CN117281899B - 一种佐剂系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含铝纳米颗粒及乳剂的佐剂系统及其制备方法和应用。本发明的佐剂系统和各类抗原联合应用，能有效增强疫苗的免疫反应，其增强效果显著优于单一的铝佐剂，且在降低成本的情况下仍能产生与AS04佐剂相当的效果。本发明的佐剂系统成本低、安全性好，可作为各类疫苗的候选佐剂，为新型疫苗佐剂的开发及应用提供了新的思路。

Description

一种佐剂系统及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于生物医药工程领域，特别涉及一种佐剂系统及其制备方法和其在免疫治疗及预防领域的应用。

背景技术

佐剂(Adjuvants)是非特异性的免疫调节剂，在疫苗中添加佐剂，可起到提高免疫反应强度、改变免疫反应类型、延长免疫反应持续时间等多种作用。特别是对免疫原性较弱的疫苗(如灭活疫苗、亚单位疫苗、重组蛋白疫苗、多肽疫苗等)，合理应用佐剂可提高疫苗在不同免疫背景人群中接种的阳转率。此外，添加佐剂可降低疫苗中抗原的用量，减少疫苗针次，有助于降低疫苗成本及解决疫情爆发时的产能问题。

铝佐剂作为免疫佐剂已经使用了很长的时间，其安全性与免疫增强作用早已被人们所证实。传统铝佐剂主要为铝盐(如硫酸铝、磷酸铝)或氢氧化铝粗颗粒，研究表明，相比于铝粗颗粒，纳米化的铝佐剂(简称纳米铝)颗粒更小，比表面积增大，吸附能力和佐剂活性更强，能提高机体的免疫应答，大大降低佐剂的副作用。

虽然铝佐剂成本低，但从免疫学的角度来讲，铝佐剂对某些疫苗候选抗原缺少佐剂效应或仅有较弱的佐剂效应，虽可增强体液免疫反应，但对细胞免疫没有强化作用，且在许多人用疫苗(尤其是重组蛋白疫苗和多肽疫苗)中没有明显的强化免疫反应的效果。因此，随着越来越多候选疫苗的涌现，对临床上可用的新型佐剂的需求正在快速增长。

乳剂型佐剂(包括水包油乳剂、油包水乳剂等)是新型佐剂的一个重要分支，乳剂可联合多种弱抗原(重组蛋白、多肽等)使用，并诱发高低度的抗原特异性抗体。乳剂型佐剂通常包含油相成分、水相成分和乳化剂。其中，水包油乳剂以水相成分为主，人体耐受性较高，且与多数疫苗抗原的相容性较好。不同的油相成分、水相成分及乳化剂混合后，各种成分的相互作用方式复杂多样，因此，采用不同配方制备的乳剂，其佐剂活性是难以预测的。

且有研究表明，单独使用抗原或仅应用某一种佐剂，其诱导的免疫应答强度偏低且偏向某一种类型，对改善抗原的反应强度、免疫力维持时间、免疫耐受等作用有限，而使用复合佐剂的疫苗可有望通过协同作用更为全面地活化免疫反应。

目前已上市的三种HPV疫苗，只有葛兰素史克的Cervarix使用了复合佐剂(氢氧化铝和MPL)，表现出较高的免疫原性，但目前MPL为经化学处理“减毒”的沙门菌脂多糖，工艺复杂且成本高昂，产能容易受MPL的来源限制。另外，该产品在国内规模化生产条件不成熟，无法满足后续临床使用需求。而默沙东四价HPV疫苗Gardasil和九价HPV疫苗Gardasil 9均采用的是单一的磷酸铝佐剂，产出的抗体滴度远低于Cervarix。

将不同类型佐剂配合研制复合免疫佐剂成为佐剂发展的新趋势，但不同机制的佐剂混合应用，是否具有互补性，其安全性和佐剂活性会发生何种变化，各佐剂组分以何种比例配制、采用怎样的制剂工艺可在确保安全性的前提下最大化免疫刺激活性，这些问题均无法预测，需要试验验证，也成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的安全性和免疫刺激活性好，具有人体应用前景的佐剂系统及其制备方法和应用。铝佐剂与水相混合，作为新乳剂的水相，与油相分散和均质后获得复合纳米乳剂系统。

本发明人经研究出人意料地发现，采用恰当的配伍方式将水包油乳剂和铝佐剂进行组合，经分散、均质获得了纳米铝和吐温80作为油水界面稳定剂的复合纳米乳佐剂系统，具有更强的免疫刺激活性，且与HPV L1 VLP疫苗联合应用，可显著提高疫苗的免疫原性，产生与AS04佐剂相当的有益效果。

本发明的技术方案如下：

本发明一方面提供一种佐剂系统，其包括水包油乳剂和均匀分散于所述水包油乳剂中的铝纳米颗粒，所述水包油乳剂包裹所述铝纳米颗粒形成乳滴，所述乳滴的粒径为100～250nm。

在一些实施方式中，所述铝纳米颗粒为选自磷酸铝、硫酸铝、氢氧化铝、或其混合形成的铝纳米颗粒。在一些实施方式中，所述铝颗粒是氢氧化铝纳米颗粒。铝颗粒的粒径为100～1000nm，优选粒径为100～800nm、100～500nm、100～400nm或100～250nm。优选地，所述氢氧化铝纳米颗粒在乳剂中的铝含量为0.5mg/ml～2mg/ml。更加优选地，所述氢氧化铝纳米颗粒在乳剂中的铝含量为2mg/ml。

