CN117210579A - 一种扩增羚牛微卫星片段的引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种扩增羚牛微卫星片段的引物组以及其应用。将该引物组用于秦岭羚牛的亲子鉴定和分析羚牛种群内近交程度中，有助于圈养秦岭羚牛的亲本管理和繁殖选配，进而能够防止圈养动物由于种群过小所带来的遗传衰退现象，同时也为微卫星分子标记在羚牛种群亲子鉴定和结构研究提供了重要的参考价值。
Description
技术领域
本发明属于动物保护技术领域，涉及秦岭羚牛种群保护，具体涉及一种扩增羚牛微卫星片段的引物组及其应用。
背景技术
秦岭羚牛(Budorcas taxicolor bedfordi)是我国特有的珍稀物种，属于国家一级保护动物，近几十年来，由于人类活动范围的不断扩大，以及对森林资源的过度利用，羚牛分布范围急剧减少，种群数量呈现明显下降趋势，随着秦岭羚牛种群规模逐渐变小，近亲繁殖、遗传漂变等发生的可能性增加，将加速小种群的灭绝速度。基于上述现状，开展圈养羚牛种群的繁育和研究是该物种保护的一个重要手段，而圈养动物繁殖所面临的最大问题是种群过小所带来的遗传衰退问题，也就是长期近亲繁殖降低个体适应力、增加患隐性遗传病概率的问题。因此，通过亲子鉴定理清群体内的系谱很有必要，运用分子手段实现个体亲子鉴定和系谱追踪可为圈养秦岭羚牛的亲本管理提供重要帮助。
微卫星是由长度为1～6bp的重复单位串联重复组成，又称为短串联重复序列(short tandem repeats，STR)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，20世纪80年代被发现，广泛且均匀随机分布于真核生物的基因组中。而作为一种应用广泛的遗传分子标记，微卫星具有丰富的多态性，并且遵循孟德尔遗传定律，能稳定地由亲本遗传给子代，等位基因之间呈现共显性遗传特点。微卫星高度的变异性使其在一个座位上可形成很多个等位基因,在群体中表现出丰富的多态性,使得多个微卫星座位上的基因型在两个同种个体间几乎不可能相同(同卵双生除外)。而真核生物基因组中众多的微卫星座位则可为研究者提供高分辨率的遗传信息，因而微卫星十分适用于个体水平的亲子鉴定研究。微卫星分子标记在种群亲子鉴定和结构研究中起到了重要的确证作用，但有关秦岭羚牛的亲缘关系鉴定研究报道较少。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种扩增羚牛微卫星片段的引物组及其应用，解决现有技术中由于缺乏秦岭羚牛的亲缘关系鉴定手段，导致圈养羚牛种群容易出现遗传衰退的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种扩增羚牛微卫星片段的引物组，包括六对引物：
第一对引物由上游引物Takin-SSR-25F和下游引物Takin-SSR-25R组成，所述的上游引物Takin-SSR-25F的核苷酸序列为：5’-CCCACTGGTGCACTGTTGT T-3’，所述的下游引物Takin-SSR-25R的核苷酸序列为：5’-AGGCACAGAAAC TGACTCAAG-3’。
第二对引物由上游引物FH-03F和下游引物FH-03R组成，所述的上游引物FH-03的核苷酸序列为：5’-AGACCTCGTGCAGTCGAATAA-3’，所述的下游引物FH-03R的核苷酸序列为：5’-GAGCACACGCGCTATGATTA-3’。
第三对引物由上游引物FH-12F和下游引物FH-12R组成，所述的上游引物FH-12F的核苷酸序列为：5’-CAAAGGCTGGGTGGTAAATG-3’，所述的下游引物FH-12R的核苷酸序列为：5’-TGGAGAAGGGGAAAGGCTAC-3’。
第四对引物由上游引物FH-16F和下游引物FH-16R组成，所述的上游引物FH-16F的核苷酸序列为：5’-CCTGGTCCAGAAAGATTCCA-3’，所述的下游引物FH-16R的核苷酸序列为：5’-AGCACCATGTGACTGACTGC-3’。
第五对引物由上游引物FH-29F和下游引物FH-29R组成，所述的上游引物FH-29F的核苷酸序列为：5’-TACTCTCCGGAACACCAAGC-3’，所述的下游引物FH-29R的核苷酸序列为5’-CACAGATTTTACATCAGTTGTTG-3’。
第六对引物由上游引物FH-31F和下游引物FH-31R组成，所述的上游引物FH-31F的核苷酸序列为：5’-TGCAATGTGAGAGACTTCGG-3’，所述的下游引物FH-31R的核苷酸序列为：5’-TTCCTGTAGGTGAGTGGCCT-3’。
本发明还具有如下技术特征：
