即时检测的问题，提供一种沙门菌的检测方法，该方法设备要求低，可肉眼直接观察，对检测人员的专业度要求交低，检测环境要求低，且具有较高的特异性和灵敏性，便于推广应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种沙门菌检测方法，包括以下步骤：

步骤1、利用细菌基因组和组织DNA提取试剂盒提取沙门菌的基因组和组织DNA；

步骤2、使用重组酶介导链替换核酸扩增技术对沙门菌特异性基因hilA进行扩增；

步骤3、利用双链DNA特异性核酸酶对RAA扩增产物和ssDNA荧光探针杂交链的切割，

步骤4、借助紫外灯或侧向横流试纸条观察结果，实现对沙门菌的可视化检测。

本发明提供了一种沙门菌的检测方法，是以沙门菌保的毒力基因hilA为靶标，首次利用重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)结合双链DNA特异性核酸酶(dsDNase)，在紫外灯(UV light)和侧向横流试纸条(LFS)的辅助下，可直接肉眼观察的沙门菌检测方法。

进一步的，所述步骤2和所述步骤3在同一个装置内进行一锅式反应。研究发现，步骤2和步骤3分开处理和一起处理，效果均较好。

进一步的，所述步骤2中，具体的操作方法为：

使用基础型核酸扩增试剂扩增步骤1得到的沙门菌靶标基因hilA；扩增处理的温度为35～38℃，孵育时间为35～45min。

进一步的，所述步骤3中，具体操作步骤为：

双链DNA特异性核酸酶切割ssDNA荧光探针，反应体系为：0.8～1.2μLFAM-ssDNA-BHQ1 probe、0.8～1.2μL dsDNAse、8～12μL步骤2得到的RAA产物，加水补充至总体积为20μL，35～38℃孵育8～12min。

本发明的另一目的是为了提供上述沙门菌检测方法的应用。

如上述的沙门菌检测方法在对环境中沙门菌监测中的应用。

如上述的沙门菌监测方法在对动物体内携带沙门菌的监测中的应用。

本发明以沙门菌保的毒力基因hilA为靶标，首次利用重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)结合双链DNA特异性核酸酶(dsDNase)，在紫外灯(UV light)和侧向横流试纸条(LFS)的辅助下，开发了一款可直接肉眼观察的沙门菌检测方法。

本发明选择hilA基因的高度保守区域作为RAA引物和dsDNase探针识别区域，对沙门菌展现出高度的特异性，而与其它7种非沙门菌无交叉反应。

本发明巧妙借助RAA反应体系中的重组酶和单链结合蛋白(SSB)，使探针能够更易结合到靶标序列上，从而被dsDNase降解。

由于RAA扩增和dsDNase降解过程可在相同的反应温度(37℃)和相同反应buffer(RAA buffer)里快速反应，因此通过条件优化，我们开发了一锅法沙门菌检测方法。

为了证实一锅法检测方法的可行性，本发明以一锅法和两步法两种模式进行(统称为SRD)，所有实验结果显示，无论是两步法还是一锅法具有相同的结果，表明一锅法检测是可行的。

沙门菌检测方法检测方法全程不需要任何RNA(如Cas12a或者Cas13a所需的crRNA)的参与，因此对检测环境要求不高。在50min(RAA40 min，dsDNAse 10min)内，紫外灯下沙门菌检测方法能够实现对10¹拷贝(DNA)和10¹CFU沙门菌的检测；在60min(RAA40min，dsDNAse 10min，LFS10min)内，利用LFS可实现对10²拷贝(DNA)和10²CFU沙门菌的检测；SRD方法不仅成功被应用于生猪养殖场中沙门菌检测，同时也成功应用于鸡组织内沙门菌的检测，证实了SRD在对环境中沙门菌和动物体内携带沙门菌的监测具有重要意义。因此沙门菌检测方法有希望成为沙门菌检测的重要手段。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种沙门菌的检测方法，是以沙门菌保守性毒力基因hilA为靶标，首次利用重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)结合双链DNA特异性核酸酶(dsDNase)，在紫外灯(UV light)和侧向横流试纸条(LFS)的辅助下，可直接肉眼观察的沙门菌检测方法。

2、本发明提供的沙门菌检测方法，先借助RAA技术对沙门菌特异性基因hilA进行大量扩增；随后利用荧光探针竞争性结合靶标序列以及巧妙的利用了RAA系统中的重组酶和单链DNA结合蛋白(SSB)将更多荧光探针结合到靶标序列上。最后，使用dsDNase降解含荧光探针的双链DNA，从而使荧光探针断裂。该方法设备要求低，可肉眼直接观察，对检测人员的专业度和对检测环境要求低，且具有较高的特异性和灵敏性，便于推广应用。