在一些实施方式中，所述乳剂中含有油相和水相。

在一些实施方式中，所述水相与油相的比例为5-15ml水相:1g油相。

在一些实施方式中，所述油相包含可代谢油，优选地，所述可代谢油为角鲨烯。

在一些实施方式中，其中，所述油相进一步包含α-生育酚。

在一些实施方式中，其中，角鲨烯与α-生育酚的重量比为0.8-1，例如0.85-0.95，优选为0.9。

在一些实施方式中，其中，所述油相进一步包含司盘85。

在一些实施方式中，其中，其中角鲨烯与司盘85的重量比为8-10，优选为8.3。

在一些实施方式中，其中，所述油相进一步包含另外的免疫刺激剂。

在一些实施方式中，其中，所述免疫刺激剂为选自LPS、MPL、3D-MPL或GLA中的任意一种的TLR4激动剂。

在一些优选的实施方式中，所述免疫刺激剂是MPL。

在一些实施方式中，所述水相中含有吐温80；所述铝颗粒溶解在所述水相中。

在一些实施方式中，所述铝颗粒和吐温80的重量比为0.1-0.6，优选为0.13。

在一些实施方式中，其中，所述水相进一步包含另外的免疫刺激剂。

在一些实施方式中，其中，所述免疫刺激剂选自CpG、PolyIC、R837、R848中的任何一种或几种。

在一些优选的实施方式中，所述免疫刺激剂是CpG。

本发明另一方面提供一种制备所述的佐剂系统的方法，包括如下步骤：

a)准备铝纳米颗粒；

b)将步骤a)的铝纳米颗粒加入包含乳化剂的缓冲溶液中，制成复合水相；

c)制备油相，所述油相包含可代谢油；

d)将步骤b)的复合水相与所述油相混合，进行分散和均质，得到所述佐剂系统。

在一些实施方式中，所述水相与油相的比例为5-15ml水相:1g油相。

在一些实施方式中，所述铝纳米颗粒为选自磷酸铝、硫酸铝、氢氧化铝或其中至少两种混合形成的铝纳米颗粒。

在一些实施方式中，所述水相与油相的比例为5-15ml水相:1g油相。

在一些实施方式中，所述可代谢油为角鲨烯。

在一些实施方式中，所述油相进一步包含α-生育酚或司盘85。

在一些实施方式中，角鲨烯与α-生育酚的重量比为0.8-1，例如0.85-0.95，优选为0.9。

在一些实施方式中，角鲨烯与司盘85的重量比为8-10，优选为8.3。

在一些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。

在一些实施方式中，所述乳化剂为吐温80，所述铝佐剂与吐温80的重量比为0.1-0.6，优选为0.13。

在一些实施方式中，所述油相进一步包含另外的免疫刺激剂；优选地，所述免疫刺激剂为选自LPS、MPL、3D-MPL或GLA中的任意一种的TLR4激动剂。

在一些实施方式中，所述水相进一步包含另外的免疫刺激剂；优选地，所述免疫刺激剂选自CpG、PolyIC、R837、R848中的任何一种或多种。

在一些实施方式中，所述分散步骤包括在8000-10000rpm搅拌10-25min。

在一些实施方式中，所述均质步骤包括依次在狭缝式均质阀0.5-1.2bar、微射流阀80-160MPa压力下进行均质。

在一些实施方式中，所述均质步骤重复进行5-20个循环。

在一些实施方式中，所述均质步骤包括依次在狭缝式均质阀0.5-1bar、微射流阀80-140MPa压力下进行第一均质，然后在狭缝式均质阀1-1.2bar、微射流阀120-160MPa压力下进行第二均质，所述第二均质的压力分别大于所述第一均质的压力。

在一些实施方式中，所述第一均质进行5-10个循环，所述第二均质进行5-10个循环。

本发明另一方面提供一种免疫原性组合物，包括上述的佐剂系统，还包括至少一种抗原，所述抗原吸附在所述铝颗粒上、并均匀分散于所述乳剂中。

在一些实施方式中，所述抗原为一种或多种来源于细菌、病毒、寄生虫、真菌、肿瘤、人体自身抗原和/或变态反应原的抗原。

在一些实施方式中，所述抗原来源于人免疫缺陷型病毒、人乳头瘤病毒HPV、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新冠病毒SARS-CoV-2中的至少一种。

在一些实施方式中，所述抗原来源于水痘带状疱疹病毒。

水痘带状疱疹病毒(VZV)是人类疱疹病毒之一。VZV糖蛋白E(glycoprotein E，gE)亚单位疫苗是目前的水痘疫苗的主流研究方向，gE由病毒的ORF68基因编码，1872个碱基组成的该基因位于VZV基因组短片段区。在利用现代生物分子学技术制备重组VZV gE蛋白时，一般将截短gE蛋白，使其缺少羧基端疏水锚区。葛兰素史克开发的Shingrix是一种基于重组gE蛋白辅以新型佐剂AS01B的亚单位疫苗，三期临床试验数据显示该亚单位疫苗在老年人中有着优于Zostavax的免疫原性和有效性，并于2017年获FDA批准上市。VZV gE蛋白的制造通常是通过在培养细胞中表达或通过化学合成来实现。常常使用并且适合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫以及哺乳动物。如本文中所使用的，gE蛋白是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI Genbank数据库登录号：Q9J3M8)。

利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：

(1)将本发明的gE蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转染至CHO细胞中；

(3)通过细胞群筛选和单克隆筛选，获得稳定表达gE蛋白的细胞株；

(4)使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得VZV gE蛋白。

将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。

在一些实施方式中，所述抗原来源于冠状病毒，例如中东呼吸综合征冠状病毒(MERS CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS CoV)，尤其是新型冠状病毒SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。RBD作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域(NTD)为病毒S蛋白N端的一段序列，其可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，介导病毒入侵宿主细胞，故该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人采用了一种包含SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域(NTD)或其功能活性片段的融合蛋白作为抗原。所述融合蛋白进一步包含foldon结构域或其功能活性片段。

在一些优选的实施方式中，所述抗原选自人乳头瘤病毒HPV6、11、18、31、33、45、52、58、68型中的至少一种。

HPV的衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。已上市疫苗都是基于HPVL1病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)为抗原的疫苗，通过基因重组表达的L1蛋白可在一定条件下形成类似病毒的颗粒，有着较好的免疫原性。在NCBI数据库中，已有许多现有的HPV各型L1 VLP蛋白(HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1)序列可供本领域技术人员进行选择，这些序列均可以作为抗原蛋白的理想选择基础。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人大部分采用了从现有技术中具有高度的保守性的序列，具体情况如下：HPV 6L1的氨基酸序列已于1995年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA74218；HPV 11L1的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46935；HPV 16L1的氨基酸序列已于1998年在NCBI数据库中收录，登录号为AAC09292.1；HPV 18L1蛋白的氨基酸序列已于2003年在NCBI数据库中收录，登录号为AAQ92369.1；HPV 31L1蛋白的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46956；HPV 33L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ACL12333.1；HPV 45L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ABP99831.1(截短了N端26个氨基酸，上述26个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短)；HPV52 L1蛋白的氨基酸序列已于2005年在NCBI数据库中收录，登录号为CAA52590.1(截短了N端27个氨基酸，上述27个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短)；HPV 58L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为CAX48979.1。