可选且优选的，该引物组还包括第七对引物，由上游引物FH-19F和下游引物FH-19R组成，所述的上游引物FH-19的核苷酸序列为：5’-CTGATGAAGAGAAGCTGGGTG-3’，所述的下游引物FH-19R的核苷酸序列为：5’-ATTCATGACATTTGTGAAGGTTG-3’。
可选且优选的，该引物组还包括第八对引物，由上游引物FH-34F和下游引物FH-34R组成，所述的上游引物FH-34F的核苷酸序列为：5’-TTATTACCCAGACCTTCCACA-3’，所述的下游引物FH-34R的核苷酸序列为：5’-GCCATCCCTACAGCATCAGT-3’。
本发明还保护如权利要求上所述的扩增羚牛微卫星片段的引物组用于羚牛亲子鉴定的应用。
本发明还保护如上所述的扩增羚牛微卫星片段的引物组用于分析羚牛种群内近交程度的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的扩增羚牛微卫星片段的引物组，能够用于秦岭羚牛的亲子鉴定和分析羚牛种群内近交程度，有助于圈养秦岭羚牛的亲本管理和繁殖选配，进而能够防止圈养动物由于种群过小所带来的遗传衰退现象，同时也为微卫星分子标记在羚牛种群亲子鉴定和结构研究提供了重要的参考价值。
以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
需要说明的是，本发明中所有用到的试剂盒，在没有特殊说明的情况下，均采用本领域已知的试剂盒，例如：基因组DNA的提取采用现有技术中已知的常规的试剂盒，具体为北京擎科生物科技有限公司生产的动物DNA提取试剂盒(通用型)。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例给出一种扩增羚牛微卫星片段的引物组，共包括八对引物。第一对引物由上游引物Takin-SSR-25F和下游引物Takin-SSR-25R组成。第二对引物由上游引物FH-03F和下游引物FH-03R组成。第三对引物由上游引物FH-12F和下游引物FH-12R组成。第四对引物由上游引物FH-16F和下游引物FH-16R组成。第七对引物由上游引物FH-19F和下游引物FH-19R组成。第五对引物由上游引物FH-29F和下游引物FH-29R组成。第六对引物由上游引物FH-31F和下游引物FH-31R组成。第八对引物由上游引物FH-34F和下游引物FH-34R组成。八对引物的引物序列如表1所示。
表1、引物序列信息
本实施例中，上述八对引物的获取过程如下：利用秦岭羚牛的转录组数据,采用MISA软件挖掘其转录组序列中的微卫星标记，查找四碱基以上至少五次重复的微卫星位点及DNA序列信息，然后检索微卫星位点前后200bp的序列，作为引物设计区域。由于数据库中缺少羚牛的基因组序列，因此以近缘种(山羊)为参照物种，使用NCBI-BLAST和PrimerPremier5进行引物设计，共得到25对引物，此外，还从现有文献中选择了20对引物，以上述共45对引物作为候选序列，采用PCR扩增和电泳鉴定筛选获得特异性好的引物，然后再进行毛细管电泳检测，最终获得了八对能够检测到多态性位点的引物。
实施例2：
本实施例给出将实施例1的扩增羚牛微卫星片段的引物组用于羚牛亲子鉴定的应用，该方法具体包括如下步骤：
步骤一，获取羚牛亲子鉴定种群基因组DNA：
选取不同羚牛个体的肌肉组织样本，将肌肉组织样本编号并提取基因组DNA；同时，选择17头陕西羚牛和3头四川羚牛，采集血样后将血液样本编号，然后从羚牛的血样中提取并获得基因组DNA。采用核酸分析仪检测所有基因组DNA的浓度与纯度，DNA浓度应高于100ng/μL，OD260/OD280值应在1.8～2.0之间，检验合格的基因组DNA即为羚牛亲子鉴定种群基因组DNA，将其置于-20℃冰箱中保存待用。上述羚牛肌肉组织样本和羚牛肌肉血液样本均为发明人所在实验室自行保存。
步骤二，毛细管电泳检测：
在实施例1的8对引物的上游引物的5’端加上16个碱基的通用tag，该通用tag的序列为：5’-CAGTCGGGCGTCATCA-3’，获得带有通用tag的上游引物，其序列信息如表2所示。然后以步骤一获得的羚牛亲子鉴定种群基因组DNA为模板，采用带有通用tag的上游引物进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR产物；再以第一轮PCR产物为模板，采用带有通用tag的上游引物和8对引物的下游引物进行第二轮PCR扩增，获得多重PCR终产物，将该多重PCR终产物进行毛细管电泳检测，电泳结束后导出并保存电泳数据。
表2、带有通用tag的上游引物序列信息
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| Takin-SSR-25F-tag | CAGTCGGGCGTCATCACCCACTGGTGCACTGTTGTT |
