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CN117385036A - SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物的应用 - Google Patents

SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物的应用 Download PDF

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CN117385036A
CN117385036A CN202311320557.9A CN202311320557A CN117385036A CN 117385036 A CN117385036 A CN 117385036A CN 202311320557 A CN202311320557 A CN 202311320557A CN 117385036 A CN117385036 A CN 117385036A
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胡哲
刘静波
刘伟
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Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
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Abstract

本发明涉及SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物的应用，涉及子宫内膜癌保持生育功能治疗技术领域，检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变的试剂在制备子宫内膜癌保育治疗耐药产品中的应用。本发明将SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物，将检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变的试剂用于制备子宫内膜癌保育治疗耐药产品中，成功构建了治疗前预测子宫内膜癌患者保育治疗耐药状态的检测体系，解决了保育治疗耐药患者缺乏临床及准确性高的治疗反应预测体系问题，成功建立了临床可行性的保育治疗精准分层方案，有效提高患者的治疗反应率，保障患者的生活质量与预后。

Description

SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药 标志物的应用
技术领域
本发明涉及子宫内膜癌保持生育功能治疗技术领域，具体涉及SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物的应用。
背景技术
子宫内膜癌(Endometrial Cancer，EC)是全球女性第六高发的癌症，流行病学统计显示，2020年全球新发病例约为417,367例,死亡病例为97,370例。随着经济水平的增长与生活方式的改变，子宫内膜癌发病呈现年轻化和趋势，小于40岁患者的发病率已经翻倍。年轻患者的增加对个人、社会和经济带来了严峻挑战，这些患者处于生育年龄且具有强烈的生育需求。目前最常用的治疗方案为口服高效孕酮的治疗，已经在多项临床研究中展现了其治疗效果。然而，仍有20％-40％的患者出现孕激素治疗抵抗的情况。但是保育耐药患者的临床与分子特征及耐药机制仍为未知。这严重威胁了患者的生活质量与生命健康，限制了保育治疗的应用。因此，进一步探索保育治疗的分子机制与逆转机制具有重要的科学意义及临床应用前景。
蛋白基因组是肿瘤学领域的一个重要研究方向。蛋白基因组是指与蛋白质相关的基因组信息，包括蛋白质的表达水平、修饰状态以及相互作用等。通过对肿瘤中的蛋白基因组进行研究，可以寻找潜在的肿瘤标志物，这些标志物可以用于肿瘤的早期诊断、预后评估和治疗监测。在肿瘤标志物的研究中，蛋白质的表达水平是一个重要的指标。通过比较肿瘤组织与正常组织中蛋白质的表达差异，可以发现与肿瘤发生、发展相关的蛋白标志物。这些标志物可以作为早期筛查工具，帮助医生更早地发现潜在的肿瘤病变。同时，蛋白质的表达水平还可以用于评估肿瘤的预后情况，判断患者的生存期和疾病进展风险，从而指导治疗方案的选择。然而目前对于子宫内膜癌的蛋白基因组研究仅局限于欧美地区绝经后的女性，对接受保育治疗的中国年轻子宫内膜癌患者的蛋白基因组图谱仍为空白。鉴于此，本发明提供SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物的应用。目的是构建治疗前预测子宫内膜癌患者保育治疗耐药状态的检测体系，提高患者的治疗反应率，保障患者的生活质量与预后。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变的试剂在制备子宫内膜癌保育治疗耐药产品中的应用，所述SIGLEC10基因在430号碱基发生胞嘧啶(C)到腺嘌呤(A)的错义突变，使得其编码的Sigelc10蛋白的第144位氨基酸从谷氨酰胺突变为赖氨酸。
