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CN117402799A - 重组细胞、重组细胞的制备方法以及异戊二烯或萜烯的生产方法 - Google Patents

重组细胞、重组细胞的制备方法以及异戊二烯或萜烯的生产方法 Download PDF

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CN117402799A
CN117402799A CN202311078808.7A CN202311078808A CN117402799A CN 117402799 A CN117402799 A CN 117402799A CN 202311078808 A CN202311078808 A CN 202311078808A CN 117402799 A CN117402799 A CN 117402799A
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recombinant cell
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松岛加奈
古谷昌弘
川端一史
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Sekisui Chemical Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种能够生产异戊二烯或萜烯的重组细胞，其具有通过甲羟戊酸途径(MVA途径)合成异戊烯二磷酸的能力，缺失了通过内源性非甲羟戊酸途径(MEP途径)合成异戊烯二磷酸的能力，具有异戊二烯合成酶基因或萜烯合成酶基因作为外源基因，并且能够表达上述外源基因而生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜烯。上述甲羟戊酸途径优选是外源性甲羟戊酸途径。

Description

重组细胞、重组细胞的制备方法以及异戊二烯或萜烯的生产 方法
本申请是中国申请号为201880011204.1、发明名称为“重组细胞、重组细胞的制备方法以及异戊二烯或萜烯的生产方法”且申请日为2018年2月14日的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及重组细胞、重组细胞的制备方法以及异戊二烯或萜烯的生产方法。本发明的重组细胞稳定地保持了通过甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，并且具有高的异戊二烯或萜烯的生产性。
背景技术
异戊二烯是合成聚异戊二烯的单体原料，特别是在轮胎工业中是重要的材料。另一方面，萜烯是以碳原子数为5的异戊二烯作为构成单元的烃，并且是由植物、昆虫、菌类等产生出的一组生物体物质。异戊二烯以及萜烯用于树脂原料、香料原料、食品添加剂、洗涤剂、电子材料、医药和农药原料等的所有领域，并且是作为工业材料必不可少的物质。
由于异戊二烯主要作为石脑油或乙烯生产的石油裂解的副产物而通过石化工艺进行生产，因此对于将来的需求而言，原料的可持续性存在危险。此外，由于许多有用的萜烯是从植物或其精油等天然的原料中提取·纯化而得的，因此难以大量获得。虽然也尝试了化学合成，但是具有复杂结构的萜烯的合成需要极大的成本和劳动力。因此，异戊二烯或萜烯的已有的生产方法中存在许多的问题。
近年来，在各种物质生产领域中，利用了微生物等并且通过生物技术而向新的生产工艺的转换技术的开发和实用化正在稳步发展。关于异戊二烯或萜烯，例如，已知使用糖作为原料的重组大肠杆菌的生产技术(例如，专利文献1、2)。然而，这些全部被限制为少量的连续生产或通过诱导表达系统的瞬时生产，从未有过可以进行恒定的大规模生产的例子。因此，特别是在该技术领域中，需要能够实现稳定大规模生产的新技术。需要说明的是，作为通过大肠杆菌以外的微生物(重组体)的异戊二烯的生产技术，例如存在专利文献3、4中记载的那些。
就通过微生物(重组体)生产异戊二烯或萜烯而言，在微生物中大量合成构成其前体的异戊烯二磷酸(IPP)和构成其异构体的二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)是必要的。IPP能够通过两种不同的代谢途径合成，即甲羟戊酸途径(MVA途径)和非甲羟戊酸途径(MEP途径)。甲羟戊酸途径存在于真核细胞的细胞质、一部分的放线菌或古细菌中。非甲羟戊酸途径存在于细菌或植物的叶绿体等中。
甲羟戊酸途径(MVA途径)使用乙酰CoA作为起始材料。作为在甲羟戊酸途径中起作用的酶，从上游起依次可举出：乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
另一方面，非甲羟戊酸途径(MEP途径)使用甘油醛3-磷酸和丙酮酸作为起始材料。作为在非甲羟戊酸途径中起作用的酶，从上游起依次可举出：DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶以及HMB-PP还原酶。
在使用大肠杆菌等细菌生产异戊二烯或萜烯时，可以认为，除了内源性MEP途径之外，还可以通过导入在能量上占优势的外源MVA途径来进行更有效的前体合成。即，由于内源性MEP途径受到多重且精密的控制，其改变是非常困难的，难以改变内源性MEP途径而实现作为前体的IPP的大规模合成。因此，为了大量获得异戊二烯、萜烯等目标产物，优选利用MVA途径进行前体合成能力的提高。
然而，当向宿主中导入外源MVA途径时，随着通过MVA途径的前体合成效率的提高，生物合成途径中的中间代谢物引起的细胞毒性不容忽视。因此，在已导入外源MVA途径的宿主中，为了避免这些毒性物质的积蓄，能积极地接受MVA途径的基因中发生突变并丧失了功能的基因。其结果，在导入外源MVA途径并生长而得的克隆中，丧失MVA途径的活性并且依赖于内源性MEP途径活性的克隆具有优势。可以认为，这种现象是阻碍获得稳定的高生产异戊二烯或萜烯的菌株的重要因素之一。因此，为了通过微生物而提高异戊二烯、萜烯等目标产物的生产量，有必要获得不依赖于MEP途径并且具有通过MVA途径的稳定的IPP合成能力的克隆，并且提高通过MVA途径的前体合成能力。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]日本特表2011-505841号公报
[专利文献2]日本特表2011-518564号公报
[专利文献3]国际公开第2014/065271号
[专利文献4]国际公开第2014/104202号
发明内容
发明所解决的技术问题
为了实现上述目的，例如，期望利用缺失了通过内源性MEP途径合成IPP的能力并且仅通过MVA途径合成IPP而生长的微生物。然而，具有这种特征(基因型)的生产异戊二烯或萜烯的微生物(重组体)仍是未知的，并且使用了该微生物来生产异戊二烯或萜烯的方法也是未知的。
因此，本发明的目的是提供能够稳定地大量生产异戊二烯或萜烯的重组细胞，以及使用该重组细胞来生产异戊二烯或萜烯的方法。
解决问题的技术手段
本发明的一个实施方式是一种重组细胞，其能够生产异戊二烯或萜烯，所述重组细胞具有通过甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，其中，选自DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶以及HMB-PP还原酶中的至少一种内源性酶的活性发生了缺失，从而缺失了通过内源性非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，上述重组细胞具有编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码二萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因或编码八氢番茄红素合成酶的基因，作为第一外源基因，表达上述第一外源基因，能够生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜烯。
上述甲羟戊酸途径优选是外源性甲羟戊酸途径。
通过上述外源性甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力优选是通过下述基因实现的：编码选自乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中的至少一种酶的第二外源基因。
上述重组细胞优选是细菌。
上述重组细胞优选是古细菌。
上述重组细胞，优选能够用选自一氧化碳和二氧化碳中的至少一种作为唯一碳源进行增殖。
上述重组细胞，优选具有由甲基四氢叶酸或甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及CoA来合成乙酰CoA的功能。
上述重组细胞，优选是梭菌属(Clostridium)细菌或穆尔氏菌属(Moorella)细菌。
上述重组细胞，优选是属于甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球菌(Methanococcus)或甲烷热球菌属(Methanothermococc)的古细菌。
上述重组细胞，优选能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛以及甲酰胺中的至少一种C1化合物来生产异戊二烯或萜烯。