3、本发明提供了沙门菌的检测方法在对环境中沙门菌监测中的应用。

4、本发明提供了沙门菌的检测方法在对动物体内携带沙门菌的监测中的应用。

附图说明

图1为RAA联合dsDNase检测沙门菌原理图。

图2为RAA引物筛选及RAA联合dsDNase检测沙门菌可行性分析图。

图3为优化反应条件结果图。

图4为沙门菌检测方法灵敏性分析图。

图5为沙门菌检测方法特异性分析图。

图6为沙门菌检测方法临床样品图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1.实验部分

1.1.试剂和材料

本发明中用到的所有引物及荧光探针经高效液相色谱(HPLC)进行纯化(表1)，并交由生工生物技术有限公司(上海，中国)合成(表1)。蓝色高保真Taq酶mix购买自北京聚合美生物科技有限公司。基础型核酸扩增试剂(RAA)购买自杭州众测生物科技有限公司。双链DNA特异性核酸酶购买自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。Cas12/13专用核酸检测试纸条购买自北京宝盈同汇生物技术有限公司。细菌基因组DNA和组织DNA提取试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.细菌基因组DNA和组织DNA提取

本实验中使用到的细菌均保存在50％甘油中，并存放在-20℃冰箱中。使用前将菌取出后，先在LB固体平板上划线活化后，再挑取单克隆至LB液体培养基中，摇菌至OD600等于0.8；之后，利用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

1.3.RAA引物设计及筛选

我们首先对沙门菌的hilA基因序列进行了分析，选择高度保守区域进行RAA引物设计，我们共设计了9对RAA引物(表1)。以含hilA基因部分序列的质粒为模板，进行RAA扩增反应。反应体系为：向RAA反应干粉管中加入25μLABuffer、和13.5μLddsH2O，彻底混匀后将其等分至5个新的EP管中。再分别向每个EP管中加入0.4μL上游引物(10μM)、0.4μL下游引物(10μM)和1μL模板，最后向每个EP管盖上加入0.5μLB Buffer，总体积为10μL。盖上管盖，上下颠倒8-10次充分混匀液体，低速离心10秒。将EP管在37℃条件下反应40min。反应结束，将RAA产物经2％琼脂凝胶电泳分析，并在紫外灯下观察结果，选择条带单一且明亮的对应引物对用于后续实验。

表1RAA引物及dsDNase荧光探针

1.4.dsDNase酶降解探针可行性分析

为了开发可视化沙门菌检测方法，我们设计了靶向于hilA基因的ssDNA荧光探针。首先评估了dsDNase对ssDNA探针和ssDNA探针-hilA基因混合物降解能力。反应体系为：2μL10xbuffer、1μLprobe(10μM)、1μL dsDNAse、2μL模板DNA或ddH2O，加水补充至总体积为20μL。

我们对dsDNase降解RAA产物和探针的情况进行了分析，反应体系为：2μL 10xbuffer、1μL FAM-ssDNA-BHQ1 probe(10μM)、1μL dsDNAse、6μLRAA产物，加水补充至总体积为20μL。37℃孵育10min，孵育结束在紫外灯下观察结果。

最后，我们将双链DNA、探针和RAA反应体系(未添加RAA引物)直接进行混合，37℃孵育10min后观察结果。

1.5.优化反应条件

主要对沙门菌检测方法中的dsDNase酶降解反应进行优化，由于RAA反应是固定且几乎是最优的。由于一锅法和两锅法中各种成分是一致的，因此我们主要采用两步法进行条件优化，如无特殊说明，各个dsDNase酶降解反应体系中，RAA产物用量均为10μL。首先我们测试了向反应体系中分别补加0、0.5μL和1μL10x dsDNAse buffer对dsDNAse的影响，因为RAA反应buffer里包含了dsDNase反应所需的所有离子种类；ssDNA荧光探针筛选：由于不同的探针可能导致dsDNase酶降解效率不同，为了获得高强度的荧光，我们对荧光探针(探针1和探针2)进行了筛选；优化dsDNase酶用量：dsDNase终浓度直接影响荧光产生速率，浓度太低或太高均影响切割效率，因此我们在反应体系中分别加入了0.5μL、0.75μL和1μLdsDNase，并在紫外灯下观察37℃反应10min时，各个反应体系中荧光强弱；dsDNase时间优化：由于dsDNase具有较高降解dsDNA的能力，为了节约检测时间，我们分别在0、5min和10min时观察了反应产生的荧光强弱，以此来决定dsDNase反应时间。RAA产物体积优化：分别向反应体系中加入6μL、8μL和10μLRAA产物，观察反应10min后产生的荧光强弱。