本发明进行了以下三方面的研究：
(1)SIGLEC10Q144K的筛选：本发明的标志物(SIGLEC10基因的p.Q144K突变，记为SIGLEC10Q144K)是前期根据接受保育治疗患者的全外显子测序与蛋白质组测序结果，进行差异分析所筛选得到的；
(2)SIGLEC10Q144K的验证：本发明针对SIGLEC10Q基因的p.Q144K突变设计了特异性巢式聚合酶链式扩增反应(PCR)引物及Sanger测序体系，结果证明了SIGLEC10基因的p.Q144K突变的存在，且与保育治疗抵抗密切相关；本发明开发了针对了SIGLEC10基因编码的Sigelc10蛋白的免疫组织化学染色(IHC)试剂盒，验证了SIGLEC10Q144K热点突变导致Siglec10蛋白的过表达；
(3)SIGLEC10Q144K促进子宫内膜癌保育治疗耐药性:本发明还构建了SIGLEC10相关的慢病毒载体，然后对其进行孕激素药物处理，观察细胞生长增殖情况和细胞死亡的变化，通过细胞存活率以评估肿瘤耐药情况，并进行了免疫共沉淀实验，结果表明SIGLEC10Q144K促进Siglec10蛋白过表达，而与雌激素受体(ERα)相互作用，从而拮抗孕激素，导致保育治疗抵抗，证明SIGLEC10Q144K促进Siglec10蛋白过表达，抵抗子宫内膜癌保育的治疗。
本发明的有益效果是：本发明将SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物，将检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变的试剂用于制备子宫内膜癌保育治疗耐药产品中，成功构建了治疗前预测子宫内膜癌患者保育治疗耐药状态的检测体系，解决了保育治疗耐药患者缺乏临床及准确性高的治疗反应预测体系问题，成功建立了临床可行性的保育治疗精准分层方案，有效提高患者的治疗反应率，保障患者的生活质量与预后。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，通过检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变，从而对子宫内膜癌保育治疗患者的耐药情况进行判断。若SIGLEC10基因编码蛋白发生p.Q144K的突变，则对子宫内膜癌保育治疗患者产生耐药性；若SIGLEC10基因编码蛋白没有发生p.Q144K的突变，则对子宫内膜癌保育治疗患者不产生耐药性。
进一步，所述子宫内膜癌保育治疗的药物为孕激素。
进一步，所述子宫内膜癌保育治疗的药物为醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroneacetate,MPA)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate,MA)或左炔诺孕酮宫内缓释系统(levonorgestrel-releasing intrauterinesystem，LNG-IUS)。其中，MPA和MA采用口服方式进行子宫内膜癌的保育治疗；LNG-IUS需要在宫内放置来进行子宫内膜癌的保育治疗。
进一步，所述产品包含检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变的巢式引物，所述巢式引物包括第一轮正向引物、第一轮反向引物、第二轮正向引物和第二轮反向引物。
进一步，所述第一轮正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述第一轮反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述第二轮正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二轮反向引物的序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步，所述产品包括检测试剂或试剂盒。
进一步，所述Sigelc10蛋白的表达量采用免疫组化试剂盒进行检测。
