CN117568335A - 一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HRP‑生物素双修饰的ssDNA reporter及其应用，涉及生物检测技术领域，所述HRP‑生物素双修饰的ssDNA reporter是采用点击化学方式将DBCO‑生物素双修饰的ssDNA reporter和HRP进行偶联所得。本发明通过对reporter进行HRP偶联，达到了CRISPR/Cas检测系统的信号输出放大的效果。同时，提供一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，能够简便、快速、无需核酸预扩增、结果可视化且无需特殊或昂贵设备对核酸靶标进行快速检测，并以狼牙病毒核酸为例，实现了临场条件下肉眼检测，可应用于如狼牙病毒等检测产品的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种HRP-生物素双修饰的ssDNAreporter及其应用。
背景技术
目前，作为基因组编辑的重要工具，CRISPR/Cas系统具有靶序列特异性识别功能。某些Cas同源物如Cas13和Cas12a在目标序列特异性的识别后还会激活非特异性的内切酶活性(trans活性)。更重要的是，作为一种可编程核酸酶，CRISPR/Cas12a的靶标特异性可以通过简单调整其反应体系中gRNA的序列来实现。本质上来说CRISPR/Cas12a反应天然本质上可以选择针对任意核酸序列。基于这一原理，CRISPR/Cas系统已经广泛应用于核酸检测。在早期开发的平台(如DETECTR和SHERLOCK)中，等温扩增技术与CRISPR/Cas12a、Cas13a和Cas14的结合不仅有助于在阿托摩尔水平(aM)上高度敏感地检测目标序列，还允许对这些目标序列中的基因型和单核苷酸多态性(SNP)进行区分。近年来，CRISPR/Cas系统已广泛用于开发高灵敏度的检测方法，针对各种目标，如寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)、SARS-CoV-2、非洲猪瘟病毒(ASFV)等。然而，在上述CRISPR/Cas检测方法中实现高灵敏度需要进行靶标序列的预扩增步骤。这不仅延长了检测时间线，还引入了大量意外的靶标序列，类似于前面提到的PCR方法，因此存在气溶胶污染的风险。
辣根过氧化物酶(HRP)能够高效催化其底物的降解反应，从而产生颜色或荧光反应。这种颜色或荧光的强度与反应中存在的HRP的数量高度相关。这一特性使得HRP广泛用于生物实验结果的输出，甚至用于ELISA和Western blotting等测定中的抗原或蛋白质的定量分析。此前已有利用HRP放大Cas13a反应结果的报道。但在该报道中，HRP被通过reporter偶联于磁珠，经Cas13a切割后，HRP被释放于Cas反应溶液中，通过向Cas反应溶液中加入HRP的底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)产生颜色反应。但这一方法对结果的放大效应十分有限，当不加预扩增环节时，该检测方法的灵敏度有限。
狼牙病毒(LayV)属于亨尼帕病毒(henipaviruses)，这类病毒中比较有名的包括亨德拉病毒和尼帕病毒。目前针对亨尼帕病毒的核酸检测方法主要包括病毒分离、免疫学方法和核酸检测方法。其中，病毒分离是病毒检测的金标准。但这种方法费时费力，且对于高致病性病原，病毒分离需在BSL-4实验室(生物安全四级实验室)进行；免疫学方法中的ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA，酶联免疫吸附试验)曾在亨德拉病毒和尼帕病毒大流行中被广泛应用，但ELISA方法灵敏度欠佳；PCR(聚合酶链式反应)一类基于核酸扩增的检测方法具有高度的灵敏度和特异性，是目前最常用的方法。但PCR方法需要精密且昂贵的温度循环设备(PCR仪)，难以在不同实验条件的地区广泛推广。并且PCR这类基于核酸扩增的方法极易造成实验环境中目标核酸片段的气溶胶污染，对后续的检测造成假阳性结果。同时，现有的核酸检测方法也仅限于亨尼帕病毒的其他成员，并无狼牙病毒的特异性核酸诊断方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter及其应用。
第一方面，本发明提供了一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter是采用点击化学方式将DBCO-生物素双修饰的ssDNAreporter和HRP进行偶联所得。
第二方面，本发明提供了第一方面HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter在制备CRISPR/Cas检测系统中的应用，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter起到CRISPR/Cas检测系统的信号输出放大的作用。
进一步地，所述CRISPR/Cas检测系统不进行核酸预扩增环节。
第三方面，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系包括Cas12a反应体系、HRP修饰reporter及其包被的反应器皿和显色试剂；
所述HRP修饰reporter包被反应器皿是通过亲和素包被的反应器皿和HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter通过生物素-亲和素系统特异性结合所得；
所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter是采用点击化学方式将DBCO-生物素双修饰的ssDNA reporter和HRP进行偶联所得。
进一步地，所述Cas12a反应体系包括以下组分：如NEBuffer 2.1(10X)等反应缓冲液、Cas12a蛋白质、gRNA、二硫苏糖醇和ddH2O。
进一步地，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter的制备方法包括以下步骤：
将HRP溶解于碳酸氢钠溶液中，得到HRP溶液；
将Azido-PEG-NHS Ester加入所述HRP溶液中进行室温搅拌反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到azide修饰的HRP；