利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：在毕赤酵母中表达上述HPV各型L1 VLP蛋白的方法，包括下述步骤：

(1)将本发明的HPV各型L1蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母宿主菌中；

(3)通过菌株筛选，获得稳定表达HPV各型L1蛋白的菌株；

(4)使用步骤(3)所得的菌株进行表达，获得HPV各型L1蛋白。

将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。

需要说明的是，使用毕赤酵母表达系统稳定表达HPV各型L1蛋白的方法是本领域众所周知的方法，具体可参照《分子克隆试验指南》及其他一些文献。本领域技术人员也可以选择例如大肠杆菌、酿酒酵母、汉逊酵母、CHO细胞、昆虫细胞等在内的其他表达方式获得HPV各型L1蛋白。

在一些实施方式中，所述抗原含量在20-40μg之间，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:23-1:53。

在一些优选的实施方式中，所述抗原含量为20或40μg，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:52.66，

在一些优选的实施方式中，所述抗原含量为20或40μg，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:29.48。

在一些优选的实施方式中，所述抗原含量为20或40μg，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:23.62。

本发明另一方面还提供一种制备上述免疫原性组合物的方法，包括如下步骤：

a)准备铝纳米颗粒；

b)将步骤a)的铝纳米颗粒加入包含乳化剂的缓冲溶液中，制成复合水相；

c)制备油相，所述油相包含可代谢油；

d)将步骤b)的复合水相与所述油相混合，进行分散和均质，得到所述佐剂系统；

e)将所述抗原添加到所述佐剂系统中，混合均匀，得到所述免疫原性组合物。

在一些实施方式中，步骤a)使用的铝佐剂为市售微米级别的铝佐剂(ALHYDROGEL)。在一些实施方式中，步骤a)使用的铝佐剂为纳米级别的铝佐剂。

在一些实施方式中，步骤a)具体为取质量比为1:1:1的苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速搅拌后，加入1mol/L的AlCl₃溶液充分搅拌。缓慢滴加氨水，保持反应体系pH>10反应2小时，结束后加入丙酮破乳离心，弃上清，然后分别用蒸馏水、乙醇反复洗涤6次，将离心后的沉淀经干燥，即得到膨松的纳米氢氧化铝颗粒。

在一些实施方式中，步骤b)具体为将步骤a)制得的纳米氢氧化铝颗粒加入含有乳化剂的缓冲溶液中充分混合作为复合水相溶液。

在一些实施方式中，步骤c)具体为将角鲨烯和α-生育酚充分混合作为油相。

在一些实施方式中，步骤c)具体为将角鲨烯单独作为油相。

在一些实施方式中，步骤c)具体为将角鲨烯和司盘85充分混合作为油相。

在一些实施方式中，步骤d)具体为将步骤b)制得的复合水相溶液与步骤c)制备的油相充分混合，经高速搅拌，然后均质以降低粒径。经多次循环，最后利用0.22μm PES过滤器过滤乳剂，得到所述佐剂系统。

本发明提供了一种包含铝佐剂及乳剂的佐剂系统，尤其是一种包含均匀分散了氢氧化铝纳米颗粒的水包油乳剂的佐剂系统及其制备方法和应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)适用范围广，纳米铝可吸附不同病原体的抗原，从而形成针对不同病原体的疫苗。

(2)稳定性高，纳米铝比表面积更大，吸附能力更强，且均匀分散于水包油乳剂中，保护抗原免遭接种环境物质破坏，增强体内外稳定性。

(3)安全性高，本发明的佐剂系统大大减少了铝佐剂的用量，且纳米铝分散在水包油乳剂体系中，能够显著减少接种部位不良反应。

(4)免疫诱导效力强，成本低，本发明的佐剂系统能有效增强疫苗的细胞免疫反应，其增强效果显著优于单一的乳剂或铝佐剂。尤其是应用于HPV抗原时，在降低成本的情况下仍能取得与专为HPV疫苗设计的AS04佐剂相当甚至更优的效果。

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。

其中：

图1为本发明实施例11中小鼠免疫后28天后，采用假病毒中和实验法检测血清中的抗HPV各型L1 VLP蛋白的中和抗体滴度的检测结果；

图2为本发明对比例2中制备的佐剂系统的分层现象；

图3为本发明对比例3中制备的佐剂系统的分层现象；

图4为本发明实施例13中利用不同方法制备的佐剂系统和HPV 45抗原免疫小鼠后血清中的中和抗体滴度检测结果。

具体实施方式

下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。

除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

术语定义

在本申请中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本申请中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。

在本申请中，术语“佐剂”是指在临床上可应用于人体或具有人体应用前景的具有增强免疫反应功能的物质，包括当前已获批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合物。

在本申请中，术语“纳米铝”、“铝纳米颗粒”、“铝颗粒”或“铝佐剂”是指直接采用的市售纳米级别或微米级别的铝佐剂(ALHYDROGEL)或利用铝盐为原料制备的纳米粒或微米粒，所述铝盐可以选自氯化铝、磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝。

在本申请中，术语“乳剂”通常是指由油相成分、水相成分及乳化剂按适当比例混合，经乳化后形成的非均相液体分散体系，可以是水包油乳剂，也可以是油包水乳剂。水相成分包括但不限于磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸-磷酸缓冲液等缓冲系统。油相成分为可代谢脂类，包括但不限于植物油、鱼油、动物油、合成油及其他脂类成分(例如但不限于角鲨烯、花生油、亚麻油、磷脂等)；乳化剂为具有适宜HLB的表面活性剂，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(Span85)、聚山梨酯80(Tween80)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(司盘80/Span80)、三甘醇单月桂基醚(布里杰30/Brij30)、聚乙二醇十六烷基醚(布里杰56/Brij56)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)等。在本发明的一些实施方式中，“乳剂”指的是水包油乳剂。

在本申请中，术语“可代谢油”通常是指可以通过机体代谢被转化的油类物质，所述油可以是任何的植物油、动物油或合成油，其对接受免疫者是无毒的，并有能力通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是常见的植物油来源；合成油也是本发明的一部分，包括可商品化供应的各种油类。一种合适的可代谢油是角鲨烯，在鲨鱼肝油中大量存在的不饱和油，是胆固醇生物合成的中间产物，并在橄榄油、麦芽油、米糠油和酵母中含量较低。

