CN117599105B - 一种具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物及其制备方法，它是由黄芪240～480g、黄蜀葵花240～480g、积雪草240～480g、丹参120～240g、甘草40～80g制得的提取物与虫草菌丝制成。本发明通过多年临床经验，结合肾脏衰老病机，筛选组方，在黄芪、黄葵、丹参、甘草的基础上增添了积雪草和虫草菌丝两味药，可以明显增进其清利活血、益气补肾之功效。方中诸药调和，通过补肾气，益肾精，活气血，清湿浊，结合护肾延衰的治疗理念，成为临床上针对肾脏功能衰退和肾脏早期损伤的常用组方。实验结果表明，本发明中药复方能使肾脏功能得到恢复，肾脏SA、HE、Masson染色显示中药治疗后衰老、纤维化症状减轻，具有很好的抗自然衰老，延年益寿的功效。

Description

一种具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物及其制备 方法与应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物及其制备方法，属于中医药技术领域。

背景技术

中医理论中认为肾中封存着先天之精及后天之精。最早在《素问·六节脏象论》中提到：“肾者主蛰，封藏之本，精之处也。”《素问、金匮真言论》认为精乃生之本。先天之精继承自父母，后天之精则是谷水食物摄入体内后经胃的腐熟，肠、脾气化，凝炼而成。肾主藏精以养五脏六腑，故肾储备精的能力与其主导的精气、水液运行情况，势必影响整个人体的健康情况。古时医家指出，肾脏衰老，则气化失常，湿浊瘀毒阻塞三焦，“肾络癥瘕”形成，最终百病丛生。

肾脏由于其生理功能，负责调控整个机体的体液代谢，是最容易老化的器官之一。随着年龄增长，肾脏结构和功能出现病变，发生肾脏纤维化等，进一步促进肾脏功能得衰退，研究也表明慢性肾脏病的肾脏具备与老龄化的肾脏相似的特征。

中国科学院动物研究所通过全基因组基因编辑技术系统地研究衰老基因，发现在早衰症患者的原代骨髓间充质干细胞(hMPCs)的老化中KAT7的表达差异最为明显，KAT7能通过选择性乙酰化组蛋白H3K14，以促进衰老标志基因的表达并诱导细胞衰老。自然衰老的动物模型研究发现，失活KAT7可以使81％的小鼠寿命超过130周，而对照组小鼠仅27％能活到130周。随着KAT7在衰老中作用的提出，近年来对KAT7与不同器官衰老相关性的探索逐渐涌现，提示了KAT7在不同物种、多种器官、不同衰老相关疾病中的研究价值。这提示抑制KAT7水平可能在抵抗衰老、延长寿命的方面可能有重要的研究价值。

中医药在抗衰老、延长寿命方面具有独特优势，因此，本发明在中医理论指导下，结合临床实践，优选出具有显著延缓肾脏衰老和肾纤维化的中药复方组合物。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，采用“护肾延衰”理论，通过补肾气，益肾精，活气血，清湿浊，辨证论治，优选出能有效延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物。本发明另一个目的是提供中药复方组合物的制备方法与应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，它是由下列原料制成：

黄芪、黄蜀葵花、积雪草、丹参、甘草和虫草菌丝。

作为优选方案，以上所述的具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，它是由黄芪、黄蜀葵花、积雪草、丹参、甘草制成的提取物与虫草菌丝制成。

作为进一步优选方案，以上所述的具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，它是由黄芪240～480g、黄蜀葵花240～480g、积雪草240～480g、丹参120～240g、甘草40～80g制成的提取物与虫草菌丝制成。

作为特别的优选方案，以上所述的具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，它是由黄芪240g、黄蜀葵花240g、积雪草240g、丹参120g、甘草40g制成的提取物与虫草菌丝制成。

作为进一步优选方案，以上所述的具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，所述的中药复方的提取物与虫草菌丝的重量比为1:0.88～1。

本发明所述的具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，所述的提取物是通过以下方法制备得到的：

取黄芪、黄蜀葵花、积雪草、丹参和甘草，加水浸没药材，先浸泡，然后煎煮提取，用纱布挤压药渣收集煎煮液，药渣再次加水煎煮，收集两次煎煮液，用纱布过滤，滤液旋转蒸发浓缩，预冷冻后使用真空冷冻干燥机处理，得到冻干粉。

