CN117203319A - 递送平台 - Google Patents

Abstract

本申请提供了用于将有效负载/货物化合物和组合物无载体和/或病毒递送至细胞中的细胞工程平台。所述平台以易于使用的方式快速实现向细胞的递送。相关的装置、系统、技术、制品和组合物也一并描述。

Description

递送平台

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119要求于2020年2月1日提交的第63/144,136号美国临时专利申请的优先权，题为“Reversible Permeabilization Platform(可逆的渗透平台)”，其全部内容在此明确地通过引证整体并入本文。

技术领域

本文描述的主题涉及的是利用基于溶液的细胞内递送的细胞工程平台。

发明背景

不同细胞类型和细胞内递送方法之间存在细胞内递送效率的差异。在细胞内递送后获得足够数量的活细胞可能需要大规模的细胞工程平台，其操作成本可能很高并且需要更大量的靶细胞和试剂介质。使用传统系统和方法，通过可逆地渗透化少量靶细胞快速生成高质量、可重复的实验数据可能非常耗时且需要大量的人工。

发明内容

在一方面，一种方法包括用细胞和第一培养基的混合物填充细胞工程平台的容器；以及通过过滤器从容器中排出第一培养基，使细胞沉积在过滤器上。所述细胞工程平台包括雾化器；以及配置用于接收所述容器的容器保持器。所述容器包括过滤器板和形成用于容纳细胞和培养基的孔的上部部分。

任何可行的组合可包括下列特征中的一个或多个特征。举例来说，可以将含有透化剂和有效负载的递送溶液喷射到沉积在过滤器上的细胞上。可以应用终止溶液。所述的容器可以填充第二培养基以再悬浮过滤器中的细胞。排出的第一培养基可被重新用作第二培养基。所述的容器可被搅拌。可从所述容器中提取所述再悬浮的细胞。所述容器的填充可通过泵和控制器自动执行。所述细胞可在所述容器内培养。从所述容器中排出第一培养基可通过重力来进行。可以应用终止溶液来清洗所述细胞。用所述第二培养基填充所述容器可作为细胞清洗过程、细胞浓度改变过程和细胞培养改变过程中的至少一种来执行。

所述容器可包括可释放地耦合到所述过滤器板的下部部分。所述容器包括存储器，所述存储器存储表征至少一个工艺参数的数据。所述至少一个工艺参数可从所述存储器中由细胞工程平台的控制器读取。至少一个处理步骤可使用所述至少一个工艺参数执行。所述容器可包括存储表征实验标识符的数据的存储器。

在另一方面，一种系统包括壳体，所述壳体包括配置用于接收容器的容器保持器，所述容器包括过滤器板和形成孔的上部部分；递送溶液施加器，其配置用于将雾化的递送溶液递送到所述的孔中；显示器；以及控制器，其包括配置为显示至少一个工艺参数的电路。

任何可行的组合可包括下列特征中的一个或多个特征。例如，所述容器可被配置为倾斜或振动所述容器。所述递送溶液施加器可包括喷头。所述容器的大小可容纳少于1x10⁷T细胞。所述系统可配置为自动将雾化的递送溶液施加到在容器内的过滤器上形成的细胞单层。所述递送溶液施加器可包括喷雾器。所述递送溶液施加器可进一步包括质量流量控制器或体积流量控制器，以调节气体流量从而操作所述喷雾器。所述递送溶液施加器被配置为每次致动递送10-300微升的递送溶液。

所述的递送溶液可包括水溶液，所述水溶液包括有效负载和浓度大于2％(v/v)的醇。所述醇可包括乙醇。所述水溶液可包括大于5％的乙醇。所述水溶液可包括5-30％之间的乙醇。所述水溶液可包括12％或25％的乙醇。所述水溶液可包括12.5-500mM的KCl。所述水溶液可包括106mM的KCl。所述的孔可配置为包含非粘附细胞群。所述非粘附细胞可包括外周血单核细胞。所述非粘附细胞可包括免疫细胞。所述非粘附细胞可包括T淋巴细胞。所述有效负载可包括信使核糖核酸(mRNA)。所述的mRNA可可编码基因编辑组合物。所述基因编辑组合物可降低PD-1的表达。所述的mRNA可编码嵌合抗原受体。

所述系统可用于将货物化合物或组合物递送至哺乳动物细胞。非粘附细胞群可包括单层。

在另一方面，一种系统包括：壳体，所述壳体包括基座，至少一个控制器，所述至少一个控制器包括配置用于控制所述系统的操作的电路，以及显示器。所述系统进一步包括一个或多个流体回路，其包括至少一个阀门、至少一个泵、一个注射器和至少一个流体检测传感器；腔室组件，其容纳在从壳体的前表面延伸的铰接框架内，其中所述腔室组件在操作中与大气条件密封并包括过滤器；至少一个介质容器；至少一个细胞培养容器，其通过所述一个或多个流体回路与所述腔室组件流体耦合；以及至少一个收集托盘，其配置用于接收所述介质或细胞。

任何可行的组合可包括下列特征中的一个或多个特征。例如，所述铰接框架可配置为搅动所述腔室组件。所述腔室组件可包括存储表征至少一个工艺参数的数据的存储器。所述至少一个控制器可配置用于通过所述电路从所述存储器读取表征至少一个工艺参数的数据，并且经由所述电路利用所述至少一个工艺参数执行至少一个处理步骤。所述腔室组件可包括存储表征实验标识符的数据的存储器。

在一些实施方式中，所述系统的操作可包括细胞清洗过程、细胞浓度改变过程和细胞培养基改变过程中的至少一个。所述显示器可包括人机界面，其配置用于接收与系统的操作相关联的输入。所述铰接框架可相对于系统定位在其上的水平表面铰接到0-10.0、10.1-15.0、15.1-20.0、20.1-25.0、25.1-30.0、30.1-35.0、35.1-40.0或40.1-45.0度之间的角度。所述铰接框架可以预定或用户定义的频率在两个角度之间摆动。预定或用户定义的频率可以在0-0.5kHz、0.51-1.0kHz、1.01-1.5kHz、1.51-2.0kHz、2.01-2.5kHz或大于2.51kHz之间。所述至少一个收集托盘可包括冷却元件或加热元件。

在一些实施方式中，所述基座可包括定位在至少一个收集托盘下方的秤。所述至少一个流体检测传感器可相对于所述一个或多个流体回路中的至少一个流体回路布置。第一流体检测传感器可配置在至少一个流体回路的第一位置，第二流体检测传感器可配置在所述至少一个流体回路的第二位置。所述第一流体检测传感器和第二流体检测传感器可操作用于计算至少一个流体回路的第一位置和第二位置之间的介质体积。所述至少一个泵可以是蠕动泵。所述系统可包括用于保持注射器的注射器保持器。所述注射器保持器可包括光学传感器，所述光学传感器配置用于确定注射器内的流体水平或注射器的柱塞的位置。所述光学传感器可包括多个光学传感器的阵列。

在一些实施方式中，所述系统可包括至少一个电连接器，其配置为将仪器通信地耦合到所述系统。所述仪器可包括温度计、比重计、气压计、光电体积描记传感器、测压元件、生化传感器、光学传感器、换能器或微电子机器中的至少一种。所述系统可包括至少一个第一气体连接器，其经由第一气体回路将第一气体供应源连接到所述腔室组件。所述系统包括第二气体连接器，其经由第二气体回路将第二气体供应源连接到所述腔室组件，所述第二气体连接器被配置为独立于至少一个第一气体连接器操作。所述系统可包括至少一个吊架，其配置为将介质源定位在所述腔室组件上方。所述吊架可包括配置在吊架内的秤以确定介质源的重量。所述系统可包括条形码读取器。所述系统可以包括管焊机。所述系统可包括至少部分地包围所述腔室组件的绝缘护套或导电护套。

所述腔室组件的内表面可包括涂层或图案，其配置为帮助细胞迁移或粘附到所述内表面。所述腔室组件可包括从下部部分移除的上部部分，所述下部部分包括过滤器。所述过滤器可包括涂层或图案，其配置为帮助细胞迁移或粘附到所述过滤器。所述上部部分可包括气体端口，在所述气体端口处可接受来自第一气体回路的气体。所述上部部分可包括空气扩散器开口和定位在所述空气扩散器开口内的空气扩散器，所述空气扩散器连接到所述第二气体活路。所述上部部分可包括喷头开口和定位在喷头开口内的喷头。所述喷头可包括连接到第一气体回路的气体入口端口和连接到包括有效载荷和醇的等渗水溶液源的流体入口端口。

所述至少一个控制器可配置为控制所述腔室组件内的压力、温度和气体成分中的一个或多个。所述气体成分可包括二氧化碳、氮气或氧气中的至少一种。所述腔室组件可包括加热元件。所述系统可配置用于培养细胞的生物反应器。所述系统可配置为在细胞冷冻保持过程中使用。所述系统可配置用于细胞透化过程。所述系统可配置为用于细胞转导过程。所述系统可配置用于细胞转染过程。

在另一方面，提供了一种用于在没有醇的情况下将货物递送至细胞的装置。所述装置包括壳体、至少一个控制器和显示器，其中所述壳体包括基座，所述至少一个控制器包括配置用于控制所述装置的操作的电路。所述系统进一步包括一个或多个流体回路，所述流体回路包括至少一个阀、至少一个泵、注射器和至少一个流体检测传感器；腔室组件，其容纳在从所述壳体的前表面延伸的铰接框架内，其中所述腔室组件在操作中与大气条件密封，并且包括过滤器；至少一个介质容器；至少一个细胞培养容器，其经由所述一个或多个流体回路流体耦合到所述腔室组件；以及至少一个收集托盘，其配置用于接收介质或细胞。

本文描述的主题的一个或多个变体的细节在以下附图和描述中阐述。本文所述主题的其他和有点姜葱说明书和附图以及权利要求中显而易见。

附图说明

图1是计算机辅助设计(CAD)绘制的立体图，其示出了根据本申请公开的一些实施方案的递送平台的一个示例性实施方案。

图2A是图1所示的递送平台的侧视图。

图2B是图1所示的递送平台的主视图。

图3是根据本文公开的一些实施方案示出的图1所示的递送平台的另一个示例性实施方案的侧视图。

图4A示出的是图1中所示的递送平台的基座组件的示例性实施方案的CAD绘制的分解视图。

图4B是图1所示平台的一些实施方式的气动图。

图5是示出图1所示递送平台的脊柱组件的示例性实施例的CAD绘制的分解视图。

图6A-B是示出图1所示的递送平台的顶部组件的示例性实施方案的CAD绘制的分解视图。

图7A-7E是示出图1的递送平台的示例Eppendorf基座支撑件的CAD图。

图8A-8E是示出图1的递送平台的夹子模块的示例性上部安装件的CAD图。

图9A-9H是示出图1的递送平台的夹子模块的示例性下部安装件的CAD图。

图10A-G示出的是用于图1的递送平台的示例性雾化器。

图11A-11E是示出图1的递送平台的示例性喷头基座安装平台的CAD图。

图12A-12D是示出图1的递送平台的容器定位座的示例性实施方案的上部部分的CAD图。

图13A-13C是示出图1的递送平台的容器定位座的示例性实施方案的下部部分的CAD图。

图14A-14F是示出图1的递送平台的示例性容器定位座盖的CAD图。

图15是在图1所示的递送平台中使用的容器组件的示例性实施方案的图像。

图16A-16C是图15中示出的容器组件的各组件的示例性实施方案的图像。

图16D是图15的容器组件的另一个示例性实施方案。

图17是示出图1中的递送平台的容器座内的容器组件的示例性实施方案的CAD绘制的立体图。

图18是图17中示出的示例性实施方案的剖面图。

图19A-19C示出的是图15中的容器组件的过滤器板连接件的示例性实施方案的CAD图。

图20是示出使用图1中的递送平台递送到细胞的过程的示例性实施方案的流程图。

图21A-B示出了用于堆叠和处理容器的示例性框架。

图22示出了根据一些示例性实施方式的示例性喷雾防护装置。

图23示出了根据本文公开的一些实施方案的递送平台的另一示例性实施方案的图像。

图24示出了图23中示出的平台的另一视图。

图25示出了图23中示出的平台的第二视图。

图26示出了图23中示出的平台的一部分的特写视图。

图27示出了图23中所示的递送平台的一次性组件的示例性实施方案的图像。

图28示出了图27所示的一次性组件的喷头的示例性实施方案的图像。

图29示出了用于同时递送RNP的实验设计的示意图。Cas9RNP-TRAC sgRNA以2:1的比例以0.4μg/μL制备(相当于每1x10⁶细胞3.3μg)；用0、5、10和15％乙醇和RNP制备S缓冲溶液，并在递送系统上使用各乙醇浓度的S缓冲溶液进行实验。

图30示出了用靶向CD3的抗体染色的细胞的代表性流式细胞术图(对活的群体进行门控)。未处理的(UT)细胞显示出>93％的CD3阳性，并且在通过关于图1所示的示例性递送平台递送TRACRNP之后，这一阳性率降低。在处理过的样品中观察到两个不同的细胞群，左侧的细胞群(门控)指的是CD3染色阴性的那些细胞。在递送溶液中不存在乙醇的样品中，所述阴性群体从约59％增加到存在乙醇的样本中的约67％。在Cas9蛋白沉淀之前，乙醇的存在量是有限的(在0.4μg/μL Cas9 RNP条件下，乙醇含量>20％)。

图31A是柱状图，其显示了通过图1所示的示例性递送平添递送TRACRNP(Cas9摩尔比为2:1；每1x10⁶细胞3.3μg)的72小时后，活化的T细胞中每个条件2-3次重复的平均CD3阴性群体(±标准差)。随着递送溶液中的货物加入浓度增加的乙醇。CD3编辑水平随着乙醇浓度的增加而适度增加(0％ EtOH-58％至15％EtOH-66％)。“UT”是指未经处理的对照细胞。

图31B是示出通过关于图1所示的示例性递送平台递送TRACRNP72小时后各组CD3阴性表达的平均值、标准偏差、平均值的标准误差和变异系数的表格。

图32是描绘在增加的乙醇浓度和递送前、递送后(第3天)、递送后(第5天)组成的时间点下的生存率百分比的柱状图。

图33A是显示与含有乙醇的溶液相比，不含乙醇的水溶液在相同压力下显示出更大的液滴尺寸的线图。如图所示，为了获得与直径约10μm的细胞(例如，人类T细胞)相似的喷雾颗粒尺寸，喷雾液滴尺寸需要施加更高的雾化压力以保持液滴尺寸范围更接近细胞尺寸，包括避免过大的液滴。

图33B是显示含有乙醇的水溶液显示出较小的液滴尺寸(与在相同压力下不具有乙醇的水溶液相比)的线图。

图34A和34B是柱状图，其显示的是使用溶液中的12％乙醇并增加来自两种缓冲溶液的蔗糖和氯化钠的比例实现GFP转染的增加。细胞活力也得以维持。

图35A和图35B是柱状图，其显示的是使用溶液中的27％乙醇并增加来自两种缓冲溶液的蔗糖和氯化钠的比例实现GFP转染的增加。细胞活力也得以维持。在各附图中相似的参考标记指代相似的元件。