在一个优选的实施方式中，所述水包油乳剂包含角鲨烯、α-生育酚和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80或Tween80)。在一个优选的实施方式中，所述水包油乳剂包含角鲨烯和吐温80。在另一个优选的实施方式中，所述水包油乳剂包含角鲨烯、吐温80和脱水山梨醇三油酸酯(司盘85或Span85)。

在本发明的一些实施方式中，佐剂系统包含由角鲨烯、α-生育酚和吐温80组分组成的水包油乳剂。例如，水包油乳剂包含2-10％角鲨烯、0.3-3％吐温80和2-10％α-生育酚(百分比是指占免疫原性组合物的总体积的百分比)，并且可以按照WO95/17210描述的制备方法制备。角鲨烯的量可以等于或少于α-生育酚的量，以提供更稳定的乳剂。水包油乳剂还可以包含司盘85和/或卵磷脂，例如占免疫原性组合物总体积的1％的水平。在本发明的一些实施方式中，首先称量一定质量的角鲨烯和α-生育酚混合后作为油相，然后与含有乳化剂的磷酸盐缓冲液混合后以10000rpm高速搅拌乳化获得初乳。最后通过前级阀(即狭缝式均质阀，下同)0.8bar、微射流阀100～150MPa压力均质初乳5～8个循环进一步降低粒径至180±10nm。在本申请一些优选的实施方式中，微射流阀100MPa压力均质初乳5循环。在本申请的一些实施方式中，所述乳剂中仅有一定质量的角鲨烯作为油相，然后与含有乳化剂的磷酸盐缓冲液混合后以10000rpm高速搅拌乳化获得初乳。最后通过前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质初乳8循环进一步降低粒径至180nm以内，优选为105nm左右。得到包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80的水包油乳剂或包含角鲨烯和吐温80的水包油乳剂。

在本发明的一些实施方式中，制备了包含角鲨烯、吐温80和司盘85的水包油乳剂。在这些实施方式中，首先称量吐温80溶解于柠檬酸盐缓冲液中制备水相，然后称量角鲨烯和司盘85，混合均匀后得到油相，将油相和水相混合均匀后以10000rpm高速搅拌获得初乳，最后通过前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质初乳、经过8个循环，再通过前级阀1.2bar、微射流阀160MPa压力均质、经过6个循环进一步降低粒径至240nm以内，优选为235nm以内，得到包含角鲨烯、吐温80和司盘85的水包油乳剂。

在本申请中，术语“抗原”是指在适当情形下被免疫系统所识别的各种物质，可来源于病原体、人体自身、肿瘤等。

在本申请中，术语“免疫原性组合物”是指一种组合物，其包含在个体，如人中，能够刺激免疫反应的免疫原性组分。相应地，在本发明的一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物是疫苗，即，免疫原性组合物可以给予个体以提高抗相应病毒的免疫反应，其能够预防或治疗个体的相应病毒感染。所述病毒选自人免疫缺陷型病毒HIV-1、人乳头瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新冠病毒SARS-CoV-2。在本发明的一些实施方式中，优选地，所述病毒为人乳头瘤病毒。相应地，本文所用的术语“疫苗”是指治疗性疫苗(用于疾病的治疗)和预防性疫苗(用于疾病的预防)。

在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。

实施例1.铝佐剂的制备

取质量比为1:1:1的苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速搅拌后倒入三角瓶，放入搅拌子，将三角瓶置于磁力搅拌器上，加入1mol/L的AlCl₃溶液10ml搅拌约20分钟。缓慢滴加10ml氨水于分液漏斗中调节滴速，保持30滴每分钟，保持反应体系pH>10反应2小时，反应结束后加入丙酮破乳离心(R＝500rpm)，弃去上清液，然后分别用蒸馏水、乙醇反复洗涤6次，将离心后的沉淀收集于烧杯中置于70℃干燥箱中干燥12小时，即得到膨松的纳米氢氧化铝佐剂。经检测，本实施例制备的氢氧化铝颗粒直径为139.9nm，PDI 0.106。

实施例2.佐剂系统BFA-EAL-1的制备

本实施例的铝佐剂采用的是市售微米级别的铝佐剂(ALHYDROGEL，CAS：21645-51-2，厂家：CRODA，货号：AJV3012，批号：0001678865)，经检测，氢氧化铝颗粒直径为1051nm，PDI 0.095。

佐剂成分：铝含量2mg/ml，角鲨烯42.76mg/ml，α-生育酚47.44mg/ml，吐温80含量15.12mg/ml。

制备水相：12ml铝佐剂(10mg/ml)，加42ml吐温80含量为21.6mg/ml的磷酸盐缓冲溶液，混匀为复合水相。

制备油相：称取2.58g角鲨烯和2.94gα-生育酚混匀为油相。

制备初乳：混合水相和油相，20℃水浴下10000rpm分散15min获得初乳。

均质制备乳剂：前级阀0.8bar、微射流阀100MPa压力均质初乳5循环，获得含有铝佐剂和水包油乳剂的佐剂系统。

经过一系列分散、均质后获得的佐剂系统中的铝颗粒粒径显著降低，经检测，复合乳剂粒径为188.9nm，PDI为0.205。标识BFA-EAL-1。

实施例3.佐剂系统BFA-EAL-2的制备

本实施例的铝佐剂采用的是市售微米级别的铝佐剂(ALHYDROGEL，CAS：21645-51-2，厂家：CRODA，货号：AJV3012，批号：0001678865)，经检测，氢氧化铝颗粒直径为1051nm，PDI 0.095。

佐剂成分：铝含量2mg/ml，角鲨烯42.76mg/ml，吐温80含量16.2mg/ml。

制备水相：12ml铝佐剂(10mg/ml)，加45ml吐温80含量为21.6mg/ml的磷酸盐缓冲溶液，混匀为复合水相。

制备油相：称取2.57g角鲨烯为油相。

制备初乳：混合水相和油相，40℃水浴下10000rpm分散15min获得初乳。

均质制备乳剂：前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质初乳8循环，获得含有铝佐剂和水包油乳剂的佐剂系统。