作为优选方案，以上所述的具有延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，所述的提取物是通过以下方法制备得到的：

取黄芪、黄蜀葵花、积雪草、丹参和甘草，加药材重量5～15倍体积的水浸没药材，浸泡30～40min，煎煮提取30～60min，纱布挤压药渣收集煎煮液，药渣再次加5～15倍体积的水煎煮30～60min，收集两次煎煮液，用纱布过滤，滤液旋转蒸发浓缩，于-80℃预冷冻24h后使用真空冷冻干燥机处理72h，得到冻干粉。

一种中药复方组合物与药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、散剂、合剂、膏剂。

本发明在制成片剂时把中药提取物添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明在制成胶囊剂时，把中药提取物与糊精或淀粉混合均匀，制粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明在制成颗粒剂时，把中药提取物加糊精等混合均匀，制粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明在制成合剂时，中药提取物加纯化水溶解，制成合剂。

本发明在制成口服液时，把中药提取物加纯化水溶解，加入甜菊素或阿斯巴坦，调pH，制成口服液。

有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：

(1)本发明通过多年临床经验，结合肾脏衰老病机，筛选组方，在黄芪、黄葵、丹参、甘草的基础上增添了积雪草和虫草菌丝两味药，可以明显增进其清利活血、益气补肾之功效。方中诸药调和，通过补肾气，益肾精，活气血，清湿浊，结合护肾延衰的治疗理念，成为临床上针对肾脏功能衰退和肾脏早期损伤的常用组方。实验结果表明，本发明提供的中药复方能使肾脏功能得到恢复，肾脏SA、HE、Masson染色显示中药治疗后衰老、纤维化症状减轻。具有很好的抗自然衰老，延年益寿的功效。

(2)本发明提供的具有延缓肾脏衰老及抗肾纤维化的中药复方组合物，可以方便和药学载体制备成多种剂型，临床上服用方便，且实验结果表明本发明提供的组合物，疗效可靠，使用安全，长期服用无毒副作用。

附图说明

图1为中药调节KAT7减轻小鼠肾脏衰老与纤维化(bar：100μm)。

图2为中药调节KAT7改善小鼠肾脏衰老与纤维化相关蛋白表达。※注：*代表与空白组对比，#代表与上一组对比；*P、#P＜0.05，**P、##P＜0.01，***P、###P＜0.001、****P、####P＜0.001。

图3为中药含药血清调节KAT7减轻肾小管上皮细胞衰老与纤维化(100×)。※注：*代表与空白组对比，#代表与上一组对比；*P、#P＜0.05，**P、##P＜0.01，***P、###P＜0.001、****P、####P＜0.001。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

1、一种延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，它是由下列重量份数的原料制成：

重量比为1:0.88的中药复方的提取物与虫草菌丝。

所述的中药复方的提取物是通过以下方法制备得到的：

取黄芪240g、黄蜀葵花240g、积雪草240g、丹参120g、甘草40g，加水浸没药材浸泡30min，补足至5L纯水，武火煮沸后文火煎煮30min，纱布挤压药渣收集煎液，再次加5L纯水煎煮30min；收集两次煎煮液使用8层纱布过滤。旋转蒸发浓缩至400mL左右后分装入50mLEP管(每管15-20mL)，于-80℃预冷冻24h后使用真空冷冻干燥机处理72h，得到冻干粉。

将冻干粉按照质量比1:0.88比例与虫草菌丝粉混合，得到复方冻干混合粉。使用时取复方冻干粉混合粉，加入适量超纯水，并加入0.5％羧甲基纤维素钠搅拌均匀，现配现用。

实施例2

1、一种延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，它是由下列重量份数的原料制成：

重量比为1:1的中药复方的提取物与虫草菌丝。

所述的中药复方的提取物制备方法同实施例1。

实施例3

1、一种延缓肾脏衰老及纤维化的中药复方组合物，它是由下列重量份数的原料制成：

重量比为1:0.88的中药复方的提取物与虫草菌丝。

所述的中药复方的提取物是通过以下方法制备得到的：

取黄芪480g、黄蜀葵花480g、积雪草480g、丹参240g、甘草80g，加水浸没药材浸泡30min，补足至10L纯水，武火煮沸后文火煎煮40min，纱布挤压药渣收集煎液，再次加10L纯水煎煮30min；收集两次煎液使用8层纱布过滤。旋转蒸发浓缩至800mL左右后分装入50mLEP管(每管15-20mL)，于-80℃预冷冻24h后使用真空冷冻干燥机处理72h，得到冻干粉。