| FH-03F-tag | CAGTCGGGCGTCATCAAGACCTCGTGCAGTCGAATAA |
| FH-12F-tag | CAGTCGGGCGTCATCACAAAGGCTGGGTGGTAAATG |
| FH-16F-tag | CAGTCGGGCGTCATCACCTGGTCCAGAAAGATTCCA |
| FH-29F-tag | CAGTCGGGCGTCATCATACTCTCCGGAACACCAAGC |
| FH-31F-tag | CAGTCGGGCGTCATCATGCAATGTGAGAGACTTCGG |
| FH-19F-tag | CAGTCGGGCGTCATCACTGATGAAGAGAAGCTGGGTG |
| FH-34F-tag | CAGTCGGGCGTCATCATTATTACCCAGACCTTCCACA |
本实施例中，两轮PCR扩增的总体系为25μL，包括2×Taq PCR Mix 12.5μL，上下游引物(5umol/L)各1.0μL，羚牛基因组DNA 1μL(100ng/μL)，无菌去离子水9.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火(温度依据引物而定)30s，72℃延伸30s，30个循环；最后在72℃下延伸5min。
步骤三，获得微卫星基因座的遗传多态性数据集：
采用GeneMarker软件对步骤二获得的电泳数据进行分析和计算，获得微卫星基因座的遗传多态性数据集，该数据集包括等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量、非排除概率PE-1(.给定候选亲本与子代基因型,不能排除候选亲本的概率)、非排除概率PE-2(给定已知亲本基因型、候选亲本基因型和子代基因型,不能排除候选亲本的概率)和非排除概率PE-P(给定候选双亲基因型,不能排除候选双亲的概率)，具体如表3所示：
表3、微卫星基因座的遗传多态性数据集
由表3可知，本实施例中，多态性位点的PIC值在0.090～0.498，8个标记当中有1个低度多态性位点，有7个中度多态性位点，没有高度多态性位点。平均多态信息含量为0.335。8个位点观察杂合度(Ho)从0.100到0.700不等，变化范围较大，平均观察杂合度为0.363；8个位点期望杂合度(He)从0.097到0.549不等，变化范围较大，平均期望杂合度为0.421。在给定一个候选亲本与子代信息的情况下(PE-1)，8个位点的排除概率(PE-1)为0.005到0.158，在给定一个亲本基因型、候选亲本基因型和子代基因型的情况下(PE-2)，8个位点的排除概率为0.045到0.321，在给定候选父母双方基因型的情况下(PE-P)，8个位点的排除概率为0.084到0.501。
步骤四，获取结合排除概率：
根据步骤三获得微卫星基因座的遗传多态性数据集中的非排除概率PE-1、非排除概率PE-2和非排除概率PE-P，计算后分别获得排除概率EP-1(已知候选亲本与子代基因型,排除候选亲本和子代亲子关系的排除概率)、排除概率EP-2(已知子代和一个亲本基因型，给定候选亲本和子代基因型，排除候选亲本和子代亲子关系的排除概率)和排除概率EP-P(已知候选亲本对基因型，排除候选亲本对和子代亲子关系的排除概率)，然后按照排除概率EP-1数值的大小进行排序，获得如下表4。
表4、微卫星基因座的排除概率
| 微卫星位点(Loci) | 排除概率EP-1 | 排除概率EP-2 | 排除概率EP-P |
| FH-12 | 0.158 | 0.321 | 0.501 |
| FH-16 | 0.124 | 0.187 | 0.281 |
| FH-29 | 0.123 | 0.186 | 0.28 |
| Takin-SSR-25 | 0.110 | 0.179 | 0.271 |
| FH-31 | 0.088 | 0.166 | 0.255 |
| FH-03 | 0.080 | 0.195 | 0.317 |
| FH-19 | 0.070 | 0.152 | 0.239 |
| FH-34 | 0.005 | 0.045 | 0.084 |
为鉴定8个微卫星位点的亲子鉴定效率，依照表4中各位点排除概率由大到小的顺序，将8个微卫星位点按组合数目进行分组，计算结合排除概率CPE-1(已知候选亲本和子代基因型，排除候选亲本和子代亲子关系的结合排除概率)，结合排除概率CPE-2(已知子代和一个亲本基因型，给定候选亲本和子代基因型，排除候选亲本和子代亲子关系的结合排除概率)和结合排除概率CPE-P(已知候选亲本对基因型，排除候选亲本对和子代亲子关系的结合排除概率)，结果见表5。
表5、微卫星基因座的结合排除概率