图36是显示线性回归分析的线形图，所述线性回归分析是基于乙醇添加后测量的血清渗透压和乙醇添加前的血清渗透压之间的差异以及以mg/dL为单位的血清乙醇浓度证明渗透压差仅由乙醇引起。渗透压差(mOsm/kg H2O)＝0.234(乙醇[mg/dL])-1.427(95％置信区间:斜率0.226-0.243,截距-2.971至0.118)。图36转载自Nguyen,M等人的“医学前沿：乙醇的渗透压浓度是否大于其摩尔浓度？”，2020年1月8日，其全部内容通过引用整体并入本文。

图37是显示高渗溶液增加转染的柱状图。

图38是示出高渗溶液对活力的影响的柱状图。

具体实施方式

尽管取得了一些进展，但将某些颗粒和/或分子递送到细胞中仍然是一种挑战。待敌送到细胞中的分子的大小或电荷等因素可能限制和/或组织分子递送到细胞。尤其是，由于细胞的分子和/或膜，跨细胞膜的递送可能是复杂的。细胞膜或血浆是一种半渗透性生物膜，起到选择性屏障的作用。膜调节细胞的内部化学成分。作为细胞的选择性屏障，膜只能允许某些分子被动地穿过膜，例如通过被动扩散进入细胞。小的疏水性分子(例如O₂、CO₂和N₂)和小的不带电荷的极性分子(例如H₂O和甘油)可被动地在细胞膜上扩散。较大的、不带电的极性分子(例如氨基酸、葡萄糖和核苷酸)和离子(如H⁺、Na⁺、K⁺和Cl^-)不能被动地扩散穿过细胞膜。

可逆透化可用于临床环境以及研究和开发环境中化合物的细胞内递送。例如，在临床或治疗性治疗方法中，可从患者身上提取细胞，分离(例如，浓缩或富集)细胞，然后用细胞工程方法进行处理。工程细胞可以扩增并返回给患者。对于跨细胞膜递送，可以用使用病毒载体的方法。然而基于病毒载体的方法通常需要高成本和复杂的过程，提供有限的可及性，并且提供可变和不一致的结果。也可以使用基于电穿孔的方法。然而，基于电穿孔的方法通常会导致更高的细胞损伤，并提供较差的细胞恢复和细胞功能。

本申请的一个目的是提供基于溶液的递送以解决细胞工程技术的成本和复杂性挑战。为了提供用于细胞治疗的可靠且一致的方法，当前主题可以提供一种细胞工程方法和平台，通过使细胞与含有有效载荷的递送溶液接触，将化合物或化合物混合物(例如，有效载荷)跨细胞膜递送到细胞中。细胞可以是悬浮细胞或者粘附细胞。在一些实施方式中，可以通过在溶液中包括用于可逆渗透细胞膜的试剂来执行跨细胞膜将有效载荷递送到细胞中，这也可以被称为细胞穿孔过程。此外，细胞的穿孔可以指的是使细胞膜渗透并通过细胞膜将有效载荷递送到细胞中的过程。

当前主题的一些实施方式可为细胞工程提供平台，所述平台可提供临床级转染，其中经处理的细胞具有高活力和表达。此外，所述递送平台可提供较小规模的细胞处理，并可用于涉及较小数量细胞的实验设计，例如0.5M-15M细胞。所述平台可包括使其易于使用的特征，例如，通过具有用于执行本文更详细描述的细胞工程过程的一次性容器。在一些实施方案中，所述容器是可重复使用的。在一些实施方案中，容器可以是腔室。所述系统可包括易于实施和可重复的细胞处理的控制功能。一些实施方式可能特别有用，例如在研究和开发工作中。所述平台还可用于将有效载荷/货物化合物和组合物无载体递送到非粘附细胞中。

使用本申请所述的平台，还可以在递送过程之前和/或之后执行其他细胞工程过程，这可以显著提高生产率并允许整个过程被简化。此外，不仅可以在单一平台内进行非病毒转染方法，还可以进行病毒转染方法。

本文所述的递送平台可以通过执行提供非粘附细胞群并使细胞群与一定体积的等渗水溶液接触的步骤来实现有效载荷穿过非粘附细胞的质膜的递送，所述水溶液包括有效载荷。在一些实施方式中，水溶液不包括醇(例如，溶液中不存在醇(例如0％乙醇))。在一些实施方式中，所述溶液还可包括浓度大于0.2％(v/v)的醇。例如，所述醇包括乙醇(例如，大于5％的乙醇、大于10％的乙醇等)。在一些实施方式中，所述水溶液包括20-30％之间的乙醇，例如27％的乙醇。其他成分也是可能的。

当前主题还可以提供一种平台，所述平台可以使细胞穿孔过程自动化并允许以各种规模向细胞进行递送。当细胞被手动装载到平台和/或从平台手动卸载时，系统的吞吐量是有限的，在应用于临床过程/治疗中存在困难。根据操作人员和/或各种环境参数，可能存在污染和工艺不一致的问题。通过过程自动化，可以更为一致地执行递送过程，可显著减少对污染的担忧，因此，可以更为容易地扩展系统。下文将描述利用手动和自动过程执行递送过程的递送平台的示例性实施方案。

根据一些实施方式的示例性容器在图15-19中示出，并且在下文中进行更全面的描述。所述示例性容器包括上部部分1605、过滤器板1610和下部部分1615。在一些实施方式中，容器可被设计用于特定的细胞群和尺寸。例如，所述容器可根据培养物包括不同的下部部分。如本文所使用的的，容器可被称为腔室、腔室组件、一次性组件(asingle-useassembly)或一次性组件(adisposable assembly)。

在一些实施方式中，所述容器可作为单一模制品制造，而不是具有夹在一起的多个部件。所述容器可以将其过滤器膜结合到单一基板上。所述容器可具有较小直径的过滤器，从而可以处理较小的细胞群。所述容器可能具有模制标记以指示填充水平，或者具有模制特征以确保平台内的方向一致。所述容器可以具有多个特征，以使其能够保持在容器保持器内或堆叠在设备外部。所述的容器可具有盖子特征，以促进细胞在其中孵育。所述容器可能具有单向止回阀，以使培养基能够保持在过滤器下方的腔室内，或将培养基支撑在过滤器上方，以在容器使用后保持细胞悬浮。

作为另一个实施例，一些容器可包括位于下部部分的吸湿泡沫，用于从过滤板上方抽吸流体。这种方法可用于将递送溶液和/或有效载荷溶液从形成在过滤板上方的细胞单层中拉出，从而控制细胞群与递送溶液和/或有效载荷溶液之间的接触长度。一种示例性泡沫是3M^TMTegaderm^TM泡沫敷料(非粘性)。

作为另外一个实施例，所述下部部分并不包括孔，并且可以包括平坦的组织培养处理表面。这种实施方式可适用于粘附细胞群以增强粘附性。这种具有平坦表面的实施方案可用于递送至组织外植体或工程组织。

在一些实施方式中，所述容器可适用于培养细胞。所述细胞可被培养一段时间，例如数小时或数天，而不是立即从容器中取出。在这样的实施方式中，所述容器可由培养相容材料形成，且可提供容器盖。

在一些实施方式中，所述容器可包括存储工艺参数的存储器。例如，可以利用工艺参数对所述容器存储器进行编程，使得当所述容器被插入细胞工程平台时，细胞工程平台上的控制器从所述容器存储器读取所述工艺参数，所述细胞工程可使用过程关键参数进行，例如，通过自动化方式(例如，递送到细胞的溶液的量可以由控制器确定)，或者通过显示器向用户显示指令。通过在进行所述递送过程之前将工艺参数存储在所述容器上，可以提高可重复性，因为用户不需要将工艺参数输入到平台中。

在另外一个实施例中，首先将工艺参数夹在到细胞工程平台的控制器中，并使用这些参数执行递送过程。过程完成后，细胞工程平台可将工艺参数写入容器存储器以供将来参考。这些工艺参数可包括本文中使用的或描述的与向细胞递送的有效载荷相关的任何参数。例如，递送方案，例如，溶液组成、暴露长度、温育时间、洗涤周期、温度、喷雾特性、压力、体积(例如，待施用的递送溶液、待引入的培养基等)、细胞特性等。

在一些实施方式中，所述细胞工程平台可以将诸如实验标识符、日期、时间等信息写入容器存储器，以供将来使用和/或参考。在一些实施方式中，容器可彼此通信。例如，适于容纳多个所述容器的集装容器或壳体可包括容器之间的连接，使得所述集装容器可从第一容器的存储器中读取数据，并将部分或全部数据复制到容纳在集装容器中的其他容器。这种方法也可以提高可重复性，因为一旦第一容器使用工艺关键参数进行编程，该数据就被复制到其他容器中，而无需对部分或全部数据进行修改。

在一些实施方式中，所述容器可包括存储器、处理器和/或通信模块，例如能够与细胞工程平台和/或其他容器通信的近场或射频识别(RFID)通信模块。在一些实施方式中，所述容器可包括电触点，其用于在所述容器插入细胞工程平台时与所述细胞工程平台通信。其他的实施方式也是可能的。

实施例1

图1是计算机辅助设计(CAD)绘制的立体图，其示出了根据本文公开的一些实施方案的递送平台100的示例性实施方案。所述递送平台100包括容器105，其配置用于布置在容器座110内并被容器座110接收。示例性容器105在图15-19中示出。所述容器105包括上部部分1605、过滤器板1610和下部部分1615。所述的容器105可经由过滤板1610提供处理表面，在所述处理表面上课提供用于治疗和处理的细胞。例如，所述过滤板1610可配置用于接收过滤器，用于使用所述递送平台100形成待处理细胞的单层。

所述容器105被接收并定位在容器座110内。在一些实施方式中，雾化器座115可以与容器座110相距固定距离，以减少用户可用的变量或自由度的数量，从而提供更易于使用的系统。例如，所述雾化器座115可以固定在容器105上方大约75mm处。所述的容器座110可包括用于接收所述容器105的圆形开口。所述容器105的下部部分1615与穿过容器座110的圆形开口延伸的过滤板1610的一部分连接而与过滤板1610配合。所述容器座110可为容器105提供支撑，并且可以在使用递送平台100的细胞处理期间保持容器105的位置。例如，容器座110可保持容器105的位置，以确保容器105的处理表面，例如过滤板1610，被充分定位以接收足够量的递送溶液。

如图1进一步所示，所述的递送平台100包括雾化器座115。所述的雾化器座115可包括与配置在所述递送平台100内的递送溶液源耦合的雾化器。所述的雾化器可雾化所述递送容易以将递送溶液提供给容器105(例如，以喷雾的形式)，从而加工或处理容器105的过滤板上配置的细胞。所述的雾化器座115可通过阀连接器120连接到所述的递送溶液源，例如clippard value连接器。配置在雾化器座115内的雾化器可配置用于在预定压力下向容器105提供递送溶液。所述递送平台100还包括样品压力连接器125和空气压力连接器130。所述的阀连接器120用于控制施加到雾化器的递送溶液。所述的样品压力连接器125对Eppendorff储液器中流体上方的气体加压，从而将样品驱动到雾化器中。所述的气体压力连接器130想雾化器供应加压气体。

所述的递送平台100还包括电源输入135。在一些实施方案中，所述的电源输入135可包括2通道直流(DC)24V电源输入135。所述的电源输入135可电耦合到开关140。所述的递送平台100还包括人机界面(HMI)电缆连接器145。HMI电缆连接器145可电耦合到HMI150。所述的HMI150可包括配置用于控制递送平台100的操作并通过本文所述的递送执行细胞处理的方法的显示器、至少一个数据处理器，以及输入装置。在一些实施方案中，HMI150可包括触摸屏界面。在一些实施方案中，HMI150可包括处理指南、实验室计时器等。HMI电缆连接器145可配置用于将HMI150耦合到与递送平台分开定位的计算设备。以这种方式，可以将数据导致到递送平台100或从递送平台100导出。

所述的递送平台100可进一步包括一个空气供应连接器155。所述的空气供应连接器155可用于经由空气供应连接器155提供空气，从而用于配置将与递送溶液一起提供给容器105的空气量。

图2A是图1所示的递送平台100的侧视图。如图2A所示，所述递送平台100可包括壳体205。所述的壳体205可包括与电源输入135、HMI电缆连接器145和空气供应连接器155相对应的多个切口。也可在壳体205内提供附加的切口而不受限制。例如，壳体205可包括多个通风孔210.所述的壳体205可固定到基板215上。所述的基板215可包括多个支脚220。在一些实施方案中，所述的支脚220可以是塑料的，并且可以包括减摩材料以将递送平台100固定到表面上。

图2B是图1所示的递送平台100的主视图。如图2B所示，递送平台100可包括HMI150，HMI150可包括显示器225。所述的显示器225可提供与递送平台100的操作的一个或多个方面相对应的数据和用户界面控件的可视化。举例来说，在一些实施方案中，显示器225可提供触摸屏控件，其配置用于执行递送到细胞的方法的一个或多个操作。在一些实施方案中，HMI150可包括计时器，所述计时器和计时器控件可通过显示器225显示。

在一些实施方式中，所述的递送平台100可包括用于抑制雾化(例如，过度喷雾)的喷雾防护装置。在一个实施例中，所述的喷雾防护装置是透明的半圆柱形装置，其内径与容器座的外轮廓相同。在一些实施方式中，所述的喷雾防护装置不是密封装置，但提供给一定程度的密封。所述的喷雾防护装置夹在所述装置的前部。图22示出了一个示例性的喷雾防护装置。

图3示出的是根据本文公开的一些实施方案，图1所示的递送平台100的另一个示例性实施例的侧视图300。如图3所示，阀门可通过管道的一个或多个部分与雾化器座115耦合。气动配件330可包括，例如，Festo 6毫米至6毫米隔板配件(目录号193951)。例如，管道305的第一部分可将阀门连接到Eppendorf基座支撑件310。所述的Eppendorf基座支撑件310可连接到递送平台100的顶盖315上。

所述的Eppendorf基座支撑件310可包括一个支架，用于将有效载荷储存器固定在空间中。示例性储存器包括1.5mLEppendorf品牌离心瓶。所述的储存器可以作为或可以不作为永久地固定到Eppendorf基座支撑件310的机构。

管道320的第二部分可将所述的Eppendorf基座支撑件310耦合到所述的雾化器座115上。递送溶液可以从递送平台100内的源通过阀门并经由管道310到达Eppendorf基座支撑件310。所述的递送溶液可通过管道320进一步提供给雾化器座115。一旦被接收在雾化器座115内，递送溶液就可以被提供给位于容器座110内的容器105。配置在雾化器座115内的雾化器可以被配置为以喷射模式325将递送溶液递送到容器105。所述的喷射模式325可以基于提供递送溶液的压力设置来配置。在一些实施方案中，喷射模式325可与雾化器座115内的雾化器的配置相关联。喷射模式325的尺寸，例如喷雾角度、覆盖区域和/或中心店，可以是雾化器座115的可配置方面。

