CN117320566A - 用于治疗自闭症谱系障碍的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于治疗自闭症谱系障碍(ASD)的方法和组合物。该方法和组合物包括用益生菌和催产素(OXT)的联合疗法，引起对ASD症状产生有益效果的治疗性协同作用。该方法和组合物提供了几种可测量参数的改善，包括但不限于：测量的ASD核心症状临床指标、肠道微生物组谱以及血液中OXT和炎症标志物的水平。

Description

用于治疗自闭症谱系障碍的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年12月30日提交的第63/132,081号美国临时申请的权益，其通过引用整体并入本文。

序列表

本申请附有序列表，并且以命名为“125141_03719_ST25.txt”的序列表ASCII文本文件提交，该文件的大小为1037字节，创建于2021年12月29日。该序列表与本申请一起通过EFS-Web电子提交，并通过引用整体并入本文。

技术领域

本技术涉及自闭症谱系障碍及相关病症、症状、障碍或疾病领域，以及用于治疗其的组合物和方法。

背景技术

自闭症谱系障碍(ASD)是一种复杂的神经发育障碍，以社交沟通障碍和刻板重复行为模式为特征。ASD因其发病率迅速上升而成为严重的健康问题。根据疾病预防控制中心(CDC)最近的一份报告，ASD的患病率已上升到每54名儿童中有1名¹。然而，其病因仍然难以确定，而且在很大程度上仍然缺乏有效治疗。

据报道，肠道微生物组组成和炎症通过肠-脑轴参与ASD的发病机理²。最近的证据表明，ASD个体的肠道微生物群的变化通过肠-微生物-脑轴改变了胃肠道(GI)生理和行为^3,4。已表明在动物研究和临床试验中使用的益生菌品种在改善ASD核心症状方面有效⁶。益生菌具有通过肠-脑轴改善神经精神症状的潜力的证据并不限于ASD。事实上，存在整个益生菌亚群，被称为精神益生菌，可在精神病患者中提供健康益处⁷。动物研究已经表明，一些精神益生菌菌株可改善抑郁样行为⁸、焦虑样行为⁹、认知¹⁰和诸如沟通缺陷和刻板行为的自闭症样行为¹¹。一种精神益生菌，植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)PS128(PS128)在不同小鼠模型中显示对抑郁样和焦虑样行为的改善作用^12,13。当向ASD儿童施用时，PS128显示焦虑、违规行为和过度活动/易冲动得以改善。

催产素(OXT)是由下丘脑产生的神经肽，其调节情感和社交沟通、建立关系和奖励相关行为的能力众所周知¹⁴。如使用OXT受体敲除小鼠模型显示诸如缺乏社交相互作用的自闭症样行为的先前研究，OXT信号传导与ASD的病因相关¹⁵。后续研究已经表明，OXT治疗增强两种ASD小鼠模型的社交性¹⁶。OXT对ASD核心症状显示有前景的治疗潜力，因为它可以很容易地施用，并且可作为具有成本效益的治疗，且不良反应最小。此外，OXT在肠-脑轴中发挥重要作用，并且可能可由某些益生菌如植物乳杆菌诱导¹⁴。然而，尚未研究植物乳杆菌(包括PS128)与内源性OXT之间可能的生物学联系。此外，尚未测试这两种有前景的干预(OXT和PS128)之间的相互作用。

发明内容

本文公开了用于治疗自闭症谱系障碍(ASD)的方法和组合物。该方法和组合物包括用益生菌和催产素(OXT)的联合疗法，引起对ASD症状产生有益作用的治疗性协同作用。该方法和组合物提供了几种可测量参数的改善，包括但不限于：ASD核心症状的可测量临床指标、肠道微生物组谱、以及血液中OXT和炎症标志物的水平。

本文公开了一种治疗被诊断有自闭症谱系障碍(ASD)或处于自闭症谱系障碍(ASD)风险的对象的方法。在一些实施方案中，该方法包括：施用包括有效量的(1)包含植物乳杆菌的益生菌组合物和(2)催产素的联合疗法。在一些实施方案中，与治疗之前相比或与未经治疗的对照对象相比，对象在治疗之后或治疗过程期间表现出临床总体印象(CGI)评分的统计学改善。在一些实施方案中，与治疗之前相比或与未经治疗的对照对象相比，对象在治疗之后或治疗过程期间表现出照料者评定的社交反应量表第二版(SRS-2)的改善。在一些实施方案中，与治疗之前相比或与未经治疗的对照对象相比，对象在治疗之后或治疗过程期间表现出照料者评定的异常行为检查表(ABC)的改善。

在所述方法的一些实施方案中，益生菌组合物包含约1×10³至约1×10²⁰CFU、1×10⁴至约1×10¹⁵CFU、1×10⁵至约1×10¹²CFU、1×10⁶至约1×10¹¹CFU、或约1×10¹⁰至约1×10¹¹CFU、或约1×10¹⁰CFU、2×10¹⁰CFU、3×10¹⁰CFU、4×10¹⁰CFU、5×10¹⁰CFU、6×10¹⁰CFU、7×10¹⁰CFU、8×10¹⁰CFU、9×10¹⁰CFU、10×10¹⁰CFU的植物乳杆菌。

在所述方法的一些实施方案中，施用包括在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年的过程内或按症状而定频率的多剂量的益生菌组合物。在一些实施方案中，益生菌组合物每天施用一次。在一些实施方案中，益生菌组合物每天施用两次。在一些实施方案中，益生菌组合物每天施用多次。在一些实施方案中，益生菌经口施用。

在所述方法的一些实施方案中，益生菌组合物包含另外的益生菌微生物。

在所述方法的一些实施方案中，施用包括在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年的过程内或按症状而定频率的多剂量的催产素。在一些实施方案中，催产素每天施用一次。在一些实施方案中，催产素每天施用两次。在一些实施方案中，催产素每天施用多次。在一些实施方案中，催产素经鼻施用。在一些实施方案中，催产素经口施用。在一些实施方案中，催产素以约1-3IU/天、约2-4IU/天、约3-5IU/天、约4-6IU/天、约5-7IU/天、约6-8IU/天、约8-10IU/天、约10-20IU/天、约20-30IU/天、约30-40IU/天、约40-50IU/天、约50-100IU/天经鼻施用。在一些实施方案中，催产素的用量在整个施用过程中逐渐增加。

在任何所公开的方法中，催产素和益生菌组合物显示协同作用。

在所公开方法的一些实施方案中，催产素和益生菌组合物每天各自施用。在一些实施方案中，联合疗法施用至少约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年或按症状而定频率施用，并且其中益生菌和催产素在同一时间、不同时间施用，施用相同时长或不同时长。