经过一系列分散、均质后获得的佐剂系统中的铝颗粒粒径显著降低，经检测，复合乳剂粒径为105.5nm，PDI为0.193。标识BFA-EAL-2。

实施例4.佐剂系统BFA-EAL-3的制备

本实施例的铝佐剂采用的是市售微米级别的铝佐剂(ALHYDROGEL，CAS：21645-51-2，厂家：CRODA，货号：AJV3012，批号：0001678865)，经检测，氢氧化铝颗粒直径为1051nm，PDI 0.095。

佐剂成分：铝含量2mg/ml，角鲨烯39mg/ml，司盘854.7mg/ml，吐温80含量3.5mg/ml。

制备水相：12ml铝佐剂(10mg/ml)，加45ml吐温80含量为4.7mg/ml的柠檬酸盐缓冲溶液，混匀为复合水相。

制备油相：称取2.35g角鲨烯和0.28g司盘85混匀为油相。

制备初乳：混合水相和油相，40℃水浴下10000rpm分散15min获得初乳。

均质制备乳剂：前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质初乳8循环。再以前级阀1.2bar、微射流阀160MPa压力均质6循环，获得含有铝佐剂和水包油乳剂的佐剂系统。

经过一系列分散、均质后获得的佐剂系统中的铝颗粒粒径显著降低，经检测，复合乳剂粒径为234.7nm，PDI为0.436。标识BFA-EAL-3。

实施例5.佐剂系统BFA-ENAL-1的制备

本实施例采用实施例1制得的纳米铝佐剂。

佐剂成分：铝含量2mg/ml，角鲨烯42.76mg/ml，α-生育酚47.44mg/ml，吐温80含量19.44mg/ml。

制备水相：36ml铝佐剂(4.48mg/ml)，加36ml吐温80含量为43.2mg/ml的磷酸盐缓冲溶液，混匀为复合水相。

制备油相：称取3.43g角鲨烯和3.83gα-生育酚混匀为油相。

制备初乳：混合水相和油相，20℃水浴下10000rpm分散20min获得初乳。

均质制备乳剂：前级阀0.8bar、微射流阀120MPa压力均质初乳6循环。再以前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质6循环，获得含有铝佐剂和水包油乳剂的佐剂系统。

经过一系列分散、均质后获得的佐剂系统中的铝颗粒粒径显著降低，经检测，复合乳剂粒径为166.7nm，PDI为0.239。标识BFA-ENAL-1。

实施例6.佐剂系统BFA-ENAL-2的制备

本实施例采用实施例1制得的纳米铝佐剂。

佐剂成分：铝含量0.5mg/ml，角鲨烯42.76mg/ml，α-生育酚47.44mg/ml，吐温80含量19.44mg/ml。

制备水相：9ml铝佐剂(4.48mg/ml)，加36ml吐温80含量为43.2mg/ml的磷酸盐缓冲溶液，加27ml注射用水，混匀为复合水相。

制备油相：称取3.42g角鲨烯和3.81gα-生育酚混匀为油相。

制备初乳：混合水相和油相，20℃水浴下10000rpm分散20min获得初乳。

均质制备乳剂：前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质初乳6循环，获得含有铝佐剂和水包油乳剂的佐剂系统。

经过一系列分散、均质后获得的佐剂系统中的铝颗粒粒径显著降低，经检测，复合乳剂粒径为153.6nm，PDI为0.099。标识BFA-ENAL-2。

实施例7.佐剂系统BFA-ENAL-1-GpG的制备

本实施例采用实施例1制得的纳米铝佐剂。

佐剂成分：铝含量0.5mg/ml，角鲨烯42.76mg/ml，α-生育酚47.44mg/ml，吐温80含量19.44mg/ml，GpG(0.2mg/ml)。

制备水相：9ml铝佐剂(4.48mg/ml)，GpG 16mg加36ml吐温80含量为43.2mg/ml的磷酸盐缓冲溶液，加27ml注射用水，混匀为复合水相。

制备油相：称取3.43g角鲨烯和3.83gα-生育酚混匀为油相。

制备初乳：混合水相和油相，20℃水浴下10000rpm分散20min获得初乳。

均质制备乳剂：前级阀0.8bar、微射流阀120MPa压力均质初乳6循环。再以前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质6循环，获得含有铝佐剂和水包油乳剂的佐剂系统。

检测乳剂粒径为159.1nm，PDI为0.356。标识BFA-ENAL-1-CpG。

实施例8.佐剂系统BFA-ENAL-1-MPL的制备

本实施例采用实施例1制得的纳米铝佐剂。

佐剂成分：铝含量2mg/ml，角鲨烯42.76mg/ml，α-生育酚47.44mg/ml，MPL 0.2mg/ml。

制备水相：36ml铝佐剂(4.48mg/ml)，加36ml吐温80含量为43.2mg/ml的磷酸盐缓冲溶液，混匀为复合水相。

制备油相：称取3.43g角鲨烯、3.83gα-生育酚、MPL 16mg混匀为油相。

制备初乳：混合水相和油相，20℃水浴下10000rpm分散20min获得初乳。

均质制备乳剂：前级阀0.8bar、微射流阀140MPa压力均质初乳6循环，获得含有铝佐剂和水包油乳剂的佐剂系统。

检测乳剂粒径为161.2nm，PDI为0.252。标识BFA-ENAL-1-MPL。

实施例9.含有HPV抗原的免疫原性组合物的制备

为了研究本发明所提供的佐剂系统的技术效果。本发明的发明人制成了以下免疫原性组合物(0.5ml/剂)，免疫原性组合物含有HPV6/11/16/18型L1 VLP蛋白、铝佐剂、BFA04佐剂或实施例2-4所述的佐剂系统。具体配制方法为：分别将HPV6/11/16/18型L1 VLP抗原以20μg、40μg、40μg、40μg的量与铝佐剂、BFA04佐剂或实施例2-4所述的佐剂系统进行充分混合。

本实施例中BFA-EAL-1佐剂系统配方为：500μg氢氧化铝，10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，3.78mg的吐温80，3.53mg的氯化钠，0.09mg的氯化钾，0.51mg的磷酸氢二钠和0.09mg的磷酸二氢钾，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中BFA-EAL-2佐剂系统配方为：氢氧化铝500μg，角鲨烯10.69mg，吐温804.05mg，3.53mg的氯化钠，0.09mg的氯化钾，0.51mg的磷酸氢二钠和0.09mg的磷酸二氢钾，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中BFA-EAL-3佐剂系统配方为：氢氧化铝500μg，角鲨烯9.75mg，司盘851.18mg，吐温80 0.88mg，二水合柠檬酸三钠0.66mg，一水合柠檬酸0.04mg，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中BFA04佐剂配方：50μg的MPL，500μg氢氧化铝，150mM的氯化钠，8mM的二水磷酸二氢钠，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中Al(OH)₃采用市售微米级别的铝佐剂(ALHYDROGEL)，浓度为2mg/ml的Al(OH)₃。