将冻干粉按照质量比1:0.88比例与虫草菌丝粉混合，得到复方冻干混合粉。

使用时取复方冻干粉混合粉，加入适量超纯水，并加入0.5％羧甲基纤维素钠搅拌均匀，现配现用。

实施例4延缓肾脏衰老及纤维化的药效试验

1、改善自然衰老小鼠肾脏衰老

1.1实验材料

1.1.1实验试剂

1.1.2实验仪器

主要仪器	型号	厂家
			倒置荧光显微镜	Axio Vert A1	ZEISS
多功能酶标仪	PE	Perkin Elmer
			凝胶成像系统	LAS 4000	FUJIFILM
Western blot凝胶电泳设备	MiNi ROTEAN	Bio-rad
			超低温冰箱	UUS-410D-SS	ESCO
纯水机	Milli-Q Integral 15	MERCK
			超净工作台	ACB-4A1	ESCO
CO2细胞培养箱	HERAcell 150i	Thermo
			细胞计数仪	C 10227	Thermo

。

1.1.3实验动物

实验动物选择SPF级C57BL/6雌性小鼠。其中2月龄小鼠8只，6月龄小鼠24只，购自江苏华创信诺生物科技有限公司，动物许可证号SCXK(苏)2020-0009。饲养于南京中医药大学动物实验中心SPF环境，饲养环境12小时光照/黑暗循环、温度22±3℃、湿度50±10％。给予小鼠维持饲料及充足洁净饮水。7-10日龄C57BL/6乳鼠30只，购自江苏华创信诺生物科技有限公司，动物许可证号SCXK(苏)2020-0009。动物实验伦理获得南京中医药大学动物实验中心伦理批准，批准号：202108A006。

1.1.4实验试剂配制

实验中的中药材及饮片由江苏省中医院制剂部提供。中药复方样品制备：取黄芪240g、黄蜀葵花240g、积雪草240g、丹参120g、甘草40g，加水浸没药材浸泡30min，补足至5L纯水，武火煮沸后文火煎煮30min，纱布挤压药渣收集煎液，再次加5L纯水煎煮；收集两次煎液使用8层纱布过滤。旋转蒸发浓缩至400mL左右后分装入50mL EP管(每管15-20mL)，于-80℃预冷冻24h后使用真空冷冻干燥机处理72h，得到160g冻干粉，得率为18.2％。将冻干粉按照1:0.88比例与虫草菌丝粉混合，得到复方冻干混合粉。使用时取复方冻干粉混合粉，加入适量超纯水，并加入0.5％羧甲基纤维素钠搅拌均匀，现配现用。

D-gal动物用药：称取5g D-gal，加入100mL无菌水，混匀得浓度为500mg/mL的D-gal注射液，储存于4℃。

电泳缓冲液：分别称取Tris 30.2g，Glycine 144g，SDS10g，加入ddH2O搅拌均匀，定容至1000mL，得到电泳10×储备液。取储备液200mL，加入ddH2O定容至2000mL，得到1×电泳缓冲液。

转膜缓冲液：取50mL 20×快速转膜液，加入100mL无水乙醇，加入ddH2O定容至1000mL，得到1×快速转膜液。

TBS/TBST缓冲液：分别称取NaCl 80g，Tris 24.4g，加入H2O搅拌均匀，定容至1000mL，得到10×TBS缓冲液。取200mL 10×缓冲液，加入H2O，并加入2mL Tween 20进行搅拌，用ddH2O定容至2000mL，得到1×TBST缓冲液。

1.2实验方法

1.2.1动物干预

6月龄小鼠适应性喂养一周后，给予足量维持饲料与洁净饮水，持续饲养至16月龄。随机分为3组：Aging组、中药复方低剂量组(HY-L组)、中药复方高剂量组(HY-H组)，每组8只。分别灌胃生理盐水0.2mL/20g/d、冻干混合粉2g/kg/d、冻干混合粉4g/kg/d，持续给药60天。6只2月龄小鼠饲养至4月龄，作为青年对照组，期间给予生理盐水0.2mL/20g/d灌胃处理。各组干预结束后将小鼠处死，收集血液、尿液、肾组织以备检测。