图4A是示出图1中所示的递送平台100的基座组件400的示例性实施方案的CAD绘制的分解视图。如图4A所示，基座组件400包括基板215和支脚220。每个支脚220可通过螺钉405固定到基板215上。在一些实施方案中，螺钉405可以包括M4x10不锈钢螺钉。如图4A中进一步所示，基座组件400包括直立安装脊410。所述的直立安装脊410可以为容器座110和雾化器座115提供支撑底座和连接机构。所述的直立安装脊410可以连接到基座215和壳体205。所述的壳体205可通过一个或多个支撑件连接到基座组件400。例如，基座组件400包括第一后盖支撑件415和第二后盖支撑件420。所述的第二后盖支撑件420可通过一个或多个螺钉425连接到基板215。在一些实施方案中，所述的螺钉425可以是M4x16不锈钢螺钉。所述的壳体215可通过一个或多个螺钉430连接到第二后盖支撑件420。在一些实施方案中，螺钉430可包括M4x10超低头螺钉。所述的直立安装脊可通过一个或多个螺钉435连接到基板215。在一些实施方案中，所述的螺钉435可以包括M6x16不锈钢螺钉。

如图4A中进一步所示，基座组件400包括压力调节器440。所述的压力调节器440可通过一个或多个螺钉445固定到基板215。所述的压力调节器440可通过电路板耦合到电源输入135。压力调节器440可被配置为控制经由雾化器座115提供给容器105的递送溶液的压力的量。

所述的压力调节器440通过气动连接网络连接到流体源，如图4B所示，其包括递送平台100的一些实施方式的气动图。所述的压力调节器440具有1Mpa的最大输入压力范围和0.005至0.5Mpa的输出范围以及200LPM的最大流量。

在一些实施方案中，所述螺钉445可包括M6x10内六角圆柱头螺钉。

图5是示出图1中所示的递送平台100的脊柱组件500的示例性实施方案的CAD绘制的分解视图。如图5所示，雾化器座115可连接到直立安装脊410上。虚线框内所示的雾化器座115包括喷头基座安装平台505和夹子模块上部安装件510。多个定位销515将夹子模块上部安装件510连接到喷头基座安装平台505。在一些实施方案中，定位销515可以是4x20mm。夹子模块上部安装件510还可以通过螺钉520连接到喷头基座安装平台505。在一些实施方案中，所述螺钉可以是M6x16内六角圆柱头螺钉。夹子模块上部安装件510可通过旋钮525连接到Eppendorf基座支撑件310。在一些实施方案中，旋钮525可包括滚花拇指旋钮525。所述的旋钮525可包括螺钉，例如M4x10mm螺钉，用于将夹子模块上部安装件510连接到Eppendorf基座支撑件310。

如图5进一步示出的，所述的雾化器座115还包括夹子模块下部安装件530。所述的夹子模块下部安装件530可以通过多个磁体535连接到喷头基座安装平台505。在一些实施方案中，磁体530可以是6x6mm。所述的夹子模块下部安装件535可通过多个螺钉540进一步固定到喷头基座安装平台505。在一些实施方案中，螺钉540可包括M3x6mm平头带帽螺钉。

所述的喷头基座安装平台505可通过多个定位销545连接至直立安装脊410。在一些实施方案中，所述的定位销545可以是6x25mm。螺钉550可进一步将喷头基座安装平台505连接到直立安装脊410。在一些实施方案中，螺钉550可包括M6x20不锈钢螺钉。所述的脊柱组件500还进一步包括轴555。所述的轴555可配置用于安装电气和气动子部件基板。在一些实施方案中，轴555可包括旋转阶梯轴555。

如图5进一步所示，容器座110可通过多个衬套560连接到直立安装脊410。在一些实施方案中，衬套560可以包括凹口型衬套。所述的容器座110可配置为向下滑动到衬套560上。所述的容器座110也可以通过螺钉565连接到直立安装脊410。在一些实施方案中，所述的螺钉565可包括M6x10内六角圆柱头螺钉。

图6A是示出图1中所示的递送平台100的顶部组件600的示例性实施方案的CAD绘制的分解视图.所述的顶部组件600包括顶盖315。所述的顶盖315可通过多个螺钉615固定到支撑肋610上。在一些实施方案中，所述的螺钉615可包括M4x10超低头螺钉。所述的顶盖315还可包括用于夹子阀连接器120、样品压力连接器125和空气压力连接器130的切口。在一些实施方案中，样品压力连接器125可包括隔板管配件。在一些实施方案中，空气压力连接器130可包括推入式隔板连接器。所述顶部组件600还看看螺钉620，其被配置为将外盖的折叠部分固定到中央脊410，如图6B所示。在一些实施方案中，所述的螺钉620可包括M4x6不锈钢螺钉。

如图6A所示，直立安装脊410可通过多个螺钉625固定到支撑肋610。在一些实施方案中，螺钉625可以是M6x16不锈钢螺钉。此外，所述顶部组件600可包括一个或多个支撑件。支撑件630可以通过多个螺钉连接到支撑肋610。支撑件635可通过多个螺钉640连接到支撑肋610。在一些实施方案中，螺钉640可以是M4x16不锈钢螺钉。支撑件645也可以通过多个螺钉连接到支撑肋610。

如图6A进一步所示，HMI150可固定在球端接头组件650上。所述的球端接头组件650允许HMI150以适于递送平台100的操作者观看的方式定位。球端接头组件650可以连接到先前关于图2描述的壳体205的部分。球端接头组件650可包括球接头承窝655。所述的球接头承窝655可连接到球端接头660。在一些实施方案中，球端接头660可包括M8x40不锈钢螺钉。球端接头组件650还包括接头组件安装板665，其可连接到HMI安装板670。所述的HMI安装板670可通过多个螺钉680固定到HMI前壳体675。在一些实施方案中，螺钉680可包括M4x10按钮不锈钢螺钉。如图6A中进一步所示的，HMI安装板670可以包括多个切口685，以释放由显示器155和/或HMI 150的电路产生的热量。

图7A-7E是示出图1中的递送平台100的示例性Eppendorf基座支撑件的CAD图。图7A-7E中所示的Eppendorf基座支撑件对应于图3和图5中所示的Eppendorf基座支撑件310。图7A-7E中所示的Eppendorf基座310的尺寸是示例性的，并不旨在限制Eppendorf基座支撑件310的尺寸或构造。Eppendorf基座支撑件310包括将有效载荷储存器保持在空间中的支架。有效载荷储存器未固定到位，用户可以自由地将其从支架上拆下，而无需脱离任何夹紧机构。

图7A示出了Eppendorf基座310的第一端的水平截面图。如图7A所示，Eppendorf基座310包括多个孔705和槽710。所述的孔705是用于采用加紧机构的特征。所述的槽710便于将Clippard夹管阀固定到作为组件115的一部分的支架510上的螺钉，并且允许夹管阀和雾化器之间的距离的变化。

如图7A进一步所示，所述Eppendorf基座310包括孔715，其配置用于接收关于图5所示和描述的旋钮525的螺纹部分。

图7B示出了Eppendorf基座310的俯视图。所述的Eppendorf基座310包括安装表面720和从安装表面720延伸的法兰部分725。安装表面720可以包括多个孔705，所述的多个孔配置成将Eppendorf基座310安装到顶盖315。所述的安装表面720包括开口730，所述的开口730在其最靠近法兰725的位置处配置有凹口735。所述的开口730可以包括围绕开口730的一部分周向延伸的凹槽部分740。有效载荷储存器位于开口730中。所述的凹口735是Elveflow子部件(未示出)的定位特征，其便于有效载荷储存器的密封和流体从储存器到雾化器的传输。

图7C示出了安装表面720的侧视图。所述凹槽部分740可以形成在安装表面720的上表面中，并且圆形开口730可延伸穿过所述的安装表面720。

图7D显示Eppendorf基座310的侧视图。所述的Eppendorf基座310可以包括垂直于法兰725布置的安装表面720。

图7E示出了图7B中所示的细节区域“C”的俯视图。如图7E所示，细节区域“C”示出了围绕圆形开口730布置的多个孔705。尽管孔705围绕圆形开口730布置成正方形，但是孔705可以围绕圆形开口730无限制的布置成任何多种构造。所述凹口735可配置为延伸穿过所述安装表面720。

图7F是示出Eppendorf基座310的立体图。

图8A-8E是示出图1的递送平台100的夹子模块上部安装件510的实施例的CAD图。图8A-8E中所示的夹子模块上部安装件510对应于图5中所示出的夹子模块上部安装件510。图8A-8E中所示的夹子模块上部安装件510的尺寸是示例性的，并不旨在限制夹子模块上部安装件510的尺寸或构造。

如图8A所示，夹子模块上部安装件510可包括槽805。所述的槽805可便于Clippard夹管阀相对于雾化器的安装位置，即夹管阀和雾化器之间的管长度更短或更长。

所述的夹子模块上部安装件510也可包括槽810，其可在任一端封闭。如图5所示，所述的旋钮525可配置为延伸穿过所述槽810，以使夹子模块上部安装件510与Eppendorf基座310连接。

图8B示出了夹子模块上部安装件510的侧视图。所述的夹子模块上部安装件510可包括配置在其中的一个或多个凹进表面。图8C是夹子模块上部安装件510的安装表面815的端视图。安装表面815可以经由一个或多个定位销515连接到喷头基座安装平台505，如图5所示。所述的定位销515可以在孔820内接收，如图8B所示。孔825可以是配置为接收图5中所示的螺钉520的螺纹孔。

图8D是示出所述夹子模块上部安装件510的槽805和810以及配置在夹子模块上部安装件510上的凹进表面的垂直截面图。

图8E是示出夹子模块上部安装件510的立体图的图。

图9A-9G是示出图1中的递送平台100的夹子模块下部安装件530的CAD图。图9A-9G中所示的夹子模块下部安装件530的尺寸是示例性的，并不旨在限制夹子模块下部安装件530的尺寸或构造。

如图9A所示，其示出了夹子模块下部安装件530的下部表面905。所述的下部表面905可包括多个孔910。所述的孔910配置用于接收图5中示出的磁体535。所述的夹子模块下部安装件530可经由定位在孔910内的磁体535连接到喷头基座安装平台505上。如图9A所示，多个孔910可以围绕形成在下部表面905的圆形凹部915布置。尽管孔910围绕圆形凹部915布置成正方形，但是孔910可以围绕圆形凹部915布置成任何构造而不受限制。槽902可延伸穿过夹子模块下部安装件530。所述槽920便于雾化器后端突出通过其夹紧安装件，如图9H所示。

图9B示出了从图9A中所示的线A-A的角度看的夹子模块下部安装件530的截面图。图9C示出了从图9A中所示的线B-B的角度看的夹子模块下部安装件530的截面图。图9C示出了夹子模块下部安装件530的侧视图，示出了下部表面905和上部表面925。所述上部表面925可包括倾斜边缘930。

图9E示出了夹子模块下部安装件530的俯视图。槽920的尺寸可配置为延伸穿过所述夹子模块下部安装件530的大约一半。倾斜边缘930可完全围绕上部表面925的圆周延伸。图9F是示出夹子模块下部安装件530的上部表面925的立体图。图9G是示出夹子模块下部安装件530的下部表面905的立体图。

图10A-10C示出了用于喷涂过程的雾化器1100的示例性实施方案。参见图10A-10C，所述的雾化器1100包括位于其下部表面的液体孔口1101和气体孔口1102(参见图10A)。在所述雾化器1100的上部表面，可以形成液体管道入口1103和气体管道入口1104(参见图10B)。因此，如图10C所示，所述的液体孔口1101通过所述液体管道入口1103连接到液体存储器，而所述气体孔口1102通过所述气体管道入口1104连接到其他存储器。所述的气体存储器可以是气缸或气泵，并且可设置有阀门。

在一些实施方式中，可以利用LB-100喷雾器。在一些实施方式中，使用的喷雾器的值涉及的是约10-300μl之间的体积的细胞递送溶液的雾化。示例性喷雾器在美国专利No.5,411,208或美国专利No.6,634,572中描述，其全部内容通过引用并入本文。其他的喷雾器也是可以商购的，例如来自DuraMist^TM喷雾器(Sigma-Aldrich GXARG1DM04-1EA)的喷雾器，OneNeb，系列2惰性同心型喷雾器，或与IPS-OES(Agilent Technologies G8010-60293)一起使用。在一些实施方案中，所述的喷雾器可以为超声喷雾器或振动网喷雾器。输入和输出管可以焊接或HospiraSpinning可使用尖顶封闭式连接器。图10D-G示出了另一个示例性雾化器。其他雾化器设计和形状也是可能的。

在一些实施方式中，可能包括雾化器适配器，其可以调整所述雾化器的方向。例如，一些雾化器可以偏离其主轴1-5度的方向上喷射。可以包括一个适配器，其以调整方向的方式保持所述雾化器，例如，使所述雾化器沿垂直于容器105过滤板1610的面的方向引导雾化的溶液。

图11A-11E是示出图1所示的递送平台100的示例性喷头基座安装平台505的CAD图。图11A-11E所示的喷头基座安装平台505与图5所示的喷头基座安装平台505对应。图11A-11E所示的喷头基座安装平台505的尺寸是示例性的，并非旨在限制所述喷头基座安装平台505的尺寸和构造。

图11A是所述喷头基座安装平台505的上部表面1105的俯视图。如图11A所示，所述喷头基座安装平台505包括相对于圆形开口1115和凹进表面1120配置的多个孔1110。如图11A所示，所述的多个孔1110可围绕所述圆形开口1115和凹进表面1120布置。尽管所述的孔1110围绕圆形开口1115和凹进表面1120以方形形状布置，但孔1110也可不受限制地以任何多种构造布置在圆形开口1115和/或凹进表面1120周围。如图5所示，所述的孔1110可接收螺钉540，用于将夹子模块下部安装件530连接到喷头基座安装平台505。

图11B示出了从图11A所示的线A-A的角度看喷头基座安装平台505的水平截面图。如图11B所示，所述的圆形开口1115可包括在其下部表面1125处的法兰部分。所述的喷头基座安装平台505也包括穿过其中的孔1130。所述的孔1130可配置用于接收螺钉520，如图5所示，以协助将夹子模块上部安装件510固定到喷头基座安装平台505。

图11C示出了所述喷头基座平台505的端视图。如图11C所示，可提供孔1135用于接收图5所示的定位销545。孔1140可配置用于接收螺钉550，从而将喷头基座安装平台505连接到直立安装脊410上。

图11D示出的是图11A所示的线B-B的角度看喷头基座安装平台505的截面图。所述的孔1105可包括用于接收所述螺钉540的反向沉头部分。

图11E是所述喷头基座安装平台505的立体示意图。如图11E所示，可在围绕所述凹进表面1120的壁上形成多个凹口1145。所述的凹口1145是固定多个测试雾化器的径向定向的特征。孔1150配置用于接收定位销515，从而将喷头基座安装平台505连接到所述的直立安装脊410，如图5所示。

图12A-12D是示出图1中的递送平台100的示例性实施方案的示例性容器座1205的CAD图。所述图12A-12D中示出的所述容器座1205的尺寸是示例性的，而非旨在限制所述容器座1205的尺寸和构造。

