CN117355600A

CN117355600A - 遗传修饰的nk细胞及其用途

Info

Publication number: CN117355600A
Application number: CN202280036465.5A
Authority: CN
Inventors: 郑勇; 吴琼; 曹锐修; 顾继杰
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2024-01-05
Also published as: WO2022242700A1; KR20240010717A; EP4341383A1; US20240285685A1; JP2024521566A; EP4341383A4

Abstract

本文提供了经遗传修饰的NK细胞及其用途。经修饰的NK细胞可用于癌症的CAR‑NK细胞的过继细胞疗法。

Description

遗传修饰的NK细胞及其用途

技术领域

本公开涉及基因工程改造和免疫治疗领域。本公开尤其涉及经遗传修饰的NK细胞及其在疾病治疗中的用途，例如在用于癌症的CAR-NK疗法和/或过继细胞疗法中的用途。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞占人外周血单核细胞(PBMC)的15％，是在抵御肿瘤和病毒感染中发挥着重要作用的细胞毒性淋巴细胞，目前已知其是连接适应性免疫系统和先天免疫系统的重要组成部分。

NK细胞的活性受到一系列识别靶细胞或抗原呈递细胞上相应配体的共刺激(例如NKG2D、CD226)和共抑制表面受体(例如PD-1、TIGIT、CD96、TIM-3、LAG-3、NKG2A)的调节。共刺激和共抑制信号的整合决定了NK细胞的反应性。

TIGIT(具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是NK和T细胞表达的跨膜糖蛋白受体，其是抑制T细胞和NK细胞活化的免疫检查点分子。TIGIT包含IgV结构域、跨膜结构域和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。CD96是同一免疫球蛋白超家族的成员，其具有相似的抑制作用，但与TIGIT相比，其与配体CD155的结合亲和力较低。CD155(主要)和CD112作为TIGIT和CD96结合的配体，从而抑制T细胞和NK细胞介导的免疫。CD155(脊髓灰质炎病毒进入受体，PVR)在正常人体组织中几乎不表达，但在各种肿瘤细胞系和原发性恶性肿瘤中高表达。临床前和临床证据已经证明，用单克隆抗体阻断TIGIT增强NK细胞和T细胞的抗肿瘤和抗病毒活性。

NKG2A(NK组2成员A)是NKG2家族的NK细胞受体，其与CD94形成异二聚体的II型膜受体。NKG2A与CD94二聚化，形成与C型凝集素相关并识别HLA-E的抑制性受体。这些抑制性受体与靶细胞上的MHC I配体相互作用，从而完全抑制细胞颗粒极化并防止细胞毒性颗粒释放。NKG2A在其胞质尾部含有两个ITIM。这些ITIM在连接具有ITIM的受体后经磷酸化，并促进酪氨酸磷酸酶的募集，例如含有SH2结构域的磷酸酶(SHP)-1和SHP-2。通过具有ITIM的受体招募SHP-1似乎抑制信号转导的启动，因为其阻断NK细胞中的大多数下游信号。血液肿瘤和实体瘤的肿瘤细胞显示出HLA-E表达上调。在各种癌症中，不良预后与HLA-E上调有关。可将用抗体阻断CD94/NKG2A受体作为一种治疗策略。

CISH(细胞因子诱导含SH2的蛋白)是NK细胞中关键的负性胞内免疫检查点，是胞内细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)家族的成员并且是细胞因子和生长因子信号转导通路的重要调节因子。与其他成员类似，CISH具有中心SH2结构域，该结构域能够与磷酸酪氨酸残基以及招募泛素转移酶系统的SOX盒基序相互作用，从而引导它们进行蛋白酶体降解。IL-15迅速诱导CISH，而缺失CISH的NK细胞对IL-15更敏感，其特征在于增强增殖、细胞因子产生和对肿瘤的细胞毒性。

遗传修饰有望改变包括T细胞、树突状细胞和NK细胞在内的各种细胞类型的功能。许多工作已经进行，特别是针对一系列肿瘤抗原的T细胞进行遗传重定向。然而，对原代NK细胞进行遗传修饰中的困难导致该领域在一定程度上落后于T细胞。一些研究已使用细胞因子转基因(例如IL-2、IL-12或IL-15转基因)来修饰NK细胞，从而通过直接向细胞提供必要的细胞因子来增强NK细胞功能。然而，大多数研究描述了通过嵌合受体重定向NK细胞特异性。

仍然十分需要在制备和使用过程中具有长期持久性并具有抗肿瘤作用增强和副作用减少的NK细胞。

发明内容

本文公开了经遗传修饰的NK细胞及其在疾病治疗中的用途，例如在癌症的过继细胞疗法中的用途。

在第一方面，本文公开了分离的经遗传修饰的NK细胞，其中NK细胞经修饰以削弱TIGIT、NKG2A和CISH中一种或多种的功能性表达。根据一些实施方式，NK细胞还可包含嵌合抗原受体(CAR)

在一些实施方式中，提供了分离的经修饰的NK细胞，其中NK细胞经修饰以削弱TIGIT、NKG2A和CISH中至少两种的功能性表达。

在一些实施方式中，提供了分离的经修饰的NK细胞，其中NK细胞经修饰以削弱TIGIT、NKG2A和CISH中一种或多种的功能性表达，并且其中NK细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)。

在第二方面，本文公开了包含本公开所述经修饰的NK细胞的细胞群或细胞培养物。

在第三方面，本文公开了包含本公开所述经修饰的NK细胞、细胞群或细胞培养物的产品。在一些实施方式中，产品是药物、药物组合物或试剂盒。

在第四方面，本文公开了用于制备本公开所述经修饰的NK细胞的方法。

在第五方面，本文公开了本公开所述经修饰的NK细胞、细胞群、细胞培养物在制备用于治疗疾病的产品中的用途。

在第六方面，本文公开了用于在有需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括给予有效量的本公开所述经修饰的NK细胞、细胞群、细胞培养物或产品。

在第七方面，本文公开了本公开所述经修饰的NK细胞、细胞群体、细胞培养物或产品用于治疗疾病。

通过以下描述和所附权利要求书，本申请的其他目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求书和具体实施例尽管示出了本申请的优选实施方式，但它们仅以示例性说明的方式给出。通过阅读以下内容，在所公开的发明的精神和范围内所做出的各种改变和修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。

附图简要说明

所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述阐述了利用本发明原理的说明性实施方式和附图，其中：

图1显示了扩增的NK细胞的纯度。

图2显示了通过流式细胞术测试的NK细胞中CRISPR/Cas9的TIGIT敲除(KO)效率。

图3A-3B显示了通过流式细胞术测试的NK细胞中CRISPR/Cas9的NKG2A敲除效率。

图4显示了通过流式细胞术测试的NK细胞中CRISPR/Cas9的TIGIT和NKG2A双重敲除效率。

图5显示了通过Western印迹测试的NK细胞中CRISPR/Cas9的CISH敲除效率。

图6显示了HT1080肿瘤细胞的CD155和HLA-E表达。“阴性”是指用荧光标记的对照抗体染色的细胞的阴性对照。

图7显示了经遗传修饰的NK细胞对HT1080-ZsGreen靶细胞的细胞毒性试验的结果。

图8A-8B显示了经修饰的NK治疗后A549荷瘤小鼠中的肿瘤生长抑制。统计数据通过双向方差分析。*p<0.05；**p<0.01。

图9A-9B显示了CD19 CAR-NK和mCD19 CAR-NK中抗CD19 CAR的表达。

图10A-10B显示了通过流式细胞术测定的mCD19 CAR-NK中TIGIT的敲除效率。

图11A-11B显示了通过Western印迹测定的mCD19 CAR-NK中CISH的敲除效率。

图12A-12B显示了mCD19 CAR-NK细胞对Raji-luc靶细胞的细胞毒性试验的结果。统计数据通过双向方差分析。*p<0.05；**p<0.01；****p<0.0001。

图13A-13B显示了mCD19 CAR-NK细胞对Raji-luc靶细胞的连续杀伤试验的结果。统计数据通过双向方差分析。***p<0.001。

图14A-14B显示了细胞毒性试验中IFN-γ的细胞因子释放。统计数据通过双向方差分析。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图15A-15B显示了连续杀伤试验中IFN-γ的细胞因子释放。

统计数据通过双向方差分析。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

具体实施方式

以下描述和实施例详细说明了本发明的实施方式。应理解，本发明不限于本文所述的特定实施方式，因此可以改变。本领域技术人员将认识到，本发明有许多变化和修改形式，它们都包含在本发明范围内。

