CN117298176A - 金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用。属于中药材技术领域。金莲花提取物的提取过程为：步骤1粉碎金莲花药材，用恒温超声波提取器提取样品液；步骤2减压浓缩样品液，上大孔树脂柱静置，采用动态吸附，待吸附完全后，依次用水、10％乙醇、75％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别浓缩成干膏，合并后两种洗脱液，浓缩蒸干，将干膏溶解于蒸馏水，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压浓缩各萃取液，将后两部分浸膏合并得到精制总黄酮浸膏，低温烘干得总黄酮粉末；步骤3将总黄酮粉末用大孔树脂柱洗脱、减压回收后，用乙酸乙酯萃取得荭草苷粗品，再经碱提酸沉纯化后，得荭草苷晶体。本发明可用于制备非酒精性脂肪肝药物。

Description

金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用

技术领域

本发明涉及中医药技术领域，具体涉及金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用。

背景技术

NAFLD(非酒精性脂肪肝)是世界上最常见的慢性肝病，包括从NAFL到NASH的一系列病理情况，NASH是一种进行性脂肪肝病，可能导致肝纤维化、肝硬化、HCC和死亡。NAFL的定义为肝5％以上细胞发生脂肪变性，而NASH则除脂肪变性之外还伴有炎症、细胞损伤等症状。NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现，与肥胖、胰岛素抵抗或2型糖尿病(T2DM)、血脂异常和高血压等疾病高度相关，全球总患病率达30％以上。近年来随着肥胖人群的增加，相关代谢疾病与NAFLD的患病率也水涨船高，超重人群中NAFLD的患病率已高达69.9％，而瘦型、非肥胖人群患病率分别为10.6％、18.3％。有研究表明，中国NAFLD发病率随着时间的推移而大幅上升，近年来已达29.2％，是全球NAFLD发病率增长最快的地区，NAFLD已成为我国人民群众健康的重要威胁。

金莲花是我国常用中药材之一，为毛茛科金莲花属金莲花Trollius chinensisBunge的干燥花，具有抗菌消炎的功能，收录于1977年版《中国药典》一部中。目前应用金莲花允许生产的药品种类很少，以金莲花单味成药的各种剂型都已开发，功效也基本相同，以金莲花清热解毒之功，多用于风热邪毒袭肺，热毒内盛引起的上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎等。在金莲花相关中药的含量检测方面，多以检测荭草苷含量为主，证明荭草苷是金莲花中的重要的代表性成分，且含量较高。

现行版2020《中国药典》载有金莲花单味药成方制剂金莲花口服液、金莲花片、金莲花胶囊和金莲花颗粒，此四方均以荭草苷为含量测定指标，可知荭草苷为金莲花主要活性成分。荭草苷广泛于自然界中广范分布，可见于廖科、棕榈科、毛茛科、大戟科、鸭跖草科等十几科的多种植物。

以荭草苷为金莲花提取物，用于治疗NAFLD的药物中，目前尚无相关的报道。

发明内容

为解决现有技术的上述问题，本发明提供金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用。

进一步的，所述金莲花提取物的提取过程为：

步骤1粉碎金莲花药材，用恒温超声波提取器提取样品液；

步骤2减压浓缩样品液，上大孔树脂柱静置，采用动态吸附，待吸附完全后，依次用水、10％乙醇、75％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别浓缩成干膏，合并75％乙醇、95％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，将干膏溶解于蒸馏水，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压浓缩各萃取液，将乙酸乙酯层和正丁醇层两部分浸膏合并得到精制总黄酮浸膏，低温烘干得总黄酮粉末；

步骤3将总黄酮粉末用大孔树脂柱洗脱、减压回收后，用乙酸乙酯萃取得荭草苷粗品，再经碱提酸沉纯化后，得荭草苷晶体。

进一步的，所述提取过程中步骤1具体包括：

取金莲花药材粉碎，过80目筛，取金莲花粉末，于恒温超声波提取器中加入65％乙醇，开启低温恒温槽加热，待温度计检测乙醇温度达60℃后，缓缓加入金莲花粉末，开始微波提取样品液。