在任何所公开的方法中，与治疗之前相比，对象的微生物组组成与治疗之后有差异。在一些实施方案中，该差异包括霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、理研菌科(Rikenelaceae)、另枝菌属(Alistipes)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、布劳特氏菌属(Blautia)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)中的一种或多种的增加。

在所公开方法的一些实施方案中，对象表现出SRS沟通、SRS特殊习惯、SRS动机、SRS认知、ABC不恰当言语、ABC刻板行为、ABC易怒和ABC过度活动/不服从中的一种或多种的改善。

本文公开了用于治疗ASD或类似病症或ASD样症状的组合物。在一些实施方案中，组合物包含配制成经口施用的植物乳杆菌和催产素。在一些实施方案中，组合物包含另外的益生菌微生物和/或另外的活性剂。

本文公开了用于治疗显示自闭症谱系障碍(ASD)的一种或多种行为特征、心理特征或身体特征的对象的方法，该方法包括：施用包括有效量的(1)包含植物乳杆菌的益生菌组合物和(2)催产素的联合疗法。在一些实施方案中，与治疗之前相比或与未经治疗的对照对象相比，对象的一种或多种行为特征、心理特征或身体特征在治疗之后得到改善。在一些实施方案中，对象表现出以下中一种或多种的改善：GCI评分、SRS-2评分和ABC评分。

附图说明

图1.整体研究设计与实施流程图。

图2.治疗条件内所有对象中显示CGI-I随时间改善的对象的比例。应用用于等比例的z检验，在对照条件和益生菌+OXT条件下显示至少最低改善(CGI-I≤3)的对象数目显著不同(P<0.05)，而益生菌和OXT单独组的变化不显著，但在这两个干预组中观测到改善趋势。

图3A至3C.使用0.7的SparCC截止值，在接受安慰剂的对象和接受活性益生菌的对象中属级肠道微生物群之间随时间的SparCC网络关联。安慰剂组V1为基线，V2为安慰剂之后，V3为安慰剂之后增加OXT；益生菌组V1为基线，V2为益生菌之后，V3为益生菌之后增加OXT；(A)SparCC共现网络。将关节点标记为围绕节点的色圈。枢纽评分由节点大小表示。(B)访视3时OXT单独组和联合组的线数或边数均显著增多(Yates连续性校正的Pearsonχ²检验，P<0.005)。(C)V3时联合组的关节点数仅比基线关节点数显著增加(Yates连续性校正的Pearsonχ²检验，P<0.05)。

图4.基于四个研究组的肠道微生物群丰度的预测功能谱的平均变化热图。显示的功能谱指标变化表明联合组的变化更多，但是这些变化与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。

图5A至5E.纵向血清标志物变化和相关的相关性的总结。各治疗组与对照组相比血清OXT(A)、S100B(B)和IL-1β(C)水平的绝对变化。基线血清S100B与ABC易怒T(D)和ABC过度活动/不服从T评分(E)呈正相关。

图6.每组CGI评分减少的瀑布数据。

图7A至7E.粪便样本的α和β多样性在本研究中未显示显著变化。

图8.显示对象人口统计资料和基线时临床指标的总结表。*通过Wilcoxon秩和检验评估连续数据的P值，而通过Yates连续性校正的Pearsonχ²检验评估分类数据的组间差异。

图9.显示社交行为测量结果改善的总结表。数据表示为平均变化±SD。*提供的P值是基于对照组和相应治疗组中评分的平均改善之间的Wilcoxon秩和检验。

图10.显示基于SparCC网络分析的已鉴定的关键枢纽类群的总结表。“+”标记在指定的研究访视和实验组的前10个枢纽类群中找到的感兴趣的类群(枢纽评分>0.8)，“-”标记未找到。提供的值为枢纽评分(截止值评分为0.8)。

图11.显示所有对象治疗之前微生物群相对丰度与社交行为参数之间的Spearman相关性的表。*所有呈现的相关性在FDR<0.1时均是显著的。

图12.显示基于Spearman秩相关性的益生菌组和安慰剂组对象中主要结果与微生物群相对丰度之间的显著相关性的表。“*”显示基于结果筛查FDR<0.1。

具体实施方式

在本研究中，本发明人评估了两种有前景的干预：相对于安慰剂对照单独和联合的益生菌和催产素。所有干预均耐受良好，未观测到严重不良事件。仅在联合治疗组，观测到社交和行为测量结果(ABC和SRS)的改善趋势，尤其是ABC总评分(P＝0.077)、ABC刻板行为分项评分(P＝0.069)和SRS认知分项评分(P＝0.059)。同时，与安慰剂相比，仅在联合治疗组发现CGI显著改善，而在益生菌或OXT单独治疗组无显著改善。联合治疗之后还鉴定了相当数量的有利肠道微生物组网络枢纽(P<0.05)。联合方案的有利社交认知反应与霍氏真杆菌群的丰度高度相关。

本发明人发现，之前从未报道过联合治疗引起的显著临床改善。以前，在不同的动物研究中发现PS128增加多巴胺和血清素^12,13；然而，尚未测试其与催产素的关系。越来越多的证据表明大脑不同区域的多巴胺能系统、催产素/加压素和血清素能系统之间存在重要的相互作用，极大地影响人的社交行为^18,19。相信本发明的发现不仅为ASD的治疗开辟新的途径，而且进一步加深了对肠-脑轴和ASD发病机理的了解，值得进一步研究。

定义

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或试验中可使用与本文所述类似或等同的任何方法和材料，但本文描述了优选的方法和材料。

说明书和权利要求书中所使用的不定冠词“一个”和“一种”，除非明确指明相反，应理解为意指“至少一个(种)”。

说明书和权利要求书中所使用的短语“和/或”应理解为意指所连接元素的“任一个或两个”，即，元素在某些情况下结合存在，而在其他情况下分离存在。以“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式解释，即，所连接元素的“一个或多个”。除了“和/或”分句具体标识的元素之外，可任选存在其他元素，无论是否与具体标识的那些元素相关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，当与开放式语言例如“包括”结合使用时，提及“A和/或B”可仅指A(任选包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选包括除A之外的元素)；在又一个实施方案中，指A和B二者(任选包括其他元素)；等。

如说明书和权利要求书中所使用，“或”应理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为是包容性的，即包括数个元素或列表元素中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选其他未列出的项目。仅明确指明相反，如“仅一个”或“正好一个”，或在权利要求书中使用时，“由……组成”指恰好包含数个元素或列表元素中的一个元素。通常，本文所使用的术语“或”在排他性术语如“任一”、“一个”、“仅一个”或“恰好一个”之前时应仅解释为指示排他性备选方案(即，“一个或另一个但不是二者”)。在权利要求书中所使用的“基本上由……组成”应具有专利法领域中使用的普通含义。