实施例10.含有HPV抗原的免疫原性组合物的制备

为了研究本发明所提供的佐剂系统的技术效果。本发明的发明人制成了以下免疫原性组合物(0.5ml/剂)，免疫原性组合物含有HPV6/11/16/18型L1 VLP蛋白、铝佐剂、BFA04佐剂或实施例5-7所述的佐剂系统。具体配制方法为：分别将HPV6/11/16/18型L1 VLP抗原以20μg、40μg、40μg、40μg的量与铝佐剂、BFA04佐剂或实施例5-7所述的佐剂系统进行充分混合。

本实施例中BFA-ENAL-1佐剂系统配方为：氢氧化铝500μg，角鲨烯10.69mg，α-生育酚11.86mg，吐温80 4.86mg，3.53mg的氯化钠，0.09mg的氯化钾，0.51mg的磷酸氢二钠和0.09mg的磷酸二氢钾，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中BFA-ENAL-2佐剂系统配方为：氢氧化铝125μg，角鲨烯10.69mg，α-生育酚11.86mg，吐温80 4.86mg，3.53mg的氯化钠，0.09mg的氯化钾，0.51mg的磷酸氢二钠和0.09mg的磷酸二氢钾，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中BFA-ENAL-1-CpG佐剂系统配方为：氢氧化铝125μg，角鲨烯10.69mg，α-生育酚11.86mg，吐温80 4.86mg，CpG 500μg，3.53mg的氯化钠，0.09mg的氯化钾，0.51mg的磷酸氢二钠和0.09mg的磷酸二氢钾，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中BFA03佐剂配方：角鲨烯10.69mg，α-生育酚11.86mg，吐温80 4.86mg，氯化钠3.53mg，氯化钾0.09mg，磷酸氢二钠0.51mg和磷酸二氢钾0.09mg，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中BFA04佐剂配方：50μg的MPLA，500μg氢氧化铝，150mM的氯化钠，8mM的二水磷酸二氢钠，制备完成用0.25ml佐剂瓶盛装保存。

本实施例中Al(OH)₃采用实施例1制备的纳米级别的铝佐剂，浓度为2mg/ml的Al(OH)₃。

实施例11.佐剂系统的佐剂效果评价

针对实施例9中获得的重组人乳头瘤病毒疫苗组合物，发明人以BALB/c小鼠为动物模型开展了免疫原性研究，考察本申请的佐剂系统联合HPV四价抗原的免疫原性。以HPV6/11/16/18型L1 VLP蛋白为抗原，以实施例2-4的佐剂系统为佐剂，研究本发明提供的疫苗组合物的免疫原性，从而评价本发明佐剂系统的效果。选择6-8周BALB/c小鼠随机分组，每组5只小鼠，肌肉注射用HPV6/11/16/18型L1 VLP蛋白联合佐剂系统制备的疫苗，注射体积为0.05ml(即1/10HD)，设置自制疫苗组、市售铝佐剂对照组以及BFA04佐剂对照组。

采用间隔3周免疫程序，第二次免疫后14天采集血液分离血清，采用假病毒中和实验法(Pseudovirion-Based Neutralization Assay，PBNA)检测血清中的抗HPV各型L1 VLP蛋白的中和抗体滴度，并计算抗体几何平均滴度(GMT)，小鼠分组及免疫方案如表1所示。

表1小鼠分组表

BFA-EAL-1(附图中又称BFA-EAL-1-uf)、BFA-EAL-2(附图中又称BFA-EAL-2-uf)、BFA-EAL-3(附图中又称BFA-EAL-3-uf)、BFA04以及Al(OH)₃佐剂制剂配方参考实施例9。

免疫原性的评价方法为本领域的行规技术手段，作为举例，假病毒中和实验法更具体的操作方式如下：

(1)取生长状态良好的293FT细胞，用0.25％ Trypsin-EDTA消化成单个细胞，用DMEM完全培养基将细胞稀释至合适浓度；以细胞计数仪计数；

(2)根据细胞计数结果，以DMEM完全培养基将293FT细胞稀释至1.5×10⁵/ml的密度，预铺于96孔细胞培养板中，每孔加细胞液100μL，于37℃5％CO₂培养箱中培养至细胞贴壁；

(3)将灭活的血清样品用DMEM完全培养基稀释到合适的起始稀释度，再进行连续对倍稀释若干梯度，每个稀释度设双复孔；

(4)用DMEM完全培养基将假病毒液稀释至log(TCID₅₀/0.1ml)＝3.2±0.5，混匀；

(5)取血清稀释液，加入相同体积假病毒稀释液，混匀，室温孵育60分钟，同时设置阳性对照孔，每孔为DMEM完全培养基加入等体积假病毒稀释液；设置空白对照孔，每孔为DMEM完全培养基；

(6)孵育结束后，准确吸取血清-假病毒混合液100μL，缓慢小心加入预铺的96孔细胞板中；

(7)于5％ CO₂培养箱中37℃培养72小时，用荧光显微镜观察或斑点分析仪读取结果，并分析处理。

表2小鼠免疫后35天后检测结果

采用本申请实施例2-4制备的佐剂系统联合HPV各型抗原免疫小鼠35天后检测结果如表2和图1所示。结果显示，首先，本申请实施例2-4利用市售微米级铝佐剂制备得到的三种佐剂系统联合HPV各型抗原均能诱导小鼠产生显著高于单独使用微米级铝佐剂所产生的中和抗体滴度，均具有良好的免疫活性。

其次，相比而言，BFA-EAL-3佐剂系统较优于BFA-EAL-2佐剂系统，说明在乳剂中作为油相成分使用的司盘85做出了一定的贡献。

更重要的是，无论是HPV6、11、16或18型组，BFA-EAL-1佐剂系统均表现出最佳的免疫增强效果，产生针对HPV6/11/16/18的中和抗体滴度分别达到了单独使用铝佐剂的7～9倍，并且与BFA04佐剂达到了相当的水平，说明BFA-EAL-1佐剂系统足以替代BFA04佐剂在HPV疫苗中的使用。