进一步的，所述提取过程中：

步骤1中恒温超声波提取器的设置参数为：温度60℃，功率600W，提取时间9min，金莲花粉末和提取溶剂的物料比为1：20。

进一步的，所述提取过程中步骤2具体包括：

减压浓缩样品液，上大孔树脂柱静置2h，采用动态吸附，待吸附完全后，依次用水、10％乙醇、75％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，每个梯度洗脱3-4个柱体积，分别浓缩成干膏，合并75％乙醇、95％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，将干膏溶解于蒸馏水，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压浓缩各萃取液，将乙酸乙酯层和正丁醇层两部分浸膏合并得到精制总黄酮浸膏，低温烘干得总黄酮粉末。

进一步的，所述提取过程中步骤2中：

动态吸附过程中控制样品液流速为1mL/min。

进一步的，所述提取过程中步骤3具体包括：

AB-8大孔树脂湿法装柱，上样总黄酮粉末，依次用蒸馏水、10％乙醇、30％乙醇、70％乙醇洗脱，并收集70％乙醇洗脱液，减压回收后，用乙酸乙酯萃取三次，得荭草苷粗品，再经三次以上碱提酸沉纯化后，得荭草苷晶体。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

金莲花提取物中荭草苷可从肝脏脂质蓄积、氧化应激、线粒体功能障碍(线粒体生物发生与线粒体自噬)三个方面改善模型大鼠NAFLD，荭草苷在NAFLD治疗方面有良好潜力，可用于制备非酒精性脂肪肝药物。

附图说明

图1a、1b、1c分别为各组大鼠体重变化、血糖变化和肝脏湿重示意图；

图2为肝组织形态及脂肪蓄积检测图；

图3为肝组织细胞凋亡检测图；

图4为肝组织脂肪代谢相关因子蛋白条带示意图；

图5a、5b为肝组织抗氧化因子mRNA表达水平中SOD mRNA相对表达量、CATmRNA相对表达量示意图；

图6a、6b、6c分别为肝组织线粒体生物发生相关因子mRNA表达水平中的PGC-1αmRNA相对表达量、NRF1 mRNA相对表达量、TFAM mRNA相对表达量示意图。

图7为肝组织线粒体自噬相关因子蛋白条带示意图；

图8为肝组织AMPK途径相关因子蛋白条带示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

本实施例中，以高脂饮食加STZ诱导Wistar大鼠为常见的T2DM合并NAFLD动物模型构建方式。采用向Wistar大鼠投喂高脂饮食加注射STZ溶液的方法构建T2DM合并NAFLD动物模型，造模成功后，以灌胃的方式连续14天给予实验动物荭草苷溶液40mg/kg/day(荭草苷晶体为40mg)，根据实验结果探讨荭草苷对NAFLD大鼠模型肝损伤的影响。

金莲花提取物的提取过程示例如下：

取450g金莲花药材粉碎，过80目筛，称取400g金莲花粉末，于恒温超声波提取器中加入65％乙醇(金莲花粉末和提取溶剂采用1：20的物料比)，设置参数，温度60℃，功率600W，提取时间9min，开启低温恒温槽加热，待温度计检测乙醇温度达60℃后，缓缓加入金莲花粉末，开始微波提取样品液。

减压浓缩样品液，上大孔树脂柱静置2h，采用动态吸附，控制样品液流速为1mL/min，待吸附完全后，依次用水、10％乙醇、75％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，每个梯度洗脱约3-4个柱体积，分别浓缩成干膏，合并75％乙醇、95％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，将干膏溶解于蒸馏水，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压浓缩各萃取液，将乙酸乙酯层和正丁醇层两部分浸膏合并得到精制总黄酮浸膏，低温烘干得总黄酮粉末13.96g。

AB-8大孔树脂湿法装柱，上样总黄酮粉末，依次用蒸馏水、10％乙醇、30％乙醇、70％乙醇洗脱，并收集70％乙醇洗脱液，减压回收后，用乙酸乙酯萃取三次，可得荭草苷粗品，再经三次(本实施例中为三次，实际中可根据情况进行多次，至少为三次)碱提酸沉纯化后，得荭草苷晶体179.02mg。