图13A-13C是示出图1中的递送平台100的示例性实施方案的示例性容器座1305的CAD图。所述图13A-13C中示出的所述容器座1305的尺寸是示例性的，而非旨在限制所述容器座1305的尺寸和构造。

图13A示出了所述容器座1305的俯视图。所述的容器座1305包括圆形的容器接收区域1310。所述的容器接收区域1310可接收容器105。所述的容器座1305可包括多个孔1315，其配置用于与图5所示的衬套560连接。所述的容器座1305也包括孔1320，其配置用于接收图5所示的螺钉565。所述的容器座1305可通过所述衬套560和螺钉565固定到所述的直立安装脊410。

图13B示出了从图13A中所示的线A-A的角度看容器座110的下部部分1305的截面侧视图。

图13C示出的是包括圆形的容器接收区域1310的容器座1305的立体示意图。在一些实施方案中，所述的容器座1305可包括传感器1325。所述的传感器1325可包括照相机、射频(RF)、识别(ID)扫描仪或IR传感器。所述的传感器1325可配置用于确定事件，例如递送溶液从容器105的充分排出。以这种方式，可以使用递送平台100来实现与细胞内递送相关联的事件驱动的工作流程。在一些实施方式中，所述传感器可包括在容器105，例如在上部部分1605、过滤板1610和/或下部部分1615中。以这种实施方式，可在所述容器105中包括电连接，并且所述容器座110用于连接到所述传感器，例如，用以提供电力和/或进行传感器测量。

在一些实施方案中，所述的容器座110、1205、1305可被配置为振动以帮助细胞沉降到所述容器的单层中或帮助从容器内回收细胞。振动功能可以通过添加到所述容器上或容器内的振动元件直接添加到所述的容器座110。振动元件的实施例包括偏心电机或线性共振位移(LRD)装置。关于所述容器座(连接到所述装置)的机械共振特性，可以在处理步骤期间添加振动扰动。频率在50Hz到2500Hz范围内的振动扰动和2mm的物理偏移(例如，振幅)可提供适当的混合或搅拌。所述的容器座110可与橡胶或弹性体安装件机械连接以促进搅拌。可使用LRD设备通过X、Y或Z平面上的信号发生器独立施加搅拌。

图14A-14F是示出图1所示的递送平台100的示例性容器座盖1405的CAD图。图14A-14F所示的容器座盖1405的尺寸是示例性的，而非旨在限制所述容器座盖1405的尺寸或构造。所述示例性容器座盖1405配置用于通过槽元件1415插入容器座1205内的配合孔来与容器座1205接合。

图14A示出了所述容器座盖1405的俯视图。所述容器座盖1405包括半圆形切口1410，容器105可在其中被接收定位在所述的容器座110内。

图14B示出了所述容器座盖1405的侧视图。所述的容器座盖1405可包括多个延伸部1415，其从所述容器座盖1405的底部突出。

图14C示出了从图14A所示的线B-B方向看所述容器座盖1405的水平横截面图。所述延伸部1415可包括螺纹M4，用于将容器座盖1405刚性固定到容器座1205。这可以通过将容器座1205下侧的2个螺钉与容器座1205上的埋头孔配合来实现。

图14D示出了从图14A中示出的线A-A方向看所述容器盖1405的垂直横截面图。

图14E示出了所述容器盖1405的顶部表面的立体示意图。图14F示出了所述容器盖1405的底部表面的立体示意图。如图14F所示，所述容器盖1405的底部表面包括从其底部表面突出的延伸部1415。所述容器盖1405的底部表面也包括围绕半圆形切口1410周向延伸并远离容器盖1405的底部表面的法兰1420，从而覆盖容器105的边缘防止容器105从所述容器座1205的升起脱出。

图15是用于图1所示的递送平台100的容器组件1500的示例性实施方案的图像。所述容器组件1500可包括多个可配合部件，其可在使用递送平台100执行向细胞的递送时被连接和断开。在一些实施方案中，所述容器组件1500的部分可配置用于与所述递送平台100一起使用。在一些实施方案中，所述容器组件1500的部分可配置用于与所述递送平台100一起重复使用。

在一些实施方式中，容器105可临时堆叠在与设备相邻或链接到设备的框架上。所述框架可组织和保持少量的容器，例如6个或12个容器105，其准备手动或自动插入到机器中。保留在框架中的容器105可以在保留在框架内的同时进行预处理或预装载细胞。所述容器105可在实验之前和之后或设备使用之前和之后在框架中停留有限的时间。在一些实施方式中，当实验运行正在进行时，操作员可以手动将所述容器从框架上转移到容器座内，转染部件中的细胞并将它们移动到第二框架以保留转染后的容器。此过程也可以自动启用。所述框架可能是开放式结构从而有助于清洁。所述框架可以是手动的，例如图21A中所示的框架2105，或者所述框架可配置用于与栈板机一起使用，例如，如图21B中示出的框架2110。市售的栈板机可从美国新泽西州斯普林菲德尔镇的Hudson Robotics,Inc获得。在一些实施方案中，所述框架可包括传感器和/或用于与容器通信的通信装置。所述框架可包括位置传感器和/或计时器。

图16A-16C是示出图15所示的容器组件1500的各部件的示例性实施方案的图像。图16A示出了所述容器组件1500的保持环1605。图16B示出了所述容器组件1500的过滤器板1610。图16C示出了所述容器组件1500的过滤器板连接件1615。在所述递送平台100内使用期间，容器105可配置用于包括保持环1605和过滤器板1610。在一些应用方面，例如排出所述递送溶液等期间，所述的过滤器板连接件1615可通过所述的过滤器板1610连接到容器105以提供来自容器105的排出路径。

如图16A所示，所述的保持环1605是一个环形部件，其配置用于保持容器105内合适的流体水平。在一些实施方式中，例如在容器配置为旨在一次性使用的一次性容器的情况下，保持环1605可以预先形成并与容器的其余部分集成在一起。所述的保持环1605的材料可以与容器基座的其他方面的材料类似。

如图16B所示，所述的过滤器板1610可包括多个孔以允许流体从其中排出。在一些实施方案中，所述的过滤器板1610可接收过滤器，在所述过滤器上课提供细胞以用于递送有效负载。所述的多个孔可以适合提供足够的细胞奥利和溶液排出的多种非限制性图案形成。例如，孔可以围绕过滤器板的外径和/或沿着过滤器板的多个径向方向对齐。在一些实施方案中，所述的过滤器板1610可包括形成于过滤器板1610的表面中的凹槽以帮助保留细胞和排出溶液。在一些实施方案中，所述的凹槽可形成同心图案。

在一些实施方案中，经由下部部分1615向容器105施加负压，这可以导致细胞悬浮培养基和/或递送溶液通过孔并通过下部部分1615排出，同时细胞被收集在过滤器表面上。

在一些实施方案中，所述的容器105可包括一个或多个传感器，其配置用于测量所述容器105内提供的细胞或流体的温度或pH。可以引入比色传感器用来读取实验中使用的介质颜色、染料或指示剂。特殊的校准盒可含有力传感器来测量雾化试剂落在盒上的细胞表面上的力。附加校准盒可能具有试纸(例如石蕊试纸)或TeeJay试纸来评估雾化喷雾。传感器可位于例如，上部1605、过滤器板1610和/或下部1615上或内部。在一些实施方案中，所述容器105可包括存储器和/或通信模块，例如近场通信模块，其能够传输与容器105的处理相关的实验数据。

在一些实施方式中，所述容器可包括微处理器或控制器来测量容器在设备内的时间。所述的微控制器可存储容器的序列号并记住放置所述容器的设备的序列号。在存在多于一个设备、多个设备的情况下，其中所述容器从一个设备移动到另一个设备以经历顺序传输动作，微处理器可以存储从设备传送到容器的序列号、时序和其他信息。无论使用一个或多个设备，其都可以将给定实验的工艺参数和环境条件、时间/日期等传输到容器。存储在永久存储器(例如，EEPROM)中的信息可由另一个设备或容器读取器读回。

如图16C所示，过滤器板连接件1615可以包括围绕过滤器板连接件1615的圆周配置的抓握表面。过滤器板连接件1615还可以包括凸缘部分以与过滤器板1610的底部表面连接。另外，过滤器板连接件1615可以包括孔1620，用于使流体通过孔1620从容器105排出。

图16D示出了另一个示例性容器实施方式，其中上部1605、过滤器板1610是一体的。管1625附接到过滤器板连接件1615的下侧上的开口特征，例如图16C中所示的孔1620。

图17是示出图1的递送平台100的容器座的容器组件的示例性实施方案的CAD图的立体示意图。

图18是图17所示的示例性实施方案的横截面图。

图19A-19C是示出图15中所示的容器组件1500的过滤器板连接件的示例性实施例的CAD图。图19A-19C示出的过滤器板连接件1615的尺寸是示例性的，并不旨在限制过滤器板连接件1615的尺寸或构造。

图20是示出使用图1的递送平台100将有效载荷递送到细胞的过程的示例性实施方案的流程图。

在操作中，可以将靶细胞以特定浓度混合在培养基中。例如，可以将大约6000万个细胞混合在约60mL培养基中。制备的含有细胞的培养基可以经由一次性管组和/或无菌针/套管引入容器105中。装载过程可以手动进行，或者可以使用泵(例如蠕动泵或容积泵)和控制器自动执行，如上文所述。类似地，阀的操作可以手动执行，或者可以使用例如电磁阀和控制器自动执行。在阀门关闭之后，在一些实施方式中，培养基由于重力而移动通过容器105的过滤器。在一些实施方式中，真空压力通过下部的端口供应到容器15的下部部分1615上。因此，介质通过过滤器移位，从而将靶细胞(例如，T细胞)沉积在过滤器表面上。例如，可以使用烧杯或其他容器来手机容器座110下方的培养基。在一些实施方式中，在介质的排放期间，正压力和真空压力可以交替地供应到容器的下部部分，以调节/重新布置过滤器上的细胞沉积。

随后，通过雾化器喷射包含有效载荷(例如货物)的递送溶液。所述控制器可以控制喷射的量和持续时间。例如，递送溶液可喷洒约300ms。为了喷射递送溶液，可以通过微量瓶价格货物引入喷头或通过可重新密封的注射口注入。

喷射递送溶液后，可以通过一次性管组和/或无菌塑料针/套管引入终止溶液。所述的终止溶液可以手动供应，或者可以使用泵和控制器自动供应。将所需量的终止溶液引入腔室中。例如，可以在大约20秒内引入大约10mL的终止溶液。在一些实施方式中，不向细胞中引入终止溶液。

在引入终止溶液之后，所述细胞被再悬浮。对于此种再悬浮，可以通过注射器或泵引入约60mL培养基，其可以是用过的、新的培养基或先前从腔室中排出的培养基。再悬浮步骤的持续时间可以是大约1分钟。为了改进再悬浮，可以在再悬浮过程中或再悬浮过程之后使用各种方法，例如平台的倾斜、搅拌(例如平台的振动)等。

将细胞再悬浮于培养基中后，收集工程化细胞用于进一步处理。可以在该过程之后冲洗或洗涤所述容器以用于后续程序。可替换地或附加地，整个容器或容器的一部分可以制成一次性单元，其可在使用后被丢弃并用新的替换。图20示出了示例性过程2000。然而，过程2000不限于图20所示的操作，并且工艺参数，例如培养基的量(体积)、细胞的数量、浓度、每个步骤的持续时间，可以根据应用而变化。

参照图20，在2005，可以将无菌容器装载到平台上。在2010，可以用基础介质灌注容器，并允许利用重力排出所述容器。在2015，可以吸干容器基部以去除残留的培养基。在2020处，可以将细胞装载到所述容器上。在2025，可以通过重力过滤形成细胞单层。在2030，可以吸干容器基部以去除残留的培养基。在2035，所述容器可以重新装载到平台上。在2040，可以通过平台用递送溶液喷射细胞。在2045处，可以连接容器组件的下部部分。在2050，可以将终止溶液添加到所述容器中。在2055，可以经由下部施加恢复介质。在2060，可以将细胞从所述容器中移除。

实施例1部分中描述的示例性实施方案可以在单次转染中转染约50万至1500万个细胞。所述平台可以允许将货物(如mRNA等)一致地递送到T细胞。所述系统可以封闭在生物安全柜内，用于无菌操作。所述系统的操作可以手动地或自动地执行。对于自动化操作，可以通过控制器和控制软件自动控制流体处理系统。所述平台可以被配置为多用途系统，其可以在清洁和洗涤后重复使用。在一些实施方式中，所述平台可以被配置为单次使用的一次性系统，其包括一次性部件，例如一次性容器。

实施例2

图23示出了根据本文公开的一些实施方案的递送平台2300的另一个示例性实施方案的图像。在一些实施方案中，递送平台2300可以作为封闭系统操作，其中细胞处理实验和生产可以在无菌、密封的环境中进行，降低污染风险。在一些实施方案中，递送平台2300可以被配置为执行过程2000的一些或全部步骤，用于递送到细胞，如关于图20所示和描述的。在这样的实施方案中，容器105可以被认为等同于配置在腔室组件2325内的过滤器2715。

如图23所示，在一些实施方式中，递送平台2300可以包括安装到基座的仪器壳体。所述基座可以使递送平台2300能够定位或安装在工作台上、通风罩工作空间内、桌面、工作台等。在一些实施方案中，递送平台2300可以安装在移动基座上，所述移动基座被配置为将递送平台2300从一个位置运输到另一个位置。递送平台2300的一些配置，例如移动配置，可以被定位在患者附近，例如，以更容易地直接从患者接收细胞体积和/或在不需要可能引入污染的多个处理步骤的情况下提供已经直接向患者递送有效载荷的细胞。

如图23所示，递送平台2300可以包括提供人机界面(HMI)2310的显示器2305。HMI2310可以被配置为接收与递送平台2300的操作相关联的用户输入，并且提供与递送平台2300的操作相关的输出。在一些实施方案中，HMI 2310可以配置有一个或多个工作流，所述工作流可以基于用户与HMI 2310的交互来启动、执行和/或停止。基于与特定细胞类型、特定试剂培养基和/或实验应用或目标相关联的更广泛的用户定义的工作流程，可以以各种非限制性序列执行单独的处理工作流程。HMI 2310可以电耦合到配置在递送平台2300内的一个或多个控制器。递送平台2300还可以包括一个或多个灯或视觉指示器2315，以指示与递送平台2300的操作相关联的一个或更多个状态。如图23所示，灯2315可以包括多个灯，这些灯可以关于与递送平台2300的操作相关联的一个或多个步骤或过程单独地操作。在一些实施方案中，HMI 2310可以显示与递送平台2300的操作相关联的一个或多个错误或操作代码，并且灯2315可以向用户提供与代码相对应的视觉指示。

如图23中进一步所示，递送平台2300可以包括停止按钮2320。在操作递送平台2300时发生用户错误或操作错误的情况下，停止按钮2320可以停止递送平台2300的操作。