本公开主要基于这样的点点滴滴的意想不到的发现，即削弱NK细胞中TIGIT、NKG2A和/或CISH的功能性表达可以显著改善经遗传修饰的NK细胞的细胞毒性并延长NK细胞的体外或体内寿命。基于该发现，本公开提供了经遗传修饰的NK细胞及其制备方法，其中对NK细胞的TIGIT、NKG2A和/或CISH中至少一种进行削弱，并且其中所述NK细胞还可以包含嵌合抗原受体或与嵌合抗原受体偶联。本文还提供了包含本公开的NK细胞的细胞群、细胞培养物或产品以及其在治疗疾病中的用途，例如癌症、自身免疫性疾病、传染病、移植排斥和其他年龄相关疾病。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所适用领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但是描述了优选的方法和材料。

本文所用术语“一个”或“一种”旨在表示“一个(种)或多个(种)”(即，至少一个(种))冠词在语法上的宾语。除非上下文中另有定义，否则单数表述包括复数表述。例如，“一个(种)元素”表示一个(种)元素或者多于一个(种)元素。

“约”或“大约”意指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的变化相对于参比数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度可达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

除非另有说明，否则“或”表示“和/或”。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”和“含有”将应理解为暗示包括规定步骤或元素或者步骤组或元素组，并且不排除任何其他步骤或元素或步骤组或元素组。

短语“由......组成”旨在包括且限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”是指示所列出元素是必需的或强制性的，并且可以存在其他元素。

术语“分离(的)”是指基本上或本质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，例如蛋白质或核酸。例如，本文所用的“分离的细胞”是指从天然存在状态的细胞中纯化的细胞。

术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指对先天免疫系统至关重要的一类细胞毒性淋巴细胞。NK细胞介导抗肿瘤和抗病毒反应，因此具有广阔的临床应用前景。本公开的NK细胞可以源自血液(例如自体同源或同种异体PBMC)、NK细胞系(例如NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS、NKL等)或分化的干细胞(例如iPSC)。

TIGIT、NKG2A和/或CISH

本文所用术语“TIGIT”或“TIGIT基因”是指编码具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的核苷酸分子，所述TIGIT是抑制T细胞和NK细胞活化的免疫检查点分子。

TIGIT基因是编码TIGIT多肽的基因，例如具有SEQ ID NO:25所示序列的TIGIT多肽，或者具有与前述TIGIT多肽或本领域已知的任何TIGIT多肽高同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％同一性)并具有相同免疫检查点功能的TIGIT多肽。

例如，TIGIT基因可以是但不限于具有SEQ ID NO:26所示序列的核酸分子；具有与前述TIGIT基因或本领域已知的任何TIGIT基因高同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％同一性)并具有相同的编码和表达功能性TIGIT多肽的功能的TIGIT多肽编码序列。

本文所用术语“NKG2A”或“NKG2A基因”是指编码NK组2成员A(NKG2A)(一种II型膜受体)的核苷酸分子，所述NKG2A是与CD94形成异二聚体并与HLA-E相互作用以抑制细胞颗粒极化并防止细胞毒性颗粒释放。

NKG2A基因是编码NKG2A多肽的基因，例如具有SEQ ID NO:27所示序列的TIGIT多肽，或者具有与前述NKG2A多肽或本领域已知的任何NKG2A多肽高同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％同一性)并具有相同免疫检查点功能的NKG2A多肽。

例如，NKG2A基因可以是但不限于具有SEQ ID NO:28所示序列的核酸分子；具有与前述NKG2A基因或本领域已知的任何NKG2A基因高同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％同一性)并具有相同编码和表达功能性NKG2A多肽的功能的NKG2A多肽编码序列。

本文所用术语“CISH”或“CISH基因”是指编码细胞因子诱导含SH2的蛋白(CISH)的核苷酸分子，所述CISH是NK细胞中关键的负性胞内免疫检查点并且是胞内细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)家族的成员，是细胞因子和生长因子信号转导通路的重要调节因子。

CISH基因是编码CISH多肽的基因，例如具有SEQ ID NO:29所示序列的TIGIT多肽，或者具有与前述CISH多肽或本领域已知的任何CISH多肽高同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％同一性)并具有相同免疫检查点功能的CISH多肽。

例如，CISH基因可以是但不限于具有SEQ ID NO:30所示序列的核酸分子；具有与前述CISH基因或本领域已知的任何CISH基因高同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％同一性)并具有相同编码和表达功能性CISH多肽的功能的CISH多肽编码序列。

术语“削弱(impair)/抑制表达”是指抑制或减少或消除基因或蛋白质的表达。为了抑制或减少或消除基因(即编码TIGIT、NKG2A或CISH的基因)的表达，可以修饰基因的序列和/或结构，以使基因不会被转录(对于DNA)或翻译(对于RNA)，或者不会被转录或翻译以产生功能性蛋白(例如，转录因子)。

本文描述了或者是本领域已知用于抑制或减少或消除基因表达的各种方法。一些方法可以将核酸取代、添加和/或缺失引入野生型基因中。一些方法还可以在基因中引入单链或双链断裂。如上所述，为了抑制或减少或消除蛋白质的表达，可以抑制或减少或消除编码蛋白质的基因或多核苷酸的表达。

本文所用术语表达“削弱(的)”或“抑制(的)”是指参比对照水平减少至少10％，例如减少至少约20％，或至少约30％，或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括减少100％(即与参比样品相比不存在的水平)。

本文所用术语“失活(的)”是指阻止由该基因编码的多肽产物的表达。失活可以在基因表达的任何阶段或过程发生，包括但不限于：转录、翻译和蛋白质表达，并且失活可以影响任何基因或基因产物，包括但不限于：DNA、RNA(诸如mRNA)和多肽。

在一些实施方式中，通过基因缺失来抑制基因或使其失活。如本文所用，“基因缺失”是指去除基因的或邻近基因处的至少部分DNA序列。在一些实施方式中，经历基因缺失的序列包含基因的外显子序列。在一些实施方式中，经历基因缺失的序列包含基因的启动子序列。在一些实施方式中，经历基因缺失的序列包含基因的侧接序列。一些实施方式中，将部分基因序列从基因中去除。在一些实施方式中，将完整的基因序列从染色体中去除。在一些实施方式中，宿主细胞包含基因缺失，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，通过使基因序列中至少一个核苷酸或核苷酸碱基对缺失来抑制基因或使基因失活，产生非功能性基因产物。在一些实施方式中，通过基因缺失使基因失活，其中使基因序列缺失至少一个核苷酸将产生不再具有原始基因产物功能或活性的基因产物；或者基因是功能失调基因产物。

在一些实施方式中，通过基因添加或取代抑制基因或使基因失活，其中将至少一个核苷酸或核苷酸碱基对添加到基因序列或将其取代产生非功能性基因产物。在一些实施方式中，通过基因失活抑制基因或使其失活，其中向基因序列纳入至少一个核苷酸或将其取代产生不再具有原始基因产物功能或活性的基因产物；或者基因是功能失调基因产物。在一些实施方式中，通过添加或取代抑制基因或使其失活，其中将至少一个核苷酸纳入基因序列或将其取代产生功能失调基因产物。在一些实施方式中，宿主细胞包含如本文任何实施方式所述的基因添加或取代。

用于削弱宿主细胞中基因功能性表达的方法和技术包括但不限于成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、同源重组、非同源末端连接和大范围核酸酶、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA；也称为短发夹RNA)。

在一些实施方式中，TIGIT可以通过包含gRNA的CRISPR/Cas9系统削弱，所述gRNA选自SEQ ID NO:1-6，例如SEQ ID NO:3、2或6。在一些实施方式中，NKG2A可以通过包含gRNA的CRISPR/Cas9系统削弱，所述gRNA选自SEQ ID NO:7-18，例如SEQ ID NO:18、7或10。在一些实施方式中，CISH可以通过包含gRNA的CRISPR/Cas9系统削弱，所述gRNA选自SEQ ID NO:19-24，例如SEQ ID NO:21、19或24。

在一些实施方式中，双重或三重敲除可以通过使用包含针对TIGIT、NKG2A和CISH中两种或三种的gRNA的CRISPR/Cas9系统来进行，例如选自SEQ ID NO:1-6的gRNA、选自SEQID NO:7-18的gRNA和选自SEQ ID NO:19-24的gRNA中的两种或更多种gRNA。例如，CRISPR/Cas9系统可以包含SEQ ID NO:3、18和/或21的gRNA。

根据本申请的公开内容，TIGIT、NKG2A和/或CISH中的一种或多种的削弱可以增加体外和/或体内细胞扩增；延长体外和/或体内细胞寿命；改善体内细胞耗竭；增加NK细胞对靶细胞的细胞毒性；和/或调节NK细胞分泌细胞因子、白细胞介素和/或生长因子。

嵌合抗原受体(CAR)

本申请经修饰的NK细胞还可包含工程改造的抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，包括激活性或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)。