进一步，所述免疫组化试剂盒包括环保脱蜡液、乙醇、PBS、抗原修复液、EDTA、PBST、组化笔、山羊血清、Siglec10的抗体、二抗、DAB显色液和苏木素和氨水反蓝液。具体的，环保脱蜡液(500ml)、无水乙醇(1L)、95％乙醇(1L)、90％乙醇(1L)、80％乙醇(1L)、PBS(50X，500mL)、抗原修复液(20X 30mL)、组化笔、山羊血清、Siglec10的抗体、山羊抗兔二抗、DAB显色液(50X 5mL)、苏木素(500ml)、盐酸分化液(500ml)和氨水反蓝液(500ml)。
其中，本发明利用Siglec10蛋白的免疫组化试剂盒，基于Siglec10的免疫组化结果预测患者的保育治疗反应。
附图说明
图1为本发明为SIGLEC10Q144K的筛选过程保育治疗抵抗和保育治疗敏感患者基于全外显子测序得到的体细胞突变图谱；其中，A为体细胞突变瀑布图，B为体细胞突变频率柱状图，C为SIGLEC10基因突变的位点分布棒棒糖图；
图2为本发明保育治疗敏感患者SIGLEC10Q144K突变导致Siglec10蛋白过表达；A为巢式PCR和Sanger测序结果验证了SIGLEC10Q144K的存在，B为SIGLEC10Q144K和SIGLEC10未突变患者的免疫组织化学染色图像，C为SIGLEC10Q144K突变与免疫组织化学评分的相关性；
图3为本发明体外实验验证SIGLEC10Q144K促进子宫内膜癌保育治疗耐药性机制；其中，A为Western Blot验证了SIGLEC10Q144K促进Siglec10过表达，B，C为Bioplex数据库与免疫共沉淀实验表明Sigelc10与雌激素受体的相互作用，D，E为克隆形成实验和CCK8实验证明了SIGLEC10Q144K促进子宫内膜癌对孕激素的耐药性。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例1：SIGLEC10Q144K的筛选
本发明提供的SIGLEC10Q144K筛选过程为，包括如下步骤：
a)样本收集：
本实施例符合《赫尔辛基宣言》的伦理标准，伦理批号分别为[TJ-IRB20211005]和[第2021-181号]。在进行任何特定研究的调查之前，均需获得每位患者的书面知情同意。
本发明筛选从2015年1月到2020年7月接受保育治疗的62名子宫内膜癌患者。取肿瘤/邻近组织的组织学切片，苏木精和伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)，以确定肿瘤组织的病理分级和肿瘤癌占比。
每个肿瘤/邻近样本由2名病理学专家检查，根据以下标准确认样本质量：(1)组织病理学定义内膜样子宫内膜癌；(2)肉眼下剔除切片上肿瘤组织后肿瘤细胞率(肿瘤纯度)>90％；(3)相邻癌旁组织中无肿瘤细胞。所有病例均根据国际妇产科联合会(InternationalFederation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)诊断标准(2018)进行分期。其他入组标准为：患者入院前未接受过任何治疗、未合并其他恶性肿瘤、未合并其他激素相关性疾病、患者有完整的临床信息。
b)石蜡包埋组织中DNA的提取：
使用MagPure FFPE DNA LQ试剂盒(购买于MAGEN，货号D6323-02)提取FFPE DNA。采用量子点荧光仪和琼脂糖凝胶电泳检测样品的浓度、完整性和纯化程度。包括如下的具体的步骤：
1.用手术剪刀和镊子去除石埋包埋组织中的多余的石蜡；
2.用切片机切出1-3片10μm的切片，并转移至1.5ml离心管中；加入800μlDeparaffinizationSolution至样品中，涡旋混匀5秒；
3.56℃水浴5分钟；涡旋混匀15秒；
4.加入20μlProteinaseK和200μlBufferATL至样品中；涡旋混匀5秒；
5.短暂离心收集管壁上的液滴；56℃温育60-180分钟；90℃温育60分钟；
6.短暂离心收集管壁上的液滴；转移下层消化液到新的离心管中；
7.加入400μlBufferMLE和30μlMagPureParticlesG至样品中；涡旋混匀15秒；室温静置3分钟，其间颠倒混匀数次；
8.转移至磁力架上吸附2-3分钟；倒弃或吸弃溶液；
9.加入500μlBufferGW1，涡旋15秒重悬磁珠；转移至磁力架上吸附2～3分钟；倒弃或吸弃溶液；
10.加入500μlBufferGW1，涡旋15秒重悬磁珠；转移至磁力架上吸附2-3分钟；倒弃或吸弃溶液；
11.加入500μlBufferGW2，涡旋15秒重悬磁珠；
12.转移至磁力架上吸附2-3分钟；倒弃或吸弃溶液；
13.重复第11-12步一次；