实施例12.佐剂系统的佐剂效果评价

发明人针对实施例10中获得的重组人乳头瘤病毒疫苗组合物，以BALB/c小鼠为动物模型开展了免疫原性研究，考察佐剂系统联合HPV四价抗原的免疫原性。

以HPV6/11/16/18型L1 VLP蛋白为抗原，以实施例5-7的佐剂系统为佐剂，研究本发明提供的疫苗组合物的免疫原性，从而评价本发明佐剂系统的效果。选择6-8周BALB/c小鼠随机分组，每组5只小鼠，肌肉注射用HPV6/11/16/18型L1 VLP蛋白联合佐剂系统制备的疫苗，注射体积为0.05ml(即1/10HD)，设置自制疫苗组、自制铝佐剂对照组、BFA03佐剂对照组以及BFA04佐剂对照组。

采用间隔3周免疫程序，第二次免疫后14天采集血液分离血清，采用假病毒中和实验法(Pseudovirion-Based Neutralization Assay，PBNA)检测血清中的抗HPV各型L1 VLP蛋白的中和抗体滴度，并计算抗体几何平均滴度(GMT)，小鼠分组及免疫方案如表3所示。

表3小鼠分组表

BFA-ENAL-1、BFA-ENAL-2、BFA-ENAL-1-CpG、BFA03、BFA04以及Al(OH)₃佐剂制剂配方参考实施例10。

采用本申请实施例5-7制备的佐剂系统联合HPV各型抗原免疫小鼠35天后检测结果如表4所示。结果显示，本发明自制的纳米级铝佐剂配制的三种佐剂系统联合免疫小鼠所产生的中和抗体滴度均显著高于单独使用纳米级铝佐剂所产生的中和抗体滴度，均具有良好的免疫活性。

发明人惊讶的发现，无论针对HPV6、11、16或18型组疫苗，BFA-ENAL-2佐剂系统均与BFA04佐剂达到了相当甚至略优的水平，即达到了与实施例11免疫试验中结果最佳的BFA-EAL-1佐剂系统相当的佐剂效果，而BFA-ENAL-2佐剂系统中的铝含量仅为BFA-EAL-1佐剂系统的1/4，说明采用被发明自制的纳米级铝佐剂配制的佐剂系统比微米级铝佐剂配制的佐剂系统效果更佳。在保证良好的佐剂效果的前提下，可以大大节约铝佐剂的用量。

特别的，本发明的BFA-ENAL-1-CpG佐剂系统表现出比BFA-ENAL-2佐剂系统更加优异的免疫增强效果。尤其值得关注的是，其联合HPV6抗原产生的中和抗体滴度是BFA04佐剂的2.3倍。说明在低铝含量的佐剂系统中添加少量的免疫刺激剂，例如CpG，可以替代BFA04佐剂，为新型疫苗佐剂的开发奠定了重要基础。

发明人更加惊讶的发现，提高了铝含量的BFA-ENAL-1佐剂系统联合HPV各型抗原产生的中和抗体滴度普遍高于BFA03佐剂，同时也表现出比BFA-ENAL-2佐剂系统更加优异的免疫增强效果，免疫产生的中和抗体滴度高达BFA04佐剂的1～2倍。加之考虑到自制纳米级铝佐剂的制备成本要远低于CpG佐剂，所以BFA-ENAL-1佐剂系统是一种更具潜力的疫苗候选佐剂，尤其可以应用于新一代HPV疫苗的研发。

表4小鼠免疫后35天后检测结果

目前已上市的三种HPV疫苗，只有葛兰素史克的Cervarix使用了复合佐剂(氢氧化铝和MPL)，表现出较高的免疫原性，但MPL为经化学处理“减毒”的沙门菌脂多糖，工艺复杂且成本高昂，产能容易受MPL的来源限制。另外，该产品在国内规模化生产条件不成熟，无法满足后续临床使用需求。而默沙东四价HPV疫苗和九价HPV疫苗Gardasil均采用的是单一的磷酸铝佐剂，产出的抗体滴度远低于

相比之下，本发明的佐剂系统免疫诱导效力强，其增强效果显著优于单一的铝佐剂，这不仅得益于本发明的佐剂系统是一种复合佐剂系统，还得益于通过发明人的制备使体系中的铝颗粒粒径进一步降低至纳米级，均匀分散于乳剂水油界面，纳米化的铝佐剂颗粒更小，比表面积增大，吸附能力和佐剂活性更强，进而能提高机体的免疫应答，大大降低佐剂的副作用，可作为新一代疫苗组合物佐剂使用。尤其是应用于HPV抗原时，能取得与葛兰素史克的使用的复合佐剂AS04(氢氧化铝和MPL)相当甚至更优的效果，同时由于其原料易获得，因此成本远低于AS04佐剂。

发明人在进一步的研究中发现，不同的制备方法对佐剂系统的稳定性、增强免疫效果方面均有着较大影响。在以下的研究中，发明人以不同方法制备佐剂系统，并结合HPV45抗原进行免疫实验。

对比例1

称取4.29g角鲨烯、4.74gα-生育酚、1.94g吐温80，混合作为油相。将10ml氢氧化铝佐剂加入80ml磷酸盐缓冲液，得到呈白色碎絮状、乳状液体。20℃8000rpm分散10min，经1bar前级阀、120MPa微射流阀均质8循环，获得油性乳剂。将27μl HPV 45抗原，加873μl磷酸盐缓冲液，混合作为水相，将油性乳剂和水相等体积混合，得到疫苗组合物。由于佐剂系统形成的为油性乳剂，将其与包含抗原的水相混合并经长时间放置发现有分层现象。

对比例2

称取1.28g角鲨烯、1.43gα-生育酚、0.58g吐温80，混合作为油相。将360μl氢氧化铝佐剂、108μl HPV 45抗原加入到132μl磷酸盐缓冲液中，混合作为水相。将500μl水相加入约2.5ml油相中，超声乳化(300W，4min，5s/5s)，得到油包水乳剂，最后加入相同体积的磷酸盐缓冲液稀释。与对比例1类似，对比例2中疫苗组合物为油包水乳剂，经磷酸盐缓冲溶液稀释、静置后发现有白絮状、沉淀和分层现象，如图2所示。