灌喂时定量称取荭草苷晶体，用羧甲基纤维素钠配置成悬浊液(通常配置成荭草苷晶体含量4％的悬浊液，根据实验动物的胃的容积大小进行调整)。

实验材料

1实验试剂

实验试剂如表1所示：

表1

2实验仪器

实验仪器如表2所示：

表2

3实验动物与材料

实验动物：30只清洁级雌性Wistar大鼠(许可证号为SCXK(黑)2021-002，符合药理学实验相关要求)，体重70g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。实验前所有大鼠进行一周适应性喂养。实验期间，动物自由取食，饮水，保持室温，室内安静，空气流通，每24h给予大鼠光照和黑暗条件各12h。饲养条件符合清洁级动物环境标准，并获得本单位实验动物伦理委员会的批准，按照国家《实验动物管理条例》执行。

高脂饮食：维持料65％、糖15％、猪油10％、奶粉5％、蛋黄粉5％，批号202101。

实验药材：本实验所用中药材金莲花购自黑龙江省呼玛县，经苏连杰教授鉴定为Trollius chinensis Bunge，其主要成分荭草苷由本单位中药资源学实验室自制，纯度98％以上。

STZ溶液的配制：将STZ溶于50mmol/L的柠檬酸钠溶液(pH 4.5)中，新鲜配制成40mg/mL的STZ溶液，并高压灭菌。避光配制，现用现配。

实验方法

1动物模型制备、分组及给药

将30只雌性Wistar大鼠适应性培养一周后，按体重随机分为对照组、模型组、治疗组各十只，以普通饲料喂养对照组大鼠，以高脂饮食喂养模型组和治疗组大鼠，各组小鼠分笼饲养，自由取食和饮水。从实验起始当日开始，每两天对各组大鼠称重并记录。至实验第20天时，提前空腹处理大鼠6至8h，以40mg/mL(1.0mL/kg)剂量的STZ溶液对模型组和治疗组大鼠进行一次性腹腔注射，同时向对照组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸钠缓冲液(pH4.5)。实验第30天，检测模型组和治疗组大鼠血糖，参考文献标准，若两组大鼠血糖水平均大于14mmol/L则提示NAFLD动物模型造模成功^[128]。

实验第30天造模成功后，将模型组和治疗组大鼠继续以高脂饮食喂养，对照组大鼠继续以普通饲料喂养。治疗组参考相关文献，每天以40mg/kg荭草苷灌胃给药一次^[129]，同时给予对照组和模型组等体积的生理盐水，连续给药14天，自二次分组当日开始，每两天对各组大鼠称重一次并记录。

实验过程中，每天观察记录各组小鼠行为、饮食、毛发变化等情况。

2实验标本采集

实验第44天给药处理后，所有大鼠禁食不禁水12h，提前准备取样器材并消毒灭菌。第二天，对各组大鼠称重并记录，用10％水合氯醛按3mL/kg体重腹腔注射对大鼠进行麻醉，取出肝脏组织，去污，称量肝脏湿重。取材后部分肝脏经4％多聚甲醛溶液固定，进行石蜡包埋并切片，其余肝脏经液氮速冻后置于-80℃的冰箱中保存留作后续实验。

石蜡切片制备：取新鲜肝脏组织，用刀片切割成约3至4mm大小组织块，将切好的组织块放入4％多聚甲醛中固定，固定完毕后，流水冲洗3次，每次5min，再依次放入梯度乙醇和二甲苯溶液中脱水透明。将石蜡融化，将组织块放入盛有蜡液的模具中，用包埋机对组织进行包埋。蜡液凝固后，用刀片切好，转移到展片台内的清水上，5min后放入载玻片，放入60℃烘箱，烤片过夜，取出常温保存备用。

冰冻切片制备：利用高渗溶液吸收组织水分，减少组织含水量，取出组织，用预冷PBS清洗后平放于铝箔纸方盒内，加入适量OCT包埋剂浸没组织，将小盒放入液氮冰结成块，取出组织冰块用冰冻切片机切片，完成后用预冷的4％多聚甲醛室温固定20min，冷水清洗3次，放入低温冰箱保存。

分别于实验开始当日、第20日、第30日和第44日，对各组大鼠进行眼眶取血。用手固定小鼠头部，压迫颈部两侧，使眼突出、眶后静脉丛充血，右手手持毛细管从眼内眦部与鼠面成45°夹角旋转刺入，固定身体，压住后肢，放松手指，调整毛细管使之流畅出血，取血完成，立即除去颈部压力，将采血器拔出，按压止血。滴加1滴血液至血糖测试纸上，使用一键式基础血糖监测系统检测大鼠的血糖。