以上条件优化结束后，我们想要知道能否将RAA扩增和dsDNase降解过程在一管中进行，从而减少操作过程及来回开盖导致的气溶胶污染，因此我们选用了顶部突起的EP管进行实验，并将dsDNase反应成分加入至EP管盖中；反应体系及步骤为：EP管底部为RAA反应体系，同步骤2.2；EP管盖中加入1μL探针2、1μL dsDNase和8μL ddH2O；37℃孵育40min，短暂离心，上下颠倒混匀后，再次短暂离心，37℃孵育10min。后续实验中，我们将同时开展两锅法和一锅法实验，互相佐证方法的可行性。

1.6.评估沙门菌检测方法灵敏性、特异性和实用性

为了对沙门菌检测方法的灵敏性进行评估，我们分别进行了两锅法和一锅法测试。模板采用连续10倍倍比稀释的hilA基因DNA(0-10³copies)和鼠伤寒沙门菌基因组DNA(0-10³CFU)。除在LFS检测时，将探针2的3’修饰改为bio外，其余反应体系及过程同步骤2.5，反应结束我们分别在紫外灯和侧向横流试纸条(LFS)下观察实验结果。

为了开展沙门菌检测方法的特异性分析，我们选取了17种不同血清型的沙门菌和8种非沙门菌(表2)进行了细菌基因组DNA提取，并分别开展了SRD和PCR分析。沙门菌检测方法反应体系及过程同灵敏性；PCR反应体系及程序为：7μL ddH2O、上下游引物各0.5μL，10μL2x PCR mix(蓝色高保真Taq酶mix购买自北京聚合美生物科技有限公司)和2μL基因组DNA。反应程序为：预变性94℃3min；变性94℃10s，退火54℃10s，延伸：72℃15s；30个循环；终延伸：72℃2min；4℃保存。PCR结束利用2％的琼脂糖胶进行PCR产物分析，并进行sanger测序和利用MEGA5进行保守性2分析，

1.7.临床样品检测

为了测试沙门菌检测方法在临床样品中的实用性检测，我们对临床上感染沙门菌的雏鸡进行了解剖，对其脏器组织(心、肝、脾、肺、肾和肠组织)进行了取样和组织DNA提取(参照说明书)，并利用PCR和SRD两种方式进行分析，反应体系及过程同2.6。

2.结果

2.1.RAA联合dsDNase检测沙门菌

目前大多数研究是将RAA产物进行琼脂糖凝胶电泳或者与Crispr/Cas系统相结合，用于靶标的检测，然而以上两种方法存在不可避免的缺点，如琼脂糖凝胶电泳易造成气溶胶污染和结果不能肉眼可见，而Crispr/Cas系统在检测过程中需要crRNA的参与，对检测环境要求较高。本实验中，先借助RAA对沙门菌特异性基因hilA进行大量扩增；随后，利用荧光探针竞争性结合靶标序列(由于荧光探针竞争性结合靶标DNA序列的能力有限，因此我们巧妙的结合了RAA系统中的重组酶和单链DNA结合蛋白(SSB)将更多荧光探针结合到靶标序列上，从而使dsDNase降解更多的探针，产生更强的荧光信号)；最后，dsDNase降解含荧光探针的双链DNA，从而使荧光探针断裂(图1)。其中图1A和1C显示，在无靶标DNA时，无论是在dsDNase反应buffer还是RAA反应buffer里，dsDNase都不能对ssDNA探针进行切割。图1B和1D显示，靶标DNA存在时，在两种buffer里，dsDNase均可对ssDNA探针进行切割，但在dsDNase反应buffer里切割能力较弱，而在RAA反应buffer里，切割能力明显增强。最后，图1E和1F显示，RAA联合dsDNase可通过两锅法和一锅法进行检测沙门菌。

2.2.RAA引物筛选及RAA联合dsDNase检测沙门菌可行性分析

在对RAA引物筛选中，我们共测试了9对RAA引物的扩增情况。在加入相同质量的模板DNA和扩增条件一致的情况下，对RAA产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果表明引物对F7R7扩增条带单一且最亮(图2A)，因此选用该对引物进行后续分析；为了测试RAA联合dsDNase检测沙门菌的可行性，向RAA产物中补加了1μL探针2、1μL dsDNase和8μL ddH2O，37℃孵育10min后，紫外灯下观察结果发现只有在同时加入了模板DNA和dsDNase时，EP管中才会产生明显的荧光，而在不加入dsDNase或者模板DNA的EP管中，无明显的荧光产生(图2B)，表明RAA联合dsDNase检测沙门菌是可行的。最后，我们发现在不加入RAA反应成分(未添加引物)时，与对照组相比，实验组荧光信号较弱，而当加入RAA反应成分时，尽管未进行RAA扩增，反应管中仍产生很强的荧光，可能是RAA反应成分中的重组酶和单链DNA结合蛋白(SSB)促进了荧光探针结合到靶标序列中，进而被dsDNase降解。