将所述azide修饰的HRP和DBCO-生物素双修饰的ssDNA reporter进行室温摇动反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter。
进一步地，所述亲和素包被的反应器皿包括亲和素包被的96孔板。
进一步地，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等，所述显色试剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
进一步地，所述HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用病原微生物检测时，无需进行核酸预扩增环节。
第四方面，本发明提供了第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系在制备病毒检测产品中的应用，所述病毒包括狼牙病毒、寨卡病毒、登革病毒、SARS-CoV-2和非洲猪瘟病毒。
第五方面，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的生物传感器，所述用于目标核酸片段检测的生物传感器包括第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
第六方面，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的试剂盒，所述用于目标核酸片段检测的试剂盒包括第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
第七方面，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的方法，所述检测方法采用第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：
1、本发明提供了一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter及其应用，通过对reporter进行HRP偶联，达到了CRISPR/Cas检测系统的信号输出放大的效果。具体来说：
CRISPR/Cas系统特异性识别靶序列的原理在于：gRNA是根据靶序列特别设计的一段约20nt、能够与靶序列通过碱基互补原则特异性结合的RNA片段，在gRNA的引导下，Cas酶与gRNA所形成的RNP能够特异性的识别靶序列，并在结合了靶序列之后进一步激活trans酶切活性。CRISPR/Cas系统作为检测工具时的通用性也是基于此原理。当需要变更检测靶标时，只需要将系统中的gRNA根据靶序列重新设计合成即可，这种灵活性是Cas酶的固有性质，也是CRISPR/Cas用于核酸检测时的一大优势。通过设计不同的gRNA序列，CRISPR/Cas系统已被应用于多种核酸靶标序列的特异性检测。且作为一种可编程核酸酶，CRISPR/Cas12a的靶标特异性可以通过简单调整其反应体系中gRNA的序列来实现，CRISPR/Cas12a反应天然本质上可以针对任意核酸序列，用于任意核酸靶标检测。
本发明并没有改变上述的Cas酶这一特性，只是在信号输出端，通过对reporter进行HRP偶联，达到了信号放大输出的效果。因而，其通用性与普通的CRISPR/Cas系统一致。后续本发明提供另外多种靶标的检测结果，以进一步证实此次设计的HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter应用于CRISPR/Cas系统时，它们对于检测不同靶标的通用性。
2、基于上述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，建立了一种能够简便、快速、无需核酸预扩增、结果可视化且无需特殊或昂贵设备的狼牙病毒核酸快速检测体系，可应用于如狼牙病毒等检测产品的制备。具体来说，本发明提供的用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系具有如下特点：
1)操作简单，无需昂贵设备：本检测方法的实施仅需要基本的核酸提取相关设备及酶标仪，操作简便。
2)无需核酸扩增，不会造成气溶胶污染：现有的高灵敏度核酸检测方法均基于核酸扩增原理(如PCR类方法)，对目标序列长期进行大量扩增难免会对实验环境造成目标片段的气溶胶污染，进而在日后的核酸检测中造成假阳性结果。本方法通过放大输出信号的思路，不需要进行核酸的扩增即可检测样本中低浓度的目标核酸片段。
3)结果可通过肉眼定性观察，也可通过酶标仪读取：采用HRP作为信号输出，可将结果可视化。当样本中含有高浓度目标片段，仅凭肉眼即可判断实验结果，配合简单的吸光值读取设备(如酶标仪)也可更加客观的通过数值判断检测结果。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系的检测原理图。
图2为本发明实施例中采用用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系的操作流程图。
图3为本发明实施例中亲和素与生物素修饰的HRP-reporter摩尔比研究结果。
图4为本发明实施例中用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用于琅琊病毒检测的特异性研究结果。
图5为本发明实施例中用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用于琅琊病毒检测的灵敏度研究结果。
图6为本发明实施例中用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用于甲型流感病毒H1N1亚型毒株的NP基因检测的研究结果。
图7为本发明实施例中用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用于甲型流感病毒H3N2亚型毒株的NP基因检测的研究结果。
图8为本发明实施例中用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用于牙龈卟啉单胞菌16s基因检测的研究结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