肝组织病理学检测

1HE染色法观察肝脏形态

将小鼠肝脏石蜡切片脱蜡至水，依次将石蜡切片放入不同浓度的二甲苯和乙醇溶液中，滴加苏木素染色液2.5min，用蒸馏水冲洗30s，洗去多余染液，滴加分化液分化7s，将切片放置于自来水的染色架上，浸泡15min。取出反蓝后的切片，吸走多余水分，滴加伊红染色6-7min，用蒸馏水冲洗，依次用不同浓度的乙醇和二甲苯溶液脱水后，滴加少许中性树胶，使用显微镜盖玻片封片。在显微镜下观察各组大鼠肝脏形态及病理变化情况。

2油红O染色法检测肝组织脂肪蓄积水平

油红O染色法通常应用于检测组织或细胞内的脂肪情况，油红O是一种脂溶性染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，在脂肪内能高度溶解，其染色原理是油红O能特异性地与组织和细胞内的中性甘油三脂、脂质及脂蛋白发生吸附作用而使脂肪染色。

将事先准备好的肝脏组织冰冻切片用蒸馏水水洗，水洗后入苏木精染色液中染色，再放入分化液中短时间分化，再次放入蒸馏水中水洗反蓝，接着放入60％异丙醇溶液5min，入饱和油红O染色液染色5min，放入异丙醇中脱去浮色。保持切片湿润，用滤纸吸干多余水分，滴加甘油明胶封片，将切片放入显微镜下观察。

3TUNEL染色法检查肝脏细胞凋亡比率变化

细胞凋亡时染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生不对称的断裂点，露出大量的粘性3'-OH末端，脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)能将脱氧核糖核苷酸和荧光素等标记物标记到DNA的3'-OH末端，从而可通过免疫组化方法进行凋亡细胞的检测，观察凋亡细胞的形态及分布，这种方法就是TUNEL法。由于DNA的断裂几乎不发生在正常的或正在增殖的细胞中，没有暴露出3'-OH末端，因此此类细胞很少能够被染色。TUNEL是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。DAPI是一种含有特定AT序列DNA的一种嵌入剂，能粘附在DNA双螺旋的小沟区，穿透扰乱的细胞膜对细胞核染色，常用于细胞凋亡检测。

取出事先准备好的石蜡切片，脱蜡前先将组织切片放入60℃恒温箱中烘烤20min，随后放入二甲苯溶液中浸泡10min。更换二甲苯溶液再浸泡10min脱去石蜡，将组织切片于无水乙醇、95％乙醇、75％乙醇等各级乙醇溶液中梯度洗脱二甲苯并逐渐增加水分，最后放入蒸馏水中。脱蜡时间宁长勿短。

滴加20μg/mL蛋白酶K溶液，37℃下湿润反应10至30min，用PBS溶液两次对切片进行漂洗，每次5min，除去PBS溶液，擦干组织周围切片，向切片滴加50μL新鲜配制好的TdT酶工作液，37℃下避光湿润反应60min，阴性对照片不加TdT酶工作液。反应完成后用PBS溶液漂洗两次，每次5min，除去PBS溶液，擦干组织周围切片，向切片滴加50μL DAPI染色液对组织细胞进行染色，37℃下避光湿润反应30min。加入37℃洗涤与终止缓冲液，保温30min，用PBS溶液漂洗3次，再用苏木素对切片进行复染，之后立即用PBS溶液水洗反蓝。用梯度乙醇对切片进行脱水处理，再用二甲苯透明处理，将切片风干后用中性树胶封片。最后将切片晾干，放于显微镜观察并收集图像。

4Westernblot法检查肝组织蛋白表达水平

(1)肝组织蛋白的提取：精确称取大鼠肝脏组织50mg置于EP管中，剪碎。在预冷的组织裂解液中添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，将组织裂解液与肝脏组织在冰水浴下机械匀浆，于冰上裂解静置30min，4℃下14000r/min离心10min，离心完毕后取上清液至新EP管，即得肝组织蛋白粗提取液。