1.2.2肾脏组织蛋白表达

使用Western blot法检测衰老相关蛋白P21、P16、LaminB1、γH2Ax表达情况；纤维化相关蛋白COLⅠ、α-SMA表达情况；KAT7及炎症小体相关蛋白NLRP3、IL-1β表达情况。

肾脏组织的Western blot具体操作如下：使用眼科剪剪下50mg肾脏皮质，剥去肾脏包膜，PBS洗净，滤纸吸去多余水分，剪碎放入2mL EP管，加入混合好的蛋白裂解液(RIPA：蛋白酶抑制剂混合液＝100：1)500μL，加入两颗3mm钢珠，使用低温匀浆机以30功率、4℃、3min条件进行匀浆2次。取出钢珠后以50％功率超声8s+冰上冷却8s，重复超声5次。以12000rpm、4℃、15min进行离心，吸取上清液5μL用于蛋白浓度测定，其余上清加入1/4体积的5×蛋白上样缓冲液，涡旋混匀，使用金属浴99℃变性10min，冷却后分装，置于-80℃储存备用。

使用制胶试剂盒配置适宜浓度的凝胶，根据蛋白浓度测定结果上样，恒压160V进行电泳，使用快速转膜液以400mA电流进行转膜，视目的蛋白分子量转膜10-50min。快速封闭液封闭15min，使用TBST清洗3min×3次，将膜放入对应一抗4℃孵育过夜。次日取出膜使用TBST清洗5min×2次+10min×2次。将膜放入对应种属二抗，室温孵育1小时，使用TBST清洗5min×2次+10min×2次，加入ECL化学显影液进行曝光。每个实验独立重复3次，使用Image J进行灰度值计算，使用Graph Pad Prism进行统计与作图。

1.2.3肾功能检测

小鼠取血后于冰上静置4h，以4℃、3000rpm离心15min，吸取血清分装保存于-80℃。使用膀胱压迫法收集小鼠尿液保存于-80℃。使用生化试剂盒检测小鼠血肌酐、血尿素氮、血尿酸、尿蛋白的水平。参照说明书加入各工作液，分别加入样本、标准品、蒸馏水，孵育后于酶标仪中检测吸光度，使用Office Excel按说明书算法计算样本中目的蛋白浓度，使用Graph Pad Prism进行统计与作图。

1.2.4肾脏SA-β-gal染色

将肾脏组织进行OTC包埋后制作冰冻切片。将切片使用PBS清洗5min×3次，加入固定液没过表面，室温固定20min，弃去固定液使用PBS清洗5min×3次，按照成分A：B：C：X＝1：1：93：5的比例配置染色工作液。每张切片滴加500μL工作液，置于保湿暗盒中于37℃烘箱过夜。次日弃去工作液，加入0.1％核固红染液染色20min，使用PBS清洗5min×3次，使用甘油明胶封片液封片，于光学显微镜下观察蓝色阳性区域。

1.2.5肾脏组织病理学染色

制作石蜡切片，进行HE、Masson、天狼星红染色。

天狼星红染色具体步骤为：将肾脏组织切片于70℃烘箱内烤片40min，依次使用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、梯度酒精进行水化处理。浸泡入饱和天狼星红染色液1h，流水冲洗10s，浸入0.5％醋酸溶液20s，流水冲洗，使用梯度乙醇和二甲苯脱水，中性树胶封片，晾干后使用偏振光显微镜观察拍摄。

1.2.6肾脏组织免疫荧光染色

将肾脏组织切片于70℃烘箱内烤片40min，依次使用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、梯度酒精进行水化处理。使用抗原修复液于95℃修复10min，冷却后PBS清洗5min×3次。加入5％山羊血清封闭30min，甩去血清，组化笔圈起组织，滴加1：100稀释的Lamin B1兔一抗，于4℃暗盒保湿孵育8h。次日取出复温15min，使用Antibody wash buffer摇洗5min×3次，PBS摇洗3min。再滴加1：100稀释的KAT7鼠抗抗体孵育8h，重复摇洗操作。滴加1：100比例的红色荧光兔二抗和绿色荧光鼠二抗，室温避光孵育1h。进行与一抗相同的摇洗操作。滴加DAPI染细胞核15min，PBS摇洗3min×3次。使用抗淬灭封片液封片，观察红、绿、蓝色荧光并拍摄。

