CN117384262B - 结核分枝杆菌特异性T细胞HLA-A*0201限制性表位肽pMtb 8及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种结核分枝杆菌特异性T细胞HLA‑A*0201限制性表位肽pMtb 8及其应用，属于生物技术和医药领域。本发明结合生物信息学预测方法和紫外诱导肽置换实验，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，高效准确地检测出表位肽pMtb 8与HLA‑A*0201分子之间的亲和力。这是新的、未被报道过的HLA‑A*0201限制性结核分枝杆菌表位肽，被结核患者体内特异性CD8⁺T细胞识别并诱导活化。HLA‑A*0201基因型是人群中最广泛携带的HLA基因型之一，本发明表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有现实意义。

Description

结核分枝杆菌特异性T细胞HLA-A*0201限制性表位肽pMtb 8 及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和医药领域，特别涉及一种结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞HLA-A*0201限制性表位肽pMtb 8及其应用。

背景技术

结核病是因结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起、全球感染率极高的传染病。Mtb主要感染部位为肺部，引起肺结核。此外，Mtb也可感染其他器官和组织，如淋巴结、脑、肾、脊柱等等，发生肺外结核。据世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)数据，全球人口约1/4有感染过或者正在感染Mtb，仅2020年，约有1000万新发活动性肺结核病例。如今，结核病疫情呈现新的特点，即耐药结核病例越来越多，结核与艾滋病共感染情况愈演愈烈。针对这两类患者，目前并无有效的防治措施。中国是世界上结核病负担最重的国家之一，研发适合中国人群的结核病疫苗和治疗药物，对社会公共卫生事业和保护人民健康具有重要意义。

Mtb是胞内寄生菌，人体对其有效控制主要依赖于细胞免疫，尤其是T细胞免疫。人体内T细胞主要分为CD4⁺T(Th)细胞和CD8⁺T(CTL)细胞两大亚群，大量研究已经证明，这两种T细胞亚群对于控制Mtb感染都具有重要作用，其中CD8⁺T更是清除结核菌的主力军。T细胞通过识别抗原递呈细胞递呈的表位肽而活化，诱发抗结核免疫反应。表位肽是蛋白抗原序列中引起免疫应答的核心部份，也称为抗原决定簇，它与抗原递呈细胞表面的MHC(HLA)分子结合，形成肽-HLA复合物并被递送和表达在抗原递呈细胞(如树突状细胞、B淋巴细胞等)表面，进而活化T细胞。HLAI类分子将表位肽递呈给CD8⁺T细胞，HLAII类分子将表位肽递呈给CD4⁺T细胞。表位肽与HLA分子形成稳定的复合物，才能有效活化T细胞，而肽与HLA分子的亲和力是形成肽-HLA复合物的关键。因此，获得具有免疫效应的T细胞表位肽，首要步骤是筛选出高亲和力的多肽，进而鉴定出具有免疫活性的表位肽。

目前，临床用于预防结核病的疫苗只有卡介苗一种，卡介苗对于儿童结核病，特别是结核性脑膜炎等重症结核病的预防效果较好，但对于预防成年人的肺结核效果较差。目前，国内外对于新型疫苗的研究已成热门，基于表位肽的新型疫苗也是热点之一。表位肽可完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了活性序列以外病原体其他有害成分，安全性良好；还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。此外，表位肽可用于制备MHC四聚体，应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面。HLA-A*0201是最常见的HLA分子之一，鉴定HLA-A*0201限制性表位，具有广阔的应用人群，因此具有非常重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞HLA-A*0201限制性表位肽pMtb 8。

本发明的另一目的在于提供该结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞HLA-A*0201限制性表位肽pMtb 8在制备结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了与HLA-A*0201分子亲和力高，能活化CD8⁺T细胞、诱导其增殖和分泌IFN-γ的结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽，命名为pMtb 8，所述表位肽的氨基酸序列为：

pMtb 8：GLAEVFAV(SEQ ID NO.8)(即：Gly-Leu-Ala-Glu-Val-Phe-Ala-Val)；

本发明还提供了上述结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8在制备结核病诊断试剂中的应用。

本发明还提供了上述结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8在制备治疗结核病药物中的应用。

本发明还提供了上述结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8在制备结核病预防性/治疗性疫苗中的应用。

所述的药物为刺激HLA-A*0201型结核患者CD8⁺T细胞增殖的药物。

所述的药物为刺激分泌IFN-γ的细胞增殖的药物。

所述的药物为诱发针对结核病的细胞免疫应答的药物。

一种结核病诊断试剂盒，包括上述结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8。

一种药物组合物，包括上述结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8。

优选的，所述的药物相同或不同的分别可采用常规方法制成各种药用剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂、滴剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂型，如针剂等。