(2)蛋白质的定量(BCA法)：参照BCA蛋白浓度试剂盒说明书，采用逐级稀释法配制蛋白标准品溶液。根据样品数量，按BCA试剂A和BCA试剂B体积比为50:1配制BCA工作液，摇匀，室温下密闭保存。取各浓度蛋白标准品和稀释后的待测样品加入96孔板，向各孔各加入2mLBCA工作液，盖好板盖，震荡充分摇匀，37℃烘箱静置30min，用酶标仪测定562nm处各孔吸光度，以标准品蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，利用公式计算各样品蛋白浓度。

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳：样品准备：根据蛋白质的定量结果，将蛋白质样品用PBS稀释到统一浓度。通过加热法使蛋白变性，加热前将蛋白样品与5×SDS Loading Buffer按照4：1的比例混合均匀，水浴100℃加热5min，分装后-80℃保存。上样：使用预制梯度胶，组装电泳装置，由内槽向外槽中加入电泳液，内槽加满后拔去梳子，于第一个孔中加入3μL蛋白Marker，其余孔按照50μg蛋白/孔的上样量用移液器向加样孔中加样。电泳：按照说明书使用恒压180v进行电泳，待到溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳。

(4)转膜：打开预制胶的玻璃板，对胶进行裁剪，取PVDF膜进行裁剪，大小略大于胶，PVDF膜需要先在甲醇中润湿激活。将切好的PVDF膜和滤纸置于1×转膜缓冲液中浸湿，并按照黑底板，海绵垫，3张滤纸-胶-PVDF膜-3张滤纸，海绵垫，白底板放置，整个操作在1×转膜缓冲液中进行，避免气泡的产生。随后，将这种“三明治”结构置于转膜夹子于电泳槽中，放入冰袋，加满1×转膜液，恒流0.3A进行转膜1h。

(5)封闭：取下PVDF膜，在平皿中加入适当配制好的5％脱脂奶粉封闭液，将裁剪好的PVDF膜用镊子转移至平皿中，室温下放置在脱色摇床上摇动封闭1h。

(6)抗体孵育：从平皿中取出封闭好的膜，使用TBST在室温下脱色摇床上洗5min，重复3次。加入目的蛋白相应的一抗(用一抗稀释液1：1000稀释)中4℃孵育过夜。次日取出PVDF膜，用TBST在室温下脱色摇床上洗5min，重复3次。用一抗相应的二抗(用封闭液1：2000稀释)室温摇床孵育1h。用TBST在室温下脱色摇床上洗5min，重复3次。

(7)化学发光：按照ECL试剂盒配制ECL发光工作液。新配制的工作液升温到室温后，将上述杂交好的PVDF膜浸入发光液中，发光液与膜面积的比为0.125mL/cm²。在室温状态下孵育1min，用镊子夹起孵育后的PVDF膜，多余发光液用滤纸吸去，放入凝胶成像系统中成像观察。

5RT-PCR法测定肝组织mRNA表达水平

总RNA提取：从-80℃冰箱中取出保存的大鼠肝脏组织，加入1mL Trizol试剂，置于冰上研磨，移至1.5mL EP管中。加入200μL氯仿，剧烈震荡，冰上静置10min，放于预冷离心机，4℃下14000r/min离心15min。取出EP管，可见液体明显分层，其中上层无色透明水相为RNA层。取上清400μL置新EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置15min。4℃下14000r/min离心15min，可见白色沉淀。离心后弃掉上清，加入1mL 75％乙醇，再次离心，用10μL移液器吸去残留液体，开盖晾干5min。每个样品根据沉淀大小加入20至30μLDEPC水，用移液器吹打溶解RNA。取1μL溶解后RNA加199μLDEPC水稀释，酶标仪测定OD值，计算RNA浓度。OD260/OD280比值范围在1.8至2.0内说明所提取RNA符合实验要求。将提取的RNA放入-80℃超低温冰箱中保存备用。

于冰上配制相应的试剂，加入1μg RNA样品在PCR仪上进行反转录，合成cDNA。使用25.0μL的PCR反应体系，以cDNA为模板，加入相应试剂和引物，在定量PCR仪上，经预变性和杂交延伸进行PCR扩增，收集产物，选用β-actin作为定量的内参，引物序列见表3，为采用2^-△△CT法计算各个基因的mRNA相对定量统计表。

表3

6数据分析

统计学方法：采用SPSS22.0分析数据，计数以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用单因素方差分析(One-ANOVA)，P＜0.05表示差异有显著性，结果有统计学意义。