1.2.7数据处理

使用Image J检测蛋白灰度值和处理图像，使用Image pro plus统计病理染色情况，使用Prism GraphPad 8.0分析统计数据并制作定量图。采用ANOVA单因素方差分析表示组间差异，采用LSD法表示两组间差异，采用表示计量资料，P＜0.05表明差异在统计学上有意义。

2.改善小鼠原代肾小管上皮细胞衰老

2.1实验材料

2.1.1实验试剂及仪器

同上1.1.1和1.1.2。

2.1.2实验动物

SPF级雄性SD大鼠20只，体重约250g，购自江苏华创信诺生物科技有限公司，动物许可证号SCXK(苏)2020-0009。饲养于南京中医药大学动物实验中心SPF环境，饲养环境12小时光照/黑暗循环、温度22±3℃、湿度50±10％。给予大鼠维持饲料及充足洁净饮水。

2.1.3实验试剂配制

受试的中药复方同以上1.1.3，使用时取复方冻干粉混合粉，加入适量超纯水，并加入0.5％羧甲基纤维素钠搅拌均匀，现配现用。

D-gal细胞用药：称取4.504g D-gal，加入50mL无菌水，混匀得浓度为500mM的D-gal储备液，经0.22μm滤头过滤后分装于1.5mLEP管中，封口后保存于-20℃。

电泳缓冲液：分别称取Tris 30.2g，Glycine 144g，SDS10g，加入ddH2O搅拌均匀，定容至1000mL，得到电泳10×储备液。取储备液200mL，加入ddH2O定容至2000mL，得到1×电泳缓冲液。

转膜缓冲液：取50mL 20×快速转膜液，加入100mL无水乙醇，加入ddH2O定容至1000mL，得到1×快速转膜液。

TBS/TBST缓冲液：分别称取NaCl 80g，Tris 24.4g，加入H2O搅拌均匀，定容至1000mL，得到10×TBS缓冲液。取200mL 10×缓冲液，加入H2O，并加入2mL Tween 20进行搅拌，用ddH2O定容至2000mL，得到1×TBST缓冲液。

2.2实验方法

2.2.1含药血清制备

大鼠适应性喂养3天后，随机分为2组，其中空白组5只，给予生理盐水2mL/250g/d灌胃。中药组15只，每日给予于早、晚各一次中药冻干混合粉溶液灌胃，剂量为1.1g/kg。灌胃4天后麻醉取血清。具体操作为：在注射戊巴比妥钠麻醉充分后，打开腹腔推开内脏，使用棉球钝性分离结缔组织，暴露腹主动脉，使用一次性采血针及真空采血管收集血液，收集完毕后处死大鼠。将采血管冰上静置2h后4℃下3000r离心15min。吸取上清至50mLEP管，置于56°水浴锅中进行内毒素灭活30min。转移入超净台内使用0.22μm滤头过滤，分装至1.5mL管内，保存于-80℃。

2.2.2原代细胞提取及干预

原代细胞提取及培养方法取材：乳鼠杀死泡入75％酒精充分消毒，从背部开刀迅速取双肾，于PBS中清洗并去除包膜、髓质，移入Hanks缓冲液剪碎成1mm3左右大小。转移入15mL管补充5mL Hanks缓冲液，1500rpm离心5min。弃去上清，加入3mL 0.1％胶原酶Ⅳ，吹打重悬后移入60mm培养皿，37℃下分别消化不同时间(15、30、45、60min)。计时结束后加入3mL含10％FBS的DMEM完全培养基中止消化。将组织液体移入15mL离心管，1000rpm离心3min，去除上清。剩余组织沉淀加入5mL Hanks溶液，500rpm离心3min，重复此步离心共计三次。加入含10％FBS、1％ITS、1％P/S的DMEM完全培养基(后称此为原代细胞培养基)1mL，吹打重悬细胞。将悬液滴加至100目细胞筛，使用5mL注射器的胶塞轻柔研磨5次，使用1mL原代细胞完全培养基冲洗，再次轻柔研磨。收集滤液滴加至200目细胞筛，重复研磨操作。收集过筛后的细胞悬液按照每4个肾脏对应一瓶T25培养瓶的比例将接种于T25瓶。接种24-36h观察情况后更换新鲜原代细胞培养基，约48小时后可进行传代或干预。将状态良好的原代细胞消化为细胞悬液，进行细胞计数。以4×105个/孔的密度接种于6孔板中，以105个/孔的密度接种于12孔板中，以104个/孔的密度接种于96孔板中，加入原代细胞培养基进行培养。待融合率达到70％-80％，分别加入10％空白组血清、10％空白血清+150mM D-gal，5％含药血清+D-gal、10％含药血清+D-gal、15％含药血清+D-gal，干预24小时。