CAR通常包括与一种或多种胞内信号转导组件连接的胞外抗原(或配体)结合结构域，在一些方面，通过接头和/或跨膜结构域连接。这类分子通常模拟或模仿通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体组合的这类受体的信号和/或单独通过共刺激受体的信号。

在一些实施方式中，构建对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性的CAR，例如待过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如癌症标志物，和/或旨在诱导减弱/抑制反应的抗原，例如在正常或非患病细胞类型上表达的抗原。因此，CAR通常在其胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方式中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。

在一些实施方式中，CAR包含特异性结合抗原的抗体重链结构域，例如癌症标志物或待靶向的细胞或疾病的细胞表面抗原，例如肿瘤细胞或癌细胞，例如本文所描述或本领域已知的任何靶抗原。

在一些实施方式中，CAR的靶标包括但不限于BCMA、CD19、CD20、CD22、PSMA、ACE2、CD7、CS1、EGFR/EGFRVIII、ErBb2/HER2、CD3、CD138和NKG2D。

抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞的生产。在一些实施方式中，抗体是重组产生的片段，例如包含非天然存在的排列的片段，例如具有通过合成接头(例如肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的片段，和/或可不是通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些方面，抗体片段是scFv。

在一些实施方式中，CAR包含特异性识别细胞表面表达的抗原(例如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如scFv)。在一些实施方式中，CAR包括抗BCMA VHH。

在一些方面，抗原特异性结合或识别组件与一个或多个跨膜和胞内信号转导结构域连接。在一些实施方式中，CAR包括与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况中，通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。

在一些实施方式中，跨膜结构域源自天然来源或合成来源。当来源是天然的时，结构域在某些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自(即，至少包括以下跨膜区)CD8，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，T细胞受体α、β或ζ链的跨膜区。或者，一些实施方式中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成的跨膜结构域的各端都会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方式中，CAR包括CD8铰链和跨膜区。

在一些实施方式中，存在短寡肽或多肽接头，例如长度为2-10个氨基酸的接头，例如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并且在CAR的跨膜结构域和细胞质信号转导结构域之间形成连接。

CAR通常包括至少一个或多个胞内信号转导组件。在一些实施方式中，CAR包括TCR复合物的胞内组件，例如介导T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3⁺链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合分子与一个或多个细胞信号转导模块连接。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号转导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方式中，CAR还包括一种或多种其他分子的部分，例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面，CAR包括CD3-ζ(CD3ζ)或Fc受体γ和CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。

在一些实施方式中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或胞内信号转导结构域激活NK细胞的至少一种正常效应功能或应答。

在一些实施方式中，CAR包括共刺激受体的信号转导结构域和/或跨膜部分，例如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。在一些方面，相同的CAR包括激活成分和共刺激组件；在其他方面，激活结构域由一个CAR提供，而共刺激组件由识别另一抗原的另一CAR提供。

在某些实施方式中，胞内信号转导结构域包含与CD3(例如，CD3-ζ)胞内结构域连接的CD28跨膜和信号转导结构域。在一些实施方式中，胞内信号转导结构域包含与CD3ζ胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。

在一些实施方式中，CAR包括在胞质部分中与激活结构域(例如主要激活结构域)组合的两个或更多个共刺激结构域。一个示例是包含CD3-ζ、CD28和4-1BB胞内组件的受体。

在一些实施方式中，CAR包含抗BCMA VHH，其具有人CD8铰链和跨膜区、胞质结构域4-1BB和CD3ζ。

在一些实施方式中，CAR或其他抗原受体还包括标志物，以确认转导或工程改造细胞以表达受体，例如细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR)。

在一些情况，将CAR称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供此类信号和共刺激信号的CAR，例如包含来自共刺激受体(例如CD28或CD137)的胞内信号转导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。

在一些方面，CAR或其他抗原受体是抑制性CAR(例如iCAR)并且包括减弱或抑制反应的胞内成分，例如免疫反应，例如细胞中ITAM和/或共刺激促进的反应。这类胞内信号转导组件的示例是在免疫检查点分子上发现的那些，包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR)。在一些方面，工程改造的细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包括此类抑制性分子的信号转导结构域或衍生自此类抑制性分子的信号转导结构域，从而将该工程改造的细胞用于抑制细胞的反应，例如由活化和/或共刺激CAR诱导的细胞反应。例如，在通过激活受体(例如CAR)识别的抗原也在正常细胞表面表达或也可能表达的情况下，将此类CAR用于减少脱靶效应的可能性。在一些方面，引入识别对正常细胞具有特异性的标志物的抑制性受体，例如iCAR。

在一些示例性实施方式中，设计CAR包含CD8信号肽(例如，包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:32编码)；抗CD19 scFv FMC63(例如，包含SEQ ID NO:33或由SEQ ID NO:34编码)；人CD8铰链区和跨膜区(例如，包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:36编码)；胞质结构域4-1BB(例如，包含SEQ ID NO:37或由SEQ ID NO:38编码)；和/或CD3ζ(例如，包含SEQ IDNO:39或由SEQ ID NO:40编码)。

细胞群、细胞培养物或产品

本文还提供包含本文公开的经修饰的NK细胞的细胞群、细胞培养物或产品。

在本公开的一些实施方式中，细胞群、细胞培养物或产品中至少50％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％的细胞是本申请所述的经修饰的NK细胞。在一些实施方式中，细胞群、细胞培养物或产品不含其他细胞。

在一些实施方式中，细胞群、细胞培养物或产品可以用于疾病治疗，例如用作药物组合物和制剂。药物组合物和制剂通常包含一种或多种任选的药学上可接受的运载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包含至少一种其他治疗剂。

术语“药物制剂”指此类形式的制备物，该形式的制备物能够使其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含对待给予该制剂的对象具有不可接受的毒性的其他成分。

“药学上可接受的运载体”指药物制剂中不是活性成分的一种成分，对对象无毒。药学上可接受的运载体包括但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些实施方式中，运载体的选择部分决定于特定细胞、结合分子和/或抗体，和/或给药方法。因此，存在多种合适的制剂。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol,A.编(1980)。药学上可接受的运载体在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒。

所述制剂或组合物还可以包含多于一种活性成分，该活性成分能够用于用结合分子或细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选对结合分子或细胞具有补充活性的那些，其中相应活性剂彼此不产生负面影响。这些活性成分适合以目标效果有效量存在于组合中。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱等等。

在一些实施方式中，向对象给予的经遗传工程改造的细胞的范围为约100万至约1000亿细胞，例如，100万-约500亿细胞(例如，约500万细胞、约2500万细胞、约5亿细胞、约10亿细胞、约50亿细胞、约200亿细胞、约300亿细胞、约400亿细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，例如约1000万-约1000亿细胞(例如，约2000万细胞、约3000万细胞、约4000万细胞、约6000万细胞、约7000万细胞、约8000万细胞、约9000万细胞、约100亿细胞、约250亿细胞、约500亿细胞、约750亿细胞、约900亿细胞或前述任何两个值之间确定的范围)，并且在一些情况，约1亿-约500亿细胞(例如，约1.2亿细胞、约2.5亿细胞、约3.5亿细胞、约4.5亿细胞、约6.5亿细胞、约8亿细胞、约9亿细胞、约30亿细胞、约300亿细胞、约450亿细胞)或这些范围之间的范围任何值，和/或每千克对象体重该数值。

本公开的药物可以使用标准给药技术、制剂和/或装置给予。提供了用于储存和给予组合物的制剂和装置，例如注射器和小瓶。细胞的给予可以是自体同源的或异源的。例如，可以从一名对象获得免疫应答细胞或祖细胞，并将其给予同一对象或不同的相容的对象。外周血来源的免疫应答细胞或其后代可以通过局部注射给予，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给予。在给予治疗组合物(例如，含有经遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制为单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、含服、舌下或栓剂给药的制剂。在一些实施方式中，将细胞群肠胃外给予。本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞群通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送给予。

治疗方法及用途

还提供了本公开经工程改造的细胞、细胞群、细胞培养物、产品的治疗方法和用途。该方法和用途可以涉及向患有可经NK细胞治疗的疾病、病症或病症的对象给予细胞或含有细胞的组合物。

如本文所用，“治疗”(及其语法变体，例如“处理”或“疗法”)是指疾病或病症或紊乱、或症状、副作用或结果、或与其相关的表型的完全或部分改善或减轻。治疗的理想效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理后果，防止转移，降低疾病进展速率，改善或缓解疾病状态，缓解或改善预后。

本文所用术语“治疗有效量”在给予/给药的上下文中是指在必要剂量/数量和时间段内，有效实现所需结果(例如治疗结果)的量。试剂(例如药物制剂)的“治疗有效量”是指在必要剂量和时间段内，有效实现所需治疗结果(例如用于治疗疾病、病症或紊乱)和/或治疗的药代动力学或药效学效应的量。治疗有效量可根据诸如对象的疾病状态、年龄、性别和体重以及给予的细胞群等因素变化。