凡是用语言“包括”来描述实施方案的，都包括用“由……组成”和/或“基本上由……组成”来描述的类似实施方案。

如本文所使用，通常认为与数字相关的术语“大约”或“约”包括在该数字的任一方向上(大于或小于)5％范围内的数字，除非上下文中另有说明或以其他方式显而易见(除非这样的数字超过某个可能值的100％)。

数字范围包括定义范围的数字，本文提供的任何单独值都可用作包括本文提供的其他单独值的范围的端点。例如，一组诸如1、2、3、8、9和10的值同样公开了1-10、1-8、3-9等的数字范围。同样地，所公开的范围是该范围所包括的每个单独值的公开。例如，所述5-10的范围也为5、6、7、8、9和10的公开。

根据一个或多个优选实施方案描述了本发明，应理解，除了明确说明的实施方案之外，还可在本发明的范围内进行许多等同物、替代物、变型和修改。

如本文所使用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展、基本上改善病症的临床症状或美学症状，或基本上预防病症的临床症状或美学症状的出现。为了本公开的目的，“治疗”或“治疗方法”描述了为了对抗疾病、病症或障碍的目的而对患者进行的管理和护理。该术语包括防范性治疗(即预防性治疗)和姑息性治疗。“治疗”包括施用本公开的组合物来防止症状或并发症的发作，减轻症状或并发症，或消除疾病、病症或障碍。本文所使用的术语“治疗”和由其产生的术语不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反地，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为这些治疗或预防具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本公开的方法可以提供哺乳动物疾病的任何量的任何水平的治疗或预防。此外，本发明方法提供的治疗或预防可包括对正在治疗或预防的疾病或疾病状态(如ASD)的一种或多种病症或症状的治疗或预防。此外，为了本公开的目的，“预防”可包括延迟疾病或其症状或病症的发作，为了本公开的目的，“治疗”或“治疗方法”包括为对抗疾病、病症或障碍的目的而对对象进行的管理和护理。治疗包括施用如本文所述的益生菌和催产素来预防疾病、病症或障碍的症状或并发症的发作，和/或减轻疾病、病症或障碍的症状或并发症。

如本文所使用，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的治疗反应而无不适当的不良副作用(如，毒性、刺激或过敏反应)的一种或多种活性治疗剂的量。显然，具体的“有效量”将随以下因素而变化：待治疗的特定病症、对象的身体状况、治疗的持续时间、同时疗法(如果有)的性质、以及所使用的特定制剂和治疗药物或其衍生物结构。确切的用量由个体医生鉴于待治疗的患者来选择。调整用量和施用以提供足够水平的活性剂或维持预期效果。

“对象”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后或治疗的任何对象，尤其是哺乳动物对象。本发明一般应用于人类，但也可以将本发明用于兽医目的。例如，可能希望对商业上重要的农场动物(如牛、马、猪、兔、山羊和绵羊)或相关实验室动物(如大鼠、小鼠、兔)等进行治疗或测试疗法。还可能希望治疗伴侣动物，如猫和狗。

在一些实施方案中，本领域普通技术人员可以使用常规实验容易地确定最佳有效量。在一些实施方案中，通过例如，在一天、数天、一周、数周、数月或数年的时间内施用多个治疗有效剂量来实现治疗有效量。在一些实施方案中，按症状而定施用有效量。

可以采用任何合适的方法来确定、检测或监测对象对根据本文提供的方法的治疗的反应。如本文所使用，“确定对象对治疗的反应”是指评估对象响应于施用本文提供的组合物或响应于根据本文提供的方法治疗的治疗结果。

如本文所用，临床总体印象(CGI)是用于测量症状严重程度和治疗反应的量表。在一些实施方案中，CGI是由临床医生和研究人员用于追踪症状变化(如，在开始治疗之前相比之后的变化)的三项目观察者评定量表。其评估的三个项目是：1)疾病严重性(CGI-S)、2)整体改善(CGI-I)和3)疗效指数(CGI-E)，这是对所施用的药物特有的治疗效果和副作用的衡量。开发CGI供NIMH资助的临床试验使用，以提供在开始研究用药之前和之后患者整体机能的临床医生观点的简要、独立的评估。CGI包括两个配套的单项测量，评估以下：(a)精神病理学严重程度，从1至7(CGI-S)，和(b)在类似的7分量表上治疗开始后的变化(CGI-I)。

优点和应用

如以下实施例所示，本发明人观测到与安慰剂组相比，益生菌和催产素联合组的ABC和SRS-2评分改善以及CGI-改善的显著改善(P<0.05)。联合治疗之后还鉴定出相当数量的有利肠道微生物组网络枢纽(P<0.05)。联合方案的有利社交认知反应与霍氏真杆菌群的丰度高度相关。

在这些实施例中，本发明人评估并比较了两种有前景的干预：相比安慰剂对照单独和联合的益生菌和催产素。所有干预均耐受良好，未观测到严重不良事件。本发明人仅在联合治疗组中观测到社交和行为测量结果(ABC和SRS)的改善趋势，尤其是ABC总评分(P＝0.077)、ABC刻板行为分项评分(P＝0.069)和SRS认知分项评分(P＝0.059)。同时，与安慰剂相比，CGI仅在联合治疗组显著改善，在益生菌或OXT单独治疗组未显著改善。

之前从未报道过本文所公开的联合治疗引起显著的临床改善。以前，在不同的动物研究中发现PS128增加多巴胺和血清素^12,13；然而，尚未测试其与催产素的关系。越来越多的证据表明大脑不同区域中的多巴胺能系统、催产素/加压素和血清素能系统之间存在重要的相互作用，极大地影响人的社交行为^18,19。该技术不仅为ASD的治疗开辟了新的途径，还进一步加深了对肠-脑轴和ASD发病机制的了解。

治疗性组合物

本文所公开的组合物可包括药物(治疗性)组合物，其包括(1)包含植物乳杆菌的益生菌组合物，(2)催产素和(3)任选地另外的益生菌微生物和/或另外的活性剂，并且可配制成施用于需要其的对象。在一些实施方案中，益生菌组合物和催产素一起提供，例如提供在同一制剂中。在一些实施方案中，益生菌组合物和催产素分开提供，例如提供在不同的制剂中。