上述重组细胞，优选具有选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径以及木酮糖单磷酸途径中的至少一种C1碳同化途径，作为甲醛的固定化途径。
上述重组细胞，优选属于Methylacidphilum属、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基胞囊菌属(Methylocystis)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基胞菌属(Methylocella)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆状菌属(Methylobacter)、甲基小杆菌属(Methylobacillus)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基娇养杆菌属(Methylotenera)、食甲基菌属(Methylovorus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、噬甲基菌属(Methylophaga)、嗜甲基菌属(Methylophilaceae)、甲基营养菌属(Methyloversatilis)。
上述重组细胞，优选属于甲烷球形菌(Methanosphaera)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷叶菌属(Methanolobus)、甲烷类球菌属(Methanococcoides)、甲烷嗜盐菌(Methanohalophilus)、甲烷盐菌属(Methanohalobium)。
本发明的另一个实施方式是一种上述重组细胞的制备方法，其包含下述工序：第一工序，提供具有通过非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力的宿主细胞；第二工序，使上述宿主细胞所具有的通过非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力缺失；第三工序，向上述宿主细胞中导入编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码二萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因或编码八氢番茄红素合成酶的基因，作为第一外源基因。
上述重组细胞的制备方法，优选其还包含下述工序：第四工序，向上述宿主细胞中导入编码选自下述酶组中的至少一种酶的基因作为第二外源基因，并赋予通过该甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，上述酶组为在甲羟戊酸途径中起作用的酶组，即乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
本发明的另一个实施方式是一种异戊二烯或萜烯的生产方法，其中，上述重组细胞或通过上述重组细胞的制备方法而制得的重组细胞，与选自一氧化碳、二氧化碳、甲酸、甲烷、甲醇、甲胺、甲醛以及甲酰胺中的至少一种C1化合物接触，在上述重组细胞中由上述C1化合物生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜烯。
上述异戊二烯或萜烯的生产方法优选包含下述工序：使用选自一氧化碳、二氧化碳、甲酸、甲烷、甲醇、甲胺、甲醛以及甲酰胺中的至少一种C1化合物作为碳源对上述重组细胞进行培养，并从其培养物中得到异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜烯。
发明效果
根据本发明，可以稳定地进行使用了重组细胞的异戊二烯或萜烯的生产。
附图说明
[图1]是表示质粒pUC-Δdxr-ermC的构成的说明图。
[图2]是表示质粒pSK1(LbMVA-ISPS)的构成的说明图。
具体实施方式
在下文中，将对本发明的实施方式进行说明。需要说明的是，在本发明中，术语“基因”全部可以用术语“核酸”或“DNA”代替。
本发明的重组细胞是能够生产异戊二烯或萜烯的重组细胞，其具有通过甲羟戊酸途径(MVA途径)合成异戊烯二磷酸的能力，缺失了通过内源性非甲羟戊酸途径(MEP途径)合成异戊烯二磷酸的能力。此外，本发明的重组细胞编码具有编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码二萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因或编码八氢番茄红素合成酶的基因，作为外源基因(第一外源基因)。
<甲羟戊酸途径>
如上所述，甲羟戊酸途径(MVA途径)是使用乙酰CoA作为起始材料的异戊烯二磷酸(IPP)的生物合成途径。在甲羟戊酸途径中起作用的酶，从上游起依次可举出：乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
本发明的重组细胞具有通过MVA途径合成异戊烯二磷酸(IPP)的能力。
本发明的重组细胞具有的MVA途径中，包含宿主细胞固有的内源性MVA途径和从外源向宿主细胞导入的MVA途径。当宿主细胞是仅具有非甲羟戊酸途径(MEP途径)作为IPP合成途径的宿主细胞(例如，细菌等原核生物)时，上述MVA途径是外源性的。另一方面，当宿主细胞具有MEP途径和MVA途径两者作为IPP合成途径时，上述MVA途径可以是内源性或外源性中的任意一者或者两者。
当向宿主细胞中导入外源性MVA途径时，将编码在甲羟戊酸途径中起作用的酶的基因，例如编码选自乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶等中的酶的基因(第二外源基因)导入宿主中，并且使其表达。导入的酶基因，只要其保持通过MVA途径合成IPP的能力，则可以是上述任意一种酶基因或多种酶基因。
作为外源性MVA途径的来源，例如上述酶组(乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)的来源，例如可举出来源于真核生物。需要说明的是，全部的真核生物都具有MVA途径。
然而，在真核生物以外的生物中也发现了MVA途径。作为具有MVA途径的上述微生物，在放线菌中可举出：链霉菌属菌株(Streptomyces sp.Strain)CL190(Takagi M.etal.,J.Bacteriol.2000,182(15),4153-7)、灰色孢链霉菌(Streptomycesgriseolosporeus)MF730-N6(Hamano Y.et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.2001,65(7),1627-35)。
此外，在细菌中可举出：瑞士乳杆菌(Lactobacillus helvecticus)(SmedsAetal.,DNA seq.2001,12(3),187-190)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NCC533、无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)、海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、橙黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)等(LombardJ.et al.,Mol.Biol.Evol.2010,28(1),87-99)。
此外，在古细菌中可举出：气火菌属(Aeropyrum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、脱硫古球菌属(Desulfurococcus)、热变形菌属(Thermoproteus)、阳光杆菌属(Halobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、热球菌属(Thermococcus)、热火球古菌属(Pyrococcus)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、热原体属(Thermoplasma)等(Lombard J.etal.,Mol.Biol.Evol.2010,28(1),87-99)。
在本发明中，这些来源于放线菌、细菌或古细菌的MVA途径可以用作外源性MVA途径。
<非甲羟戊酸途径>
非甲羟戊酸途径(MEP途径)是异戊烯基二磷酸(IPP)的生物合成途径，其中，使用甘油醛3-磷酸和丙酮酸作为起始材料。作为在非甲羟戊酸途径中起作用的酶，从上游起依次可举出：DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶以及HMB-PP还原酶。
本发明的重组细胞缺失了通过内源性MEP途径合成异戊烯二磷酸(IPP)的能力。具体而言，上述选自DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶以及HMB-PP还原酶中的至少一种内源性酶的活性发生了缺失，其结果，缺失了通过内源性MEP途径合成IPP的能力。
作为缺失了这些酶的活性的实施方式，例如可举出：缺失了编码酶的结构基因的一部分或全部、在结构基因中产生移码等突变等实施方式。其他实施方式可举出：由于控制酶基因的启动子的突变或核糖体结合区域的突变等，而不能正常进行酶的表达的实施方式。作为突变处理，可举出：通过放射线照射或使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等变异剂的处理等。