实验结果

1大鼠体重、血糖和肝重的变化情况

实验过程中，各组大鼠均存活至取材日，每日取食、饮水正常，行动自如，毛发呈现良好光泽，对外界刺激有正常的反应现象。

大鼠体重变化情况如图1a所示，实验开始时各组小鼠体重无显著差别，实验过程中各组大鼠的体重变化均呈正常增长曲线。通过比对各组大鼠体重变化曲线下方面积，结果显示模型组大鼠体重增长明显高于对照组(P＜0.05)；治疗组大鼠的体重增长与模型组相比虽有减少，但变化不显著(P＞0.05)。

大鼠血糖变化如图1b所示。实验第30天模型组和治疗组大鼠血糖水平均大于14mmol/L，表明NAFLD动物模型造模成功。此时模型组的血糖水平均显著高于对照组大鼠(P＜0.01)；然而后续实验至第44天时，治疗组大鼠血糖与模型组相比虽有降低，但变化不显著(P＞0.05)。

依次记录实验第44日各组大鼠肝脏湿重情况。结果如图1c所示，模型组大鼠肝脏湿重显著高于对照组(P＜0.01)；治疗组大鼠肝脏湿重与模型组相比虽有减少，但变化不显著(P＞0.05)。

2大鼠肝组织病理学检查结果

2.1荭草苷对大鼠肝脏形态和脂肪蓄积水平的影响

采用HE染色法和油红O染色法分析大鼠肝脏组织变化。

HE染色结果如图2所示，对照组大鼠肝细胞形态规则、结构清晰、分布均匀，肝索结构未见异常排列，无脂肪变性及坏死。图片中模型组和治疗组亦无脂肪变性及坏死，与对照组相比，均未见有明显病理性改变。

油红O染色结果如图2所示，与对照组比较，模型组肝组织颜色加深，红色脂滴漫布，表明NAFLD大鼠肝脏出现脂肪沉积；治疗组肝组织与模型组比较颜色明显变淡，红色脂滴减少，大鼠肝脏脂质蓄积减轻。

2.2荭草苷对大鼠肝组织细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果如图3所示，模型组和治疗组较对照组肝细胞凋亡数量并无明显变化，未发现高脂饮食及STZ诱导和荭草苷干预对大鼠肝细胞凋亡有明显影响。

2.3荭草苷对大鼠肝组织脂肪代谢的影响

结果如图4所示，模型组较对照组大鼠肝组织中脂肪代谢相关因子SREBP-1和FAS的蛋白表达水平升高，SCD蛋白表达水平降低，与油红O染色结果一致，高脂饮食及STZ诱导大鼠脂质代谢紊乱，使肝脏脂质蓄积。荭草苷灌胃给药14天后，治疗组较模型组大鼠肝组织中SREBP-1和FAS的蛋白表达降低，SCD蛋白表达水平升高。

2.4荭草苷对大鼠肝组织抗氧化能力的影响

SOD和CAT是两种常见的抗氧化酶，在NAFLD中对抗过量产生的ROS以改善氧化应激。如图5a、5b所示，模型组较对照组大鼠SOD和CAT的mRNA表达水平无显著性差异(P＞0.05)。与对照组和模型组相比，治疗组大鼠SOD和CAT的mRNA表达水平均有显著提升(P＜0.01)，表示荭草苷能提高大鼠机体抗氧化能力。

2.5荭草苷对大鼠肝组织线粒体功能的影响

2.5.1荭草苷对大鼠肝组织线粒体生物发生的影响

PGC-1α、NRF1、TFAM都是线粒体代谢和生物合成的关键因子。结果如图6a、6b、6c所示，图6a、6b、6c分别为PGC-1αmRNA相对表达量、NRF1 mRNA相对表达量、TFAM mRNA相对表达量；**P＜0.01vs对照组；^##P＜0.01vs模型组。与对照组相比，模型组NRF1和TFAM的mRNA表达水平无显著变化(P＞0.05)，PGC-1α的mRNA表达水平显著下降(P＜0.01)；与模型组相比，荭草苷治疗组TFAM的mRNA表达水平无显著变化(P＞0.05)，PGC-1α和NRF1的mRNA表达水平显著上升(P＜0.01)。