考虑到如特定患者的年龄、性别、体重和病况以及施用途径的因素，可以按医学领域技术人员所熟知的技术按一定用量配置和/或施用本公开的组合物。

该组合物可以包括本领域已知的药物溶液，包括载体、稀释剂、赋形剂、防腐剂和表面活性剂。该组合物还可以包括缓冲剂(如，为了保持组合物的pH)。

该药物组合物可用于治疗性施用。在治疗性应用中，组合物以足以引起治疗性效果(如，治愈或至少部分阻止或减缓疾病的症状和/或并发症的反应)的量(即，“治疗有效剂量”)施用于患者。

在一些实施方案中，组合物被配制用于全身递送，如经口、经鼻或肠胃外递送(如，动脉内、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内)。

根据一些实施方案，经口施用具有硬或软明胶胶囊、丸剂、胶囊剂、片剂(包括包衣片剂)、糖衣丸、酏剂、混悬剂、液体剂、凝胶、浆液或糖浆的形式及其受控释放的形式。在一些实施方案中，将本公开的一种或多种组合物添加到用于经口施用的食品或饮料中。

经口施用的示例性载体是本领域所熟知的。用于经口施用的组合物可使用固体赋形剂制成，任选地通过以下制成：研磨所得到的混合物，并在根据需要添加合适的助剂之后加工颗粒混合物来获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂的非限制性示例包括填料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠，和/或生理上可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。用于分配器中的例如明胶的胶囊和药盒可配制为含有化合物和合适粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

用于经口施用的固体剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性化合物与至少一种药学上可接受的惰性载体(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。这种剂型也可包括，按正常做法，除惰性稀释剂以外的其他物质，例如润滑剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，该剂型还可以包含缓冲剂。片剂和丸剂还可以用肠溶包衣来制备。本文使用的术语“肠溶包衣”是指控制组合物在消化系统内的吸收位置的包衣。用于肠溶包衣的材料的非限制性示例为脂肪酸、蜡、植物纤维或塑料。

经口施用的液体剂型还可以包含辅料，如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。

在一些实施方案中，益生菌组合物包括约1×10³至约1×10²⁰CFU、1×10⁴至约1×10¹⁵CFU、1×10⁵至约1×10¹²CFU、1×10⁶至约1×10¹¹CFU、或约1×10¹⁰至约1×10¹¹CFU、或约1×10¹⁰CFU、2×10¹⁰CFU、3×10¹⁰CFU、4×10¹⁰CFU、5×10¹⁰CFU、6×10¹⁰CFU、7×10¹⁰CFU、8×10¹⁰CFU、9×10¹⁰CFU、10×10¹⁰CFU的植物乳杆菌。

在一些实施方案中，催产素以约1-3IU/天、约2-4IU/天、约3-5IU/天、约4-6IU/天、约5-7IU/天、约6-8IU/天、约8-10IU/天、约10-20IU/天、约20-30IU/天、约30-40IU/天、约40-50IU/天、约50-100IU/天经鼻施用。

在一些实施方案中，益生菌组合物和催产素共同施用，即在同一时间施用(如，如果它们在同一制剂例如口服片剂或胶囊中)或基本上同时施用(如，如果经口施用益生菌，而经鼻施用催产素)。在一些实施方案中，益生菌组合物和催产素在不同时间施用。

在一些实施方案中，益生菌组合物在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年的过程内或按症状而定频率以多剂量经口施用。例如，但不限于此，在一些实施方案中，益生菌组合物每天施用1次、2次、3次、4次、5次或更多次。

在一些实施方案中，催产素在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年的过程内或按症状而定频率以多剂量经鼻或经口施用。例如，但不限于此，在一些实施方案中，催产素组合物每天施用1次、2次、3次、4次、5次或更多次。

实施例

实施例不旨在限制本发明的范围。

实施例1.益生菌与催产素联合治疗自闭症谱系障碍患者的效果：随机、双盲、安慰 剂对照试验

背景简述：自闭症谱系障碍(ASD)是一种迅速增长的神经发育障碍。据报道，益生菌和催产素均具有治疗潜力；然而，尚未研究联合疗法。

方法概述：在35名3-20岁ASD患者(中位数＝10.30岁)中进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的两阶段试点试验。随机分配对象每天接受植物乳杆菌PS128益生菌(6×10¹⁰CFU)或安慰剂治疗28周；从第16周开始，两组均接受催产素。主要结果测量使用社交反应量表第二版(SRS-2)和异常行为检查表(ABC)测试社交行为。所测量的次要结果包括临床总体印象(CGI)量表、肠道微生物组组成、和血液炎症标志物，包括白细胞介素-1β、S100钙结合蛋白B、胶质纤维酸性蛋白、髓磷脂碱性蛋白和催产素水平。比较两个组之间在基线、治疗16周和28周时的结果。

结果概述：总体而言，与安慰剂组相比，观测到益生菌和催产素联合组的ABC和SRS-2评分改善且CGI-改善的显著改善(P<0.05)。联合治疗后还鉴定出相当数量的有利肠道微生物组网络枢纽(P<0.05)。联合方案的有利社交认知反应与霍氏真杆菌群的丰度高度相关。

结论：研究结果表明ASD患者中益生菌PS128与催产素之间的协同作用。

结果

人口统计资料

研究流程图如图1所示。2018年12月12日至2019年6月17日，登记并随机分配35名3-20岁的ASD患者(中位数＝10.30岁)。安慰剂组对象的年龄范围为4.69岁至19.70岁，益生菌组对象的年龄范围为3.60岁至18.50岁。35名参与者的基线人口统计资料特征和临床指标如图8所示。两个组在人口统计资料和临床指标上无显著性差异(P>0.05)。未观测到严重或重度不良事件。一名对象在第二阶段因自行迅速消退的轻微鼻出血而终止；该对象具有与季节性鼻炎相关的复发性鼻出血病史。另一名对象因轻度上呼吸道感染使用口服门诊抗生素而终止。其他自行退出是由于搬家、旅行或发现与研究或任何不良事件无关的其他管理原因导致的。两个组之间的退出率无显著差异(P>0.05)。

社交行为参数和其他临床指标

针对对照组和益生菌组从访视1到访视2(V2-V1)以及OXT组和益生菌+OXT联合组从访视1到访视3(V3-V1)的通过异常行为检查表(ABC)和社交反应量表第二版(SRS-2)测量的社交行为参数的变化(图9)。对各治疗组对象与对照组对象进行了独立的Wilcoxon秩和检验。联合治疗组(益生菌+OXT)中观测到ABC总评分(P＝0.077)、刻板行为评分(P＝0.069)和SRS认知评分(P＝0.059)改善的趋势，但ABC和SRS的总评分或分量表未观测到显著差异(Wilcoxon秩和检验，P>0.05)。