由表5可得，随着微卫星位点个数的减少，结合排除概率逐渐减小。CPEs小于0.90，筛选出的微卫星位点组合不能用于亲子鉴定。当微卫星位点在6～8个时(即引物对数在6～8对时)，CPE-P大于90％，说明引物组能够用于秦岭羚牛的亲子鉴定。
实施例3：
本实施例给出将实施例1的扩增羚牛微卫星片段的引物组用于分析羚牛种群内近交程度的应用，该方法具体包括如下步骤：
步骤一，获取羚牛亲子鉴定种群基因组DNA：
本实施例中，步骤一与实施例2的步骤一完全相同。
步骤二，毛细管电泳检测：
本实施例中，步骤二与实施例2的步骤二完全相同。
步骤三，种群内近交程度分析：
采用GeneMarker软件对步骤二获得的电泳数据进行分析和计算，获得种群内近交程度数据集，该数据集包括群体内近交系数、总群体近交系数、群体间基因分化系数和基因流，如表6所示。
表6、种群内近交程度分析表
表6中的Fis、Fit和Fst都是反映群体近交程度或群体间遗传分化的指标，其值越大，表示偏离Hardy-Weinberg平衡程度越明显。由表6可知，Fis值与Fit值不相等，Fst值不为零，群体内存在一定的近交行为，但数值偏低，秦岭羚牛群体的位点平均多态信息含量为0.335，遗传多样性处于中度水平。本实施例中，8个微卫星位点的平均观察杂合度为0.363，平均期望杂合度为0.421，遗传杂合度小于0.5，结合种群近交程度的分析，可知该种群存在一定的近交行为，但近交程度不大。这个结论是符合实际情况的，因为本实施例中选择的鉴定种群并非单一群体，而分布在陕西和四川的两个种群。
Claims (5)
1.一种扩增羚牛微卫星片段的引物组，其特征在于，包括六对引物：
第一对引物由上游引物Takin-SSR-25F和下游引物Takin-SSR-25R组成，所述的上游引物Takin-SSR-25F的核苷酸序列为：5’-CCCACTGGTGCACTGTTGT T-3’，所述的下游引物Takin-SSR-25R的核苷酸序列为：5’-AGGCACAGAAAC TGACTCAAG-3’；
第二对引物由上游引物FH-03F和下游引物FH-03R组成，所述的上游引物FH-03的核苷酸序列为：5’-AGACCTCGTGCAGTCGAATAA-3’，所述的下游引物FH-03R的核苷酸序列为：5’-GAGCACACGCGCTATGATTA-3’；
第三对引物由上游引物FH-12F和下游引物FH-12R组成，所述的上游引物FH-12F的核苷酸序列为：5’-CAAAGGCTGGGTGGTAAATG-3’，所述的下游引物FH-12R的核苷酸序列为：5’-TGGAGAAGGGGAAAGGCTAC-3’；
第四对引物由上游引物FH-16F和下游引物FH-16R组成，所述的上游引物FH-16F的核苷酸序列为：5’-CCTGGTCCAGAAAGATTCCA-3’，所述的下游引物FH-16R的核苷酸序列为：5’-AGCACCATGTGACTGACTGC-3’；
第五对引物由上游引物FH-29F和下游引物FH-29R组成，所述的上游引物FH-29F的核苷酸序列为：5’-TACTCTCCGGAACACCAAGC-3’，所述的下游引物FH-29R的核苷酸序列为5’-CACAGATTTTACATCAGTTGTTG-3’；
第六对引物由上游引物FH-31F和下游引物FH-31R组成，所述的上游引物FH-31F的核苷酸序列为：5’-TGCAATGTGAGAGACTTCGG-3’，所述的下游引物FH-31R的核苷酸序列为：5’-TTCCTGTAGGTGAGTGGCCT-3’。
2.如权利要求1所述的扩增羚牛微卫星片段的引物组，其特征在于，还包括第七对引物，由上游引物FH-19F和下游引物FH-19R组成，所述的上游引物FH-19的核苷酸序列为：5’-CTGATGAAGAGAAGCTGGGTG-3’，所述的下游引物FH-19R的核苷酸序列为：5’-ATTCATGACATTTGTGAAGGTTG-3’。
3.如权利要求2所述的扩增羚牛微卫星片段的引物组，其特征在于，还包括第八对引物，由上游引物FH-34F和下游引物FH-34R组成，所述的上游引物FH-34F的核苷酸序列为：5’-TTATTACCCAGACCTTCCACA-3’，所述的下游引物FH-34R的核苷酸序列为：5’-GCCATCCCTACAGCATCAGT-3’。
4.如权利要求1至3任一项所述的扩增羚牛微卫星片段的引物组用于羚牛亲子鉴定的应用。
5.如权利要求3所述的扩增羚牛微卫星片段的引物组用于分析羚牛种群内近交程度的应用。