如图23中进一步所示，递送平台2300可以包括安装在框架2330内的腔室组件2325。有利地，腔室组件2325可以使实验能够在各种实验过程中进行，而没有可能通过可重复使用的组件发生污染的风险。例如，实验过程可以包括细胞洗涤过程、细胞浓度改变过程和细胞培养改变过程。因此，与利用可重复使用组件的系统相比，对于不同的细胞处理过程，可以提高实验结果的准确性。腔室组件2325可以被提供用于密封的、无菌的包装中。腔室组件2325可以包括过滤器，在过滤器上可以提供用于递送有效载荷并在递送之后收集的细胞。在一些实施方案中，过滤器可以是气体可渗透和液体可渗透的过滤器。在一些实施方案中，新鲜试剂介质可以从过滤器下方引入，例如在洗涤工作流程期间。腔室组件2325可以配置在框架2330内。在一些实施方案中，框架2330可以是半圆形框架或“C”形框架。框架2330可以安装到从递送平台2300延伸的轴上。在图23中以水平方向示出的框架2330可以被配置为通过轴的旋转而在向上或向下的垂直方向上倾斜。例如，在一些实施方案中，框架2330可以被配置为从图23所示的水平方向倾斜0-10度、5-15度、10-20度、15-25度、20-30度或25-45度。在一些实施方案中，轴可以被配置为以相对于框架2330的角度倾斜量的振荡方式倾斜框架2330。例如，框架2330可以倾斜到+30度，并且框架2330然后可以相对于+30度取向在正角度取向(例如+1度)和负角度取向(如-1度)之间振荡，导致框架2330在+31度和+29度之间振荡。框架2330可以以预定或用户定义的频率在两个角度取向之间振荡。在一些实施方案中，框架2330可以以0.5kHz、1kHz、1.5kHz、2kHz、2.5kHz或更高的频率振荡。在一些实施方案中，轴和/或框架2330可以连接到伺服马达，该伺服马达被配置为振动轴和/或者框架2330。

与基于抽吸的收集方法相比，振荡和/或振动框架2330可以有利地增加在递送有效载荷之后收集的细胞的量。基于抽吸的收集方法需要在腔室组件2325内重复施加和提取收集介质。此外，振荡和/或振动框架2330也可以有利地增加所收集的细胞的活力，当使用基于抽吸的收集方法收集细胞时，由于暴露于重复的流体压力和流动动力学，活力可能降低。

如图23中进一步所示，递送平台2300可以包括废物收集盘2335，在该废物收集盘处可以收集从腔室组件2325排出的试剂和/或介质。在一些实施方案中，废物收集托盘2335可以从递送平台2300移除。如图23中进一步所示，递送平台2300还可以包括细胞收集托盘2340，在所述托盘处可以收集已经经历了有效载荷递送的细胞。在一些实施方案中，细胞收集托盘2340可以从递送平台2300移除。在一些实施方案中，细胞收集托盘2340可以包括冷却元件和/或加热元件，以将细胞维持在期望的温度。在一些实施方案中，与细胞收集托盘2340相关联的加热和/或冷却元件可以被配置在递送平台2300的基座内。在一些实施方案中，底座可以包括位于废物收集托盘2335和/或细胞收集托盘2340下面的秤。以这种方式，递送平台2300可以确定所收集的介质材料和所收集的细胞的重量。在一些实施方案中，收集托盘2340可以包括铰接支架，在该铰接支架中培养基材料或收集的细胞可以保持和保持运动以提高细胞活力。

如图23中进一步所示，递送平台2300可以包括一个或多个介质材料2345。介质材料2345可以经由一个或多个流体回路流体耦合到腔室2330。递送平台2300还可以包括一个或多个阀2350，其被配置为控制经由一个或多个流体回路提供的介质的量。在一些实施方案中，一个或多个阀2350可以包括夹管阀。递送平台可以包括一个或多个流体检测传感器2355，所述传感器2355被配置成相对于对应的流体回路串联。流体检测传感器2355可以被配置为辅助递送平台2300的充注以及校准。此外，流体检测传感器2355可以被配置为测量系统，以计算两个位置之间的流体回路内的介质体积。如图23中进一步所示，递送平台2300可以包括一个或多个泵2360以将细胞培养基泵送到腔室组件2325中。通过以循环方式将细胞培养基泵入和泵出腔室组件2325，当框架2330振动和/或倾斜时，与非倾斜、非振动的细胞收集操作相比，可以增加细胞收集。在一些实施方案中，泵2360可以包括蠕动泵。其他示例性泵的类型可以包括注射器泵、无柱塞注射器泵、封闭式注射器类型、袋挤压器泵等。递送平台2300还可以包括超声流速检测器2365。

如图23中进一步所示，递送平台2300可以包括注射器2370。在一些实施方案中，注射器2370可以包括无柱塞注射器。可以将空气施加到注射器2370以将介质2345提供到腔室组件2325。递送平台2300还可以包括配置在注射器2370的支架内或递送平台2300本身内的光学传感器2375。光学传感器2375可以检测注射器2370内的流体水平或者注射器2370的柱塞或塞子的位置。光学传感器2375可以包括以垂直阵列线性布置的光学传感器阵列，例如红外检测器。光学传感器2375可以在校准操作中与泵2360结合使用。在一些实施方案中，注射器2370可以连接到位于注射器2370的出口处的止回阀。光学传感器2375可以连接到阀2380以控制提供给腔室组件2325的介质的量。

图24示出了图23中所示的递送平台2300的视图。如图24所示，递送平台2300可以包括阀保持器2405，其被配置成保持阀2410。阀保持器2405可以被配置成将阀2410保持在相对于腔室组件2325的取向成一定角度。

图25示出了图23所示递送平台的第二视图。如图25所示，递送平台2300可以包括一个或多个电连接器2505。在一些实施方案中，电连接器2505可以是将外部仪器设备连接到递送平台2300的仪器连接器。外部仪器可以包括，例如，电温度计、比重计、气压计、光电体积描记传感器、测压元件、生物化学传感器(例如，醇传感器)、光学传感器、测量振动的换能器(例如，振动膜微电子机器(MEM))等。

递送平台2300还可以包括一个或多个气体连接器2510。气体连接器2510可以接收气体供应，并且在期望的压力条件下经由将腔室组件2325与气体供应耦合的气体回路将气体供应提供给腔室组件2325。在一些实施方案中，气体连接器2510可以接收来自腔室组件2325的气体，例如当对腔室组件2325进行吹扫或排气时。在一些实施方式中，气体连接器2510可以经由软件独立地控制，并且每个气体连接器2510可以被配置为提供静态或动态压力头(例如，压力设定点)。在一些实施方式中，气体连接器2510可以用不同的气体(例如，医用气体、氮气等)操作，可以是软件可配置的，可以在指定压力下向容器中提供连续的气流，等等。压力可以由流量控制调节器、压力调节器、流量转换器、压力转换器等提供。可以向其他部件提供压力，例如雾化器、喷头、Eppendorf针等，以驱动无柱塞注射器中的塞子等。每个气体连接器2510可以是独立软件可配置的，而不是歧管的一部分。

阀2350可以连接到与气体连接器2510中的一个相关联的气体回路(如图24所示)，并且可以控制供应到腔室组件2325的气体量。递送平台2300可以包括软管夹2515，以固定被配置为与腔室组件2325一起使用的软管的一部分。递送平台2300还可以包括一个或多个吊架2520以保持介质2345。在一些实施方案中，吊架2520可以配置有秤以确定介质2345的重量。

如图25所示，递送平台2300可以包括条形码读取器2525。条形码读取器2525可以被配置为扫描条形码介质、与递送平台2300的操作者相关联的徽章和/或包含腔室组件2325的条形码包装。在一些实施方案中，条形码读取器2525可以包括线性条形码读取器或2-D条形码读取器。在一些实施方案中，条形码读取器2525可以是手持式条形码读取器。在一些实施方案中，HMI 2310可以通信地耦合到条形码读取器2525。另外，递送平台2300可以包括管焊接器2530，其被配置为将焊接固定或施加到递送平台2300的管上，例如与连接到介质2345的一个或多个流体回路联合使用的管。在一些实施方案中，HMI 2310可以通信地耦合到管焊接器2530。

图26示出了图23中所示的递送平台的一部分的特写视图。如图26所示，腔室组件2325和框架2330相对于图23所示的水平方向以大约+30度的角度方向倾斜。在该位置，框架2330可以从+30度角方向以正和负角运动振荡，以帮助经由配置在腔室组件2325的底部中的排水管2605收集细胞。在一些实施方案中，腔室组件2325可以至少部分地被封闭在绝缘或导电护套中，以向腔室组件2325提供加热或冷却。

图27示出了图23所示递送平台的腔室组件2325的示例性实施方案的图像。在一些实施方案中，腔室组件2325的一个或多个内表面或区域可以被涂覆或图案化，以帮助细胞迁移和/或粘附。例如，腔室组件2325可以包括形成在腔室组件2325内的一个或多个表面或区域上的一个或者多个三维结构。附加的示例性三维结构包括在相邻肋之间形成凹槽的周向肋、螺旋、径向肋、凸起、凹坑、填充图案等。在一些实施方式中，周向肋可以具有在每侧上具有约500微米的三角形轮廓的肋，凹槽之间的间隔为2mm。

在一些实施方式中，图案可以在过滤过程中控制培养基中细胞的流动。这种图案可以引导流动朝向或远离过滤器表面上的区域，以抵消往往导致过滤器在中心膨胀的流体力，并使沉积在过滤器表面上细胞的浓度均匀。

多种非限制性涂层材料可以应用于腔室组件2325的内表面。以这种方式，腔室组件2325可以提供用于细胞粘附的表面，这可以帮助递送、渗透和/或细胞收集。在一些实施方式中，内部腔室表面可以是疏水的(例如，为了可视化的清晰度，由聚碳酸酯制成)，并且是过滤器亲水性的。在一些实施方案中，腔室组件2325可以包括一个或多个可移除和可替换部分，这些部分可以在使用中或不使用时更换。例如，用作掩模的可移除部分可以被交换到腔室中，以便暴露过滤膜的较小部分。这样做的好处包括能够转染少量细胞，例如，少于10^6、少于2x10^6、少于5x10^6和/或少于10^7个。受益的细胞类型包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、人类干细胞(HSC)和诱导多能干细胞(IPS)。

如图27所示，腔室组件2325可以包括上部2705和下部2710。上部2705可以从下部2710移除。下部2710可以包括过滤器2715，细胞可以沉积在过滤器2715上、渗透并从过滤器2715收集。在一些实施方案中，过滤器2715可以被涂覆和/或包括适于帮助细胞粘附到过滤器2715的图案化材料。例如，涂层材料可能有利于减少悬浮细胞的粘附性，增加细胞在过滤器表面上的迁移率。这有利于提高细胞的活力(和产量)，转染后更容易从过滤器表面回收细胞。更大的润湿能力也将货物和溶液散布在表面上，从而接触更多的细胞并增加转染。涂层材料的实施例包括沉积在材料上作为润湿剂的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。这种试剂允许(更容易允许)细胞在腔室内的培养基中润湿和铺展。通过用Au(金)溅射、氧等离子体处理、减少表面电荷或其他策略使过滤器表面更亲水，可以获得类似的结果。类似地，对于粘附细胞如MSC、IPS、A549、HEK293和巨噬细胞，具有亲水性的过滤器表面可能是有益的。

根据细胞类型和/或实验或治疗应用，可以在室组件2325内使用各种非限制性过滤器2715。上部2705可以包括气体端口2720，该气体端口被配置为经由气体连接器2510接收气体。上部2705还可以包括空气扩散器开口2725，该空气扩散器开口2725配置用于接收连接到气体连接器2510的空气扩散器。空气扩散器可配置为改变腔室组件2325内的静态空气条件，并对腔室组件2325加压以用作封闭系统。空气扩散器可在各种温度和压力条件下将气体或气体组合供应到腔室组件2325。例如，空气扩散器可以提供包括特定浓度的CO₂气体的气体。如图27中进一步所示，上部2705可以包括喷头开口2730，该喷头开口被配置为在其中接收喷头。

腔室组件2325可以被配置成各种非限制性的尺寸和体积。在一些实施方案中，腔室组件2325可以具有大约1L的体积。在一些实施方案中，下部2710可以具有大约300-500ml的体积。

图28示出了图23中所示的一次性组件的喷头的示例性实施方案的图像。如图28所示，喷头2805可以包括气体入口端口2810和流体入口端口2815。气体入口端口2810可以连接到气体连接器2510中的任何一个，以在腔室组件2325内供应加压气体。流体入口端口2815可以连接到包括有效载荷的等渗水溶液源。加压喷雾可在喷头2805内形成，并通过出口2820递送到腔室组件2325中。

由于过程自动化，细胞工程平台可以更一致地执行细胞处理和操作过程，例如转染，并且可以更容易地进行货物递送。因此，细胞工程平台可以提供可靠的无载体递送方法，以降低细胞工程技术的成本和复杂性。

尽管上面已经详细描述了一些变化，但是其他修改或添加也是可能的。例如，设计变化可以包括其他几何形状的腔室组件2325或过滤器2715，例如矩形、正方形或椭圆形。此外，具有不同形貌的腔室组件2325或过滤器2715可以包括具有微观或宏观特征的凸面、凹面和纹理表面。此外，还设想了包括圆形目标和环形目标两者的目标配置。在实施方案中，所述修改或添加可以优化在喷涂目标下的细胞沉积。尽管本文使用术语腔室组件2325或一次性组件，但在一些实施方式中，腔室组件2325可以是可重复使用的(例如，可以多次使用，例如，用于处理多个细胞群)。

本文所描述的主题提供了许多技术优势。例如，本文所述的腔室组件避免了对系统进行灭菌的需要，并大大降低了患者样本之间交叉污染的风险，并实现了更简单的验证过程。另一个优点是本文所述的腔室组件能够通过单个喷头通过共同递送来递送多个货物。此外，本文描述的主题是快速和简单的，温和的细胞处理保持细胞健康并能够对初代细胞群进行工程改造。

实施例3

在一些实施方式中，除了有效载荷的递送(例如转染)之外，递送平台2300还可用于细胞处理功能。例如，递送平台2300可用于使用腔室组件2325实现多种上游和/或下游细胞处理工作流程。如本文所使用的，上游细胞处理包括在使用上述过程递送有效载荷之前执行的过程(例如，使细胞群与包括有效载荷的溶液接触(例如，通过喷雾))，并且下游细胞处理包括在使用上述过程递送有效载荷之后执行的过程(例如，使细胞群与包括有效载荷的溶液接触(例如，通过喷雾))。作为实施例，在进行上述递送过程(例如，使细胞群体与包括有效载荷的溶液接触(例如，通过喷雾))之后，腔室组件2325可以用作细胞群的细胞培养(例如，孵育)的生物反应器。通过利用腔室组件2325进行额外的细胞处理步骤，可以提高细胞活力。