评估临床总体印象(CGI)来评估每次访视时ASD症状及症状改善的相对程度。如图2所示，与对照组相比时，仅益生菌+OXT联合组中显示改善的对象比例显著增加(Pearsonχ²-检验，P<0.05)，而益生菌或OXT单独组的变化不显著，但是这两个干预组均观测到改善的趋势。各组CGI评分减少的瀑布数据如图6所示。

与安慰剂组相比，治疗过程期间3个治疗组的GI严重程度指数(GIS)无显著变化(P>0.05)。

肠道微生物组

通过测序粪便DNA来研究肠道微生物组。尽管在本研究中α和β多样性未显示显著变化(图7)，但是发现使用0.7的SparCC截止值，与之前两次访视V1和V2相比，微生物群枢纽和连接边数唯独在V3时显著增加(图3A)。OXT单独组(P<0.001)和联合组(P<0.005)的连接线或边显著增加(图3B)，然而，仅联合组的关节点数(具有光圈围绕节点的那些又被称为“枢纽”)显著更多(Yates连续性校正的Pearsonχ²检验，P<0.05，图3C)。

研究枢纽评分大于0.8的那些关键枢纽分类群时，有趣地，在三个治疗组中发现了无重叠的一组不同的枢纽(标记为“+”)。克里斯滕森菌科R7、瘤胃菌科UCG-002、毛螺菌科UCG-001、布劳特氏菌属和巴恩斯氏菌属仅存在于联合治疗组；不同的枢纽，粪球菌属(Coprococcus)2，理研菌科RC9、嗜胆菌属(Bilophila)、链型杆菌属(Catenibacterium)和霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)仅存在于OXT单独组；而罗斯氏菌属(Roseburia)、韦永氏球菌属(Veillonella)和链球菌属(Streptococcus)仅存在于益生菌组。安慰剂组没有发现任何关键枢纽(图10)。

功能基因预测分析表明，在28周的治疗期间，联合组中的几种基因趋于更大的丰度。值得注意地，发现编码转运蛋白、ABC转运蛋白、转录因子、孢子形成、淀粉和蔗糖代谢、卟啉和叶绿素代谢、信号转录代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及硫胺素代谢的基因在联合组比其他组富集更多，但是差异无统计学显著性(P>0.05，图4)。

然后，进行Spearman相关性分析，以评估基线时和治疗过程期间通过ABC和SRS测量的社交行为参数与微生物群相对丰度之间的相关性。有趣地，发现在治疗之前霍氏真杆菌群与SRS总评分(R＝-0.59，错误发现率调整的P(FDR)＝0.00767)和三个分量表(SRS沟通：R＝-0.55，FDR＝0.04282)；SRS特殊习惯：R＝-0.6，FDR＝0.01753；SRS动机：R＝-0.56，FDR＝0.0645；图11)显著相关；发现霍氏真杆菌群与SRS认知评分之间存在最强负相关(Spearmanρ＝-0.97,P＝0.0048,FDR<0.1)，而且联合治疗组中霍氏真杆菌群的绝对变化(V3-V1)与基线SRS认知评分呈正相关(Spearmanρ＝0.71,P＝0.05)，同时联合治疗组中理研菌科、另枝菌属、克里斯滕森菌科R7和瘤胃菌科UCG-002的绝对变化(V3-V1)与基线ABC刻板行为评分呈正相关(图12)。值得注意地，发现基线时理研菌科和另枝菌属与SRS-动机显著相关(图11)，而克里斯滕森菌科R7和瘤胃菌科UCG-002是仅在联合治疗组中发现的五个重要且独有枢纽中的两个(图10)。此外，发现基线时毛螺菌科(未培养)与ABC不恰当言语呈负相关(R＝-0.68，FDR＝0.04247)。

血清标志物

对于所测量的OXT水平，四组均无显著变化(p>0.05)(图5A)。对于本研究中检测的炎症标志物，观测到OXT单独组中S100(图5B)和联合治疗组中IL-1β水平(图5C)大幅减少的趋势；不过这些差异无统计学意义(Wilcoxon秩和检验，P>0.05)。通过Spearman相关性分析，还发现基线时S100水平与ABC易怒(图5D)和ABC过度活动/不服从评分(图5E)呈正相关。

讨论

在本研究中，探索并比较了两种有前途的干预：相比安慰剂对照单独和联合的益生菌和催产素。所有干预均耐受良好，未观测到重大不良事件。仅在联合治疗组，观测到社交和行为测量结果(ABC和SRS)改善的趋势，尤其是ABC总评分(P＝0.077)、ABC刻板行为分项评分(P＝0.069)和SRS认知分项评分(P＝0.059)。同时，与安慰剂相比，仅在联合治疗组发现CGI的显著改善，而益生菌或OXT单独治疗组则没有。CGI提供在开始研究用药之前和之后患者整体机能的临床医生观点的简要、独立的评估。CGI-I代表在七分量表上自开始治疗的变化¹⁷。在本研究中，CGI-I由对治疗状态完全设盲且同时非常了解对象的临床医生完成。发现联合治疗引起了显著的临床改善，这在以前从未报道过。以前，在不同的动物研究中发现PS128增加多巴胺和血清素^12,13；然而，其与催产素的关系尚未进行测试。越来越多的证据表明大脑不同区域中的多巴胺能系统、催产素/加压素和血清素能系统之间存在重要的相互作用，极大影响人的社交行为^18,19。认为这一发现不仅为ASD治疗开辟了新的途径，而且也加深了对肠-脑轴和ASD致病机理的了解，值得进一步研究。

在发现用联合治疗改善了精神病理学的基础上，进一步发现肠道微生物组在干预过程期间的一些显著有利的变化。特别地，发现SparCC共现网络显著增加。OXT单独组(P<0.001)和联合组(P<0.005)的连接线显著增加，然而关节点(枢纽)数仅在联合组(P<0.05)而非OXT单独组(P>0.05)显著更多，这表明联合治疗中涉及更多关键且有意义的微生物组相互作用。众所周知，网络中的关节点是一个节点，它的去除会使网络断开。这一新发现支持了联合治疗的协同作用。在检查关节点的驱动物种时，观测到联合治疗组中鉴定的微生物群不仅与安慰剂组不同，而且与益生菌或OXT单独组也没有重叠。在联合治疗组中具有高枢纽评分(>0.8)的那些微生物中，以前报道过布劳特氏菌属(Blautia)和巴恩斯氏菌属在ASD患者的肠道中均减少^20-22，而且两者均可促进有益于肠道健康的丁酸酯产生²³。在ASD中尚未报道过克里斯滕森菌科R7、瘤胃菌科UCG 002和毛螺菌科UCG 001，但它们与体重、肠道健康和糖尿病相关的健康益处已报道过。这些枢纽的增加总体上有利于改善新陈代谢和炎症^24-28。获自OXT单独组的结果具有嗜胆菌属、粪球菌属-2、霍尔德曼氏菌属、理研菌科和链型杆菌属的高评分枢纽，也通常有利于抗炎和肠道健康^.29-34。类似地，在益生菌组中发现了具有高枢纽评分的罗斯氏菌属、韦永氏球菌属和链球菌属，同样促进抗炎、肠道健康以及另外的碳水化合物代谢^29,35,36。在联合组中，关节点数的显著增加很可能促成其比每种单独治疗更好的治疗反应，来自单一治疗组的不同枢纽组也支持在联合治疗组中所观测到的协同作用。网络理论的进步有助于解开发生在微生物组内的高阶相互作用³⁷，这可能比所代表的微生物组多样性更重要。