缺失了活性的酶是DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶以及HMB-PP还原酶中的任意一种或多种。
在优选的实施方式中，缺失了DOXP还原异构酶和HMB-PP合成酶中的至少一种或两种。
<宿主细胞>
作为本发明的重组细胞所基于的宿主细胞，可以是具有MEP途径的宿主细胞，例如可举出细菌。此外，一部分古细菌也是候选者。此外，从可资化碳源的观点出发，作为所谓的合成气利用性微生物或甲醇利用性微生物(甲基营养菌等)并且具有MEP途径的微生物是宿主细胞的候选者。
<合成气利用性微生物>
合成气(Synthesis gas,Syngas)是由一氧化碳、二氧化碳以及氢作为主要成分的混合气体，其可以通过金属催化剂的作用在高温·高压下从废弃物、天然气以及煤中有效地获得。
在本发明的重组细胞的一个实施方式中，重组细胞能够用选自一氧化碳和二氧化碳中的至少一种作为唯一碳源进行增殖。此外，其优选具有由甲基四氢叶酸或甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及CoA来合成乙酰CoA的功能。通过具有这些性质，本发明的重组细胞例如可以利用合成气来生产异戊二烯或萜烯。作为这类细胞(微生物)的实例，可举出：具有还原型乙酰CoA途径(Wood-Ljungdahl pathway)和甲醇途径(Methanol pathway)的厌氧性微生物。
作为该厌氧性微生物的代表性实例，可举出：杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、Clostridium autoethanogenum、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、Clostridium ragsdalei(Kopke M.et al.,Appl.Environ.Microbiol.2011,77(15),5467-5475)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)(与Clostridium thermoaceticum相同)(Pierce EG.Et al.,Environ.Microbiol.2008,10,2550-2573)等的梭菌属(Clostridium)细菌或穆尔氏菌属(Moorella)细菌。特别是，梭菌属(Clostridium)细菌已经确立了宿主-载体系统或培养方法，并且适合作为本发明的宿主细胞。
作为除梭菌属(Clostridium)细菌、穆尔氏菌属(Moorella)细菌之外的上述厌氧微生物的实例，可举出：生孢一氧化碳胞菌(Carboxydocella sporoducenssp.Nov.)(Slepova TV.et al.,Inter.J.Sys.Evol.Microbiol.2006,56,797-800)、胶状红假单胞菌菌(Rhodopseudomonas gelatinosa)(Uffen RL,J.Bacteriol.1983,155(3),956-965)、黏液真杆菌(Eubacterium limosum)(Roh H.et al.,J.Bacteriol.2011,193(1),307-308)、甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)(Lynd,LH.Et al.,J.Bacteriol.1983,153(3),1415-1423)、食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)等细菌。
此外，虽然细菌具有还原型乙酰CoA途径，但是古细菌也具有类似的途径。作为乙酰CoA合成酶的基质的甲基供体，在细菌中是甲基四氢叶酸等，而在古细菌中是甲基四氢蝶呤等(Diender M.et al.,Frontiers in Microbiology2015,vol.6,article 1275)。
作为属于古细菌的上述厌氧性微生物的实例，可举出：属于热球菌属(Thermococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球菌属(Methanococcus)、食甲基甲烷菌属(Methanomethylovorans)、甲烷线菌属(Methanothrix)、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)、Methanomethylophilus属、甲烷球形菌属(Methanosphaera)等的细菌(Diender M.et al.,Frontiers in Microbiology 2015,vol.6,article 1275；Borrel G.et al.,Genome Biol.Evol.2013,5(10),1769-1779)。在本发明中，例如，可以使用属于甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球菌属(Methanococcus)或产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)的古细菌。
<甲基营养菌>
甲基营养菌(Methylotroph)是以分子内不具有C-C键的碳化合物，例如甲烷、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等作为唯一的碳源和能源的C1化合物利用性微生物的总称。甲烷营养菌(Methanotroph)、甲烷氧化细菌、甲醇利用性细菌、甲醇利用性酵母、甲醇利用性微生物等微生物，全部都属于甲基营养菌。
甲基营养菌以将甲醇转化为甲醛，然后将甲醛转化为具有C-C键的有机物的反应作为中心代谢反应。作为经由甲醛的碳同化途径，已知有：丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径(RuMP途径)以及木酮糖单磷酸途径(XuMP途径)。被分类为细菌的甲基营养菌(甲基营养细菌)保有丝氨酸回路或RuMP途径。另一方面，被分类为酵母的甲基营养菌(甲基营养酵母)保有XuMP途径。
此外，甲基营养细菌中，基于甲醇需求性的差异，被分类为专性甲基营养菌(obligate methylotroph)和可以利用其他的碳化合物的兼性甲基营养菌(facultativemethylotroph)。
本发明的重组细胞可以是甲基营养菌。例如，在本发明的重组细胞的一个实施方式中，本发明的重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛以及甲酰胺中的至少一种C1化合物来生产异戊二烯或萜烯。此外，其具有选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径以及木酮糖单磷酸途径中的至少一种C1碳同化途径，作为甲醛的固定化途径。
作为能够用于本发明的甲基营养菌，例如可举出下述属于菌属的甲基营养菌：Methylacidphilum属、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基胞囊菌属(Methylocystis)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基胞菌属(Methylocella)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆状菌属(Methylobacter)、甲基小杆菌属(Methylobacillus)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基娇养杆菌属(Methylotenera)、食甲基菌属(Methylovorus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、噬甲基菌属(Methylophaga)、嗜甲基菌属(Methylophilaceae)、甲基营养菌属(Methyloversatilis)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、贝日阿托氏菌属(Beggiatoa)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、颗粒杆菌属(Granulibacter)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色小杆菌属(Achromobactor)、副球菌属(Paracoccus)、泉发菌属(Crenothrix)、Clonothrix属、红细菌属(Rhodobacter)、红环菌科属(Rhodocyclaceae)、硅杆菌属(Silicibacter)、硫微螺菌属(Thiomicrospira)、疣微菌属(Verrucomicrobia)等。