2.5.2荭草苷对大鼠肝组织线粒体自噬的影响

结果见图7，与对照组相比，模型组大鼠肝组织中各线粒体自噬相关因子无明显变化；与模型组相比，荭草苷治疗组Parkin的蛋白表达上升，其他因子无明显变化。

2.6荭草苷对大鼠肝组织AMPK的影响

结果见图8，与对照组相比，模型组大鼠肝组织中AMPK调节因子P-AMPK、P-mTOR的蛋白表达降低，其他因子则无明显变化；与模型组相比，荭草苷治疗组的P-AMPK、P-mTOR的蛋白表达上升，其他因子无明显变化。

结论

中药材金莲花为毛茛科金莲花属金莲花的干燥花，能清热解毒、平肝明目，也可作代茶饮，是黑龙江省中药材产业的重点发展品种。黄酮类化合物荭草苷是金莲花的主要活性成分和含量测定指标物，具有抗脂质生成、抗氧化、抗炎、抗肝纤维化、改善胰岛素抵抗等多重保肝作用，有治疗NAFLD的潜力。团队早期研究已证明金莲花总黄酮能改善高糖诱导的HepG2细胞NAFLD样病症脂质蓄积与ROS水平升高，本研究采用喂养高脂饮食加腹腔注射STZ溶液诱导雌性大鼠制备T2DM合并NAFLD大鼠模型，实验第30天时模型组与荭草苷组大鼠血糖＞14mmol/L则认为造模成功。

正常生理条件下，游离脂肪酸与甘油再酯化形成甘油三酯，以脂滴形式少量(＜5％)储存在肝细胞中，肝脏脂肪积聚超过5％是NAFLD的重要诊断标准，在NAFLD的疾病进程中，肝脏脂肪变性反映于脂肪堆积程度。肝脏脂肪主要通过脂肪摄取(循环中的脂类摄取、DNL)和脂肪代谢(脂肪酸氧化、输出极低密度脂蛋白)调节，肝脏脂肪变性是脂肪摄取与脂肪代谢失衡导致脂肪堆积的结果^[18]，抑制肝脏脂肪蓄积是防治NAFLD的重中之重。SREBP1c是AMPK的下游靶点，在DNL中负责脂肪酸合成相关酶FAS、ACC和SCD1等的调控。SCD1调控饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸之间的转化，对NAFLD可能起到保护作用。本发明研究结果表明荭草苷可改善NAFLD大鼠脂质蓄积，减少肝组织脂滴，下调SREBP1c、FAS和上调SCD的蛋白表达，表示其抑制脂质蓄积与调控脂质代谢相关因子的表达有关。

游离脂肪酸过量摄入会导致肝脏脂肪酸β-氧化不足，使ETC电子传递受阻，导致ROS的过量产生，这也是造成肝细胞损伤的主要因素。当ROS的过量产生造成机体抗氧化机制的负荷时，氧化应激应运而生。ROS的过量产生和氧化应激已确认能影响NAFLD胰岛素抵抗、肝纤维化和慢性炎症的发生发展。SOD、CAT是内源性的抗氧化分子，SOD催化超氧阴离子自由基向过氧化氢转化，后续再通过CAT或GPX的反应来对抗氧化应激。本发明研究结果表明荭草苷可改善NAFLD大鼠氧化应激，提高抗氧化因子SOD、CAT的mRNA表达水平。

线粒体是细胞内ROS形成的主要部位，伴随着过量的ROS生成，线粒体会发生超微结构异常，导致线粒体功能障碍，其特征是不同程度的线粒体超微结构损伤、呼吸链活性降低、ATP耗竭、外膜和内膜通透性增加、ROS过量产生和氧化应激介导的mtDNA缺失，这些作用加剧了肝脏脂质堆积，引发炎症和纤维化反应，并导致细胞死亡，因此，线粒体功能障碍是NAFLD疾病进程的一个决定性因素，同时也是NAFLD关键的治疗靶点。

当线粒体稳态失调，其线粒体生物发生与线粒体自噬的能力受到负面影响，wangsi-wei等研究发现PGC-1α介导的线粒体生物发生在新橙皮苷减轻肝脏脂肪变性的作用中起着至关重要的作用。PGC-1α是线粒体生物发生过程中的一个重要转录因子，受AMPK调控，通过与线粒体启动子中的Nrf1/2相互作用，调节Tfam等核基因的表达。本发明研究结果表明金莲花中荭草苷可逆转NAFLD大鼠PGC-1α的mRNA表达水平下降，并增加NRF1的mRNA表达，改善线粒体生物发生。