14.短暂离心，转移至磁力架上吸附1分钟，吸弃所有溶液；
15.打开管盖，空气干燥10分钟；
16.加入30～50μlElutionBuffer，涡旋打散磁珠；55℃振荡温育5-10分钟；
17.转移至磁力架上吸附2-3分钟，把DNA转移至新的离心管中。
c)文库构建与全外显子测序：
使用核酸超声破碎仪将0.2-0.5μg FFPE DNA随机片段化。使用QubitTMdsDNA BRAssay试剂盒(购买于Invitrogen，货号Q32850)进行平均大小为150-250bp的片段选择。文库使用KAPA Hyper准备试剂盒(购买于KAPA，货号KK8504)构建。对这些片段进行末端修复，然后进行3'腺苷化。将接头连接到这些3'腺苷化片段的末端上。这些片段用前一步的接头进行扩增。PCR产物采用SureSelectXT Reagent Kit试剂盒(购买于Agilent，货号G9611B)回收。取一定数量的PCR产物与Agilent SureSelectXT Human All Exon V6试剂盒(购买于Agilent，货号5190-8863)进行杂交和清洗步骤。将前一步捕获的DNA片段再次扩增，并用磁珠(购买于BGI，货号LB00V60)回收PCR产物。对双链PCR产物进行热变性，经夹板寡核苷酸序列环状化，形成单链环状DNA(ssCir DNA)作为最终文库，经质量控制鉴定。该文库被扩增成DNA纳米球(DNA nanoball，DNB)，其中每个分子有300多个碱基对。在BGIseq-500平台(BGI-Shenzhen,China)上，将DNB加载到图版纳米阵列中，通过组合探针-锚点合成(combinedatorial proatorial anchor Synthesis,cPAS)生成双端100bp序列。
d)体细胞突变检测：
遵循GATK(The Genome Analysis Toolkit)Best Practice软件对全外显子数据进行体细胞单核苷酸变异(Single nucleotide variations，SNV)和短插入/缺失(Insertions and Deletions，InDel)检测：本发明用BWA-mem(v0.7.15)将双端测序的WES读数映射到人类参考基因组(hg19)。随后用picard(v2.22.8)对比对后的BAM文件进行预处理，并用GATK BaseRecalibrator(v4.1.7.0)重新校准碱基质量。然后，使用GATK的MuTect2从肿瘤和配对的正常样本中检测SNVs和InDels。然后用VEP(v105)和vcf2maf(v1.6.21)对所检测的体细胞变异进行基因注释。
为了鉴定子宫内膜癌的驱动基因突变，本发明使用MutSigCV工具基于突变率与基因特异性从肿瘤基因组中鉴定驱动肿瘤的基因。MutSigCV工具基于驱动肿瘤的基因会发生比随机突变更频繁地突变，因此可以通过比较基因的观察突变频率和期望突变频率来鉴定驱动突变基因，于是本发明使用基于泊松分布的统计模型来鉴定突变频率显著高于期望的基因。具体来说，该方法首先使用参考基因组和癌症样本中的突变数据来计算每个基因的突变率，然后使用各种因素(如样本污染和肿瘤异质性)来调整期望突变率，最后计算每个基因的MutSigCV分数，以鉴定驱动突变基因。
e)保育耐药相关突变基因筛选：
将患者基于保育治疗反应分为保育治疗耐药(n＝30)和保育治疗敏感(n＝32)两组，分别计算显著突变基因的突变频率，并进行Fisher精确检验或者卡方检验，计算OR值和p-value，以筛选保育耐药组中富集的体细胞基因突变。结果如图1A-C，其中，A为体细胞突变瀑布图，B为体细胞突变频率柱状图，C为SIGLEC10基因突变的位点分布棒棒糖图。
f)结果：
体细胞突变差异分析结果如图1A-C显示，保育耐药患者中显著富集SIGLEC10基因突变(p＝0.04)，即说明SIGLEC10基因突变促进了子宫内膜癌的保育治疗抵抗。
实施例2：SIGLEC10Q144K热点突变验证
本发明针对SIGLEC10Q144K热点突变设计了特异性巢式聚合酶链式扩增反应(PCR)引物及Sanger测序体系，检测SIGLEC10Q144K的特异性巢式PCR引物序列，其碱基序列为：
第一轮正向引物SIG-F1：5’-GAGGTCGTTGGTTTGGTTCC-3'(SEQ ID NO:1)；
第一轮反向引物SIG-R1:5’-GTCAGTGATGGTGCCGGAG-3'(SEQ ID NO:2)；
第二轮正向引物SIG-F2:5’-AGGGGGTGGACATTCCTCAA-3'(SEQ ID NO:3)；
第二轮反向引物SIG-R2:5’-GAATCTCCCACCACGGTCTC-3'(SEQ ID NO:4)。