除细菌之外，具有MEP途径的还可举出：属于毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母菌属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)、克勒克酵母属(Kloeckera)等的甲基营养酵母。作为毕赤酵母属(Pichia)酵母的实例，可举出：甲虫毕赤酵母(P.haplophila)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、喜海藻糖毕赤酵母(P.trehalophila)、P.lindnerii等。作为假丝酵母菌(Candida)属酵母的实例，可举出：近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、甲醇假丝酵母(C.methanolica)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、C.alcomigas等。作为酵母菌属(Saccharomyces)酵母的实例，可举出：Saccharomyces metha-nonfoams等。作为汉逊酵母属(Hansenula)酵母的实例，可举出：H.wickerhamii、H.capsulata、H.glucozyma、H.henricii、H.minuta、H.nonfermentans、H.philodendra、H.polymorpha等。作为球拟酵母属(Torulopsis)酵母的实例，可举出：T.methanolovescens、光滑球拟酵母菌(T.glabrata)、T.nemodendra、T.pinus、T.methanofloat、T.enokii、T.menthanophiles、T.methanosorbosa、T.methanodomercqii等。
在优选的实施方式中，重组细胞属于Methylacidphilum属、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基胞囊菌属(Methylocystis)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基胞菌属(Methylocella)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆状菌属(Methylobacter)、甲基小杆菌属(Methylobacillus)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基娇养杆菌属(Methylotenera)、食甲基菌属(Methylovorus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、噬甲基菌属(Methylophaga)、嗜甲基菌属(Methylophilaceae)或甲基营养菌属(Methyloversatilis)。特别优选属于甲烷球形菌(Methanosphaera)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷叶菌属(Methanolobus)、甲烷类球菌属(Methanococcoides)、甲烷嗜盐菌(Methanohalophilus)、甲烷盐菌属(Methanohalobium)。
需要说明的是，在非甲基营养菌的宿主细胞中，通过导入经由甲醛的碳同化代谢途径(丝氨酸途径、RuMP途径、XuMP酸途径等)，能够以与甲基营养菌相同的方式进行处理。就RuMP途径的导入而言，例如，可以通过导入3-己酮糖6磷酸合成酶(HPS；例如EC4.1.2.43)基因、6-磷酸-3-己烷苏洛异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase)(PHI；例如EC5.3.1.27)基因来实现。例如，通过导入丝氨酸羟甲基转移酶(例如EC 2.1.2.1)基因，可以实现丝氨酸途径的导入。像这样使非甲基营养菌甲基营养化的方法的详细内容，记载在例如国际公开第2014/104202号(专利文献4)中。
<第一外源基因>
在本发明中，具有异戊二烯合成酶基因作为外源基因(第一外源基因)的重组细胞能够生产异戊二烯。此外，具有单萜合成酶基因作为外源基因的重组细胞能够生产单萜(碳原子数为10的萜烯)。此外，具有倍半萜合成酶基因作为外源基因的重组细胞能够生产倍半萜(碳原子数为15的萜烯)。此外，具有二萜合成酶基因作为外源基因的重组细胞能够生产二萜(碳原子数为20的萜烯)。此外，具有角鲨烯合成酶基因作为外源基因的重组细胞能够生产三萜(碳原子数为30的萜烯)。此外，具有八氢番茄红素合成酶基因作为外源基因的重组细胞能够生产四萜(碳原子数为40的萜烯)。以下，对各酶以及基因按顺序进行说明。
<异戊二烯合成酶>
异戊二烯合成酶(isoprene synthase，IspS)具有将异戊烯二磷酸(IPP)的异构体即二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl diphosphate(DMAPP))转化为异戊二烯的作用。需要说明的是，异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸之间的结构转化由异戊烯二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase(IDI))催化。异戊烯二磷酸异构酶存在于所有生物体中。
用于本发明的异戊二烯合成酶(IspS)没有特别限制，例如可以使用源于植物等真核生物的异戊二烯合成酶。作为源于植物的异戊二烯合成酶，通常可举出源于黑杨、黧豆、野葛的异戊二烯合成酶，但不限于这些。作为异戊二烯合成酶的具体实例，可举出Q50L36、Q6EJ97、Q9AR86、Q7XAS7、A0PFK2、A0A0M4UQH9、A0A0M5MSL0(以上为UniProtKB entry)等。
序列编号1表示编码源于黑杨的异戊二烯合成酶(GenBank Accession No.:AM410988.1)的氨基酸序列。
关于本发明中使用的异戊二烯合成酶，除了在自然界中发现并且分离的异戊二烯合成酶之外，还可以是其改性体。例如，可以是现有的异戊二烯合成酶的部分片段或、是其氨基酸取代突变体并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质。
例如，本发明中使用的异戊二烯合成酶中至少包含下述(a-1)、(a-2)或(a-3)的蛋白质：
(a-1)由序列编号1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a-2)由氨基酸序列组成并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列是在由序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1～20个氨基酸而成的。
(a-3)由氨基酸序列组成并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与由序列编号1所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(a-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
除异戊二烯合成酶基因外，实施方式中还可以具有编码异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)的基因作为外源基因。通过导入IDI基因，增强了从IPP向DMAPP的转化，并且可以增强异戊二烯合成能力。这里使用的IDI没有特别限制，其实例可举出P61615、Q13907、Q46822、P50740、Q8TT35、P15496、Q10132、Q9KWG2(以上为UniProtKB entry)等。
<单帖合成酶>
单萜是碳原子数为10的萜烯，其由两个异戊二烯单元组成。单萜有非环状和环状的。非环状单萜包含香叶醇、月桂烯、柠檬醛、芳樟醇、橙花醇等。环状单萜包含柠檬烯、α-水芹烯、β-水芹烯、薄荷醇、百里香酚、α-蒎烯、β-蒎烯、蒈烯、香芹酮、桉叶素、樟脑等。
单萜合成酶是将香叶基二磷酸(GPP)或橙花基二磷酸(neryl diphosphate(NPP))转化为单萜的酶的总称。作为单萜的合成途径，可举出：通过GPP合成酶(GPP synthase(GPPS))或NPP合成酶(NPP synthase(NPPS))的作用，从异戊烯基二磷酸(IPP)出发，合成GPP或NPP。随后，通过单萜合成酶的作用，从GPP或NPP出发，合成单萜。
在优选的实施方式中，单萜合成酶是环状单萜合成酶。更优选的是，环状单萜合成酶是水芹烯合成酶，具体而言，是α-水芹烯合成酶或β-水芹烯合成酶。
作为α-水芹烯合成酶，可以使用任何酶，只要其具有从作为底物的GPP或NPP出发，生成α-水芹烯的活性即可。α-水芹烯合成酶的实例包含但不限于G5CV35、E5GAG2(以上为UniProtKB entry)、GN65-37361(SolCyc GeneID)等。
作为β-水芹烯合成酶，可以使用任何酶，只要其具有从作为底物的GPP或NPP出发，生成β-水芹烯的活性即可。β-水芹烯合成酶的实例包含但不限于Q9M7D1、C1K5M3、Q1XBU4、R9QMW3、R9QMR4、R9QMW7、E9N3U9、C0PTH8、F2XFA5、F2XFA1、F2XFA4、A0A0B0P314(以上为UniProtKB entry)等。
至于本发明中使用的单萜合成酶，除了在自然界中发现且分离的单萜合成酶外，还可以使用它们的变体。例如，可以为是现有单萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有单萜合成酶活性的蛋白质。