为了将递送平台2300用作培养箱，递送平台2300可以提供环境控制，以将细胞群维持在有利于培养的人工环境中。理想的培养条件对于不同的细胞类型可以有很大的变化，但培养细胞的人工环境可以包括作为容器的腔室组件2325，过滤器作为基底和/或可以应用额外的培养基，其提供必需的营养素(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质等)、生长因子、激素，和气体(氧气(O₂)、二氧化碳(CO₂)、氮气(N₂)等)，并调节物理化学环境(pH、渗透压、温度)。

递送平台2300可以包括被配置为封闭腔室的腔室组件2325，其能够在用户定义的压力和温度设置下引入和控制无菌气体。例如，递送平台2300可以被配置为引入、循环和排出封闭的、密封的腔室内的气体和气体成分。气体和气体成分的实施例可以包括临床空气、氮气以及与收集、保存和/或产生已经使用递送平台2300递送有效载荷的细胞的工作流程相关联的气体和气体组合。也可以根据用户定义的设置，通过调节供应到封闭腔室中的气体的温度和/或对封闭腔室的外部加热来控制封闭腔室内的温度。递送平台2300还可以根据用户定义的程序提供封闭腔室的运动或不运动。因此，可以利用递送平台2300的封闭、密封配置来调节许多实验和生产参数，以增加活细胞的计数。

环境控制可以包括控制环境的气体成分、环境的温度、环境的运动和引入环境中的介质的成分。递送平台2300可以控制环境的气体成分，例如，通过气体扩散器将适当的气体混合物施加到室组件2325。例如，递送平台2300可以控制腔室组件2325内的环境以具有特定的组成，包括控制气体的浓度，例如二氧化碳(CO₂)、氮气(N₂)和氧气(O₂)。对于包含在一次性组件中的给定生长培养基，生长培养基控制培养物的pH，并缓冲培养物中的细胞以对抗pH的变化影响。这种缓冲可以通过包含有机(例如HEPES)或基于CO₂碳酸氢盐的缓冲液来实现。由于介质的pH取决于溶解的二氧化碳(CO₂)和碳酸氢盐(HCO₃-)的平衡，大气中CO₂的变化会改变介质的pH。因此，当使用基于CO₂碳酸氢盐的缓冲液缓冲的介质时，递送平台2300可以控制环境CO₂浓度。CO₂浓度可在空气中提供1％-10％、5％-7％或4-10％的CO₂。例如，CO₂浓度可以保持在1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

递送平台2300可以将细胞群维持在合适的温度下。这可以通过例如在腔室组件2325内包括加热元件来实现。加热元件可以是任何合适的类型，例如电加热元件。在一些实施方式中，可以包括导电套管以帮助热传递并将细胞群维持在均匀的温度。温度可以根据特定的应用和细胞群而变化。例如，细胞群的温度可以维持在分离细胞的宿主的体温，并且在较小程度上维持在温度的解剖变化上(例如，皮肤的温度可以低于骨骼肌的温度)。对于细胞培养物来说，过热可能比加热不足更严重；因此，在一些细胞培养方案中，可以将温度设置为略低于最佳温度。许多人类和哺乳动物细胞系保持在36℃至37℃的温度下以获得最佳生长，尽管其他温度也是可能的。在一些实施方式中，可以通过控制引入环境中的气体的温度来控制温度。

递送平台2300可以控制环境的运动。例如，递送平台2300可以使腔室组件2325摆动或振荡，如以上更详细描述的。摆动或振荡可以在细胞培养的持续时间内进行，或者根据给定的细胞处理方案的要求进行。

递送平台2300可以控制容纳在腔室组件2325内的介质。例如，诸如有机介质(例如HEPES)或基于CO₂碳酸氢盐的缓冲液的介质可以通过端口引入到腔室组件中。在一些实施方式中，介质可以通过注射器2370引入，以向腔室组件2325提供介质(例如介质2345)。在一些实施方式中，为了防止介质从腔室组件2325中排出，可以在一次性组件下方的管道上包括夹管阀或夹子，以将介质在组件中保持更长的时间。

当利用腔室组件2325进行细胞培养时，可以以允许生长的密度接种细胞。

在一些实施方式中，可以在细胞培养期间分析细胞代谢物。例如，可以监测葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸盐和CO₂，作为在细胞培养过程中控制培养基变化的一部分。在一些实施方式中，可以根据需要引入和/或移除不同的培养基。

在一些实施方式中，可以从细胞群中移除细胞样本，例如，用于在培养过程中进行测试。通过能够在细胞培养过程中去除细胞，可以在一段时间内对细胞培养物进行额外的测量和/或测试。在一些实施方式中，细胞可以被移除并放置到外部生物反应器(例如，适于细胞培养的另一个容器或腔室)中。在一些实施方式中，细胞去除可以通过一个或多个管的提取来实现。

在一些实施方式中，可以在细胞培养过程中搅拌细胞。在一些实施方式中，搅拌可以手动进行。在一些实施方式中，搅拌可以由递送平台2300执行，例如通过振荡腔室组件2325。频率范围为50Hz至2500Hz的振动扰动和2mm或以上的物理偏移(例如振幅)可以提供适当的混合或搅拌。在一些实施方式中，可以使用更低或更高的频率(例如，1-50Hz或2500-5000Hz)和更大的幅度(例如，2-20mm)。

作为递送平台2300可被配置为执行的下游过程的另一实施例，递送平台2300可以用于执行冷冻保存过程。例如，冷冻保存培养的细胞可以包括在液氮中，在冷冻保护剂如二甲基亚砜(DMSO)或甘油的存在下，将它们储存在完全培养基中。冷冻保护剂降低了培养基的凝固点，也允许较慢的冷却速度，大大降低了冰晶形成的风险，冰晶会损伤细胞并导致细胞死亡。因此，可以将冷冻保护剂如DMSO提供到腔室组件2325中，例如，使用腔室组件2325中的端口来帮助细胞群的冷冻保存(例如，在经历一个或多个上述过程之后的细胞，例如使用透化剂递送有效载荷(例如，转染)、基于病毒的转导、细胞培养等)。

在一些实施方案中，递送平台2300可以被配置为允许将病毒组分引入封闭腔室内的一定体积的细胞以培养或共培养细胞(例如，细胞转导过程)。例如，可以在进行上述递送过程之前或之后(例如，使细胞群与包括有效载荷的溶液接触(例如，通过喷雾))将含有待引入靶细胞的遗传物质的复制缺陷病毒添加到细胞群体中。

递送平台2300还可以被配置用于下游处理，例如清洗、收获和冷冻保存。在一些实施方案中，递送平台2300可以容易地连接到其他实验或治疗装置、平台或系统。例如，递送平台2300可以流体连接到其他专用的或传统的透化或细胞处理平台，例如Eppendorf反应器。

递送平台2300可以容易地促进上游处理，例如在封闭腔室内激活细胞和/或珠粒，以及在转导和/或转染工作流程期间引发细胞。细胞清洗和体积减少可以作为上游处理步骤进行。也可以使用其他上游工艺。

递送平台2300可以有利地提供可控的、封闭的环境，该环境在实验和特定应用的设置中易于配置，并且不需要昂贵、复杂的机械或自动化机构来操作。可互换介质和收集容器的配置可以实现灵活、可调节的工作流程或处理循环，其是特定的应用或实验，同时保持递送平台2300的无菌、无污染的操作。通常，污染可以通过开放系统或平台的移动/重新定位引入。在需要连接和断开多个流体通道或导管以引入或提取细胞和/或试剂介质的系统中也可能引入污染。

本文所描述的主题提供了许多技术优势。例如，通过利用递送平台2300进行细胞培养，一些实施方式可以提供用于研究细胞的正常生理学和生物化学(例如，代谢研究、衰老)、药物和有毒化合物对细胞的影响以及诱变和致癌的优秀模型系统。它还可以用于药物筛选和开发，以及生物化合物(如疫苗、治疗性蛋白质)的大规模生产。通过利用递送平台2300进行细胞培养，可以提高结果扫描的一致性和再现性。此外，通过利用递送平台2300进行细胞培养，细胞不需要从一次性组件移动到单独的容器或培养孔，这可以提高生存能力并减少污染。

尽管本文已经使用了术语上游处理和下游处理，但是当前主题的一些实施方式可以以任何期望的顺序实现任何处理步骤。例如，流程可以是用户定义的，也可以按任何顺序定义(无论步骤发生在上游还是下游)。

示例性递送协议的实施方案

本发明基于一个令人惊讶的发现，即化合物或化合物的混合物(组合物)通过使真核细胞与含有待递送的化合物(例如有效载荷)的溶液接触而递送到真核细胞的细胞质中。优选地，溶液以喷雾的形式，例如水性颗粒的形式递送到细胞中(参见例如PCT/US2015/057247和PCT/IB2016/001895，通过引用将其全部并入本文)。例如，用喷雾涂覆细胞，但不浸泡或浸没在含有递送化合物的溶液中。在一些实施方案中，递送溶液可以包括渗透或溶解细胞膜的试剂，尽管可能不需要该试剂来影响有效载荷的递送，但该试剂可以增强递送。渗透或溶解真核细胞膜的示例性试剂包括醇和清洁剂，例如分别为乙醇和Triton X-100。其他示例性清洁剂，例如表面活性剂，包括聚山梨醇酯20(例如Tween20)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)、十二烷基硫酸钠(SDS)和辛基葡萄糖苷。

实现涂覆细胞群的涂覆的条件的实施例包括递送细颗粒喷雾，例如，这些条件不包括将大剂量溶液滴加或移液到细胞上，使得大部分细胞群被一定体积的流体浸泡或浸没。因此，薄雾或喷雾包括流体体积与细胞体积的比率。或者，所述条件包括雾或喷雾的体积与暴露的细胞面积的比率，例如，当细胞作为融合层或基本融合层存在于基本平坦的表面上时暴露的细胞膜的面积，所述表面例如组织培养容器的底部，例如组织培养板的孔，例如微量滴定组织培养板。

“货物”或“有效载荷”是用于描述通过水溶液递送穿过细胞质膜并进入细胞内部的化合物或组合物的术语。

在一个方面中，跨细胞质膜递送有效载荷包括提供细胞群并使所述细胞群与一定体积的水溶液接触。所述水溶液包括有效载荷。在一些实施方式中，水溶液不包括醇。在一些实施方式中，水溶液包括浓度大于0.2％的醇含量。在一些实施方案中，水溶液包括有效载荷和浓度大于5％的醇含量。水溶液的体积可以是细胞群暴露表面积的函数，也可以是细胞群中细胞数量的函数。

在另一个方面，一种用于跨细胞质膜递送有效载荷的组合物包括水溶液，所述水溶液包括有效载荷、大于46mM的盐、小于121mM的糖和小于19mM的缓冲剂。在一些实施方式中，水溶液不包括任何醇。在一些实施方式中，水溶液包括浓度大于0.2％的醇。举例来说，醇，例如乙醇，其浓度大于2％、大于5％和/或不超过50％。

以下特征中的一个或多个可以包括在任何可行的组合中。待递送至细胞的溶液的体积是多个单元，例如喷雾，例如水性颗粒上的多个液滴。体积是相对于单个细胞或相对于融合或基本融合的暴露表面积(例如，至少75％、至少80％融合，例如85％、90％、95％、97％、98％、100％)的细胞群来描述。例如，体积可以在每细胞6.0x10^-7微升和每细胞7.4x10^-4微升之间。体积在每个细胞4.9x10^-6微升和每个细胞2.2x10^-3微升之间。体积可以在每细胞9.3x10^-6微升和每细胞2.8x10^-5微升之间。每个细胞的体积可以是大约1.9×10^-5微升，大约表示在10％以内。每个细胞的体积在6.0x10^-7微升到2.2x10^-3微升之间。体积可以在每平方微米暴露表面积2.6x10^-9微升和每平方微米曝光表面积1.1x10^-6微升之间。体积可以在每平方微米暴露表面积5.3x10^-8微升和每平方微米露出表面积1.6x10-⁷微升之间。体积可以是每平方微米暴露表面积约1.1×10^-7微升。大约表示在10％以内。

细胞的融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计的(或计数的)百分比，例如，10％融合意味着10％的表面，例如组织培养血管的表面，被细胞覆盖，100％则意味着它被完全覆盖。例如，粘附细胞在组织培养孔、平板或烧瓶的表面上二维生长。非粘附细胞可以从细胞群的顶部旋转下来，通过真空或组织培养基抽吸下来，或者通过从血管底部抽吸或真空去除来去除。

使细胞群与一定体积的水溶液接触可以通过气体推动水溶液形成喷雾来进行。所述气体可以包括氮气、环境空气或惰性气体。喷雾可以包括尺寸范围从1nm到100μm的离散体积单位，例如直径为30-100μm。喷雾包括直径约为30-50μm的离散体积单位。总体积为20μl的水溶液可通过喷雾递送到约1.9cm²的细胞占据面积，例如24孔培养板的一个孔。将总体积为10μl的水溶液递送至约0.95cm²的细胞占据面积，例如48孔培养板的一个孔。通常，水溶液包括要穿过细胞膜递送并进入细胞的有效载荷，并且第二体积是不包含有效载荷的缓冲液或培养基(例如，终止溶液)。或者，第二体积(缓冲液或介质)也可以包含有效载荷。在一些实施方案中，水溶液包括有效载荷和醇，并且第二体积不包含醇(并且可选地不包含有效载荷)。在加入第二体积的缓冲液或培养基以浸没或悬浮所述细胞群体之前，细胞群可以与所述水溶液接触0.1至10分钟。缓冲液或培养基可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在加入第二体积的缓冲液或培养基以浸没或悬浮细胞群之前，细胞群可以与水溶液接触2秒至5分钟。在加入第二体积的缓冲液或培养基(例如，在没有有效载荷的情况下)以浸没或悬浮细胞群体之前，细胞群可以与水溶液(例如，含有有效载荷的水溶液)接触30秒至2分钟。在加入第二体积的缓冲液或培养基以浸没或悬浮细胞群之前，细胞群可以与喷雾接触约1-2分钟。在喷洒细胞和添加缓冲液或培养基之间的时间内，细胞通过来自喷洒体积的湿气层保持水合。

水溶液可以包括5％至30％的乙醇浓度。水溶液可以包括75％至98％的H₂O、2％至45％的乙醇、6至91mM的蔗糖、2至500mM的KCl、2至35mM的乙酸铵和1至14mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)中的一种或多种。例如，递送溶液含有106mM KCl和27％乙醇。

细胞群可以包括粘附细胞或非粘附细胞。粘附细胞可以包括原代间充质干细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、肺细胞、神经元细胞、成细胞、人脐静脉(HUVEC)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚胎肾(HEK)细胞或永生化细胞(例如细胞系)中的至少一种。在优选的实施方案中，细胞群包括非粘附细胞，例如，群体中的非粘附细胞百分比为至少50％、60％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的非粘附细胞。非粘附细胞原代细胞以及永生化细胞(例如细胞系的细胞)。示例性的非粘附/悬浮细胞包括原代造血干细胞(HSC)、T细胞(例如CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞)、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、人脐血CD34+细胞、B细胞或细胞系如Jurkat T细胞系。