第一方面，本发明提供了一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter，所述HRP-生物素双修饰的ssDNAreporter是采用点击化学方式将DBCO-生物素双修饰的ssDNA和HRP进行偶联所得。
第二方面，基于同一个发明构思，本发明提供了第一方面HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter在制备CRISPR/Cas检测系统中的应用，所述HRP-生物素双修饰的ssDNAreporter起到CRISPR/Cas检测系统的信号输出放大的作用。
在一些具体实施例中，所述CRISPR/Cas检测系统可不进行核酸预扩增环节。
第三方面，基于同一个发明构思，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系包括Cas12a反应体系、HRP修饰reporter包被器皿和显色试剂；
所述HRP修饰reporter包被器皿是通过亲和素包被的反应器皿和HRP-生物素双修饰的ssDNAreporter通过生物素-亲和素系统特异性结合所得；
所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter是采用点击化学方式将DBCO-生物素双修饰的ssDNA和HRP进行偶联所得。
Cas12a可在引导RNA(gRNA)的引导下特异性识别目标序列，进而激活非特异性(trans)的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)内切酶活性。辣根过氧化物酶(HRP)对其底物具有高效的降解活性，其底物降解后可产生颜色或荧光反应；并且这种颜色或荧光的强度与反应中HRP的量高度相关，这一特性已被广泛应用于各类分子生物学实验的抗原或蛋白定量分析中。申请人发现Cas反应体系对于HRP降解底物的活性有显著的抑制作用，这可能是此前类似方法灵敏度低的原因。
本专利将HRP与Cas12a技术相结合建立了一种能够简便、快速、无需核酸预扩增、结果可视化且无需特殊或昂贵设备的狼牙病毒核酸快速检测技术。如图1所示，本技术的原理：通过点击化学手段将ssDNA reporter与HRP相偶联，随后固定于如96孔板等器皿；随后将含或不含有目标序列的Cas12a反应溶液加到96孔板；此时当样品中含有靶标序列(如：狼牙病毒核酸)时，Cas12a的trans活性被激活，进而切割固定于孔内的HRP修饰的ssDNAreporter，减少孔内的HRP数量，随后通过洗板的步骤移除孔内被切下游离的HRP及残余Cas12a反应溶液，以消除Cas反应体系对HRP酶活性的抑制，再向孔中加入HRP的底物TMB进行显色，通过检测显色后的OD450nm或直接通过肉眼观察空中颜色与阴性对照的颜色深度判断样品中是否含有狼牙病毒核酸。同时，本专利通过固定HRP修饰reporter，规避了Cas反应体系对HRP酶活的抑制作用，从而解决了现有技术中存在灵敏度低等问题。
在一些具体实施例中，所述Cas12a反应体系包括以下组分：NEBuffer 2.1(10X)缓冲液、Cas12a蛋白质、gRNA、二硫苏糖醇和ddH2O。
在一些具体实施例中，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter的制备方法包括以下步骤：
将HRP溶解于碳酸氢钠溶液中，得到HRP溶液；
将Azido-PEG-NHS Ester加入所述HRP溶液中进行室温搅拌反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到azide修饰的HRP；
将所述azide修饰的HRP和DBCO-生物素双修饰的ssDNA进行室温摇动反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter。
在一些具体实施例中，所述亲和素包被的反应器皿包括亲和素包被的96孔板。
在一些具体实施例中，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等，所述显色试剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
第四方面，基于同一个发明构思，本发明提供了第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系在制备病毒检测产品中的应用，所述病毒包括狼牙病毒、寨卡病毒、登革病毒、SARS-CoV-2和非洲猪瘟病毒。
第五方面，基于同一个发明构思，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的生物传感器，所述用于目标核酸片段检测的生物传感器包括第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
第六方面，基于同一个发明构思，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的试剂盒，所述用于目标核酸片段检测的试剂盒包括第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
第七方面，基于同一个发明构思，本发明提供了一种用于目标核酸片段检测的方法，所述检测方法采用第一方面任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
综上所述，本发明提供了一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter的制备方法及其应用，同时基于上述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter，提供了一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，建立了一种能够简便、快速、无需核酸预扩增、结果可视化且无需特殊或昂贵设备的核酸快速检测体系，可应用于如狼牙病毒等检测产品的制备。具体来说，本发明提供的用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系具有如下特点：
1)操作简单，无需昂贵设备：本检测方法的实施仅需要基本的核酸提取相关设备及酶标仪，操作简便。