例如，本发明中使用的水芹烯合成酶(单萜合成酶的一个实例)至少包含下述(b-1)～(b-3)的蛋白质。
(b-1)由序列编号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b-2)由氨基酸序列组成并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列是在由序列编号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1～20个氨基酸而成的。
(b-3)由氨基酸序列组成并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与由序列编号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(b-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
此外，本发明中使用的水芹烯合成酶(单萜合成酶的一个实例)至少包含下述(c-1)～(c-3)的蛋白质。
(c-1)由序列编号3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c-2)由氨基酸序列组成并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列是在由序列编号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1～20个氨基酸而成的。
(c-3)由氨基酸序列组成并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与由序列编号3所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(c-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
除了单萜合成酶基因外，实施方式中还可以具有编码异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)作为外源基因的基因。通过导入IDI基因，可以增强从IPP向DMAPP的转化，并且增强GPP合成能力或NPP合成能力。其结果，可以提高单萜合成能力。
在优选的实施方式中，除了单萜合成酶基因等外，还具有编码GPP合成酶(GPPS)作为外源基因的基因或NPP合成酶(NPPS)基因。通过导入这些基因，可以增强从GPP或NPP出发的单萜合成能力。GPPS的实例包含S4S927、S4S8D9、D8LHY4、H6VLF6、H6VLF3、D8RV97、Q6V4K1、Q8LKJ3、Q8LKJ2、Q8LKJ1、Q9FSW8、H6VLF7、V5REB1、Q58GE8(以上为UniProtKBentry)。NPPS的实例包含源于番茄的NDPS1(Schilmiller AL et al.,PNAS2009,106(26),10865-10870)等。
<倍半萜合成酶>
倍半萜是碳原子数为15的萜烯，其由三个异戊二烯单元组成。倍半萜有非环状、单环状、双环状以及三环状的。非环状倍半萜包含法呢烯、法呢醇等。单环状倍半萜包含zingiberene、Humulene、脱落酸等。双环状倍半萜包含Caryophyllene、Eudesman、Eremophilan、Valeran、Cadinan、Cadinene、Guajan、Driman、Cedrol、Nootkatone等。三环状倍半萜包含Illudan、Prezizaan、Marasman、Cedran、Thujopsan、Hirsutan等。
倍半萜合成酶是将法呢基二磷酸(FPP)转化为倍半萜的酶的总称。作为倍半萜的合成路线，可举出：通过GPP合成酶的作用，从IPP出发合成GPP。随后，通过FPP合成酶的作用，从GPP出发合成FPP。随后，通过倍半萜合成酶的作用，从FPP出发合成倍半萜。
在优选的实施方式中，倍半萜合成酶是环状倍半萜合成酶。在另一优选的实施方式中，倍半萜合成酶是法呢烯合成酶。
作为法呢烯合成酶，可以使用具有从作为底物的法呢基二磷酸(FPP)出发，生成法呢烯的活性的任何酶。法呢烯合成酶的实例包含：用于合成法呢烯的α体((3E，6E)-alpha-farnesene)的Q84LB2,B9RXW0、B2KSJ6、Q84KL5(以上为UniProtKB entry)等；用于合成法呢烯的β体((E)-beta-farnesene)的Q9FXY7、O48935、Q2NM15、C7E5V9、C7E5V7、Q94JS8、C7E5W0、C7E5V8(以上为UniProtKB entry)等，但不限于此。
关于本发明中使用的倍半萜合成酶，除了天然发现和分离的倍半萜合成酶外，还可以使用其变体。例如，可以为是现有倍半萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有倍半萜合成酶活性的蛋白质。
例如，本发明中使用的法呢烯合成酶(倍半合成酶)至少包含下述(d-1)～(d-3)的蛋白质。
(d-1)由序列编号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d-2)由氨基酸序列组成并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列是在由序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1～20个氨基酸而成的。
(d-3)由氨基酸序列组成并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与由序列编号4所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(d-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
除了倍半萜合成酶基因外，实施方式中还可以具有编码IDI作为外源基因的基因。通过导入IDI基因，可以增强GPP合成能力。其结果，FPP合成能力增强，并且可以提高倍半萜合成能力。
在优选的实施方式中，除了倍半萜合成酶基因等之外，还具有编码GPP合成酶(GPPS)的基因和/或FPP合成酶(FPPS)基因作为外源基因。通过导入这些基因，增强了GPP和/或FPP的合成能力，其结果，可以提高倍半萜的合成能力。GPPS的实例包含上述例举的那些。FPPS的实例包含P08524、P09152、P49349、P14324、P05369、O014230(以上为UniProtKBentry)等。对于GPPS基因和FPPS基因，可以导入任一种，也可以导入这两种。
<二萜合成酶>
二萜是碳原子数为20的萜烯，其由四个异戊二烯单元组成。二萜有非环状、单环状、双环状以及三环状的。非环状二萜包含α-生育酚、视黄醇、植醇等。环状二萜包含Abietane、Abietic acid、Neoabietic acid、Levomaric acid、Sapietic acid、Atisane、Beyerane、Gibbane、Gibberellic acid、Kaurane、Steviol、Labdane、Picrasane、Pimarane、Podocarpane、Rosane、Taxane、视黄醛，视黄酸，视黄醇等。
二萜合成酶是将香叶基香叶基二磷酸(GGPP)转化为二萜的酶的总称。作为二萜的合成途径，可举出：通过GPP合成酶的作用，从IPP出发合成GPP。随后，通过FPP合成酶的作用，从GPP出发合成FPP。随后，通过GGPP合成酶(GGPPS)的作用，从FPP出发合成GGPP。随后，通过二萜合成酶的作用，从GGPP出发合成二萜。
作为二萜合成酶，可以使用具有从GGPP出发，生成二萜的活性的任何酶。二萜合成酶的实例包含但不限于Q38710、P9WJ61、G9MAN7、M4HY05、H8ZM70、M1VDX3、A2PZA5、Q675L5、Q0E088、P9WJ60、Q6Z5J6、M4HYP3(UniProtKB entry)等。
关于本发明中使用的二萜合成酶，除了天然发现和分离的二萜合成酶外，还可以使用其变体。例如，可以为是现有二萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有二萜合成酶活性的蛋白质。
除了二萜合成酶基因外，实施方式还可以具有编码IDI作为外源基因的基因。通过导入IDI基因，可以增强GPP合成能力。其结果，FPP合成能力和GPP合成能力增强，并且可以增强二萜合成能力。
在优选的实施方式中，除了二萜合成酶基因等外，还具有至少一种选自下述的基因作为外源基因：编码GPP合成酶(GPPS)的基因、编码FPP合成酶(FPPS)的基因以及编码GGPP合成酶(GGPPS)的基因。通过导入这些基因，GPP、FPP或GGPP的合成能力增强，其结果，可以增强二萜合成能力。GPPS和FPPS的实例包含上述的那些。GGPPS的实例包含Q12051、Q84J75、P34802、P80042、Q94ID7、Q9SLG2、Q9C446、Q54BK1、Q9LUE1、Q92236、Q39108、O95749、Q12051、Q9P885、P24322(UniProtKB entry)等。
对于GPPS基因、FPPS基因、GGPPS基因，可以导入任一种，也可以导入两种以上。