如本文所用“对象”是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方式中，对象患有持续性或复发性疾病，例如，在用其他疗法治疗后，包括化疗、放射、和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT。在一些实施方式中，对象尚未复发，但确定处于复发风险中，例如处于高复发风险中，因此预防性地给予化合物或组合物，例如以降低复发的可能性或防止复发。

疾病和病症包括癌症。可以用本文所述经遗传修饰的T细胞治疗任何癌症。在一些实施方式中，癌症是血液癌症。在一些实施方式中，癌症是癌或肉瘤。在一些实施方式中，癌症是急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，伯基特淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，毛细胞白血病，慢性骨髓增殖性疾病，骨髓增生异常综合征，成人急性骨髓增殖性疾病，多发性骨髓瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌，前列腺癌，睾丸癌，肾细胞癌，膀胱癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，子宫内膜癌，肺癌，结直肠癌，肛门癌，胰腺癌，胃癌，食管癌，肝细胞癌，肾癌，头颈癌，胶质母细胞瘤，间皮瘤，黑色素瘤，软骨肉瘤或骨或软组织肉瘤。在一些实施方式中，癌症是肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，基底细胞癌，胆管癌，骨肿瘤，脑干神经胶质瘤，脑癌，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，视通路和下丘脑神经胶质瘤或支气管腺瘤。在一些实施方式中，癌症是促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤，室管膜瘤，上皮样血管内皮瘤(EHE)，尤因氏肉瘤，颅外生殖细胞肿瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管癌，眼内黑素瘤，视网膜母细胞瘤，胆囊癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠道间质瘤(GIST)，生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，胃类癌，心癌，下咽癌，下丘脑和视觉通路神经胶质瘤，儿童，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌，卡波西肉瘤，喉癌，唇癌和口腔癌，脂肪肉瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，骨恶性纤维组织细胞瘤，髓母细胞瘤，黑色素瘤，默克尔(Merkel)细胞癌，间皮瘤，转移性鳞状颈癌，口癌，多发性内分泌肿瘤综合征，蕈样肉芽肿，慢性，粘液瘤，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，少突胶质细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低度恶性潜能肿瘤，鼻窦和鼻窦癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体星形细胞瘤，松果体生殖细胞瘤，松果体母细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体腺瘤，浆细胞瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，肾细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，子宫肉瘤，塞扎里(Sézary)综合征，非黑色素瘤皮肤癌，黑色素瘤默克尔细胞皮肤癌，小肠癌，鳞状细胞癌，鳞状颈癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿瘤，妊娠癌，尿道癌，子宫癌，阴道癌，外阴癌，华氏巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。

疾病和病症还包括自身免疫性疾病和炎症性疾病。示例性的疾病和病症包括多发性硬化症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮(SLE)。

除癌症外，疾病和病症还包括与年龄相关的疾病。示例性的疾病和病症包括动脉粥样硬化、糖尿病、肝纤维化和骨关节炎。

在一些实施方式中，该方法包括过继细胞疗法，由此将本公开的经遗传工程改造的细胞给予对象。这类给药可以靶向方式促进细胞的活化(例如，NK细胞活化)，从而靶向破坏疾病或病症的细胞。

过继细胞疗法代表了癌症免疫疗法的新范例，但其可能受限于转移的T/NK细胞较差的持久性和功能。自然杀伤(NK)细胞可以异种移植，并有可能成为现成产品，从而使NK细胞或CAR-NK细胞过继细胞疗法成为通用型。

例如，我们使用CRISPR-Cas9诱变筛选方法来证明，通过靶向TIGIT、NKG2A和/或CISH将NK细胞重编程为在肿瘤中具有广泛积累、更好持久性和鲁棒效应功能的长寿效应细胞；此外，还包含CAR的经修饰的NK细胞产生抗肿瘤效果改善。因此，我们提供了经修饰的NK细胞，它们在诸如肿瘤的疾病的过继细胞治疗中具有前景。

提供的方法和用途包括过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方式中，方法包括向对象、组织或细胞给予细胞或含有细胞的组合物，例如患有疾病、病症或紊乱，处于患有疾病、病症或紊乱的风险，或疑似患有疾病、病症或紊乱的对象、组织或细胞。在一些实施方式中，将细胞、群体和组合物给予患有待治疗的特定疾病或病症的对象，例如，通过过继细胞疗法，例如过继NK细胞疗法或CAR-NK细胞疗法。在一些实施方式中，将细胞或组合物给予对象，例如患有疾病或病症或处于患有疾病或病症风险的对象。在一些方面，方法由此治疗例如改善疾病或病症的一种或多种症状，例如通过减轻肿瘤负荷。

给予过继细胞治疗所用细胞的方法是已知的，可与本文方法和组合物联用。在一些实施方式中，通过自体同源转移进行细胞疗法，例如，过继细胞疗法，例如过继细胞疗法，其中细胞分离自和/或以其他方式由待接受细胞疗法的对象或源自这样对象的样品制备。因此，在某些方面，细胞源自需要治疗的对象(例如，患者)，并在分离和处理后给予同一对象。

在一些实施方式中，通过同种异体移植进行细胞疗法例如，过继细胞疗法，例如过继NK或CAR-NK细胞疗法，其中细胞分离自和/或以其他方法由除待接受或最终接受细胞疗法的对象(例如第一对象)之外的对象制备。在这类实施方式中，然后将细胞给予相同物种的不同对象，例如第二对象。在一些实施方式中，第一和第二对象在遗传上是相同的。在一些实施方式中，第一和第二对象在遗传上是相似的。在一些实施方式中，第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超型。

取决于疾病的类型和严重程度，细胞或药物组合物的剂量可以包括约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)，约1μg/kg-100mg/kg或更多，约0.05mg/kg-约10mg/kg，0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg。可以间歇地给予多个剂量，例如每周或每三周。可以给予初始较高的负荷剂量，然后给予一个或多个较低的剂量。

将细胞给予哺乳动物(例如，人)后，可以通过任何已知方法测量经工程改造的细胞群和/或药物组合物的生物活性。评估的参数包括经工程改造的NK细胞与抗原的特异性结合，例如，通过体内成像或通过离体ELISA或流式细胞术。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，例如细胞毒性测定。在某些实施方式中，通过测定某些细胞因子的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在某些方面中，生物活性通过评估临床效果来测量，如肿瘤负荷或负载的减少。

在一些实施方式中，细胞或药物组合物作为联合治疗的部分给予，例如与另一治疗性干预(例如另一经工程改造的细胞或受体或试剂，诸如细胞毒性或治疗性试剂)同时或以任何顺序依次给予。

本文引用的出版物及其中援引相关的材料都具体通过引用整体纳入本文。除非另有说明，所有试剂均是可商购的。除非另有说明，所有份数和百分数均以重量计。除非另有说明，显示结果的平均值。除非另有定义，本文使用的缩写是常规的。

实施例

实施例1.使用K562饲养细胞进行体外NK扩增

通过睡美人转染系统(艾德基因公司(Addgene))构建表达全长4-1BBL和膜结合形式的IL-21(mbIL-21)的K562细胞。将编码mbIL-21和4-1BBL的基因序列克隆到pSBbi-RB质粒(艾德基因公司-60522)。

pSBbi-RB-mbIL21-4-1BBL质粒通过以3:1的比例与睡美人转座酶(SB100X，艾德基因公司目录号-127909)共孵育转导到K562细胞中。经工程改造的K562细胞在杀稻瘟菌素(blasticidin)压力下经数周选择，在确认mbIL-21和4-1BBL表达后将其用作NK饲养细胞体外扩增NK细胞。

来自健康供体的新鲜PBMC由SailyBio(中国上海)和AllCells(中国上海)提供。K562饲养细胞经50μg/mL丝裂霉素C(Sigma-M4287)在37℃、5％CO₂下预处理1小时以停止细胞增殖。将PBMC与灭活的K562饲养细胞以1:1的比例在含有10％FBS和200U/mL(R&D-202-IL)人IL-2的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO₂下共培养。培养基每2天或3天更换一次。

实施例2.扩增的NK细胞的纯度确定

第14天，将扩增的NK细胞(1×10⁵个细胞/孔)与APC-抗CD3(百进公司(Biolegend)-300439)和PE-抗CD56抗体(百进公司-318305)在4℃下共孵育1小时。用1％BSA/PBS洗涤后，进一步洗涤细胞并重悬于1％BSA-PBS(w/v)中进行流式细胞术，并通过FlowJo分析数据。