优选的，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或一种以上药学上可接受的载体或赋形剂。

优选的，所述的赋形剂可包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)疫苗仍是控制结核病流行的最佳策略。目前临床上使用的卡介苗仅对预防儿童重症结核有效，对成人无直接保护作用。因此，急需研制新型疫苗！基于表位开发的多肽疫苗具有以下几个重要的优点：首先，多肽疫苗有个独特的优势，即可以选择免疫优势的表位，避免菌体或蛋白疫苗与自身组织的交叉反应而引起的自身免疫等不良反应；其次，合成肽不含遗传物质，也没有恢复毒力的问题，而这两者是减毒疫苗和突变株令人担忧之处；再次，多肽表位疫苗能够诱导比蛋白疫苗更多的免疫反应，并且能避免蛋白疫苗诱导的集中免疫；此外，表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短，还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。然而，抗原表位构象复杂，准确筛选具有局限性，免疫原性较低，需要佐剂辅助才能产生较好免疫应答。目前发现的结核菌CTL表位肽主要是在欧美人群中鉴定，而对于结核病流行严重的亚洲人群效果未可知。本发明对于抗结核多肽疫苗和诊断试剂的研发具有重要意义。

(2)本发明结合生物信息学预测方法和紫外诱导肽置换实验，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，高效准确地检测出表位肽pMtb 8与HLA-A*0201分子之间的亲和力。这是新的、未被报道过的HLA-A*0201限制性结核分枝杆菌表位肽，被结核患者体内特异性CD8⁺T细胞识别并诱导活化。HLA-A*0201基因型是人群中最广泛携带的HLA基因型之一，本发明表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有现实意义。

附图说明

图1为候选表位肽pMtb 8与HLA-A*0201分子亲和力示意图。

图2为表位肽pMtb 8的序列的质谱分析图。

图3为ELISPOT检测pMtb 8诱导结核患者T细胞分泌IFN-γ的示意图。

图4为CFSE标记增殖实验检测pMtb 8诱导结核患者CD8⁺T细胞增殖的结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本发明综合利用各种生物信息学、免疫信息学的技术手段，对结核分枝杆菌抗原蛋白的HLA-A*0201限制性CD8⁺T表位肽进行了预测分析，采用紫外诱导肽置换实验检验候选肽与HLA-A*0201分子结合的亲和力和稳定性，筛选获得表位肽，通过免疫学实验鉴定表位肽的功能效应。筛选结果发现CD8⁺T表位肽pMtb 8可诱导HLA-A*0201型结核患者的CD8⁺T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，并诱导CD8⁺T细胞发生显著增殖。

实施例1：HLA-A*0201限制性表位肽的获得

应用生物信息学方法，预测HLA-A*0201限制性表位肽：

从HLA基因频率数据库AFND(Allele Frequency Net Database,AFND)上获得人群HLA-A位点各基因型的频率分布信息，其中HLA-A*0201在欧洲人群中等位基因频率约为27％，在中国人群中携带频率约为11％，是最高频的HLA-A基因型之一。

通过调研文献，筛选了具有较强免疫原性的结核分枝杆菌抗原蛋白，一共30个，具体蛋白名称见表1。从GeneBank获得各个抗原蛋白的氨基酸序列。

表1.候选结核分枝杆菌抗原蛋白

使用生物信息学算法预测抗原蛋白所含的HLA-A*0201限制性CD8⁺T表位肽，采用的算法为CBS数据库中的NetMHCcons。根据IC50值将预测结果进行排序，IC50值越低，说明表位肽与HLA分子亲和力越高，通常认为IC50值低于50nM即表示高亲和力。由此，预测出30个抗原蛋白中HLA-A*0201限制性表位肽，并且筛选出高亲和力的表位肽，作为候选表位肽，如表2所示。

表2.HLA-A*0201限制性候选表位肽

应用紫外诱导肽置换实验方法，检测候选表位肽与HLA-A*0201分子之间的亲和力和结合稳定性。实验过程如下：

含光敏感性表位肽的肽-HLA*0201复合物在紫外线照射下，光敏感性表位肽发生断裂，断裂的肽段不再与HLA*0201结合，因此与HLA*0201分子分离，这时往反应体系中加入待检测的候选表位肽，如果候选表位肽与HLA*0201分子具有较高的亲和力，二者则可形成新的稳定的表位肽-HLA复合物，反之，如果候选表位肽与HLA*0201分子不具有较高亲和力，二者则无法形成新的稳定的表位肽-HLA复合物，同时，失去表位肽的HLA*0201分子不稳定，快速降解。使用抗-β2m抗体捕获HLA分子，ELISA检测新形成的表位肽-HLA复合物浓度，评价表位肽和HLA分子之间的亲和力大小。以阳性肽作为阳性对照(Pos.control)，阴性肽作为阴性对照(Neg.control)，不添加表位肽作为空白对照(No peptide)；阳性肽的氨基酸序列为NLVPMVATA；阴性肽的氨基酸序列为CTELKLSDY。参照阳性肽(Pos.control)，结合力大于100％则表示候选肽与HLA-A*0201的结合力大于阳性肽，即为高结合力肽。其中，pMtb 8与HLA-A*0201结合力为211.4％，见图1和表3所示。