在优选的实施方式中，除了二萜合成酶基因等之外，还具有编码柯巴基二磷酸合成酶(CPPS)作为外源基因的基因。柯巴基二磷酸(Copalyl diphosphate(CPP))是碳原子数为20的GGPP衍生物。通过导入CPP合成酶基因，可以应对二萜合成酶底物为CPP的情况。CPPS的实例包含G8HZG6、O22667、A0A0N7I618、Q0Q2G7(UniProtKB entry)等。
<角鲨烯合成酶>
三萜是碳原子数为30的萜烯，其由六个异戊二烯单元组成。通常，通过FPP(C15)的二聚体化，生成作为非环状三萜的角鲨烯(Squalene)(C30)(由角鲨烯合成酶催化)，从角鲨烯出发生成2,3-Oxidosqualene(2,3-epoxy-2,3-dihydroaqualene)，经过2,3-Oxidosqualene的环化而生物合成200种以上的三萜骨架。然而，由于从角鲨烯出发生成2,3-Oxidosqualene是需氧的，因此通过作为厌氧古细菌的本发明的重组细胞而可以生产的三萜主要是，通过角鲨烯的环化生产的藿烯(Hopene)、藿烷醇(Hopanol)以及其衍生物即藿烷类(Hopanoid)化合物。
如上所述，角鲨烯合成酶(squalene synthase(SS))(EC 2.5.1.21)具有使FPP二聚体化的作用。在合成类胡萝卜素化合物的情况下，除角鲨烯合成酶基因外，至少还导入角鲨烯/藿烯环化酶(Squalene/Hopene cyclase)(EC 5.4.99.17)基因或角鲨烯/藿烷醇环化酶(Squalene/Hopanol cyclase)(EC 4.2.1.129)基因即可。通常，角鲨烯/藿烯环化酶也具有角鲨烯/藿烷醇环化酶活性。角鲨烯合成酶(SS)的实例包含P53799、P36596、P29704、P37268、P52020、Q9HGZ6、Q9Y753、Q9SDW9、P78589(UniProtKB entry)等。角鲨烯/藿烯环化酶(角鲨烯/藿烷醇环化酶)的实例包含P33247、P33990、P54924、P55348(UniProtKB entry)等。
通过导入除SS基因之外的IDI基因，可以增强角鲨烯合成能力。此外，通过导入香叶基二磷酸合成酶(GPPS)基因和/或法呢基二磷酸合成酶(FPPS)基因，可以增强合成角鲨烯的能力。GPPS和FPPS的实例包含上述例举的那些。
关于本发明中使用的角鲨烯合成酶，除了在自然界中发现和分离的角鲨烯合成酶之外，还可以使用其变体。例如，可以为是现有角鲨烯合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有角鲨烯合成酶活性的蛋白质。
<八氢番茄红素合成酶>
四萜是由八个异戊二烯单元组成并且碳原子数为40的萜烯，主要包含类胡萝卜素的化合物组。四萜中存在许多非环状或环状四萜。非环状四萜包含八氢番茄红素、番茄红素、链孢红素等。单环状四萜包含γ-胡萝卜素等。双环状四萜包含α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、虾青素、抗青黄素、角黄素、辣椒红素、β-隐黄质、叶黄素、蓝溪藻黄素(myxoxanthophyll)、玉米黄质、岩藻黄质、紫罗兰红素、新黄质、毛莨黄素等。
八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase(PYS))(EC 2.5.1.32)具有使香叶基香叶基二磷酸(GGPP)二聚体化的作用。PYS的实例包含Q7Z859、Q9P854、P37272、Q67GH9、D5KXJ0、P21683、Q9UUQ6、P08196、B2ATB0、Q2U4X9、A2QM49、P37271、P37273、P49085、P54975、P9WHP3、P54977、P22872、P17056(UniProtKB entry)等。
通过导入除PSY基因之外的IDI基因，可以增强八氢番茄红素的合成能力。此外，通过导入选自GPP合成酶基因、FPP合成酶基因以及GGPP合成酶基因中的至少一种基因，可以增强八氢番茄红素的合成能力。GPPS、FPPS、GGPPS的实例包含上述例举的那些。
关于本发明中使用的八氢番茄红素合成酶，除了在自然界中发现和分离的八氢番茄红素合成酶之外，还可以使用其变体。例如，可以为是现有八氢番茄红素合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有八氢番茄红素合成酶活性的蛋白质。
如上所述，本发明的重组细胞具有异戊二烯合成酶基因、单萜合成酶基因、倍半萜合成酶基因、二萜合成酶基因、角鲨烯合成酶基因或八氢番茄红素合成酶基因作为外源基因。并且还可以任选具有IDI基因、GPPS基因、NPPS基因、GGPPS基因、CPPS基因、SS基因等。
<重组细胞的制备方法>
本发明的重组细胞可以例如使用具有通过非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力的宿主细胞和编码异戊二烯合成酶或萜烯合成酶的基因来制备。
例如，本发明的重组细胞可以通过包含下述工序(1)～(3)方法进行制备：
(1)第一工序，提供具有通过非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力的宿主细胞；
(2)第二工序，使上述宿主细胞所具有的通过非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力缺失；
(3)第三工序，向上述宿主细胞中导入编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码二萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因或编码八氢番茄红素合成酶的基因，作为第一外源基因。
上述第一工序提供具有通过非甲羟戊酸途径(MEP途径)合成异戊烯二磷酸(IPP)的能力的宿主细胞。例如，制备细菌等通过MEP途径合成IPP的细胞作为宿主细胞。
在上述第二工序中，使宿主细胞所具有的通过非甲羟戊酸途径(MEP途径)合成异戊烯二磷酸(IPP)的能力缺失。例如，使选自DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶以及HMB-PP还原酶等作用于MEP途径的酶组中的至少一种内源性酶的活性缺失。如上所述，作为使酶的活性缺失的方法，例如可举出：使酶基因的一部分或全部缺失、在酶基因中产生突变(移码等)、在启动子或核糖体结合区域中产生突变等。作为突变处理的实例，可举出：通过放射线照射、变异剂(NTG、亚硝酸盐等)的处理等。需要说明的是，可以仅使一种上述酶活性缺失，或使多种上述酶活性缺失。
在优选的实施方式中，至少缺失DOXP还原异构酶和HMB-PP合成酶中的任意一种或两种。
在上述第三工序中，向上述宿主细胞中导入编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码二萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因或编码八氢番茄红素合成酶的基因，作为第一外源基因。由此，获得缺乏通过内源性MEP途径合成异戊烯二磷酸的能力并且能生产异戊二烯或萜烯的重组细胞。需要说明的是，IPP的合成可以通过内源性MVA途径或另行导入的外源性MVA途径来进行。
需要说明的是，在本方法中，第二工序和第三工序的实施顺序并不重要。即，可以使内源性MEP途径的活性缺失后再导入第一外源基因，也可以在导入第一外源基因后再使内源性MEP途径的活性缺失。两个工序也可以同时进行。
在优选的实施方式中，除了上述(1)～(3)外，还包含以下工序(4)：
(4)第四工序，向所述宿主细胞中导入编码选自下述酶组中的至少一种酶的基因作为第二外源基因，并赋予通过该甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，所述酶组为在甲羟戊酸途径中起作用的酶组，即乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
当宿主细胞不具有内源性甲羟戊酸途径(MVA途径)时，则基本上第四工序是必要的。导入的第二外源基因只要可以赋予通过MVA途径合成IPP的能力，则可以是上述任意一种酶基因或多种酶基因。
需要说明的是，在本方法中，尽管第二工序、第三工序、第四工序的实施顺序并不重要，但优选在第二工序之前进行第四工序。即，优选在导入第二外源基因后再使内源性MEP途径缺失。此外，第三工序和第四工序可以同时进行。例如，可以将第一外源基因和第二外源基因整合到一个载体中，并将该载体导入宿主细胞中，从而同时进行第三工序和第四工序。
<基因导入的方法>
作为向宿主细胞中导入基因的方法没有特别限制，可以根据宿主细胞的种类等适当选择。例如，可以使用能够导入宿主细胞并且能够表达被整合的基因的载体。例如，当宿主细胞是细菌等原核生物时，可以使用能够在宿主细胞中自主复制或能够被整合到染色体中，并且在可以转录所插入的上述基因的位置处含有启动子的载体作为该载体。例如，优选使用该载体在宿主细胞中构建包含启动子、核糖体结合序列、上述基因(DNA)、和转录终止序列的一系列构成。
当宿主细胞是梭菌属(Clostridium)细菌(包括穆尔氏菌属(Moorella)细菌这样的相关菌种)时，可以使用梭菌属(Clostridium)细菌和大肠杆菌的穿梭载体pIMP1(Mermelstein LD et al.,Bio/technology 1992,10,190-195)。该穿梭载体是pUC9(ATCC37252)与从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离的pIM13(Projan SJ et al.,J.Bacteriol.1987,169(11)，5131-5139)形成的融合载体，并且稳定存在于梭菌属(Clostridium)细菌中。