2.3.优化反应条件及沙门菌检测方法一锅法可行性分析

为了提高SRD检测能力，我们对沙门菌检测方法的反应条件进行了优化，优化结果如下：在分别加入0、0.5μL和1μL 10xbuffer的各个反应体系中，各组样品紫外灯下荧光强度无明显区别，表明10x buffer对反应无促进作用，在后续实验中被去除(图3A)；探针筛选实验中，探针2组荧光强度明显强于探针1组，因此选用探针2进行后续实验(图3B)；在对RAA产物用量进行优化时发现，加入10μLRAA产物时，其荧光最强(图3C)；在优化dsDNase处理时间时，发现5min和10min时其荧光强度明显强于0min，且二者无明显差别，但为了保证dsDNase完全切割底物，我们后续实验仍选用10min来进行dsDNase处理(图3D)；为了提高dsDNase降解速率，缩短SRD检测时间，对dsDNase用量进行优化时发现，37℃孵育10min，加入1μL dsDNase，其荧光强度最大(图3E)。

以上条件优化结束后，为了进一步简化反应程序，我们根据上面反应条件优化结果将RAA反应和dsDNase酶处理过程置于一管中，与将两种反应过程分开进行实验相比，二者无明显区别，表明沙门菌检测方法一锅法是可行的(图3F)。

2.4.SRD灵敏性分析

我们接下来对SRD在紫外灯和LFS辅助下分别进行了灵敏性分析，分析结果为：紫外灯下无论是两锅法还是一锅法，SRD均可以检测到10¹copies(图4A和4E)和10¹CFU(图4C和4G)；而在LFS辅助下，沙门菌检测方法检测下限均为10²copies(图4B和4F)和10²CFU(图4D和4H)。结果表明，我们开发的检测方法沙门菌检测方法对沙门菌较为灵敏，完全满足日常沙门菌检测需要。

2.5.SRD特异性分析

为了进一步分析SRD对沙门菌是否具有较高的特异性，我们利用SRD和PCR两种技术对17种血清型沙门菌和8种非沙门菌进行特异性分析。结果表明，PCR技术可以无差别对17种血清型沙门菌的hilA基因进行扩增，而对非沙门菌则无法产生明显的扩增条带(图5A)。将PCR产物进行Sanger测序，利用MEGA5对测序条带进行分析发现，我们设计的引物和探针在17种血清型沙门菌的hilA基因中具有高度保守性(图5B)。SRD分析结果表明：SRD在所有使用的沙门菌血清型中均产生了明显的荧光(紫外灯下)和测试条带(LFS)，表明SRD对沙门菌具有高度特异性，且两锅法和一锅法具有类似的结果(图5C和图5D)，其中，图5A、5C和5D联合分析显示，PCR和SRD对沙门菌具有高度特异性，而对非沙门菌无交叉反应。图5B显示，利用sanger测序发现，RAA引物和探针在hilA基因中具有高度保守性。

2.6.SRD临床样品分析

在完成特异性和灵敏性分析后，我们进一步将SRD应用于临床样品分析。结果显示:SRD对感染了沙门菌的雏鸡组织(心、肝、脾、肺、肾和肠)样本检测时产生了明显的荧光(紫外灯下)和测试条带(LFS)，而在健康鸡中无明显荧光和测试条带产生，且两锅法和一锅法具有类似的结果(图6)，表明SRD可以直接用于临床样品中沙门菌的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种沙门菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、利用细菌基因组和组织DNA提取试剂盒提取沙门菌的基因组和组织DNA；

步骤2、使用重组酶介导链替换核酸扩增技术对沙门菌特异性基因hilA进行扩增；

步骤3、利用双链DNA特异性核酸酶对RAA扩增产物和ssDNA荧光探针杂交链的切割，

步骤4、借助紫外灯或侧向横流试纸条观察结果，实现对沙门菌的可视化检测。

2.根据权利要求1所述的沙门菌检测方法，其特征在于，所述步骤2和所述步骤3在同一个装置内进行一锅式反应。

3.根据权利要求1所述的沙门菌检测方法，其特征在于，所述步骤2中，具体的操作方法为：使用基础型核酸扩增试剂扩增步骤1得到的沙门菌靶标基因hilA；扩增处理的温度为35～38℃，孵育时间为35～45min。

4.根据权利要求3所述的沙门菌检测方法，其特征在于，所述步骤3中，具体操作步骤为：双链DNA特异性核酸酶切割ssDNA荧光探针，反应体系为：0.8～1.2μLFAM-ssDNA-BHQ1probe、0.8～1.2μL dsDNAse、8～12μL所述步骤2得到的RAA产物，加水补充至总体积为20μL，35～38℃孵育8～12min。

5.如权利要求1-4任意一项所述的沙门菌检测方法在对环境中沙门菌监测中的应用。

6.如权利要求1-4任意一项所述的沙门菌监测方法在对动物体内携带沙门菌的监测中的应用。