有效载荷可以包括小化学分子、肽或蛋白质或核酸。小化学分子可以小于1000Da。化学分子可以包括RedCMXRos、碘化丙啶、甲氨蝶呤和/或DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)。所述的肽可为约5000Da。所述的肽可包括商品名为Kalbitor的伊卡兰肽，是一种用于治疗遗传性血管性水肿和预防心胸外科手术中失血的60个氨基酸的多肽)、利拉鲁肽(商品名为Victoza，用于治疗II型糖尿病，以及用于治疗肥胖的Saxenda)，和Icatibant(商品名Firazyer，一种用于治疗遗传性血管性水肿急性发作的拟肽)。小干扰核糖核酸(siRNA)分子的长度可以是约20-25个碱基对，或者可以是约10,000-15,000Da。siRNA分子可以减少任何基因产物的表达，例如临床相关靶基因或模型基因的基因表达的敲低，例如甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA、GAPDH siRNA FITC、亲环蛋白B siRNA，和/或层粘连蛋白siRNA。蛋白质治疗剂可以包括肽、酶、结构蛋白、受体、细胞蛋白、或循环蛋白、或其片段。蛋白质或多肽为约100-500,000Da，例如1,000-150,000Da。蛋白质可包括任何治疗性、诊断性或研究性蛋白质或肽，例如β-乳球蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和/或辣根过氧化物酶。在其他实施例中，所述蛋白质可包括癌症特异性凋亡蛋白，例如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导蛋白(TRAIL)。

抗体的分子量通常为约150,000Da。抗体可以包括抗肌动蛋白抗体、抗GAPDH抗体、抗Src抗体、抗Myc-ab和/或抗Raf抗体。抗体可以包括绿色荧光蛋白(GFP)质粒、GLuc质粒和BATEM质粒。DNA分子可以大于5,000,000Da。在一些实施例中，抗体可以是鼠源性单克隆抗体，例如，替优昔单抗、莫莫单抗-CD3、托西莫单抗、人抗体或人源化小鼠(或其他物种来源)抗体。在其他实施例中，抗体可以是嵌合单克隆抗体，例如阿昔单抗、巴昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗或利妥昔单抗。在其他实施例中，抗体可以是人源化单克隆抗体，例如阿仑单抗、贝伐单抗、聚乙二醇赛妥珠单抗、达珠单抗、真珠单抗、曲妥珠单抗、托西珠单抗、易普利姆单抗或帕尼单抗。抗体可以包含抗体片段，例如阿贝西普、阿柏西普、阿法西普或依那西普。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括免疫活性抗体片段，例如Fab或(Fab)2片段；工程单链Fv分子；或嵌合分子，例如抗体，其包含一种抗体(例如鼠源抗体)和另一种抗体(例如人源抗体)的剩余部分的结合特异性的抗体。

有效载荷可以包括治疗剂。“治疗剂，例如药物或活性剂”可以指用于治疗或诊断目的的任何化合物，该术语可以理解为指给患者治疗疾病的任何化合物。因此，治疗剂可以包括蛋白质、肽、抗体、抗体片段和小分子。在美国专利号No.7,667,004(通过引用并入本文)可用于本文所述的方法中。治疗剂可以包括顺铂、阿司匹林、他汀类药物(例如，匹伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、盐酸丙嗪、盐酸氯丙嗪、盐酸甲硫瑞达嗪、硫酸多粘菌素B、氯霉素、盐酸苯氯雷司和盐酸吩唑吡啶)和氟西汀中的至少一种。有效载荷可以包括诊断剂。诊断剂可以包括可检测标记或标记物，例如亚甲基蓝、专利蓝V和吲哚菁绿中的至少一种。有效载荷可以包括荧光分子。有效载荷可以包括可检测的纳米颗粒。纳米颗粒可以包括量子点。

非粘附细胞群可以基本上融合，例如大于75％的融合度。细胞的融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计的(或计数的)百分比，例如，10％融合意味着10％的表面，例如组织培养血管的表面，被细胞覆盖，100％意味着它被完全覆盖。例如，粘附细胞在组织培养孔、平板或烧瓶的表面二维生长。非粘附细胞可以从细胞群的顶部旋转下来，通过真空或组织培养基抽吸下来，或者通过从血管底部抽吸或真空去除来去除。细胞群可以形成单层细胞。

所述的醇可以选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和苯甲醇。所述的盐可以选自NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄和C₂H₃O₂NH。在优选的实施方案中，所述盐是KCl。所述的糖可以包括蔗糖。缓冲剂可以包括4-2-(羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。

本申请的主题涉及一种用于跨质膜递送分子的方法。本申请的主题在细胞内递送领域中具有实用性，并且在例如将分子生物学和药理学治疗剂递送到靶位点(例如细胞、组织或器官)中具有应用。本发明的方法包括将分子引入水性组合物以形成基质；将所述基质雾化成喷雾；以及使基质与质膜接触。

本发明的主题涉及一种用于跨质膜递送分子的组合物。本发明的主题在细胞内递送领域中具有实用性，并且在例如将分子生物学和药理学治疗剂递送到靶位点(例如细胞、组织或器官)中具有应用。本发明的组合物包括醇；盐；糖；和/或缓冲剂。

在一些实施方案中，证明了一种递送技术，所述技术促进独立于分子和细胞类型的分子的细胞内递送。纳米颗粒、小分子、核酸、蛋白质和其他分子可以有效地原位递送到悬浮细胞或粘附细胞中，包括原代细胞和干细胞，具有低细胞毒性，并且该技术与高通量和自动化的基于细胞的测定相兼容。

本文描述的一些示例方法包括有效载荷，其中有效载荷包括醇。术语“醇”是指包括连接到至少一个碳原子上的羟基(-OH)官能团的多原子有机化合物。醇可以是一元醇，并且可以包括至少一个碳原子，例如甲醇。醇可以包括至少两个碳原子(例如乙醇)。在其他方面，醇包括至少三个碳(例如异丙醇)。醇可以包括至少四个碳原子(例如丁醇)，或至少七个碳原子(例如苯甲醇)。示例性有效载荷可以包括不超过50％(v/v)的醇，更优选地，有效载荷包括2-45％(v/v)的醇、5-40％的醇和10-40％的醇。有效载荷可以包括20-30％(v/v)的醇。

在一些实施方式中，有效载荷递送溶液包括25％(v/v)的醇。或者，有效载荷可以包括2-8％(v/v)的醇或2％的醇。醇可以包括乙醇，并且有效载荷包括5％、10％、20％、25％、30％和高达40％或50％(v/v)的乙醇，例如27％。示例方法可以包括甲醇作为醇，并且有效载荷可以包括5％、10％、20％、25％、30％或40％(v/v)的甲醇。有效载荷可以包括2-45％(v/v)的甲醇、20-30％(v/v)或25％(v/v)的甲醇。优选地，有效载荷包括20-30％(v/v)的甲醇。进一步可选地，醇是丁醇，并且有效载荷包括2％、4％或8％(v/v)的丁醇。

在本发明的一些方面中，有效载荷在等渗溶液或缓冲液中。

根据本主题，有效载荷可以包括至少一种盐。所述盐可以选自NaCl、KCl、Na₂HPO₄、C₂H₃O₂NH₄和KH₂PO₄。例如，KCl浓度范围为2mM至500mM。在一些优选实施方案中，浓度大于100mM，例如106mM。

根据本发明的示例方法，有效载荷可以包括糖(例如，蔗糖或二糖)。根据示例方法，有效载荷包括小于121mM的糖、6-91mM或26-39mM的糖。更进一步地，有效载荷包括32mM糖(例如蔗糖)。任选地，糖是蔗糖，有效载荷包括6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8或89.6mM蔗糖。

根据本发明的示例方法，有效载荷可以包括缓冲剂(例如弱酸或弱碱)。缓冲剂可以包括两性离子。根据实施例方法，缓冲剂为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。有效载荷可以包括小于19mM的缓冲剂(例如，1-15mM、或4-6mM或5mM缓冲剂)。根据示例性方法，缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，有效载荷包括1、2、3、4、5、10、12、14mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。进一步优选地，有效载荷包括5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。

根据本发明的示例方法，有效载荷包括乙酸铵。有效载荷可以包括少于46mM的乙酸铵(例如，2-35mM、10-15mM或12mM的乙酸铵)。有效载荷可以包括2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8或33.6mM乙酸铵。

通过气体推动所述水溶液而进行的水溶液的体积可以包括压缩空气(例如环境空气)，其他实施方式可以包括惰性气体，例如氦气、氖气和氩气。

在本主题的某些方面，细胞群可以包括粘附细胞(例如，肺、肾、免疫细胞如巨噬细胞)或非粘附细胞(如悬浮细胞)。

在本主题的某些方面中，细胞群可以基本上是融合的，并且基本上可以包括大于75％的融合度。在优选实施方式中，细胞群可以形成单个单层。

根据示例方法，待递送的有效载荷具有高达20,000,000Da的平均分子量。在一些实施例中，待递送有效载荷可具有高达2,000,000Da的平均分子量。在一些实施方式中，待递送的有效载荷可具有高达150,000Da的平均分子量。在进一步的实施方式中，待递送的有效载荷具有高达15,000Da、5,000Da或1,000Da的平均分子量。

跨细胞质膜递送的有效载荷可以包括小化学分子、肽或蛋白质、多糖或核酸或纳米颗粒。小化学分子可以小于1,000Da，肽可以具有约5,000Da的分子量，siRNA可以具有约15,000Da的分子量，抗体可以具有约150,000Da的分子量，并且DNA可以具有大于或等于5,000,000Da的分子量。在优选实施方案中，有效载荷包括mRNA。

根据示例方法，有效载荷包括3.0-150.0μM的待递送分子，更优选地，6.6-150.0μM的待递送分子(例如，3.0、3.3、6.6或150.0μM的待递送分子)。在一些实施方式中，待递送的有效载荷的平均分子量高达15,000Da，并且有效载荷包括3.3μM待递送分子。

根据示例方法，待递送的有效载荷的平均分子量高达15,000Da，并且有效载荷包括6.6μM待递送。在一些实施方式中，待递送的有效载荷具有高达1,000Da的平均分子量，并且有效载荷包括150.0μM待递送。

根据本主题的进一步方面，提供了一种用于跨质膜递送一个以上分子量的分子的方法；该方法包括以下步骤：将一个以上分子量的分子引入水溶液中；以及使所述水溶液与质膜接触。

在一些实施方式中，所述方法包括将具有第一分子量的第一分子和具有第二分子量的第二分子引入到有效载荷中，其中第一分子和第二分子可以具有不同的分子量，或者其中第一分子可以具有相同的分子量。根据示例方法，第一分子和第二分子可以是不同的分子。

在一些实施方式中，待递送的有效载荷可以包括治疗剂或诊断剂，包括例如顺铂、阿司匹林、各种他汀类药物(例如匹伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、盐酸丙嗪、盐酸氯丙嗪、盐酸硫瑞达嗪、硫酸多粘菌素B、氯霉素、盐酸苯氯雷司和盐酸吩唑吡啶)和氟西汀。其他治疗剂包括抗微生物剂(氨基环苷类(例如庆大霉素、新霉素、链霉素)、青霉素(例如阿莫西林、氨苄青霉素)、糖肽(例如阿沃霉素、万古霉素)、大环内酯类(例如红霉素、替米考星、泰乐菌素)、喹诺酮类(例如沙拉沙星、恩诺氟新)、链菌素(例如维吉尼亚霉素、奎奴普丁-达氟菌素)、碳青霉烯类、脂肽、恶唑烷酮、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙酰胺、异烟肼、对氨基水杨酸和吡嗪酰胺)。在一些实施例中，抗病毒药物(例如，阿巴卡韦、阿昔洛韦、恩富韦、恩替卡韦、内勒菲那韦、奈韦拉平、奈克萨韦、奥司他韦-拉替拉韦、利托那韦、司他夫定和伐昔洛韦)。治疗剂可以包括用于治疗各种疾病的基于蛋白质的治疗，例如癌症、传染病、血友病、贫血、多发性硬化症和乙型或丙型肝炎。

附加的示例性有效载荷还可以包括可检测标记或标记物，例如亚甲基蓝、专利蓝V和吲哚菁绿。

本文描述的方法还可以包括包含可检测部分或可检测纳米颗粒(例如，量子点)的有效载荷。可检测部分可以包括荧光分子或放射性试剂(例如¹²⁵I)。当荧光分子暴露在适当波长的光下时，由于荧光可以检测到其存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、对苯甲醛和荧光胺。该分子还可以使用荧光发射金属如¹⁵²Eu或镧系元素的其他金属进行可检测的标记。这些金属可以使用诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合基团连接到分子上。该分子还可以通过将其与化学发光化合物偶联来进行可检测标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实施例是鲁米诺、异鲁米诺、甲基吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

在另外的实施方案中，待递送的有效载荷可以包括编辑基因组DNA的组合物(即，基因编辑工具)。例如，基因编辑组合物可以包括切割、缺刻、拼接、重排、转位、重组或以其他方式改变基因组DNA的化合物或复合物。可替换地或另外，基因编辑组合物可包含化合物，所述化合物(i)可包括切割、缺刻、拼接、重排、转位、重组或以其他方式改变基因组DNA的基因编辑复合物；或者(ii)可以被加工或改变为包括在切割、缺刻、拼接、重排、转位、重组或以其他方式改变基因组DNA的基因编辑复合物中的化合物。在各种实施方案中，基因编辑组合物包括以下一种或多种：(a)基因编辑蛋白；(b)RNA分子；和/或(c)核糖核蛋白(RNP)。

在一些实施方案中，基因编辑组合物包括基因编辑蛋白，并且基因编辑蛋白是锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应核酸酶(TALEN)、Cas蛋白、Cre重组酶、Hin重组酶或Flp重组酶。在另外的实施方案中，基因编辑蛋白可以是结合归巢核酸内切酶和组件式DNA结合结构域的融合蛋白(megaTAL)。例如，megaTAL可以作为蛋白质递送，或者可替换地，将编码megaTAL蛋白质的mRNA递送到细胞。

在各种实施方案中，基因编辑组合物包含RNA分子，并且RNA分子包括sgRNA、crRNA和/或tracrRNA。

在某些实施方案中，基因编辑组合物包含RNP，RNP包括Cas蛋白和sgRNA或crRNA和tracrRNA。本主题的各方面对于控制特定基因编辑化合物在细胞中何时存在以及存在多长时间特别有用。

在本主题的各种实施方式中，基因编辑组合物在细胞群体或其后代中是可检测的，例如(a)在细胞群与水溶液接触后约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5-2、0.5-6、6-12或0.5-72小时，或者(b)在细胞群与水溶液接触后小于约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5-2、0.5-6、6-12或0.5-72小时。

在一些实施方案中，细胞群中的细胞基因组或其子代包括Cre重组酶、Hin重组酶或Flp重组酶的至少一个位点特异性重组位点。

本发明的各方面涉及包含一种基因编辑化合物的细胞，以及向该细胞中插入另一种基因编辑化合物。例如，可以将RNP的一个组分引入到表达或以其他方式已经包含RNP的另一个组分的细胞中。例如，细胞群中的细胞或其后代可以包括sgRNA、crRNA和/或tracrRNA。在一些实施方案中，细胞群或其后代表达sgRNA、crRNA和/或tracrRNA。可替代地或另外，细胞群中的细胞或其后代表达Cas蛋白。