需要说明的是，向梭菌属(Clostridium)细菌中导入基因时，虽然通常使用电穿孔法，但基因导入后的导入的外源质粒容易受到限制酶Cac824I等的降解，并且极其不稳定。因此，在保有携带了来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体Φ3T1的甲基转移酶基因的pAN1(Mermelstein LD et al.,Apply.Environ.Microbiol.1993,59(4),1077-1081)的大肠杆菌，例如菌株ER2275等中，优选将来源于pIMP1的载体先进行扩增并进行甲基化处理，然后将其从大肠杆菌中回收并用于通过电穿孔的转化。需要说明的是，最近已经开发出缺失了Cac824I基因的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，还没有进行甲基化处理的载体也可以是稳定的(Dong H.et al.,PLoS ONE 2010,5(2),e9038)。
作为梭菌属(Clostridium)细菌中异源基因表达的启动子，例如可举出：thl(硫解酶(thiolase))启动子(Perret S et al.,J.Bacteriol.2004,186(1),253-257)、Dha(甘油脱水酶(glycerol dehydratase))启动子(Raynaud C.et al.,PNAS2003,100(9),5010-5015)、ptb(磷酸丁酰转移酶(phosphotransbutyrylase))启动子(Desai RP et al.,Appl.Environ.Microbiol.1999,65(3),936-945)、adc(乙酰乙酸脱羧酶(acetoacetatedecarboxylase))启动子(Lee J et al.,Appl.Environ.Microbiol.2012,78(5),1416-1423)。然而，在本发明中不限于此，可以使用在宿主细胞等中发现的各种代谢系统的操纵子中使用的启动子区域的序列。
对在宿主细胞是甲基营养细菌的情况进行说明时，作为整合到甲基营养细菌的染色体中的方法，可举出：在具有核酮糖单磷酸途径的鞭毛甲基小杆菌(Methylobacillusflagellatus)或具有丝氨酸途径的扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquencs)中，通过目的基因的破坏操作的示例(Chistoserdova L.et al.,Microbiology 2000,146,233-238；Chistoserdov AY.,etal.,J.Bacteriol 1994,176,4052-4065)。这些是使用了环状DNA并且导入到基因组中的基因导入法，但是在嗜甲基菌属(Methylophilus)细菌中，也开发有使用了线性DNA并且导入到基因组中的基因导入法(日本特开第2004-229662号公报)。通常，当不易被宿主细胞降解时，通过线性DNA的基因组重组比通过环状DNA的基因组重组更有效率。此外，通常，同源重组法如反向重复序列(inverted-repeat sequence)等那样，优选以在基因组上存在多个拷贝的基因为靶点。此外，作为将多拷贝导入基因组的方法，除了同源重组外，还有搭载到转座子中的方法。作为通过质粒导入甲基营养细菌中的基因导入法，例如存在，广泛宿主区载体即pAYC32(Chistoserdov AY.,et al.,Plasmid 1986,16,161-167)、pRP301(Lane M.,et al.,Arch.Microbiol.1986,144(1),29-34)、pBBR1、pBHR1(Antoine R.et al.,Molecular Microbiology 1992,6,1785-1799)、pCM80(Marx CJ.etal.,Microbiology 2001,147,2065-2075)等
对宿主细胞是古细菌的情况进行说明时，在古细菌中的基因工程中，例如，可以使用以甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)细菌中内在的质粒pC2A作为基质的大肠杆菌的穿梭载体(Sowers K.R.et al.,J.Bacteriol.1988,170,4979-4982；Metcalf W.W.et al.,PNAS1997,94,2626-2631)。还存在通过同源重组进行基因导入、缺失的实例(Rother M.,etal.,J.Bacteriol 2005,187,5552-5559；Conway D.M.,J.Mol.Biol.1996,262,12-20)，可以使用这些方法。作为表达系统，可以使用利用了四环素抗性基因表达的控制系统的诱导以及构成表达的方法(Guess A.M.et al.,Archaea 2008,2,193-203)等。
此外，当使用载体将多种基因导入宿主细胞时，各基因可以整合到一个载体中，也可以分别整合到不同的载体中。此外，在一个载体中整合多个基因时，各核酸可以在共通的启动子下表达，也可以分别在不同的启动子下表达。作为导入多种基因的实例，可举出：导入上述第一外源基因和第二外源基因的实施方式。
除了导入上述外源基因外，还可以通过实施突变或基因组重排(Genomeshuffling)来培育异戊二烯或萜烯的生产性得到显著提高的菌株。
<异戊二烯或萜烯的生产方法>
本发明的异戊二烯或萜烯的生产方法中，上述重组细胞与选自一氧化碳、二氧化碳、甲酸、甲烷、甲醇、甲胺、甲醛以及甲酰胺中的至少一种C1化合物接触，在该重组细胞中由上述C1化合物生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜烯。典型的，使用选自一氧化碳、二氧化碳、甲酸、甲烷、甲醇、甲胺、甲醛以及甲酰胺中的至少一种C1化合物作为碳源对上述重组细胞进行培养，并从其培养物中得到异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜烯。
就用作碳源的上述C1化合物而言，可以仅使用一种，也可以组合两种以上使用。此外，优选使用这些C1化合物作为主要碳源，更优选为唯一的碳源。此外，优选同时提供氢(H2)作为能源。
作为培养本发明的重组细胞的方法没有特别限制，可以根据宿主细胞的种类等适当进行。当重组细胞是梭菌属(Clostridium)细菌(绝对厌氧性)时，例如，在包含生长必需的无机盐类以及合成气的营养条件下进行培养。优选在0.2～0.3MPa(绝对压)程度的压力状态下进行培养。此外，为了使初期增殖以及到达细胞密度良好，可以添加少量的维生素、酵母提取物、玉米浆、胰蛋白胨(Bacto Trypton)等有机物。
需要说明的是，当重组细胞是好氧性或兼性厌氧性的时，例如可以进行使用了液体培养基的通气·搅拌培养。
可以向上述重组细胞提供以一氧化碳和氢作为主要成分的气体或者以二氧化碳和氢作为主要成分的气体。即，将这些气体用作碳源并培养重组细胞，或者使这些气体与重组细胞接触，由气体中的一氧化碳或二氧化碳生产异戊二烯或萜烯。这时，氢也被用作能源。
也可以向重组细胞提供甲酸以及/或甲醇，由甲酸以及/或甲醇生产异戊二烯或萜烯。即，除了一氧化碳或二氧化碳以外，可以单独使用甲酸或甲醇作为碳源并培养重组细胞，或者使甲酸或甲醇与重组细胞接触，从而由甲酸或甲醇生产异戊二烯或萜烯。
也可以在不进行培养的情况下进行异戊二烯或萜烯的生产。即，无论是否伴随细胞分裂(细胞增殖)，都可以使上述C1化合物与重组细胞接触，以生产异戊二烯或萜烯。例如，将上述C1化合物连续供给到固定化了的重组细胞，可以连续地生产异戊二烯或萜烯。同样在该实施方式中，就这些碳源即C1化合物而言，可以仅使用一种，也可以组合两种以上使用。此外，优选同时与作为能源的氢(H2)接触。
生产的异戊二烯或萜烯，例如可以从细胞外即培养液或气相馏分中回收。
在下文中，将通过实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不限于这些实施例。
[实施例1]
在该实施例中，通过一种合成气利用性细菌即李氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)的重组细胞以及缺失了MEP途径的重组细胞，对异戊二烯的生产量进行比较。
(1)各种载体的构建
参照Appl Biochem Biotechnol(2012)168:1384–1393，制备pUC-Δdxr-ermC(序列编号5)，其包含：李氏梭菌(C.ljungdahlii)的DOXP还原异构酶基因dxr(CLJU_c13080)的上游序列、红霉素抗性基因(来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的ermC基因，序列编号5，GenBank AccessionNo.:KX011076)以及李氏梭菌(C.ljungdahlii)的DOXP还原异构酶基因dxr的下游序列。pUC-Δdxr-ermC的构成如图1所示。在该图中，dxrupstream表示DOXP还原异构酶基因的上游序列，dxr downstream表示DOXP还原异构酶基因的下游序列，ermC表示红霉素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