结果如图2所示；结果证明了SIGLEC10Q144K热点突变的存在，且与保育治疗抵抗密切相关。
本发明开发了针对SIGLEC10Q144K基因编码的Sigelc10蛋白的免疫组织化学染色(IHC)试剂盒，可以基于Siglec10的免疫组化结果预测患者的保育治疗反应，所述试剂盒包括：环保脱蜡液(500ml)、无水乙醇(1L)、95％乙醇(1L)、90％乙醇(1L)、80％乙醇(1L)、PBS(50X，500mL)、抗原修复液(20X30mL)、组化笔、山羊血清、Siglec10的抗体、山羊抗兔二抗、DAB显色液(50X5mL)、苏木素(500ml)、盐酸分化液(500ml)和氨水反蓝液(500ml)。
结果如图2A-C所示，MT代表发生了SIGLEC10Q144K突变的患者，WT代表SIGLEC10Q144K未突变的患者。A为巢式PCR和Sanger测序结果验证了SIGLEC10Q144K的存在，B为SIGLEC10Q144K和SIGLEC10未突变患者的免疫组织化学染色图像，C为SIGLEC10Q144K突变与免疫组织化学评分的相关性；验证了SIGLEC10Q144K热点突变导致Siglec10蛋白的过表达。
实施例3：SIGLEC10Q144K促进子宫内膜癌保育治疗耐药性
本发明验证SIGLEC10Q144K促进子宫内膜癌保育治疗耐药性的过程为：
a)SIGLEC10Q144K过表达细胞株构建与培养
人子宫内膜癌细胞株Ishikawa和RL95-2购自中国科学院细胞库。
Ishikawa在添加10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。RL95-2细胞在含有15％胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。所有培养基中均添加青霉素和链霉素。所有细胞系均在使用前验证其无支原体污染，并在含有5％CO2的培养箱中以37℃培养。
用重组慢病毒SIGLEC10(购买于吉凯基因)转染子宫内膜癌细胞系(Ishikawa和RL95-2)wt/SIGLEC10Q144K过表达的质粒(购买于吉凯基因)24小时。以pΔ8.91-pVSVG-Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-Puro(购买于吉凯基因)为克隆载体。慢病毒的滴度维持在2×107IU，作为转染SIGLEC10的载体wt/SIGLEC10Q144K过表达质粒进入EC细胞系(Ishikawa MOI＝20；RL95-2MOI＝60)，Ishikawa细胞悬液密度约4×105/mL，RL95-2细胞悬液密度采用2×106/mL进行移植。空载质粒也被转染作为阴性对照。
b)SIGLEC10Q144K过表达细胞株在孕激素刺激下细胞增殖的检测
使用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK8)分析细胞活力。
1.将对数生长期细胞以2.5×103/孔的密度进行接种和培养，放入培养箱静置过夜。
2.用1.6983mL的DMSO将5mg的黄体酮(Progesterone，PRG，购买于Selleck，货号S705)溶解为10mM储存液，以200uL/EP管进行分装，药物溶液放入-80℃冻存。
3.96孔细胞培养板过夜贴壁后，按照指定药物和浓度对96孔板以倍比稀释的方式加药换液(100uL培养基/孔)。各实验组和空白对照组均设置有5个孔作为重复。空白对照组DMSO浓度为3uL/mL培养基。
4.参考文献中的药物作用时间，我们在加药后的第72小时弃掉96孔板中培养基，用培养基以9：1(培养基：CCK-8试剂原液)比例稀释CCK-8试剂后，加入96孔细胞培养板内。
5.用锡箔纸包装96孔细胞培养板以避光，放入细胞培养箱，静置3～4小时，以便试剂充分反应。将96孔细胞培养板放于酶标仪检测吸光度，设置吸收波长为450nm。
c)免疫共沉淀实验
1.裂解蛋白：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％NP-40、1X蛋白酶抑制剂复合物，并将pH调节至7.5。充分混合，放置于冰上。在培养皿中加入3ml配置好的蛋白裂解缓冲液，并不断吹打30至50分钟，并保证全程冰上操作。刮取细胞收集放入离心管内并做好标记。
2.使用anti-flag磁珠共沉淀目标蛋白(购买于MCE，货号HY-K0207)，将磁珠使用TBST缓冲液(购买于赛维尔生物，货号G2150-1L)漂洗，使用磁铁吸附磁珠并吸取废液，重复三次。然后使用0.1％NP-40裂解液漂洗1次，磁铁吸附吸去废液。保留500μl蛋白裂解混合物作为空白对照。放入负八十度冰箱过夜。每500μl裂解的蛋白裂解混合物加入10μl anti-flag磁珠在4℃下于旋转混合仪上孵育过夜。取出加入磁珠的蛋白裂解混合物，用TBS缓冲液洗涤3次，使用分光光度仪检测洗脱液分光光度值，当分光光度值小于0.01时则认为DNA全部洗脱。