对比例3

称取1.29g角鲨烯和1.43gα-生育酚，混合作为油相。将400μl氢氧化铝纳米颗粒加入3080μl磷酸盐缓冲液，加120μl HPV 45抗原原液，混合为水相。取300μl油相和2.7ml水相混合，超声乳化(300W，4min，5s/5s)，获得Pickering乳液，取相同体积的Pickering乳液与磷酸盐缓冲液混合，得到疫苗组合物，离心后样品明显分层。该对比例中制备的Pickering乳液是一种由固体颗粒代替表面活性剂的乳液体系。乳液的稳定机理主要是通过固体颗粒吸附在油水界面，形成固体颗粒单层或多层结构，从而使乳液稳定。但该技术对制备工艺条件要求较高，且乳液稳定性较差，发明人发现长时间放置或者离心后有明显分层现象，如图3所示。

除上述对比例所述的方法外，发明人在另外的研究中将铝佐剂、水包油乳剂和抗原三种组分先后混合来制备免疫组合物。研究发现，油相和表面活性剂形成的液滴以及抗原先后被吸附到铝佐剂上。油相和表面活性剂形成的液滴和铝佐剂之间的吸附会与抗原和铝佐剂之间的吸附形成竞争，铝佐剂难以有效吸附和保护抗原，另一方面，铝佐剂会破坏乳剂的水油界面的平衡，从而破坏乳剂的形态，与抗原混合后，难以发挥乳剂自身的优势。

实施例13.不同方法制备的佐剂系统的佐剂效果评价

参照实施例12的方法，分别利用实施例5和对比例1-3制备的佐剂系统结核HPV 45抗原进行免疫实验，每组10只小鼠，肌肉注射用HPV 45型L1 VLP蛋白联合佐剂系统制备的疫苗，HPV 45蛋白剂量5μg，注射体积为0.05ml(即1/10HD)，设置Al(OH)₃对照组。

每组中各小鼠的检测结果如表5和图4所示。可以发现，实施例5和对比例1中制备的免疫组合物诱导产生的中和抗体滴度均显著高于Al(OH)₃对照组，但两组之间没有显著性差异。对比例2和3中制备的免疫组合物诱导产生的中和抗体滴度均显著低于Al(OH)₃对照组，这可能是由于一方面这两个对比例中的免疫组合物稳定性较差，另一方面，抗原和铝佐剂作为水相与油相一起乳化，形成乳剂的过程会对抗原产生很大的破坏作用，可能会影响抗原的免疫效果。

综合来看，本发明通过将铝佐剂加入水相然后与油相一起乳化来制备佐剂系统，一方面可以提高佐剂系统的稳定性，另一方面还可以显著增强抗原的免疫效果。

表5

*注：抗体滴度低于检测下限80时，记为下限的一半，即40。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (24)

1.一种佐剂系统，其特征在于，包括水包油乳剂和均匀分散于所述水包油乳剂中的铝佐剂纳米颗粒，所述水包油乳剂包裹所述铝佐剂纳米颗粒形成乳滴，所述乳滴的粒径为100~250nm，所述佐剂系统的制备方法包括：将铝佐剂纳米颗粒加入包含吐温80的缓冲溶液中制成复合水相，将所述复合水相与包含角鲨烯的油相混合，进行分散和均质。

2.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述铝佐剂纳米颗粒为选自磷酸铝、硫酸铝、氢氧化铝或其中至少两种混合形成的铝佐剂纳米颗粒。

3.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述佐剂系统中的铝含量为0.5mg/ml~2mg/ml。

4.权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述水相与油相的比例为5-15ml水相:1g油相。

5.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述油相进一步包含α-生育酚或司盘85。

6.如权利要求5所述的佐剂系统，其特征在于，角鲨烯与α-生育酚的重量比为0.8-1；角鲨烯与司盘85的重量比为8-10。

7.如权利要求5所述的佐剂系统，其特征在于，角鲨烯与α-生育酚的重量比为0.85-0.95；角鲨烯与司盘85的重量比为8.3。

8.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述油相进一步包含另外的免疫刺激剂。

9.如权利要求8所述的佐剂系统，其特征在于，所述免疫刺激剂为选自LPS、MPL、3D-MPL或GLA中的任意一种的TLR4激动剂。

10.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述铝佐剂纳米颗粒与吐温80的重量比为0.1-0.6。

11.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述水相进一步包含另外的免疫刺激剂。

12.如权利要求11所述的佐剂系统，其特征在于，所述免疫刺激剂选自CpG、PolyIC、R837、R848中的任何一种或几种。

13.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。

14.一种制备权利要求1~13中任一项所述的佐剂系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a) 准备铝佐剂纳米颗粒；

b) 将步骤a)的铝佐剂纳米颗粒加入包含吐温80的缓冲溶液中，制成复合水相；

c) 制备油相，所述油相包含角鲨烯；

d) 将步骤b)的复合水相与所述油相混合，进行分散和均质，得到所述佐剂系统。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述分散步骤包括以8000-10000rpm搅拌10-25min。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述均质步骤包括依次在狭缝式均质阀0.5-1.2bar、微射流阀80-160MPa压力下进行均质。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述均质步骤重复进行5-20个循环。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述均质步骤包括依次在狭缝式均质阀0.5-1bar、微射流阀80-140MPa压力下进行第一均质，然后在狭缝式均质阀1-1.2bar、微射流阀120-160MPa压力下进行第二均质，所述第二均质的压力大于所述第一均质的压力。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一均质进行5-10个循环，所述第二均质进行5-10个循环。

20.一种免疫原性组合物，包括权利要求1~13中任一项所述的佐剂系统以及至少一种抗原，所述抗原吸附在所述铝佐剂纳米颗粒上、并均匀分散于所述乳剂中。

21.如权利要求20所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述抗原为一种或多种来源于细菌、病毒、寄生虫、真菌和肿瘤的抗原。

22.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述抗原来源于人免疫缺陷型病毒、人乳头瘤病毒HPV、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新冠病毒SARS-CoV-2中的至少一种。

23.如权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述抗原选自人乳头瘤病毒HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58型中的至少一种。

24.一种制备权利要求20~23中任一项所述的免疫原性组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a) 按照权利要求14-19中任一项所述的方法制备佐剂系统；

b) 将所述抗原添加到所述佐剂系统中，混合均匀，得到所述免疫原性组合物。