2)无需核酸扩增，不会造成气溶胶污染：现有的高灵敏度核酸检测方法均基于核酸扩增原理(如PCR类方法)，对目标序列长期进行大量扩增难免会对实验环境造成目标片段的气溶胶污染，进而在日后的核酸检测中造成假阳性结果。本方法通过Cas12a反式酶切加HRP放大输出信号的思路，不需要进行核酸的扩增即可检测样本中低浓度的目标核酸片段。
3)结果可通过肉眼定性观察，也可通过酶标仪读取：采用HRP作为信号输出，可将结果可视化。当样本中含有高浓度目标片段，仅凭肉眼即可判断实验结果，配合简单的吸光值读取设备(如酶标仪)也可更加客观的通过数值判断检测结果。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
本例提供一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，并进一步将其应用于狼牙病毒检测，考察其检测狼牙病毒的特异性和灵敏度，建立并应用用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系的操作流程图如图2所示。
1、材料方法
反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测法：使用Primer Premier 6软件设计PCR引物。PCR反应混合物的成分包括12.5μL 2×M5 Pfu PCRMasterMix、每种引物10pmol、1μLcDNA作为模板，以及双蒸馏水(ddH2O)，总反应体积为25μL。PCR循环参数包括在94℃下进行5分钟的初始变性步骤，然后进行32个周期的94℃变性50秒，退火50秒，延伸步骤在72℃，持续时间根据产物大小而变化，介于10到30秒之间，最后进行72℃的最终延伸步骤，持续10分钟。
2、HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter的合成
0.05μmol的HRP溶解在1mL的0.1M NaHCO3中，制备为50μM的HRP溶液。随后，将50mmol的azido-PEG4-NHS ester加入溶液，在室温下与HRP反应2小时。充分反应后，将azide修饰的HRP通过30kDa MWCO离心过滤器进行三次洗涤(4,000rcf离心5分钟)。随后，将200μL的10μM azide修饰HRP与2nmol的DBCO-生物素双修饰的ssDNA reporter(市售产品，购自委托北京擎科生物科技股份有限公司)混合，室温摇动反应15小时，形成HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter。将HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter通过30kDa MWCO离心过滤器进行三次洗涤(4,000rcf离心5分钟)。
3、HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系的建立与应用
3.1、首先，制备HRP-reporter包被板。使用0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，将亲和素制备为1ng/μL溶液。将亲和素溶液加入到高亲合力96孔板中，每孔100μL，并在4℃孵育过夜。然后，弃去孔中液体，使用0.02M PBS含0.05％(v/v)Tween-20进行充分冲洗，每次每孔加入200μL，每次持续5分钟。随后，使用2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液，每孔加入100μL，室温孵育2小时，封闭。弃去孔中液体，然后按照上述相同的步骤进行三次冲洗。随后，将与亲和素相应的0到5倍摩尔量的HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter加入每个孔中，板在室温下孵育2小时，允许HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter上的生物素充分结合到孔内固定的亲和素上。孵育后，弃去孔中液体，并冲洗三次。制备好的HRP-reporter包被板存放在4℃以备后续使用。
用于此步骤的Cas12a反应体系包括以下成分：10μL的10×NEB 2.1缓冲液，6pmol的Cas12a蛋白质，6pmol的gRNA，1μmol的DTT，可变量的靶标核酸片段，以及必要量的ddH2O以达到总体积为100μL。混合均匀后，将混合物转移到HRP-reporter包被板。室温下孵育30分钟，促使RNP复合物对孔内固定的HRP-reporter进行切割。孵育后，弃去孔中液体并冲洗三次。随后每孔加入50μL的TMB底物，并在37℃下反应15分钟。随后，向每个孔中加入50μL的2M H2SO4以终止反应。使用ELISA读数器定量测量OD450nm。
3.2、考察HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系的特异性和灵敏度
在特异性评估中，本发明使用了六种其他的Paramyxoviruses的N基因以其他三种不同病毒的cDNA，来评估本发明开发的检测方法。
灵敏度研究中，鉴于实际的LayV基因组由RNA构成，本发明通过体外转录过程合成了目标RNA片段：包含目标片段的DNA序列合成于T7启动子序列的下游。随后，使用HiScribeTMT7 High Yield RNA Synthesis Kit进行体外转录。RNA的浓度通过Qubit 4荧光仪进行定量。随后，目标RNA经过10倍梯度稀释。使用PrimeScriptTMRT试剂盒将不同浓度的目标RNA逆转录成cDNA，然后在随后的Cas反应或PCR检测中使用。
3.3、实验结果
HRP-reporter包被板的制备：理论上，一个亲和素可结合4个HRP-、生物素-双修饰reporter，但实际情况中由于空间位阻的影响，亲和素与HRP-、生物素-双修饰reporter实际结合的摩尔比尚需探索。结果如图3显示，实际包被于96孔板的亲和素最多可结合3个HRP-、生物素-双修饰reporter。