NK细胞群的纯度(以CD3^-CD56⁺表征)如图1所示并列于表1中。

表1.来自6个供体的扩增的NK细胞的纯度

供体	CD3-CD56⁺群
		1	76.9％
2	94.7％
		3	78.3％
4	91.9％
		5	92.4％
6	84.1％

结果表明，NK细胞成功地以高纯度从新鲜PBMC中扩增。

实施例3.CRISPR/Cas9单敲除或双敲除TIGIT、NKG2A和/或CISH

3.1 sgRNA序列

TIGIT、NKG2A或CISH的小向导RNA(sgRNA)序列在CRISPOR网站(http://crispor.tefor.net/)上设计，并由金斯瑞公司(GenScript)(中国南京)合成。sgRNA的序列列于表2中。

表2.TIGIT、NKG2A和CISH的sgRNA序列

3.2 CRISPR/Cas9敲除TIGIT、NKG2A和CISH

CRISPR-Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物通过4D-Nucleofector^TM系统(4D-Nucleofector Core Unit，龙沙公司(Lonza))递送至扩增的NK细胞。

培养基(含10％FBS和200U/mL人IL-2的RPMI-1640)在细胞培养板中以37℃预热30分钟，收获NK细胞用于核转染。将Cas9的RNP(核糖核蛋白)复合物(100pmol，英杰公司(Invitrogen)-A36498)和sgRNA(200pmol)混合并在室温下孵育20分钟。将各反应1×10⁶个扩增的NK细胞与包含sgRNA的RNP复合物在室温下于100μL P3初级核转染溶液(龙沙公司-V4XP-3024)中温和混合，然后将混合物转移至Nucleocucette容器中。将容器插入Lonza4D-Nucleofector，并使用程序CM-137进行核转染。取出容器后，立即将预热的培养基添加到各个盒中。将培养基/细胞/RNP混合物移液到6孔板中预热的RPMI-1640培养基中，并在37℃、5％CO₂下孵育。在第3天，随后通过流式细胞术或Western印迹测定敲除效率。

使用sgRNA-3(针对TIGIT)、sgRNA-18(针对NKG2A)和sgRNA21(针对CISH)进行双敲除(DKO)，它们在单蛋白敲除中具有显著效果。

3.3通过流式细胞术确定敲除效率

通过流式细胞术测定细胞表面蛋白TIGIT和NKG2A的单敲除和双敲除效率。

NK细胞(1×10⁵个细胞/孔)与APC-抗TIGIT抗体(eBioscience-17-9500-42)在4℃下孵育1小时。用1％BSA/PBS洗涤后，洗涤细胞并重悬于1％BSA-PBS(w/v)中进行流式细胞术，并通过FlowJo分析数据。

TIGIT、NKG2A和双重敲除的效率分别如图2-4所示和表3-5列出。

表3.TIGIT敲除的效率

表4.NKG2A敲除的效率

表5.TIGIT和NKG2A双重敲除的效率

结果表明，至少一些sgRNA有效敲除TIGIT和/或NKG2A。

3.4通过Western印迹确定敲除效率

通过Western印迹测定胞内蛋白CISH的单一效率。

收集NK细胞(1×10⁷个细胞)，用冰冷PBS洗涤并在细胞裂解缓冲液(细胞信号技术公司(Cell Signaling Technology)-9803)中裂解。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离含有等量蛋白质的细胞裂解物，并转移至聚偏二氟乙烯膜。在5％脱脂乳的含0.1％吐温20的Tris缓冲盐水中封闭后，将膜与兔抗CISH抗体(细胞信号技术公司-8731)在4℃下孵育过夜，然后在室温下暴露于HRP-山羊抗兔IgG(细胞信号技术公司-7070S)2小时。使用增强的化学发光系统(ChemiDocMF，伯乐公司(Bio-Rad))显示免疫反应蛋白。将条带在TBST中洗涤，然后与小鼠抗GAPDH抗体(细胞信号技术公司-97166)在4℃下孵育过夜。二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG(拜森实验室公司(Bethyl Laboratories)目录号-A90-231P))孵育后，重新捕获化学发光信号。

数据如图5所示。结果表明，一些sgRNA在CISH敲除中有效。

实施例4.经修饰的NK细胞的细胞毒性

使用人纤维肉瘤细胞系HT1080(ECACC编码85111505)评估修饰的NK细胞的细胞毒性，所述HT1080在细胞表面具有内源性CD155表达并在IFN-γ诱导后升高HLA-E表达。表达ZsGreen的慢病毒用上海生工公司(Sangon)(中国上海)合成的ZsGreen慢病毒穿梭载体和包装质粒PsPAX.2(艾德基因公司-12260)和PMD2.G(艾德基因公司-12259)包装。将用ZsGreen慢病毒转染的HT1080细胞预接种到96孔板中，在0.5μg/mL IFN-γ存在的情况下培养24小时，使它们粘附在培养板的平底。

使用PE-抗CD155抗体(eBioscience-12-1550-41)和APC-抗HLA-E抗体(Biolegend-342606)通过流式细胞术测定CD155和HLA-E表达水平。图6显示了HT1080细胞中CD155(TIGIT的配体)和HLA-E(NKG2A的配体)的高表达水平。

随后，以3:10的比例将经修饰的NK细胞添加到各孔中。活细胞的数量通过IncuCyteZOOM(埃森生物科学公司(EssenBioscience))自动活细胞成像系统监测的绿色荧光信号来评估。

图7中的数据表明，在NK/肿瘤细胞比例为3:10时，TIGIT、NKG2A和/或CISH敲除的NK细胞的细胞毒性增强，其中，TIGIT/NKG2A、TIGIT/CISH和NKG2A/CISH双敲除显示出良好的抗肿瘤活性，其中TIGIT+CISH双重敲除在所有测试组中显示出最好的效果。

实施例5.工程改造的NK的体内研究

将6至8周龄雌性NSG(百奥赛图公司(Biocytogen)，中国)小鼠在特定的无病原体条件下饲养和处理，并喂食高压灭菌的食物和水。研究中与动物处理、护理和治疗相关的所有程序均按照实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)的指导进行。第0天，将100mL PBS中的4×10⁶个A549细胞皮下注射到NSG小鼠右侧。当肿瘤达到50-100mm³时，将小鼠分为四组(载剂-PBS；未修饰的NK；具有TIGIT/CISH敲除的NK；具有NKG2A/CISH敲除的NK；n＝6)，并在第0天、第3天和第6天静脉注射1x10⁷个NK细胞。每三天测量一次肿瘤体积和小鼠体重。每三天用卡尺测量肿瘤体积并用下式计算：V＝0.5ab²，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径。

结果分别示于图8A(肿瘤生长抑制)和图8B(体重变化)。

图8A中的结果显示具有TIGIT/CISH敲除或NKG2A/CISH敲除的NK细胞对消除小鼠HT1080肿瘤生长具有卓越功效。此外，如图8B所示，体重未观察到显著差异，这表明NK治疗的安全性。

实施例6.CAR-NK和经修饰的CAR-NK制备

6.1抗CD19 CAR质粒和逆转录病毒载体的构建

设计的靶向CD19的CAR包含CD8信号肽(SEQ ID NO:31氨基酸序列；SEQ ID NO:32编码序列)，抗CD19 scFv FMC63(SEQ ID NO:33氨基酸序列；SEQ ID NO:34编码序列)，具有人CD8铰链和跨膜区(SEQ ID NO:35氨基酸序列；SEQ ID NO:36编码序列)，胞质结构域4-1BB(SEQ ID NO:37氨基酸序列；SEQ ID NO:38编码序列)和CD3ζ((SEQ ID NO:39氨基酸序列；SEQ ID NO:40编码序列)。将CAR cDNA构建体合成为逆转录病毒穿梭载体pMSCV-SFFV的多克隆位点。

第0天，将1×10⁷个293T细胞(ATCC-CRL-3216)接种到150-mm培养皿中。次日，将CD19 CAR和载体与逆转录病毒包装质粒，pCMV-gag-pol和PMD2.BaEV(SEQ ID NO：41氨基酸序列；SEQ ID NO：42编码序列)共转染到293T细胞。第2天，用新鲜培养基更换转染的293T细胞的培养基。第3天，从转染的293T细胞中收集逆转录病毒上清液，并用0.45μm聚醚砜(PES)膜过滤器过滤。如有必要，通过超速离心机(Beckman公司)浓缩逆转录病毒上清液。

逆转录病毒的效价通过HT1080(ECACC编号85111505)感染确定。简言之，将HT1080细胞以10,000/孔的密度接种在96孔板中过夜。将用完全DMEM培养基连续稀释5倍的逆转录病毒添加到HT1080细胞中并轻柔混合。将板置于37℃培养箱中72小时。使用流式细胞术通过荧光来表征HT1080细胞中的CAR表达。逆转录病毒的效价如下计算：