AMPK是一种重要的细胞能量感受器蛋白，在细胞低能状态下被激活，通过激活ULK1和抑制mTORC1触发线粒体线粒体自噬。作为对细胞能量应激的反应，AMPK被激活并促进线粒体分裂，这有助于分离健康的线粒体和去极化的线粒体，在后者中PINK1和Parkin信号被激活。当线粒体电位超出正常范围(即线粒体去极化)时，PINK1稳定在线粒体膜外膜上，并招募E3泛素连接酶Parkin，随后通过与LC3的相互作用启动线粒体自噬。本发明研究结果表明金莲花中荭草苷逆转了NAFLD大鼠P-AMPK、P-mTOR的蛋白异常表达，提高了线粒体自噬相关因子Parkin的蛋白表达水平。

ROS的过量产生是导致线粒体功能障碍的原因之一，线粒体功能障碍使游离脂肪酸在线粒体外氧化，产生更多ROS，形成恶性循环，故改善线粒体功能障碍可以减少ROS的产生从而对抗氧化应激。研究表明矢车菊素-3-O-葡萄糖苷可抑制NAFLD氧化应激，其治疗作用是通过增加PINK1/Parkin的表达并促进PINK1介导的线粒体自噬实现的^[92]。与本实验结果一致，荭草苷改善氧化应激的机制与改善线粒体生物发生和线粒体自噬有关。

综上所述，金莲花中荭草苷可从肝脏脂质蓄积、氧化应激、线粒体功能障碍(线粒体生物发生与线粒体自噬)三个方面改善模型大鼠NAFLD，荭草苷在NAFLD治疗方面有良好潜力。

以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用。

2.如权利要求1所述的金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述金莲花提取物的提取过程为：

步骤1粉碎金莲花药材，用恒温超声波提取器提取样品液；

步骤2减压浓缩样品液，上大孔树脂柱静置，采用动态吸附，待吸附完全后，依次用水、10％乙醇、75％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别浓缩成干膏，合并75％乙醇、95％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，将干膏溶解于蒸馏水，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压浓缩各萃取液，将乙酸乙酯层和正丁醇层两部分浸膏合并得到精制总黄酮浸膏，低温烘干得总黄酮粉末；

步骤3将总黄酮粉末用大孔树脂柱洗脱、减压回收后，用乙酸乙酯萃取得荭草苷粗品，再经碱提酸沉纯化后，得荭草苷晶体。

3.如权利要求2所述的金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述提取过程中步骤1具体包括：

取金莲花药材粉碎，过80目筛，取金莲花粉末，于恒温超声波提取器中加入65％乙醇，开启低温恒温槽加热，待温度计检测乙醇温度达60℃后，缓缓加入金莲花粉末，开始微波提取样品液。

4.如权利要求3所述的金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述提取过程中：

步骤1中恒温超声波提取器的设置参数为：温度60℃，功率600W，提取时间9min，金莲花粉末和提取溶剂的物料比为1：20。

5.如权利要求1所述的金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述提取过程中步骤2具体包括：

减压浓缩样品液，上大孔树脂柱静置2h，采用动态吸附，待吸附完全后，依次用水、10％乙醇、75％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，每个梯度洗脱3-4个柱体积，分别浓缩成干膏，合并75％乙醇、95％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，将干膏溶解于蒸馏水，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压浓缩各萃取液，将乙酸乙酯层和正丁醇层两部分浸膏合并得到精制总黄酮浸膏，低温烘干得总黄酮粉末。

6.如权利要求5所述的金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述提取过程中步骤2中：

动态吸附过程中控制样品液流速为1mL/min。

7.如权利要求1所述的金莲花提取物在制备非酒精性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述提取过程中步骤3具体包括：

AB-8大孔树脂湿法装柱，上样总黄酮粉末，依次用蒸馏水、10％乙醇、30％乙醇、70％乙醇洗脱，并收集70％乙醇洗脱液，减压回收后，用乙酸乙酯萃取三次，得荭草苷粗品，再经三次以上碱提酸沉纯化后，得荭草苷晶体。