表3.pMtb8与HLA-A*0201高亲和力结合

实验结果：

表位肽pMtb 8的氨基酸序列为GLAEVFAV(SEQ ID NO.8)，其质谱分析图如图2所示。生物信息学预测结果，表位肽pMtb 8与HLA-A*0201结合力IC50值为3.66nM；紫外置换实验检测，表位肽pMtb 8与HLA-A*0201可形成稳定的复合物，结合力为211.4％；可见表位肽pMtb 8与HLA-A*0201分子间具有很高的亲和力。

实施例2：ELISpot实验检测表位肽pMtb 8诱导T细胞分泌IFN-γ

实验过程如下：

采用密度梯度法分离HLA-A*0201基因型结核患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear，PBMC)。将收集的20mL外周血用PBS稀释一倍，缓慢加入淋巴细胞分离液上方，两者体积比为2：1，然后以800g/min转速离心30min，离心后液体分为三层，其中PBMC在第一层和第二层之间，成白膜状，用滴管小心吸取PBMC至新的离心管中，加入5倍以上体积PBS洗涤，800g/min离心10min，重复洗涤一次，用冻存液(90％FBS+10％DMSO)冻存细胞，液氮储存。

ELISpot实验：复苏HLA-A*0201基因型患者PBMC，在37℃，5％ CO₂孵箱中静置过夜。用去死细胞磁珠去除PBMC中的死细胞。细胞计数，完全培养基重悬细胞至1.25×10⁶个/mL，将200μL/孔细胞悬液铺入ELISpot板(即2.5×10⁵个/孔)，共48孔。将表位肽pMtb 8按10μg/mL浓度加入孔中，阳性对照孔分别加入4μg/mLPHA(植物血凝素)，2个阴性对照孔不加任何刺激，补上全培。各孔分别加好样后，将培养板置于细胞培养箱中，37℃，5％ CO₂培养24h。取出ELISpot板，PBS洗涤5次，拍干后加入酶标抗IFN-γ抗体100μL，孵育2h，PBS洗涤5次，拍干后加入显色剂100μL，待阳性对照孔出现明显斑点后，用超纯水终止反应；晾干，读板，计数，校正。肽特异性T细胞频率以SFC/10⁶表示。

实验结果：图3显示表位肽pMtb 8刺激HLA-A*0201结核患者后，ELISPOT检测的分泌IFN-γ抗原特异性CD8⁺T细胞的频率。由图可以看出，HLA-A*0201结核患者PBMC中，pMtb8特异性CD8⁺T细胞频率显著高于阴性对照组(NC)。

实施例3：CFSE标记的淋巴细胞增殖实验检测表位肽pMtb 8诱导CD8⁺T细胞增殖

实验过程如下：

复苏HLA-A*0201型结核患者PBMC，静置过夜。使用去死细胞磁珠去除死细胞，计数，离心后用PBS重悬细胞至1×10⁷个/mL，加入5μM CFSE标记，混匀后避光孵育10min。加入5倍体积预冷的完全培养基(10％FBS+RPMI-1640)终止染色标记。300g离心10min，用完全培养基洗涤，重复两次。再次计数，用完全培养基重悬细胞至1×10⁶个/mL。将细胞悬液铺入96孔U底细胞培养板中，200μL/孔，共8孔，实验组各孔分别加入10μg/mL表位肽pMtb8，阳性对照孔加入4μg/mL PHA，阴性对照孔不加任何刺激物，补足全培。在荧光显微镜下观察，确定细胞被CFSE标记(绿色荧光)。37℃，5％ CO₂孵箱中培养48h。各孔中分别加入100IU IL-2，继续培养至第7d，取出细胞，洗涤后标记anti-CD8抗体，流式细胞术检测。

根据CFSE染料标记的特点，染料随细胞增殖均匀地从母代细胞分配到子代细胞中，荧光强度减半。所以，弱CFSE荧光的细胞，即为增殖后的细胞。表位肽诱导CD8⁺T细胞增殖能力由弱CFSE荧光的CD8⁺T细胞/CD8⁺T细胞表示。

实验结果：检测结果如图4所示，从中可以看出表位肽pMtb 8可诱导HLA-A*0201型结核患者CD8⁺T细胞发生特异性增殖，而健康志愿者不发生明显增殖。这表明pMtb 8具有较强的免疫原性，能够诱导CD8⁺T细胞活化并扩大CD8⁺T细胞反应。

综上所述，本发明筛选鉴定的表位肽pMtb 8能够特异地被HLA-A*0201型结核患者识别，并诱导CD8⁺T细胞增殖和分泌IFN-γ，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。如可以将本发明表位肽pMtb 8直接作为结核病的疫苗，也可将表位肽pMtb 8作为治疗结核病药物的成分；也可以通过检测患者对表位肽pMtb 8的免疫反应来判断患者是否患有结核病，故表位肽pMtb 8也可作为结核病诊断试剂盒中的成分。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8的应用，其特征在于，为下述应用之一：

1）结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8在制备结核病诊断试剂中的应用；

2）结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8在制备治疗结核病药物中的应用；

所述的结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的结核分枝杆菌特异性CD8⁺T细胞表位肽pMtb 8在制备结核病预防性/治疗性疫苗中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物还含有一种或以上药学上可接受的载体或赋形剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的赋形剂包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂或防腐剂。