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| CN202311260182.1A Active CN117210579B (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 一种扩增羚牛微卫星片段的引物组及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117210579B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172241A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-05-19 | 吉林省农业科学院 | 绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用 |
| CN113151504A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-07-23 | 西北农林科技大学 | 一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用 |
| CN113897444A (zh) * | 2021-09-07 | 2022-01-07 | 沈阳农业大学 | 用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组及其12-plex快速分型检测方法 |
-
2023
- 2023-09-27 CN CN202311260182.1A patent/CN117210579B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172241A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-05-19 | 吉林省农业科学院 | 绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用 |
| CN113151504A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-07-23 | 西北农林科技大学 | 一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用 |
| CN113897444A (zh) * | 2021-09-07 | 2022-01-07 | 沈阳农业大学 | 用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组及其12-plex快速分型检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| HUI FENG: "Forest fragmentation causes an isolated population of the golden takin (Budorcas taxicolor bedfordi Thomas, 1911) (Artiodactyla: Bovidae) in the Qinling Mountains (China)", ZOOLOGY, vol. 9, no. 2, 30 January 2024 (2024-01-30), pages 1 - 11 * |
| JU QIU: "De Novo Transcriptome Assembly, Functional Annotation and SSR Marker Discovery of Qinling Takin (Budorcas taxicolor bedfordi)", ANIMALS, vol. 11, 11 August 2021 (2021-08-11), pages 1 - 9 * |
| 冯慧: "利用mtDNA和微卫星分析羚牛秦岭亚种遗传多样性和遗传结构", 中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑, 15 December 2017 (2017-12-15), pages 33 - 34 * |
| 李安宁: "秦岭羚牛的保护生物学研究进展", 西北农业学报, vol. 30, no. 8, 31 August 2021 (2021-08-31), pages 1113 - 1121 * |
| 钱敏, 窦震, 顾永熙, 张芹, 鲁润龙, 朱学良: "秦岭羚牛高度重复序列DNA片段的分子克隆和序列分析", 实验生物学报, no. 01, 15 March 2002 (2002-03-15), pages 36 - 41 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117210579B (zh) | 2024-11-15 |
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