此外，预测的功能基因分析表明，与安慰剂和其他治疗组相比，联合组的几种重要途径更易激活。联合组中具有最强区别能力的途径是“转运蛋白”，其次是“ABC转运蛋白”、转录因子、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及硫胺素代谢。ABC转运蛋白结合能量代谢并介导营养物摄取和生理功能，发现其在神经元网络受损的ASD模型中被抑制^38,39。在ASD中发现淀粉和蔗糖代谢途径下调⁴⁰。人肠道微生物组是消化的关键组成成分，因为它促进复杂碳水化合物和蛋白质的分解⁴¹。已证明精氨酸在肠道炎症和感染的情况下显著降低⁴²。作为一氧化氮(NO)的代谢前体，精氨酸调节神经元的存活、分化、突触活动和可塑性⁴³。硫胺素(维生素B₁)是重要的辅因子，缺乏时会导致诸如精神错乱、记忆力下降和睡眠障碍的症状⁴⁴，而充分的浓度会促进健康肠道生态系统的内稳态。这些有利的发现进一步支持使用联合治疗而非单独使用它们作为一种有前景的治疗方法，并且所涉及的协同作用促进能量代谢和正常生理功能。

重要地，发现肠道微生物组与社交行为参数高度相关。发现霍氏真杆菌与SRS总评分和分项评分高度负相关，尤其是SRS认知分项评分。霍氏真杆菌越富集与SRS评分越低相关，SRS评分越低代表更好的社交功能水平，这种强相关性不仅在基线时观测到，而且在第3次访视时在联合组中绝对增加。如前所述，图9所示的联合组中SRS认知分项量表的改善(P＝0.059)是所观测到的最明显改善趋势之一。基线时霍氏真杆菌越高，在联合治疗过程期间社交认知的改善越有利。基线时社交认知水平越低(评分越高)，观测到联合组中霍氏真杆菌的增加越多。霍氏真杆菌可利用葡萄糖和发酵中间体乙酸酯和乳酸酯来形成有利于肠道健康的丁酸酯⁴⁵；然而，在ASD患者中尚未报道过这种有前景的分类群。此外，克里斯滕森菌科R7和瘤胃菌科UCG-002是仅在联合治疗组(V3-V1)中观测到的五个特有枢纽中的两个，发现它们与描述ASD核心症状之一的ABC刻板行为分项评分呈正相关。该相关性分析进一步证实了在联合组中基线时和良好治疗反应之后肠道微生物组与ASD核心症状的强相关性。

为了进一步了解这些治疗反应，还测量了治疗过程期间的血清催产素和炎症标志物。在该研究中，与安慰剂组相比，未发现三个治疗组的催产素水平显著变化。

已报道了在ASD个体中不同程度的异常OXT血清水平，与非ASD对照相比，有时降低^46,47，有时无差异^48,49，有时富集⁵⁰。这些差异可能与ASD人群亚组中OXT的生物合成或释放减少^51,52、功能障碍OXT处理失调、或催产素受体异常⁵³有关。需要进一步研究这些潜在的ASD亚型，并分析不同亚群中的这些可变结果和治疗反应。

已广泛报道了与ASD相关的炎症机制。与健康对照相比，发现ASD个体的炎症细胞因子显著升高⁵⁴ _, ⁵⁵。类似地，已发现ASD儿童的脑损伤和炎症标志物GFAP、MBP和S100B比对照显著富集^55-59；这些脑损伤标志物和细胞因子释放随后在脑内触发胶质细胞活化和炎症过程⁶⁰。在本研究中，检测了这四种血清炎症标志物，发现OXT组的S100呈下降趋势，而在联合治疗中IL-1β的下降更明显。显示出S100B与问题行为的严重程度呈显著正相关(基线时ABC易怒和过度活动评分；P<0.05)。

该研究有几个局限性值得考虑。1)尽管采用了适当的招募和保留策略，但该试验的参与者登记和保持是有挑战性的。本次试点试验样本量相对少，限制了统计学功效和进一步的亚组分析。2)虽然基线时益生菌组和安慰剂组的临床指标没有统计学差异，但本研究中使用的年龄范围较大，导致对象人群异质性较高，治疗功效可能发生变化。未来的研究需要更大样本量和亚组分层。3)由于亚洲和其他少数民族患者有一定的文化和语言障碍，除了多种影响行为变化的因素外，父母对社交行为量表的评定可能存在一定偏差；4)四个干预组在同一时间点未进行顺序比较。两阶段设计似乎不如简单地四个组进行2×2因子设计；在该设计中，延长的治疗疗程可能受其他随机发生因素的影响。

材料和方法

试验设计

本临床试验是根据试验报告统一标准(CONSORT)指南的一项随机、双盲、安慰剂对照的研究。将对象随机分为两组，在该两阶段研究中两组的比例为1:1。为了对主要结果实现80％的统计学功效，假设大的效应量为0.8(Cohen’s d)，总共需要60名参与者(每组30名)。然而，由于主要兴趣在于研究拟定治疗的初步效果，登记并随机分配了35名纳入数据分析的对象。在第1阶段中，益生菌组接受口服益生菌PS128，而安慰剂组接受口服安慰剂16周。在第2阶段，两组继续各自给药，同时加入鼻内催产素喷雾剂。进行治疗共28周，在第0周、第16周和第28周进行3次访视(分别为V1、V2和V3)以进行结果测量。虽然最初计划在第0周、第12周和第24周进行研究结果测量，但基于一些初步结果决定将第1阶段的研究治疗再延长4周。决定这种变化是合理的，因为以前从未研究过补充有当前感兴趣菌株的益生菌的长期治疗。