2.2.3细胞活性检测

上述96孔板干预24小时后。将旧培养基吸出后使用对应培养基配置10％浓度的CCK-8工作液，每孔加入100μL工作液于培养箱放置孵育，每间隔15min使用多功能酶标仪于450nm处检测各孔吸光度，直至空白对照组吸光度约在1左右。

2.2.4SA-β-gal染色

上述12孔板干预24h后，弃去培养液用PBS清洗1次，每孔加入500μL染色固定液，室温固定20min，加入PBS在摇床60rpm转速下摇洗5min×3次。按照A：B：C：X＝1：1：93：5的比例配置染色工作液。每孔加入500μL染色工作液，在孔间缝隙中滴加适量PBS保湿，封口膜封板，包裹铝箔避光放置于37℃恒温箱过夜，次日弃去工作液换为PBS，使用光学显微镜观察并拍摄。

2.2.5原代肾小管上皮细胞蛋白表达

使用Western blot法检测衰老相关蛋白P21、P16、LaminB1、γH2Ax表达情况；纤维化相关蛋白COLⅠ、α-SMA表达情况；KAT7及炎症小体相关蛋白NLRP3、IL-1β表达情况。

对于原代肾小管上皮细胞的Western blot具体操作如下：弃去6孔板中的旧培养基，使用PBS清洗2次，加入150μL混合好的蛋白裂解液(RIPA：蛋白酶抑制剂混合液＝100：1)，置于冰上用摇床60rpm裂解15min，使用细胞刮刀刮下细胞，并用移液枪轻柔吹打，移入1.5mL EP管短暂涡旋，以50％功率超声8s+冰上冷却8s，重复5次。以12000rpm、4℃、15min进行离心，吸取上清液5μL用于蛋白浓度测定，其余上清加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，涡旋混匀，使用金属浴99℃变性10min，冷却后分装，置于-80℃储存备用。

使用制胶试剂盒配置适宜浓度的凝胶，根据蛋白浓度测定结果上样，恒压160V进行电泳，使用快速转膜液以400mA电流进行转膜，视目的蛋白分子量转膜10-50min。快速封闭液封闭15min，使用TBST清洗3min×3次，将膜放入对应一抗4℃孵育过夜。次日取出膜使用TBST清洗5min×2次+10min×2次。将膜放入对应种属二抗，室温孵育1小时，使用TBST清洗5min×2次+10min×2次，加入ECL化学显影液进行曝光。每个实验独立重复3次，使用Image J进行灰度值计算，使用Graph Pad Prism进行统计与作图。

2.2.6数据分析

使用Image J检测蛋白灰度值和处理图像，使用Image pro plus统计病理染色情况，使用Prism GraphPad 8.0分析统计数据并制作定量图。采用ANOVA单因素方差分析表示组间差异，采用LSD法表示两组间差异，采用表示计量资料，P＜0.05表明差异在统计学上有意义。

3.实验结果

3.1中药复方组合物在体内改善自然衰老小鼠肾脏衰老与纤维化

如图1和图2实验结果表明。HE染色显示4月龄小鼠肾脏中肾小管、肾小球形态完好；18月龄时小鼠出现炎症细胞浸润、肾小管上皮空泡化、肾小球萎缩等病理变化，在经过不同剂量中药复方组合物干预后明显减轻。