3.磁珠结合蛋白加入5X Loading Buffer缓冲液中，在95℃下提取10min。使用磁铁吸附磁珠提取上清。然后按照进行SDS-PAGE电泳。
结果如图3A-E所示，其中，A为Western Blot验证了SIGLEC10Q144K促进Siglec10过表达，B，C为Bioplex数据库与免疫共沉淀实验表明Sigelc10与雌激素受体的相互作用，D，E为克隆形成实验和CCK8实验证明了SIGLEC10Q144K促进子宫内膜癌对孕激素的耐药性；结果表明SIGLEC10Q144K促进Siglec10蛋白过表达，而与雌激素受体相互作用，从而拮抗孕激素，导致保育治疗抵抗。即证明SIGLEC10Q144K和Siglec10蛋白过表达促进了子宫内膜癌保育治疗的抵抗。
综上可知，本发明将SIGLEC10基因的p.Q144K突变作为子宫内膜癌保育治疗耐药标志物，将检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变的试剂用于制备子宫内膜癌保育治疗耐药产品中，成功构建了治疗前预测子宫内膜癌患者保育治疗耐药状态的检测体系，解决了保育治疗耐药患者缺乏临床及准确性高的治疗反应预测体系问题，成功建立了临床可行性的保育治疗精准分层方案，有效提高患者的治疗反应率，保障患者的生活质量与预后。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.检测SIGLEC10基因是否发生p.Q144K(c.430C>A)突变的试剂在制备子宫内膜癌保育治疗耐药产品中的应用，其特征在于，所述SIGLEC10基因在430号碱基发生胞嘧啶到腺嘌呤的错义突变，使得其编码的Sigelc10蛋白的第144位氨基酸从谷氨酰胺突变为赖氨酸。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，通过检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变，从而对子宫内膜癌保育治疗患者的耐药情况进行判断。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，若SIGLEC10基因编码蛋白发生p.Q144K的突变，则对子宫内膜癌保育治疗患者产生耐药性。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述子宫内膜癌保育治疗的药物为孕激素。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述子宫内膜癌保育治疗的药物为醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮或左炔诺孕酮宫内缓释系统。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述产品包含检测SIGLEC10基因编码蛋白是否发生p.Q144K突变的巢式引物，所述巢式引物包括第一轮正向引物、第一轮反向引物、第二轮正向引物和第二轮反向引物。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述第一轮正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述第一轮反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述第二轮正向引物的序列如SEQID NO：3所示，所述第二轮反向引物的序列如SEQ ID NO：4所示。
8.根据权利要求6或7所述应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂或试剂盒。
9.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述Sigelc10蛋白的表达量采用免疫组化试剂盒进行检测。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述免疫组化试剂盒包括环保脱蜡液、乙醇、PBS、抗原修复液、EDTA、PBST、组化笔、山羊血清、Siglec10的抗体、二抗、DAB显色液和苏木素和氨水反蓝液。
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