逆转录病毒的效价(TU/mL)＝(转导细胞数×荧光阳性％)/(病毒体积)。

6.2抗CD19 CAR-NK细胞的产生

扩增的NK细胞与MOI为4的逆转录病毒颗粒以及聚凝胺(Millipore-TR-1003-G；4μg/mL)混合，这已被证明可以改善NK细胞的逆转录病毒转导效率。然后，将细胞在6孔板中离心90分钟(在32℃下1500rpm)，然后在完全RPMI 1640培养基中37℃孵育18小时。然后通过离心去除转导混合物，并用新鲜的完全RPMI 1640培养基替换，其中存在IL-2(200U/mL)和IL-15(140U/mL)。

6.3经修饰的CAR-NK细胞的产生

在转染后第4天通过双重敲除TIGIT和CISH从抗CD19 CAR-NK中获得经修饰的抗CD19 CAR-NK(mCD19 CAR-NK)。具有TIGIT和CISH RNP复合物的CAR-NK的电穿孔过程如实施例3.2中所述。然后，mCD19 CAR-NK细胞与丝裂霉素C处理的K562饲养细胞在存在IL-2(200U/mL)和IL-15(140U/mL)的完全1640培养基中共培养(与实施例1中的处理相同)。

6.4 CD19 CAR-NK的转导效率确定

在转染后第8天通过流式细胞术评估CD19 CAR和mCD19 CAR NK细胞的转导效率(即与K562饲养细胞共培养5天后)。简言之，收获CAR-NK和mCAR-NK细胞并与PE标记的CD19抗原(AcroBiosystems，CD9-HP2H3；1:100稀释)在4℃孵育1小时。用1％BSA/PBS洗涤后，洗涤细胞并重悬于1％BSA-PBS(w/v)中进行流式细胞术，并通过FlowJo分析数据。

图9A和9B中的结果表明，抗CD19 CAR-NK细胞以高转导效率有效产生。

6.5通过FACS和Western印迹确定敲除效率

mCD19 CAR NK细胞的TIGIT和CISH敲除效率分别通过流式细胞术和Western印迹确定。图10A、10B、11A和11B中显示的结果证明了TIGIT和CISH在mCD19 CAR NK细胞中的高敲除效率。

实施例7.CAR-NK的体外表征

通过转染后第14天的细胞因子释放以及针对肿瘤细胞的杀伤能力测试来表征CAR-NK细胞。

7.1细胞毒性测定

为了产生表达荧光素酶的靶细胞，将慢病毒荧光素酶转导到Raji细胞中。将CD19CAR-NK和mCD19 CAR-NK细胞与20,000个表达荧光素酶的Raji(Raji-luc，ATCC-CCL86)细胞以3:1和1:1的比例共培养24小时。将One-Glo荧光素酶测定试剂(普洛麦格公司(Promega)目录号E6120)添加到各孔中。将板在室温下振荡5分钟后，使用EnVision读数器(帕金埃尔默公司(PerkinElmer))检测发光。收集上清液并在-80℃冷冻以释放IFN-γ。通过下式计算细胞毒性：细胞毒性＝RLU_试验组/RLU_对照组X100％。

图12A和12B中的结果显示，相较于未经修饰的CD19 CAR-NK细胞，mCD19 CAR-NK细胞对癌细胞的细胞毒性显著增加，这表明经修饰的CAR-NK细胞在癌症治疗中有效得多。

7.2连续杀伤试验

进一步使用连续杀伤试验来研究mCD19 CAR-NK的细胞毒性。CD19CAR-NK和mCD19CAR-NK细胞与20,000个Raji-luc细胞以3:1和1:1的比例共培养24小时，然后添加等量的新Raji-luc细胞。24小时后，收集100μL上清液并在-80℃冷冻以释放IFN-γ。将One-Glo荧光素酶测定试剂(普洛麦格公司目录号E6120)添加到各孔中。将板在室温下振荡5分钟后，使用EnVision读数器(帕金埃尔默公司)检测发光。

图13A和13B中的结果显示，mCD19 CAR-NK细胞在连续杀伤试验中对癌细胞的细胞毒性增加，这表明经修饰的CAR-NK细胞在癌症治疗中可能更有效。

7.3细胞因子释放检测

将如实施例7.1和7.2中所述收集的上清液解冻，使用匹配的抗体对通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行IFN-γ定量。

将重组人IFN-γ(PeproTech目录号-300-02)作为标准品。用对人IFN-γ具有特异性的捕获抗体(皮尔斯公司(Pierce)目录号-M700A)预涂覆板。封闭后，将100μL标准品或样品移液到各孔中并在环境温度下孵育2小时。去除未结合的物质后，将生物素偶联的IFN-γ特异性检测抗体(皮尔斯公司目录号-M701B)添加到孔中并孵育1小时。然后，将链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(HRP)(英杰公司目录号-SNN1004)添加到孔中，在环境温度下孵育30分钟。通过分配100μl的TMB底物显色，然后用100μl的2NHCl终止。吸光度使用微孔板分光光度计在450nM处读取。

图14A、14B、15A和15B中的结果表明，mCD19 CAR-NK细胞释放的人IFN-γ远高于CD19 CAR-NK。

本发明不局限于本文所述实施方式的范围，这些实施方式仅旨在说明本发明的单独方面，任何功能等同形式也在本发明范围内。基于前述内容及教导，除了本文所述内容外，对本发明的组合物和方法的各种修改对于本领域技术人员而言是显而易见，并且同样旨在落入本发明的范围内。可以在不脱离本发明的真实范围和精神的情况下实施这种修改或其它实施方式。

附录：序列信息

序列表

<110> 上海药明生物技术有限公司（WUXI BIOLOGICS (SHANGHAI) CO., LTD.）

药明生物技术爱尔兰有限公司（WUXI BIOLOGICS IRELAND LIMITED）

<120> 遗传修饰的NK细胞及其用途

<130> 211316Z 1PCWO

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TIGIT sgRNA-1

<400> 1

caggcacaat agaaacaacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TIGIT sgRNA-2

<400> 2

atgtcacctc tcctccacca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TIGIT sgRNA-3

<400> 3

gctgaccgtg aacgatacag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TIGIT sgRNA-4

<400> 4

tcgctgaccg tgaacgatac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TIGIT sgRNA-5

<400> 5

cactgggaga atcttcctgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TIGIT sgRNA-6

<400> 6

ctgggtcact tgtgccgtgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-1

<400> 7

tgaacaggaa ataacctatg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-2

<400> 8

ttgaaggttt aattccgcat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-3

<400> 9

ggtctgagta gattactcct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-4

<400> 10

agataagaca gataattccc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-5

<400> 11

atgagcttct ctggagctga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-6

<400> 12

aacaactatc gttaccacag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-7

<400> 13

gctccagaga agctcattgt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-8

<400> 14

gaagctcatt gttgggatcc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-9

<400> 15

ctccatttta gcaactgaac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-10

<400> 16

aagctcattg ttgggatcct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-11

<400> 17

atcccaacaa tgagcttctc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NKG2A sgRNA-12

<400> 18

aggcagcaac gaaaacctaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CISH sgRNA-1

<400> 19

caaccgtctg gtggccgacg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CISH sgRNA-2

<400> 20

caggcacaat agaaacaacg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CISH sgRNA-3

<400> 21

atgtcacctc tcctccacca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CISH sgRNA-4

<400> 22

gctgaccgtg aacgatacag 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CISH sgRNA-5

<400> 23

tcgctgaccg tgaacgatac 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CISH sgRNA-6