肾功能检测显示：血清肌酐、尿酸、尿素氮和尿液中尿蛋白水平在18月龄出现明显升高，经中药复方组合物干预后呈现不同程度的降低。

Masson染色显示，在18月龄小鼠肾脏中胶原沉积明显，中药复方组合物组呈现明显改善。天狼星红染色偏振光观察显示，青年组小鼠肾脏中呈现部分Ⅲ型胶原及少量Ⅰ型胶原，18月龄小鼠肾脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原大量沉积，Ⅳ型胶原也有增加，中药复方对Ⅰ型胶原有明显下调作用。Western blot显示显示青年组小鼠肾脏COLⅠ、α-SMA水平较低，18月龄中水平显著升高，中药复方组合物干预后表达水平下调。蛋白表达差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

肾脏SA-β-gal显示：18月龄小鼠肾脏出现大量蓝色阳性染色，经过中药复方组合物干预，衰老染色的阳性区域明显减少。Western blot显示：青年组肾脏LaminB1水平较高，而P21、P16、γH2Ax水平较低。18月龄中Lamin B1下降明显，而P21、P16、γH2Ax。中药复方组合物干预后以上衰老标志物蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

同时Western blot结果显示KAT7、NLRP3、IL-1β在18月龄组中表达提高，经过中药复方组合物干预后以上蛋白表达水平降低，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。

免疫荧光显示，在18月龄自然衰老小鼠肾脏中，代表KAT7表达的绿色荧光与代表lamin B1的红色荧光表达出现相反趋势。同时观察到中药干预降低KAT7的同时增加了肾脏Lamin B1的表达。

3.2中药复方组合物含药血清在体外改善原代肾小管上皮细胞衰老与纤维化

如图3的实验结果表明。细胞活性检测结果显示：与添加空白组血清与D-gal的模型组相比，添加含药血清可以不同程度地改善mPTCs细胞活性，其中10％含药血清改善最为明显，15％浓度时效果较10％有所降低。

SA-β-gal检测结果显示，使用空白血清培养的mPTCs细胞经D-gal干预后蓝绿色阳性染色增加，而给予不同浓度含药血清干预，阳性染色呈现不同程度地降低，其中5％、10％降低较为明显。

Western blot结果显示：中药复方组合物含药血清的干预可上调D-gal诱导的衰老mPTCs中Lamin B1蛋白表达水平，下调P21、P16、γH2Ax水平。且可以观察到COLⅠ、α-SMA的表达水平下调，这些变化的组间差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

在炎症小体调节方面的现象与体内实验相似。Western blot结果显示KAT7、NLRP3、IL-1β在复方含药血清干预后表达降低，本部分体内外的实验结果提示中药复方可抑制炎症小体的激活，从而改善衰老的肾脏功能和纤维化情况。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种具有延缓肾脏纤维化作用的中药复方组合物，其特征在于，它是由黄芪240~480g、黄蜀葵花240~480g、积雪草240~480g、丹参120~240g、甘草40~80g制成的提取物与虫草菌丝制成；所述的提取物与虫草菌丝的重量比为1:0.88~1；

所述的提取物是通过以下方法制备得到的：

取黄芪、黄蜀葵花、积雪草、丹参和甘草，加水浸没药材，先浸泡，煎煮提取，用纱布挤压药渣收集煎煮液，药渣再次加水煎煮，收集两次煎煮液，用纱布过滤，滤液旋转蒸发浓缩，预冷冻后使用真空冷冻干燥机处理，得到冻干粉。

2.根据权利要求1所述的具有延缓肾脏纤维化作用的中药复方组合物，其特征在于，它是由黄芪240g、黄蜀葵花240g、积雪草240g、丹参120g、甘草40g制成的提取物与虫草菌丝制成。

3.根据权利要求1所述的具有延缓肾脏纤维化作用的中药复方组合物，其特征在于，所述的提取物是通过以下方法制备得到的：

取黄芪、黄蜀葵花、积雪草、丹参和甘草，加药材重量5~15倍体积的水浸没药材，浸泡30~40min，煎煮提取30~60min，纱布挤压药渣收集煎煮液，药渣再次加5~15倍体积的水煎煮30~60min，收集两次煎煮液，用纱布过滤，滤液旋转蒸发浓缩，于-80℃预冷冻24h后使用真空冷冻干燥机处理72h，得到冻干粉。

4.一种具有延缓肾脏纤维化作用的中药制剂，其特征在于，将权利要求1~3任一项所述的中药复方组合物与药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、合剂、膏剂。

5.权利要求1~3任一项所述的中药复方组合物在制备治疗肾纤维化的药物中的应用。