本研究的伦理批准由麻省总医院内部审查委员会(the Internal Review Board(IRB)of Massachusetts General Hospital)颁发(2017P001667)。试验经注册(NCT03337035)且提前发布方案⁶。本研究按照《赫尔辛基宣言》(Declaration ofHelsinki)中所述的指导原则进行。根据IRB要求，获得有能力的成人对象或有认知障碍的儿童和成人的父母或法定监护人的书面知情同意书。

通过电话登记和通过互联网研究电子数据采集(REDCap，v9.5.23)软件的自我报告每月评估用药依从性和潜在不良影响的安全性评估。所有不良事件均按照指导原则及时上报麻省总医院人体研究委员会。已制定数据和安全监控计划(DSMP)并获得了IRB的批准，以确保参与者的安全、数据有效性和本研究的适当终止。

参与者

研究参与者通过当地社区的广告海报/传单以及ASD父母网络和研讨会招募。年龄为3-25岁，具有已按精神障碍诊断与统计手册(DSM-IV TR/-5)标准、自闭症诊断观察量表第二版(ADOS-2)和/或自闭症诊断访谈修订版(ADI-R)确诊为ASD的预先诊断的参与者入选。其他入选标准包括：参与者必须稳定用药至少4周，试验期间用药或心理干预没有计划改变，愿意及时提供粪便样本和血液，愿意参与访视和研究程序。如果对象怀孕(研究之前或研究期间)、患有其他神经和/或精神疾病(如，双相障碍或物质使用障碍病史)合并症、服用精神药物、患有不受药物控制的活动性心血管疾病或在过去4周内接受了催产素或益生素治疗，则排除潜在的参与者。在麻省总医院Athinoula A.Martinos中心的临床研究设置的私人房间对参与者进行了访谈和测试。

随机和设盲

随机分配隐蔽由非研究小组成员的统计员与麻省总医院研究药房合作进行。通过电子方式生成随机抽样编号，并由药房使用外观相同的编号药物容器在研究药房进行中心随机化，以确保分配的隐蔽性。通过使胶囊外观相同保持了设盲。参与者和收集结果数据的研究人员都对治疗状态不知情。

干预

从传统发酵芥末食品分离的植物乳杆菌PS128(PS128)以DSMZ登记号DSM 28632保藏。已阐明PS128的基因组结构⁶²。利用PS128的动物和人类研究显示极其安全^12,13,63。益生菌胶囊仅含有一种菌株(植物乳杆菌PS128)。本研究的用量为每日2粒胶囊(6×10¹⁰CFU)。将微晶纤维素胶囊用作PS128的安慰剂。益生菌胶囊和安慰剂胶囊均由Bened生物医药公司免费赠送。

在本研究中，催产素经鼻施用。喷雾剂(Novartis Pharma AG)是目前全球临床试验中最常用的标准化催产素鼻喷雾剂。我们指导患者和家属使用这种喷雾剂。在第二阶段的第一周开始给药，每日喷一下4IU。随后，第二周用量增加至每日每个鼻孔喷一下(8IU/天)，第三周用量增加至每日两次，每次每个鼻孔喷一下(16IU/天)。然后从第4周开始，将用量滴定至每日32IU的最大剂量，即每日两次，每次每个鼻孔喷两下。以前的文章已显示32IU/天的用量对于更年轻的患者(3-8岁)而言是安全且适当的⁶⁴。另一项研究报道了在年龄为6-12岁的32名ASD患儿中进行4周鼻内OXT治疗⁶⁵(24IU，每日两次，共48IU/天，超过本研究的最大剂量32IU/天)。获得了FDA的激活IND，/>(Pitocin,催产素)的IND编号为138827。

结果

主要结果测量

评估了两个主要结果测量：

照料者评定的社交反应量表第二版(SRS-2)⁶⁶的变化，和

照料者评定的异常行为检查表(ABC)⁶⁷的变化。

SRS-2用于基于五个分项量表评估社会兴趣和互动。访视了4岁以上的所有对象。ABC是通过主成分分析经验得出的信息评定工具。包含58项，分为5个分项量表。访谈了所有5岁以上的对象。

次要结果测量

血液样本采集及循环性生物标志物分析。参与者在8小时空腹之后，三次(第0周、第16周和第28周)来到麻省总医院附属Athinoula A.Martinos中心进行访视。采血并处理获得血清，用唯一代码标记，并储存于-80℃。用ELISA法(R&D Systems Inc.,明尼阿波里斯市,MN,美国)按制造商说明书测定循环性OXT、MBP、GFAP、S100B和IL-1β。

GI症状严重程度评估。通过经验证的GI严重程度指数(GSI)评估GI症状，包括便秘、腹泻、粪便稠度、粪便气味、胀气、腹痛、意外日间易怒、夜间觉醒和腹部压痛。使用布里斯托(Bristol)粪便图对粪便状态进行评分。

临床总体印象(CGI)。CGI开发用于临床试验，以提供研究用药的患者整体机能变化的临床医生观点的简要、独立的评估。CGI包括两个配套的单项测量，评估以下：(a)精神病理学严重程度，从1至7(CGI-S)和(b)在类似的七分量表上治疗开始的变化，临床总体印象-改善(CGI-I)¹⁷。

粪便样本处理。由参与者在经培训的父母监督下在家用OMNIgene Gut OMR-200收集盒(DNA Genotek Inc.)采集粪便样本并于室温下储存，然后将粪便样本去识别化并且运送或运输至Athinoula A.Martinos中心，在那里粪便样品于-80℃冷冻箱储存。第28周之后收集到所有实验样本，用干冰包装并亲手送交Brigham&Woman医院的实验室进行DNA提取和测序分析。然后根据制造商说明书提取微生物DNA，并用NanoDrop分光光度计定量DNA样品。还测定A260/A280之比，以确认高纯度DNA含量。来自总肠道DNA样本的微生物16S rRNA V4基因组区用以下引物515F(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA,SEQ ID NO:1)和806R(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT,SEQ ID NO:2)进行扩增。使用Bioanalyzer DNA试剂盒对PCR产物进行纯化和分析，然后通过实时PCR进行定量。将DNA文库合并，并用Illumina MiSeq下一代测序系统((Illumina；圣地亚哥,CA,美国)测序，使用具有重叠读取的V4 2×250bp双端策略。

统计学分析

基于意向治疗原则进行数据分析。治疗比较的主要结果是SRS和ABC评分(SRS T评分，ABC T评分)的变化。次要结果测量包括CGI、GSI、血清标志物水平和肠道微生物组。