对梭菌(Clostridium)/大肠杆菌(E.Coli)二元载体即pJIR750ai(Sigma-Aldrich公司)进行改变，构建pSK1(LbMVA-ISPS)(序列编号10)，其包含：来源于乳酸杆菌的甲羟戊酸途径的基因簇(来源于约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NCC 533，序列编号7、序列编号8，GenBank AccessionNo.:AE017198.1)、异戊二烯合成酶基因(来源于黑杨IspS基因，序列编号9，GenBank Accession No.：AM410988.1)、氯霉素抗性基因(来源于pJIR750ai)的，密码子改变了的核苷酸序列。
pSK1(LbMVA-ISPS)的构成如图2所示。图中，MvaE表示乙酰CoA乙酰转移酶基因，HMGCR表示HMG-CoA还原酶基因，HMGCS表示HMG-CoA合成酶基因，MVK表示甲羟戊酸激酶基因，MVD表示二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因，PMVK表示磷酸甲羟戊酸激酶基因，IDI表示异戊烯二磷酸异构酶基因。此外，IspS populus表示来源于黑杨的异戊二烯合成酶的序列(用于梭菌(Clostridium)中改变部分密码子)，GroEL SD表示李氏梭菌(C.ljungdahlii)的chaperonin GroEL基因的上游的SD序列，thl promoter表示丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的硫解酶启动子。此外，pMB1表示大肠杆菌的ori，CatP表示氯霉素抗性基因，rep origin表示梭菌(Clostridium)的复制起点，pIP404 replication enzyme表示梭菌(Clostridium)的复制酶。
(2)向DSM13528/ATCC55383菌株导入基因
使用Leang C.et al.,Appl Environ Microbiol.2013 79(4),1102-9中记载的方法，通过电穿孔法向DSM13528/ATCC55383菌株中导入pSK1(LbMVA-ISPS)。通过在含有5μg/mL甲砜霉素的ATCC1754琼脂培养基(含果糖，1.5％琼脂)中进行筛选，获得异戊二烯生产菌株SK1。SK1菌株同时具有内源性MEP途径和外源性MVA途径这两种途径。
(3)缺失MEP途径(dxr基因敲除)的梭菌(Clostridium)菌株的制备
使用Leang C.et al.,Appl Environ Microbiol.2013 79(4),1102-9推荐的方法，向SK1菌株中导入pUC-Δdxr-Cat。在分别含有4μg/mL克拉霉素以及5μg/mL甲砜霉素的ATCC1754琼脂培养基(1.5％琼脂)中进行筛选，并通过同源重组使dxr缺失。由此，制备了缺失了内源性MEP途径并且依赖于外源性MVA途径而生长的异戊二烯生产菌株SK2。
(4)异戊二烯的定量
将SK1菌株和SK2菌株分别在37℃的厌氧条件下进行培养。接种到5ml的含有5μg/mL甲砜霉素的ATCC1754培养基中(其中，pH＝5.0，不含果糖)，将CO/CO2/H2＝33/33/34％(体积比)的混合气体导入27mL体积的可密封的顶空小瓶容器中，在0.25MPa(绝对压)的气压下进行填充，用铝盖密封后振荡培养。当观察到增殖液的OD600达到1.0时终止培养，并通过气相色谱质谱仪(GCMS-QP2010 Ultra，岛津制作所公司)来分析气相。
其结果，对于SK1菌株、SK2菌株，以平均10mg异戊二烯/干燥菌体(g)的生产量检测出异戊二烯。
从上文可知，缺失了内源性MEP途径但具有外源性MVA途径功能的李氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的重组细胞，能够与具有内源性MEP途径和外源性MVA途径这两者的重组细胞同等地生产异戊二烯。即，无论是否具有内源性MEP途径，通过外源性MVA途径都能生产同等的异戊二烯。
[实施例2]
在本实施例中，使用实施例1中制备的SK1菌株以及SK2菌株，研究各菌株中异戊二烯生产的稳定性。
(1)重组细胞的传代培养实验
对于各SK1菌株以及SK2菌株，将5个克隆各自接种到5mL的含有5μg/mL的甲砜霉素的ATCC1754培养基中(其中，pH＝5.0，不含果糖)，将CO/CO2/H2＝33/33/34％(体积比)的混合气体导入27mL体积的可密封的顶空小瓶容器中，在0.25MPa(绝对压)的气压下进行填充，用铝盖密封后，振荡培养。当OD600达到1.0时，将各菌株重新接种在新的ATCC1754培养基中(传代培养)。当该传代培养的工序重复20次时，证实了所有的克隆在第20次传代培养后也能增殖。
(2)质粒稳定性和异戊二烯生产性
参照Isolation of Plasmid DNA from Bacillus subtilis using the QIAprepSpin Miniprep Kit-(EN)，从SK1菌株以及SK2菌株的各克隆中，使用QIAprep SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司)，从各菌体中提取质粒pSK1(LbMVA-ISPS)。将提取出的DNA转化到E.coli JM109(Takara Bio公司)中，在获得的菌落中，使用QIAprep Spin Miniprep Kit分别从10个菌落中再次进行质粒提取。使用Applied Biosystems 3130遗传分析仪(Applied Biosystems公司)分析获得的质粒的核苷酸序列。
其结果，认为在来源于SK1菌株的各克隆的质粒中，在甲羟戊酸途径基因簇序列中发生有至少一个以上的突变，并且缺失了MVA途径的功能。需要说明的是，未发现抗药性基因序列的突变。另一方面，在来源于SK2菌株的各克隆的质粒中，在甲羟戊酸途径基因簇序列中以及抗药性基因序列中均未发现突变，并且MVA基因簇在20次传代后也保持正常。
此外，对于SK1菌株以及SK2菌株的20次传代培养后的小瓶的气相，通过气相色谱质谱仪(GCMS-QP2010 Ultra)进行分析。结果，在SK1菌株中，所有克隆中异戊二烯的生产量都在气相色谱质谱仪的检测限以下。另一方面，在SK2菌株中，在所有克隆中检测出平均10mg异戊二烯/干燥菌体(g)的生产量的异戊二烯。
根据上述内容，将合成异戊二烯的前体(IPP)的外源性甲羟戊酸途径导入到宿主细胞中，同时敲除宿主的内源性非甲羟戊酸途径基因，从而可以制备只有外源性甲羟戊酸途径作为IPP的合成途径起作用的重组细胞。并且，显示了，导入了异戊二烯合成酶基因的该重组细胞可以稳定地维持外源性甲羟戊酸途径的功能，并且可以稳定且连续地生产异戊二烯。

Claims (7)

1.一种重组细胞，其为能够生产异戊二烯的梭菌属(Clostridium)细菌的重组细胞，所述重组细胞具有第一能力，即通过外源性甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，其中，
选自DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶以及HMB-PP还原酶中的至少一种内源性酶的活性发生了缺失，从而缺失了第二能力，即通过内源性非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，
所述重组细胞具有编码异戊二烯合成酶的基因的第一外源基因，并具有实现所述第一能力的第二外源基因，该第二外源基因包含：编码乙酰CoA乙酰转移酶的基因、编码HMG-CoA合成酶的基因、编码HMG-CoA还原酶的基因、编码甲羟戊酸激酶的基因、编码5-磷酸甲羟戊酸激酶的基因、以及编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的基因，
表达所述第一外源基因，能够生产异戊二烯。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其能够用选自一氧化碳和二氧化碳中的至少一种作为唯一碳源进行增殖。
3.根据权利要求1所述的重组细胞，其具有由甲基四氢叶酸或甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及CoA来合成乙酰CoA的功能。
4.根据权利要求1所述的重组细胞，其进一步具有编码异戊烯基二磷酸异构酶的第三外源基因。
5.一种重组细胞的制备方法，其制备权利要求1～4中任一项所述的重组细胞，所述制备方法包含下述工序：
第一工序，提供具有通过非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力的梭菌属(Clostridium)细菌的宿主细胞；
第二工序，使所述宿主细胞所具有的通过非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力缺失；
第三工序，作为所述第一外源基因，向所述宿主细胞中导入编码异戊二烯合成酶的基因；
第四工序，向所述宿主细胞导入所述第二外源基因。
6.一种异戊二烯的生产方法，其中，
使权利要求1～4中任一项所述的重组细胞，与选自一氧化碳以及二氧化碳中的至少一种C1化合物接触，在所述重组细胞中由所述C1化合物生产异戊二烯。
7.根据权利要求6所述的异戊二烯的生产方法，其包含下述工序：
使用选自一氧化碳以及二氧化碳中的至少一种C1化合物作为碳源对所述重组细胞进行培养，并从其培养物中得到异戊二烯。
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