特异性实验结果：为检验HRP-Cas检测方法的特异性，本发明合成了Mojiangvirus(MojV)、Cedar virus(CedV)、Hendra virus(HeV)、Nipah virus(NiV)、Daeryongvirus(DARV)、Gamak virus(GAKV)的N基因，同时还使用了Human Respiratory SyncytialVirus(RSV)、influenza Avirus(IAV)H1N1和H3N2毒株的cDNA来检验特异性。结果显示，HRP-Cas反应能够特异地对LayV核酸片段产生阳性信号，对于其他不相关病毒无非特异性反应(如图4所示)。
灵敏度实验结果：本发明使用了10倍梯度稀释RNA检验HRP-Cas检测方法的灵敏度。结果显示，本方法最低可检测到1+E4拷贝LayV N基因片段，与RT-PCR相比，灵敏度高100倍，如图5所示，图5中：(A)为HRP-Cas反应灵敏度研究；(B)为RT-PCT检测方法。
另外，在上述狼牙病毒检测的实验基础上，为了验证本专利中HRP-Cas12a系统的通用性，本发明通过针对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)H1N1和H3N2亚型毒株的NP基因及牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,PG)16s基因设计gRNA序列，并将原HRP-Cas12a系统中的针对狼牙病毒N基因的gRNA进行替换，建立了IAV H1N1、H3N2及PG的核酸检测方法。检测结果证明，HRP-Cas12a系统可用于这三种病原的核酸检测；并且，通过简单的gRNA重新设计和替换，HRP-Cas12a系统可简便的切换检测靶标，检测结果如图6、图7和图8所示。
本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter，其特征在于，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter是采用点击化学方式将DBCO-生物素双修饰的ssDNA reporter和HRP进行偶联所得。
2.权利要求1所述的HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter在制备CRISPR/Cas检测系统中的应用，其特征在于，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter起到CRISPR/Cas检测系统的信号输出放大的作用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas检测系统不进行核酸预扩增环节。
4.一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系包括Cas12a反应体系、HRP修饰reporter包被反应器皿和显色试剂；
所述HRP修饰reporter包被反应器皿是通过亲和素包被的反应器皿和HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter通过生物素-亲和素系统特异性结合所得；
所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter是采用点击化学方式将DBCO-生物素双修饰的ssDNA reporter和HRP进行偶联所得。
5.权利要求4所述的用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述Cas12a反应体系包括以下组分：反应缓冲液、Cas12a蛋白质、gRNA、二硫苏糖醇和ddH2O；
所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter的制备方法包括以下步骤：
将HRP溶解于碳酸氢钠溶液中，得到HRP溶液；
将Azido-PEG-NHS Ester加入所述HRP溶液中进行室温搅拌反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到azide修饰的HRP；
将所述azide修饰的HRP和DBCO-生物素双修饰的ssDNA进行室温摇动反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter；
所述亲和素包被的反应器皿包括亲和素包被的96孔板；
所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等；
所述显色试剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
6.权利要求4所述的用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用病原微生物检测时，无需进行核酸预扩增环节。
7.权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系在制备病原微生物检测产品中的应用。
8.一种用于目标核酸片段检测的生物传感器，其特征在于，所述用于目标核酸片段检测的生物传感器包括权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系。
9.一种用于目标核酸片段检测的试剂盒，其特征在于，所述用于目标核酸片段检测的试剂盒包括权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系。
10.一种用于目标核酸片段检测的方法，其特征在于，所述检测方法采用权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系。
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| CN202311493980.9A Pending CN117568335A (zh) | 2023-11-08 | 2023-11-08 | 一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117568335A (zh) |
-
2023
- 2023-11-08 CN CN202311493980.9A patent/CN117568335A/zh active Pending
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