使用用于连续变量的独立样本t-检验/Wilcoxon秩和检验来检测干预过程期间测量结果变化的组间差异。使用配对样本t检验和Wilcoxon符号秩检验来检验干预之前和之后主要结果和次要结果的组间差异(V2-V1和V3-V1)。对于显示次要结果测量变化的对象比例差异，应用用于无连续性校正的等比例的z检验。

此外，基于基线SRS/ABC评分、GI状况和神经炎症/神经损伤血清标志物水平进行分层分析。

利用QIIME 2⁶⁸对测序数据进行处理和分析，并使用Phyloseq R软件包通过Chao-1、Faith PD、Evenness和Observed OTU计算α多样性。分析β多样性、加权UniFrac、非加权UniFrac、Bray-Curtis和Jaccard。

构建SparCC共丰度网络来检查肠道微生物群之间关联的纵向变化⁶⁹。认为具有量级大于0.7的SparCC截止值的相关性是显著的。已鉴定的枢纽分类群和各自的枢纽评分由圆圈的大小表示。在每次研究访视时针对所有评估变量按组进行基于错误发现率(FDR)的类型1错误控制。这经由MaAsLin2完成评估主要结果和次要结果以及血清标志物浓度相比微生物群相对丰度的相关性⁷⁰。FDR<0.1时认为显著相关。

PICRUSt-1(通过重建未观测状态进行群落的系统发育研究)是一种使用标志物基因数据和参考基因组数据库以预测宏基因组的功能组成的计算方法，并应用于当前的16S数据集。计算每个实验对象的访视V1和访视V2(V2-V1)以及访视V1和访视V3(V3-V1)之间各特征丰度(ASV或途径)的丰度相对变化。然后利用Wilcoxon秩和检验对益生菌与安慰剂组之间的相对变化进行差异分析。所有16S rRNA原始数据均已提交至国家生物技术信息中心的序列读取档案(SRA)数据库SAMN16687792–SAMN16687860。

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在上述描述中，本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行不同的替换和修改。在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下，可以适当地实施本文所述的示例性本发明。将所使用的术语和措词用作描述而非限制性术语，并且无意在使用这类术语和措词时排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而是已认识到在本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管本发明已通过具体实施方案进行了说明，并且本文所公开的概念的可选特征、修改和/或变化可以由本领域技术人员采用，并且认为这种修改和变化在本发明的范围内。

本文引用了许多专利和非专利参考文献。所引用的参考文献以引用的方式以其整体并入本文。如果说明书中术语的定义与所引用的参考文献中术语的定义不一致，则应当基于说明书中的定义对该术语进行解释。

序列表

<110> 通用医疗公司

孔学军

<120> 用于治疗自闭症谱系障碍的方法和组合物

<130> 125141.03719

<150> 63/132,081

<151> 2020-12-30

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- 微生物16S 引物 515F

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(37)

<223> n为a, c, g, 或t

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntat ggtaattgtg tgccagcmgc 60

cgcggtaa 68

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- 微生物16S 引物 806R

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n为a, c, g, 或t

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnagtcagtc agccggacta chvgggtwtc 60

taat 64

Claims (30)

1.一种治疗被诊断有自闭症谱系障碍(ASD)或处于自闭症谱系障碍(ASD)风险的对象的方法，所述方法包括：施用包括有效量的(1)包含植物乳杆菌的益生菌组合物和(2)催产素的联合疗法。

2.根据权利要求1所述的方法，其中与治疗之前相比，所述对象在治疗之后或治疗过程期间表现出临床总体印象(CGI)评分的统计学改善。

3.根据权利要求1所述的方法，其中与治疗之前相比，所述对象在治疗之后或治疗过程期间表现出照料者评定的社交反应量表第二版(SRS-2)的改善。

4.根据权利要求1所述的方法，其中与治疗之前相比，所述对象在治疗之后或治疗过程期间表现出照料者评定的异常行为检查表(ABC)的改善。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述益生菌组合物包含约1×10³至约1×10²⁰CFU、1×10⁴至约1×10¹⁵CFU、1×10⁵至约1×10¹²CFU、1×10⁶至约1×10¹¹CFU、或约1×10¹⁰至约1×10¹¹CFU、或约1×10¹⁰CFU、2×10¹⁰CFU、3×10¹⁰CFU、4×10¹⁰CFU、5×10¹⁰CFU、6×10¹⁰CFU、7×10¹⁰CFU、8×10¹⁰CFU、9×10¹⁰CFU、10×10¹⁰CFU的植物乳杆菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包括在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年的过程内或按症状而定频率的多剂量的益生菌组合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述益生菌组合物每天施用一次。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述益生菌组合物每天施用两次。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述益生菌组合物每天施用多次。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述益生菌经口施用。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包括在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年的过程内或按症状而定频率的多剂量的催产素。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素每天施用一次。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素每天施用两次。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素每天施用多次。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素经鼻施用。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素经口施用。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素以约1-3IU/天、约2-4IU/天、约3-5IU/天、约4-6IU/天、约5-7IU/天、约6-8IU/天、约8-10IU/天、约10-20IU/天、约20-30IU/天、约30-40IU/天、约40-50IU/天、约50-100IU/天经鼻施用。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素的用量在整个施用过程中逐渐增加。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素和所述益生菌组合物显示协同作用。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述催产素和所述益生菌组合物每天各自施用。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述联合疗法施用至少约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月、约6个月、约1年或按症状而定频率施用，并且其中所述益生菌和所述催产素在同一时间、不同时间施用，施用相同时长或不同时长。

22.根据权利要求1所述的方法，其中与治疗之前相比，所述对象的微生物组组成在治疗之后有差异。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述差异包括霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)、理研菌科(Rikenelaceae)、另枝菌属(Alistipes)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、布劳特氏菌属(Blautia)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)中的一种或多种的增加。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象表现出SRS沟通、SRS特殊习惯、SRS动机、SRS认知、ABC不恰当言语、ABC刻板行为、ABC易怒和ABC过度活动/不服从中的一种或多种的改善。

25.一种组合物，包含配制成经口施用的植物乳杆菌和催产素。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述益生菌组合物包含另外的益生菌微生物。

27.根据权利要求25所述的组合物，其包含另外的益生微生物和/或包含另外的活性剂。

28.一种治疗显示自闭症谱系障碍(ASD)的一种或多种行为特征、心理特征或身体特征的对象的方法，所述方法包括：施用包括有效量的(1)包含植物乳杆菌的益生菌组合物和(2)催产素的联合疗法。

29.根据权利要求28所述的方法，其中与治疗之前相比，所述对象的一种或多种行为特征、心理特征或身体特征在治疗之后得到改善。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述对象表现出以下中一种或多种的改善：GCI评分、SRS-2评分和ABC评分。