<400> 24

cactgggaga atcttcctgg 20

<210> 25

<211> 244

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 25

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

165 170 175

Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

195 200 205

Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp

210 215 220

Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe

225 230 235 240

Thr Glu Thr Gly

<210> 26

<211> 735

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 26

atgcgctggt gtctcctcct gatctgggcc caggggctga ggcaggctcc cctcgcctca 60

ggaatgatga caggcacaat agaaacaacg gggaacattt ctgcagagaa aggtggctct 120

atcatcttac aatgtcacct ctcctccacc acggcacaag tgacccaggt caactgggag 180

cagcaggacc agcttctggc catttgtaat gctgacttgg ggtggcacat ctccccatcc 240

ttcaaggatc gagtggcccc aggtcccggc ctgggcctca ccctccagtc gctgaccgtg 300

aacgatacag gggagtactt ctgcatctat cacacctacc ctgatgggac gtacactggg 360

agaatcttcc tggaggtcct agaaagctca gtggctgagc acggtgccag gttccagatt 420

ccattgcttg gagccatggc cgcgacgctg gtggtcatct gcacagcagt catcgtggtg 480

gtcgcgttga ctagaaagaa gaaagccctc agaatccatt ctgtggaagg tgacctcagg 540

agaaaatcag ctggacagga ggaatggagc cccagtgctc cctcaccccc aggaagctgt 600

gtccaggcag aagctgcacc tgctgggctc tgtggagagc agcggggaga ggactgtgcc 660

gagctgcatg actacttcaa tgtcctgagt tacagaagcc tgggtaactg cagcttcttc 720

acagagactg gttag 735

<210> 27

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 27

Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Asn Ser Ile Leu Ala

20 25 30

Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu Pro

50 55 60

Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys Leu

65 70 75 80

Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Arg His

85 90 95

Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys Tyr

100 105 110

Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala Cys

115 120 125

Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu Met

130 135 140

Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe Arg

145 150 155 160

Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu Ala Phe Lys

165 170 175

His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val Leu

180 185 190

Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Ile Ile Tyr

195 200 205

His Cys Lys His Lys Leu

210

<210> 28

<211> 648

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 28

atggataacc aaggagtaat ctactcagac ctgaatctgc ccccaaaccc aaagaggcag 60

caacgaaaac ctaaaggcaa taaaaactcc attttagcaa ctgaacagga aataacctat 120

gcggaattaa accttcaaaa agcttctcag gattttcaag ggaatgacaa aacctatcac 180

tgcaaagatt taccatcagc tccagagaag ctcattgttg ggatcctggg aattatctgt 240

cttatcttaa tggcctctgt ggtaacgata gttgttattc cctcacgtca ttgtggccat 300

tgtcctgagg agtggattac atattccaac agttgttact acattggtaa ggaaagaaga 360

acttgggaag agagtttgct ggcctgtact tcgaagaact ccagtctgct ttctatagat 420

aatgaagaag aaatgaaatt tctgtccatc atttcaccat cctcatggat tggtgtgttt 480

cgtaacagca gtcatcatcc atgggtgaca atgaatggtt tggctttcaa acatgagata 540

aaagactcag ataatgctga acttaactgt gcagtgctac aagtaaatcg acttaaatca 600

gcccagtgtg gatcttcaat aatatatcat tgtaagcata agctttag 648

<210> 29

<211> 258

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 29

Met Val Leu Cys Val Gln Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Glu Arg

1 5 10 15

Thr Gly Gln Arg Pro Leu Trp Ala Pro Ser Leu Glu Leu Pro Lys Pro

20 25 30

Val Met Gln Pro Leu Pro Ala Gly Ala Phe Leu Glu Glu Val Ala Glu

35 40 45

Gly Thr Pro Ala Gln Thr Glu Ser Glu Pro Lys Val Leu Asp Pro Glu

50 55 60

Glu Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser

65 70 75 80

Gly Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu

85 90 95

Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro

100 105 110

Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn

115 120 125

Val Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys

130 135 140

Leu Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val

145 150 155 160

Gln His Tyr Val Ala Ser Cys Thr Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro

165 170 175

Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Pro Lys Glu Asp Ala Pro

180 185 190

Ser Asp Pro Ala Leu Pro Ala Pro Pro Pro Ala Thr Ala Val His Leu

195 200 205

Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln

210 215 220

His Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Ala Asp Val Asp Cys

225 230 235 240

Leu Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe

245 250 255

Gln Leu

<210> 30

<211> 777

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 30

atggtcctct gcgttcaggg acctcgtcct ttgctggctg tggagcggac tgggcagcgg 60

cccctgtggg ccccgtccct ggaactgccc aagccagtca tgcagccctt gcctgctggg 120

gccttcctcg aggaggtggc agagggtacc ccagcccaga cagagagtga gccaaaggtg 180

ctggacccag aggaggatct gctgtgcata gccaagacct tctcctacct tcgggaatct 240

ggctggtatt ggggttccat tacggccagc gaggcccgac aacacctgca gaagatgcca 300

gaaggcacgt tcttagtacg tgacagcacg caccccagct acctgttcac gctgtcagtg 360

aaaaccactc gtggccccac caatgtacgc attgagtatg ccgactccag cttccgtctg 420

gactccaact gcttgtccag gccacgcatc ctggcctttc cggatgtggt cagccttgtg 480

cagcactatg tggcctcctg cactgctgat acccgaagcg acagccccga tcctgctccc 540

accccggccc tgcctatgcc taaggaggat gcgcctagtg acccagcact gcctgctcct 600

ccaccagcca ctgctgtaca cctaaaactg gtgcagccct ttgtacgcag aagcagtgcc 660

cgcagcctgc aacacctgtg ccgccttgtc atcaaccgtc tggtggccga cgtggactgc 720

ctgccactgc cccggcgcat ggccgactac ctccgacagt accccttcca gctctga 777

<210> 31

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CD8信号肽

<400> 31

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 32

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CD8信号肽编码序列

<400> 32

atggccctgc cagtgaccgc cctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgctcgt 60

cct 63

<210> 33

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗CD19 scFv FMC63

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 34

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗CD19 scFv FMC63编码序列

<400> 34

gacattcaga tgacacagac cacaagcagc ctgagcgcct ccctgggcga cagagtgacc 60

atcagctgca gagcctccca agacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120

gacggcaccg tgaagctgct gatctaccac acaagcagac tgcacagcgg cgtgcctagc 180

agattctccg gcagcggctc cggcacagac tacagcctga ccatcagcaa cctggagcaa 240

gaggacatcg ccacctactt ctgtcagcaa ggcaacaccc tgccctacac cttcggcggg 300

ggcaccaagc tggaaatcac cggcagcaca agcgggtccg gcaaacccgg cagcggcgag 360

gggagcacaa agggcgaggt gaagctgcaa gagagcgggc ccggcctggt ggccccctcc 420

caaagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480

tggatcagac agccccctag aaagggcctg gagtggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540

accacctact acaacagcgc cctgaagagc agactgacca tcatcaagga caacagcaag 600

agccaagtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660

gccaagcact actattacgg cggcagctac gccatggact actggggcca aggcacaagc 720

gtgaccgtga gcagc 735

<210> 35

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人 CD8铰链和跨膜区

<400> 35

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 36

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人 CD8铰链和跨膜区编码序列

<400> 36

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207

<210> 37

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 4-1BB

<400> 37

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 38

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 4-1BB编码序列

<400> 38

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 39

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CD3ζ

<400> 39

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 40

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CD3ζ编码序列

<400> 40

cgggtgaagt tctccaggtc tgccgacgcc cccgcctaca agcagggcca gaaccagctg 60

tacaatgagc tgaacctggg ccggcgggag gagtatgacg tgctggataa gaggcgcggc 120

cgggaccccg agatgggcgg taaacctaga agaaaaaatc cacaggaagg actgtataat 180

gaactgcaga aggataaaat ggctgaggca tatagtgaaa ttggcatgaa aggggagagg 240

agaagaggaa aaggacatga tggactgtat cagggactga gcacagctac aaaagataca 300

tatgatgccc tgcacatgca ggccctgccc cctaga 336

<210> 41

<211> 563

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> BaEV

<400> 41

Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val

1 5 10 15

Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys

20 25 30

Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro

35 40 45

Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr

50 55 60

Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr

65 70 75 80

Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser

85 90 95

Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly

100 105 110

Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly

115 120 125

Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser

130 135 140

Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala

145 150 155 160

Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile

165 170 175

Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro

180 185 190

Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu

195 200 205

Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu

210 215 220

Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu

225 230 235 240

Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser

245 250 255

Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro

260 265 270

Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser

275 280 285

Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe

290 295 300

Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val

305 310 315 320

Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu

325 330 335

Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp

340 345 350

Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp

355 360 365

His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu

370 375 380

Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu

385 390 395 400

Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser

405 410 415

Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val

420 425 430

Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu

435 440 445

Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys

450 455 460

Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr

465 470 475 480

Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro

485 490 495

Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu

500 505 510

Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile

515 520 525

Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His

530 535 540

Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu

545 550 555 560

Ala Gln Asp

<210> 42

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> BaEV编码序列

<400> 42

atgggattca caacaaagat aatcttctta tacaacctag tactggtcta cgcggggttt 60

gacgaccctc gcaaagccat agaactagta caaaagcgat atggccgacc atgcgattgc 120

agcggaggac aagtgtccga gcccccgtca gacagggtca gtcaagtgac ttgctcaggc 180

aagacagctt acttaatgcc cgaccaaaga tggaaatgta agtcaattcc aaaagacacc 240

tccccaagcg ggccactcca agagtgcccc tgtaattctt accagtcctc agtacacagt 300

tcttgttata cctcatacca acaatgcaga tcaggcaata agacatatta tacggctact 360

ctgctaaaaa cacaaactgg gggcaccagt gatgtacaag tattaggatc caccaacaaa 420

cttatacaat ctccctgtaa tggcataaaa gggcagtcta tttgctggag cactacagct 480

cctatccacg tctctgatgg aggaggtcca ttagacacca caagaattaa aagtgttcag 540

agaaaactgg aagaaattca taaagcccta tatcctgaac ttcagtatca ccctttggcc 600

atacctaagg ttagagataa cctcatggtc gatgcccaga ctttaaacat tctcaatgcc 660

acttacaact tactcctaat gtccaacacg agcctagtgg acgactgttg gctttgttta 720

aaattaggtc cccctactcc cctcgcaata cctaacttcc tattatccta cgtgactcgc 780

tcctcggata atatctcttg tttaataatt cccccccttc tagttcaacc gatgcagttt 840

tccaattcat cttgcctctt ttccccctcc tacaacagta cagaagaaat agatctaggc 900

catgttgcct tcagcaactg tacctccata accaatgtca ccggtcccat atgcgctgta 960

aatggttcgg tctttctctg tggcaataac atggcataca cttatctacc cacgaactgg 1020

acggggcttt gcgtcctagc aactctcctc cccgacattg acatcattcc cggagatgaa 1080

ccggtcccca tccctgctat tgatcatttt atatatagac ctaaacgggc catacagttt 1140

attcctttac tagcagggct agggatcacc gcagccttca caacaggagc tacaggccta 1200

ggtgtctctg tgacccaata tacaaaatta tctaatcagc taatttctga tgtacaaatc 1260

ttatctagca ccatacaaga tctgcaagat caagtagact cattagccga agtggttctc 1320

cagaacagaa gggggctaga tctacttaca gcagaacaag gaggaatctg tttagccctg 1380

caagaaaaat gctgctttta tgttaacaag tcagggattg tgagagacaa aataaaaacc 1440

ttacaagaag aactagaaag acgtagaaaa gatctagctt ccaacccact ttggactggg 1500

cttcaagggc tcctccctta cctcctgccc tttcttggcc ctctacttac cctcctgctc 1560

ttactcacca ttgggccgtg catttttaac cgtctaaccg cttttattaa tgataagtta 1620

aacataatac acgctatggt gctaacccaa cagtatcagg tgctcagaac cgatgaagaa 1680

gctcaagatt ga 1692

Claims

1.一种分离的经修饰的NK细胞，其中，所述NK细胞经修饰以削弱TIGIT、NKG2A和CISH中两种或三种的功能性表达。

2.一种分离的经修饰的NK细胞，其中，所述NK细胞经修饰以削弱TIGIT、NKG2A和CISH中一种或两种或三种的功能性表达，并且其中所述NK细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)。

3.如权利要求1或2所述的经修饰的NK细胞，其中，所述功能性表达通过基因敲除、基因突变、基因缺失、基因沉默或前述任意的组合减少或消除。

4.如权利要求1或2所述的经修饰的NK细胞，其中，所述功能性表达使用CRISPR系统、TALEN系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、大范围核酸酶系统、siRNA、反义RNA、微小RNA、短发夹RNA或前述任意的组合减少或消除。

5.如权利要求1或2所述的经修饰的NK细胞，其中，所述功能性表达使用CRISPR系统减少或消除，并且所用sgRNA选自SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:7-18和SEQ ID NO:19-24。

6.如权利要求1或2所述的经修饰的NK细胞，其中，所述功能性表达的削弱使所述经修饰的NK细胞中靶基因的表达相较于不存在削弱的相应NK细胞降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。

7.如权利要求1或2所述的经修饰的NK细胞，其中，所述NK细胞源自下组：脊椎动物(例如，人或啮齿动物细胞)的脐带血、外周血和/或胎盘和诱导多能干细胞(iPSC)；和/或所述NK细胞是自体同源的或同种异体的。

8.如权利要求2所述的经修饰的NK细胞，其中，所述CAR包含：(i)抗原识别结构域、(ii)胞外铰链区、(iii)跨膜结构域和(iv)胞内细胞信号转导结构域。

9.如权利要求8所述的经修饰的NK细胞，其中，所述抗原识别结构域是靶向在所述靶细胞表达但在健康细胞不表达的抗原的抗体或其抗原结合片段，例如衍生自链接在一起形成单链可变片段(scFv)的单克隆抗体(mAb)可变区的抗原识别结构域，或重链抗体重链的可变结构域(VHH)；和/或

所述抗原识别结构域是天然配体/受体对的成员，例如细胞因子、先天免疫受体、TNF受体超家族成员、生长因子和/或结构蛋白。

10.如权利要求8所述的经修饰的NK细胞，其中，所述抗原识别结构域靶向选自下组的一种或多种抗原：CD19，CD20，HER2，BCMA，和/或EGFR TSHR，CD19，CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA，TnAg，PSMA，ROR1，FLT3，FAP，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT，IL-13Ra2，间皮素，IL-11Ra，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-β，SSEA-4，CD2O，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，Prostase，PAP，ELF2M，肝配蛋白B2，IGF-I受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，o-乙酰基-GD2，叶酸受体β，

TEM1/CD248，TEM7R，CLDN6，GPRC5D，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，聚唾液酸，PLAC1，GloboH，NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR2O，LY6K，0R51E2，TARP，WT1，NY-ESO-1，LAGE-la，MAGE-A1，豆荚蛋白，HPV E6，E7，MAGE Al，ETV6-AML，精子蛋白17，XAGE1，Tie2，MAD-CT-1，MADCT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，Prostein，生存素和端粒酶，PCTA-1/半乳凝素8，MelanAI MART1，Ras突变体，hTERT，肉瘤易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PA1X3，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK，AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，肠羧酸酯酶，mut hsp70-2，CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2，LY75，GPC3，FCRLS，和IGLL1；和尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)。

11.如权利要求8所述的经修饰的NK细胞，其中，所述CAR包含CD3ζ内结构域(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:39或由包含SEQ ID NO:40的核苷酸分子编码的多肽)，共刺激信号转导结构域，所述共刺激信号转导结构域选自CD27，CD28，4-1BB(CD137，例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:31或由包含SEQ ID NO:32的核苷酸分子编码的多肽)，OX40，CD30，CD4O，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，配体，其特异性结合CD83，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp8O(KLRF1)，CD16O，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD1O3，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD16O(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly1O8)，SLAM(SLAMF1，CD1SO，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，和NKG2D。

12.如权利要求8所述的经修饰的NK细胞，其中，所述CAR通过载体转导至所述NK细胞，例如慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如γ-逆转录病毒载体，pMSCV-SFFV)；和/或通过CRISPR系统转导至所述NK细胞。

13.如权利要求1或2所述的经修饰的NK细胞，其中，所述经修饰的NK细胞处于细胞群、细胞培养物或产品中。

14.如权利要求1或2所述的经修饰的NK细胞，其相较于TIGIT、NKG2A和CISH中一种或多种的功能表达未削弱的NK细胞具有下述一种或多种特征：

(a)TIGIT、NKG2A和CISH中一种或多种的功能表达减少或消除；

(b)体外和/或体内细胞扩增增加；

(c)体外和/或体内细胞寿命延长；

(d)体内细胞消耗改善；

(e)所述NK细胞对靶细胞的细胞毒性改善；和/或

(f)细胞因子、白细胞介素和/或生长因子的分泌由所述NK细胞调节。

15.一种制备权利要求1-14中任一项所述的经修饰的NK细胞的方法，其包括以下步骤：(i)提供NK细胞；(ii)修饰所述NK细胞以削弱TIGIT、NKG2A和CISH中一种或多种的功能性表达；(iii)任选地修饰所述NK细胞以使其包含嵌合抗原受体(CAR)；和(iv)任选地，扩增经修饰的细胞。

16.如权利要求15所述的方法，其中，步骤(ii)在步骤(iii)之前、同时或之后进行；和/或步骤(iv)在步骤(i)-(iii)中一个或多个之前或之后进行。

17.权利要求1-14中任一项所述的经修饰的NK细胞在制备用于治疗疾病的产品中的用途。

18.一种用于治疗有需要的对象中疾病的方法，其包括给予有效量的权利要求1-14中任一项所述的经修饰的NK细胞。

19.如权利要求1-14中任一项所述的经修饰的NK细胞用于治疗疾病。

20.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的NK细胞，其中，所述治疗是过继细胞疗法，优选CAR-NK过继细胞疗法。

21.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的NK细胞，其中，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、移植排斥和其他年龄相关疾病。

22.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的NK细胞，其中，所述疾病选自癌，肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤和白血病；和/或癌症，其选自血液系统，淋巴系统，消化系统，呼吸系统，生殖系统，运动系统和神经系统的癌症。

23.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的NK细胞，其中，所述疾病选自下组：动脉粥样硬化、糖尿病、肝纤维化和骨关节炎。