本文主题的各种实施方式包括Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白或其突变体。本文描述了示例性的Cas蛋白(包括Cas9和Cas9突变体的非限制性实施例)。

在各个方面，Cas9蛋白的浓度可以在约0.1至约25μg的范围内。例如，Cas9的浓度可以是约1μg、约5μg、约10μg、约15μg或约20μg。可替代地，Cas9的浓度可以在约10ng/μL至约300ng/μL的范围内；例如约10ng/μL至约200ng/μL；或约10ng/μL至约100ng/μL，或约10ng/μL至约50ng/μL。

在某些实施方案中，基因编辑组合物包括(a)第一sgRNA分子和第二sgRNA分子，其中第一sgRNA分子的核酸序列不同于第二sgRNA分子的核酸序列；(b)包括第一sgRNA的第一RNP和包括第二sgRNA的第二RNP，其中所述第一sgRNA分子的核酸序列不同于所述第二sgRNA分子的核酸序列；(c)第一crRNA分子和第二crRNA分子，其中所述第一crRNA分子的核酸序列不同于所述第二crRNA分子的核酸序列；(d)第一crRNA分子和第二crRNA分子，其中所述第一crRNA分子的核酸序列不同于所述第二crRNA分子的核酸序列，并且进一步包括tracrRNA分子；或(e)包括第一crRNA和tracrRNA的第一RNP和包括第二crRNA和tracrRNA的第二RNP，其中所述第一crRNA分子的核酸序列不同于所述第二crRNA分子的核酸顺序。

在一些方面，Cas9蛋白与引导RNA的比例可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。

在实施方案中，增加细胞通过递送过程的次数(或者，增加剂量的数量)，可以增加百分比编辑；其中，在一些实施方案中，剂量的数量可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量。

在各种实施方案中，第一sgRNA和第二sgRNA或第一crRNA分子和第二crRNA分子一起包括与基因、外显子、内含子、染色体外序列或基因组核酸序列侧翼的靶序列互补的核酸序列，其中基因、外显子、内含子、染色体外序列或基因组核酸序列的长度为约1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100千碱基或长度为至少约1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100千碱基。在一些实施方案中，包含第一sgRNA和第二sgRNA或第一crRNA分子和第二crRNA分子的成对RNP的使用可用于产生包括基因、外显子、内含子、染色体外序列或基因组核酸序列的多核苷酸分子。

在某些实施方案中，sgRNA或crRNA的靶序列为约12至约25，或约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、17-23或18-22个核苷酸长。在一些实施方案中，靶序列为20个核苷酸长或约20个核苷酸长。

在各种实施方案中，第一和第二sgRNA或第一和第二crRNA分子与位于表达载体内的染色体外序列侧翼的序列互补。

本主题的各方面涉及基因编辑复合物的多种组分的递送，其中所述多个组分不复合在一起。在一些实施方案中，基因编辑组合物包括至少一种基因编辑蛋白和至少一种核酸，其中基因编辑蛋白与核酸彼此不结合或不复合。

本主题允许高基因编辑效率，同时保持高细胞存活率。在一些实施方案中，至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1-99％或更多的细胞群或其后代在与水溶液接触后变成遗传修饰的。在各种实施方案中，至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1-99％或更多的细胞群或其后代在与水溶液接触后是活的。

在某些实施方案中，基因编辑组合物诱导细胞内DNA的单链或双链断裂。在一些实施方案中，基因编辑组合物进一步包括修复模板多核苷酸。在各种实施方案中，修复模板包括(a)包括与在单链或双链断裂的一侧的约40至约90个碱基对互补的序列中的核苷酸的第一侧翼区和包括与在单链或双链断裂的另一侧约40至约90个碱基对互补的序列中的核苷酸的第二侧翼区；或(b)包括与在单链或双链断裂的一侧的至少约20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90个碱基对互补的序列中的核苷酸的第一侧翼区，以及包括与在单链或双链断裂的另一侧的至少约20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90个碱基对互补的序列中的核苷酸的第二侧翼区。Ran等人(2013)Nat Protoc.2013Nov；8(11):2281-2308中讨论了使用CRISPR-Cas系统进行基因编辑(包括修复模板)的非限制性描述，其全部内容通过引用并入本文。涉及修复模板的实施方式不限于包括CRISPR-Cas系统的那些。

在本主题的各种实施方式中，一定体积的水溶液以喷雾的形式递送到细胞群。在一些实施方案中，体积在6.0×10^-7微升/细胞和7.4×10^-4微升/细胞之间。在某些实施方案中，喷雾包括直径为10nm至100μm的胶体或亚粒子。在各种实施方案中，体积在每平方微米暴露表面积2.6x10^-9微升和每平方微米暴露表面积1.1x10^-6微升之间。

在一些实施方案中，RNP的尺寸约为或10nmx10nmx5nm。在各种实施方案中，调节喷雾颗粒的尺寸以适应每个喷雾颗粒至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多RNP。

例如，使细胞群与一定体积的水溶液接触可以通过气体推动水溶液形成喷雾来进行。在某些实施方案中，在加入第二体积的缓冲液或培养基以浸没或悬浮所述细胞群之前，细胞群与所述水溶液接触0.01-10分钟(例如，0.1-10分钟)。

在各种实施方案中，细胞群包括原代细胞或永生化细胞中的至少一种。例如，细胞群可以包括间充质干细胞、肺细胞、神经元细胞、成纤维细胞、人脐静脉(HUVEC)细胞和人胚胎肾(HEK)细胞、原代或永生化造血干细胞(HSC)、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、人脐带血CD34+细胞、B细胞。T细胞的非限制性实施例可包括CD8+或CD4+T细胞。在一些方面中，使用CD3+T细胞的CD8+亚群。CD8+T细胞可以通过使用抗CD8珠的阳性分离从PBMC群体中纯化。在一些方面，从PBMC分离原代NK细胞，并且GFP mRNA可以通过平台递送技术递送(即，在24小时3％的表达和96％的存活率)。在另外的方面中，可以使用NK细胞系，例如NK92。

细胞类型还包括先前已被修饰的细胞，例如T细胞、NK细胞和MSC，以增强其治疗功效，并用于三维培养、组织外植体、皮肤移植物、工程组织等。例如：表达嵌合抗原受体的T细胞或NK细胞(分别为CAR T细胞、CAR NK细胞)；表达修饰的T细胞受体(TCR)的T细胞；经病毒或非病毒修饰以过表达补充其固有特性的治疗蛋白的MSC(例如，使用慢病毒载体递送Epo或使用AAV-6递送BMP-2)(在Park等人，Methods，2015Aug；84-16中综述)；用非肽药物或磁性纳米颗粒引发的MSC分别用于增强疗效和外部调节靶向(Park等人，2015)；用靶向部分功能化以使用酶修饰(例如岩藻糖基转移酶)、化学缀合(例如，通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰MSC上的SLeX)或非共价相互作用(例如，用棕榈酸蛋白修饰细胞表面，棕榈酸蛋白作为随后抗体缀合的疏水锚)来增强其对治疗位点的归巢的MSC(Park等人，2015)。例如，已经被修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)，例如原代T细胞或T细胞系，可以根据本发明进一步用基因编辑蛋白和/或含有CAR编码序列特异的引导核酸的复合物处理，以编辑编码CAR的基因，从而减少或停止CAR在修饰的T细胞中的表达。

本发明的方面涉及基因编辑化合物和复合物到细胞和组织的无表达载体递送，例如在原代人T细胞、造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)中递送用于基因组编辑的Cas-gRNA核糖核蛋白。在一些实施例中，编码这种蛋白质的mRNA被递送到细胞。

CRISPR-Cas系统的各个方面在本领域中是已知的。所述系统的非限制性方面被描述，例如在2015年5月5日发布的美国专利第9,023,649中；2015年7月7日发布的美国专利第9,074,199号；2014年4月15日发布的美国专利号8,697,359；2015年1月13日发布的美国专利第8,932,814号；PCT国际专利申请公开号WO 2015/071474，公布于2015年8月27日；Cho等人(2013)《自然生物技术》第31卷第3期第230-232页(含补充信息)；以及Jinek等人，(2012)Science第337卷，第6096期，816-821页，其每一个的全部内容通过引用并入本文。

Cas蛋白的非限制性实施例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX，Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及其同源物，或其修饰形式。这些酶是已知的；例如化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到，在NCBI数据库中以登录号Q99ZW2.1找到。UniProt数据库登录号A0A0G4DEU5和CDJ55032提供了Cas9蛋白氨基酸序列的另一个实施例。另一个非限制性实施例是嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9蛋白，其氨基酸序列可以在UniProt数据库中以登录号Q03JI6.1找到。在一些实施方案中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，例如Cas9。在某些实施方案中，所述CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓性链球菌(S.pyogenes)或肺炎链球菌(S.pneumoniae)的Cas9。在各种实施方案中，所述CRISPR酶在靶序列的位置引导一条或两条链的切割，例如在靶序列内和/或在靶序列互补物内。在一些实施方案中，CRISPR酶指导从靶序列的第一个或最后一个核苷酸切割约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多碱基对内的一条或两条链。在一些实施方案中，载体编码CRISPR酶，所述CRISPR酶相对于相应的野生型酶突变，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，化脓性链球菌Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸的取代，其将Cas9从切割两条链的核酸酶转化为切口酶(切割单链)。导致Cas9切口酶的突变的其他实施例包括但不限于H840A、N854A和N863A。在本发明的方面中，切口酶可用于通过同源重组进行基因组编辑。

在某些实施方案中，Cas9切口酶可与引导序列(例如两个引导序列)组合使用，所述引导序列分别靶向DNA靶标的有义链和反义链。这种组合允许两条链都被切开并用于诱导NHEJ。

作为进一步的实施例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II和RuvCIII)可以被突变以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的突变Cas9。D10A突变可以与H840A、N854A或N863A突变中的一个或多个结合，以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在某些实施方案中，当突变酶的DNA切割活性相对于其非突变形式小于约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更低时，CRISPR酶被认为基本上缺乏所有DNA切割活性。其他突变可能是有用的；在Cas9或其他CRISPR酶来自化脓性链球菌以外的物种的情况下，可以进行相应氨基酸的突变以实现类似的效果。其他突变可能是有用的；其中Cas9或其他CRISPR酶来自化脓性链球菌以外的物种，可以制备相应氨基酸的突变以实现类似的效果。

在某些实施方案中，被递送的蛋白质(例如Cas蛋白或其变体)可以包括亚细胞定位信号。例如，RNP内的Cas蛋白可以包括亚细胞定位信号。根据上下文，包含例如Cas9和核定位信号的融合蛋白在本文中可以被称为“Cas9”，而不指定包含核定位信号。在一些实施方案中，有效载荷(例如RNP)包括融合蛋白，该融合蛋白包括定位信号。例如，融合蛋白可以包含核定位信号、核仁定位信号或线粒体靶向信号。此类信号在本领域中是已知的，并且非限制性实例描述于Kalderon等人(1984)Cell 39(3Pt2):499-509；Makkerh等人，(1996)Curr Biol.6(8)：1025-7；Dingwall等人，(1991)《生化科学趋势》16(12)：478-81；Scott等人，(2011)BMC生物信息学12:317(7页)；Omura T(1998)生物化学杂志，123(6)：1010-6；Rapaport D(2003)EMBO Rep.4(10)：948-52；以及Brocard&Hartig(2006)Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research 1763(12):1565-1573，其各自的内容通过引用并入本文。在各种实施方案中，Cas蛋白可以包括一个以上的定位信号，例如2、3、4、5或更多个核定位信号。在一些实施方案中，定位信号在Cas蛋白的N末端，而在其他实施方案中，定位信号在Cas蛋白的C末端。

在一些实施方案中，编码CRISPR酶的酶编码序列被密码子优化用于在特定细胞(例如真核细胞)中表达。真核细胞可以是或来源于特定生物体(例如哺乳动物的真核细胞)，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类动物。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)，同时保持天然氨基酸序列，来修饰核酸序列以在感兴趣的宿主细胞中增强表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。密码子偏好(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，从而信使核糖核酸的翻译效率又被认为取决于被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中所选的tRNA的优势通常反映了肽合成中最常用的密码子。

因此，基于密码子优化，可以针对给定生物体中的最佳基因表达来定制基因。密码子使用情况表很容易获得，例如，在“密码子使用数据库”中，这些表可以通过多种方式进行调整。参见Nakamura，Y.等人“国际DNA序列数据库中的密码子使用情况：2000年的状况”，Nuccl.Acids，Res.28:292(2000)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，例如Gene Forge(Aptagen；Jacobus，Pa)也是可用的。在一些实施方案中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多，或所有密码子)对应于特定氨基酸的最常用密码子。

一般而言，引导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并将CRISPR复合物序列特异性结合到靶序列的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，引导序列与其对应的靶序列之间的互补程度为约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施方案中，互补程度是100％。最佳比对可以通过使用任何合适的用于比对序列的算法来确定，其非限制性实施例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows-Weller比对器)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novalign(NovocraftTechnologies)，ELAND(Illumina,SanDiego,Calif.)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获取)和Maq(在available at maq.sourceforge.net可获取)。在一些实施方案中，引导序列的长度为约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多核苷酸。在某些实施方案中，引导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。引导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可以通过任何合适的分析来评估。例如，可以将足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括待测试的引导序列，提供给具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过用编码CRISPR序列的组分的载体转染，然后评估靶序列内的优先切割，例如通过本文所述的Surveyor测定。类似地，可以在试管中通过提供靶序列、CRISPR复合物的组分(包括待测试的引导序列和不同于测试引导序列的对照引导序列)，并比较测试和对照引导序列反应之间靶序列处的结合或切割速率，来评估靶多核苷酸序列的切割。

促进了广泛细胞类型的基因组工程的CRISPR-Cas技术正在迅速发展。最近的研究表明，与递送编码Cas9和gRNA的质粒相比，以核糖核蛋白(RNPs)形式递送Cas9 gRNA编辑工具产生若干益处。好处包括更快、更高效的编辑、更少的脱靶效应和更小的毒性。RNP已经通过脂质转染和电穿孔递送，但这些递送方法仍然存在局限性，特别是对于某些临床相关的细胞类型，包括毒性和低效率。因此，需要提供一种无载体(例如，无病毒载体)的方法，用于跨质膜递送生物相关有效载荷(例如，RNP)并进入细胞。“货物”或“有效载荷”是用于描述通过水溶液跨细胞质膜递送并进入细胞内部的化合物或组合物的术语。

当前的主题涉及促进向具有低毒性的细胞递送广泛有效载荷的递送技术。基因组编辑可以通过使用当前主题的某些方面将RNP递送到细胞来实现。此后，水平下降，直到不再检测到Cas9。递送技术本身不会对Jurkat和原代T细胞的存活率或功能产生有害影响。当前的主题使得能够在毒性最小的临床相关细胞类型中通过Cas9 RNPs进行基因编辑。

CRISPR/Cas组分如Cas和/或gRNA的瞬时和直接递送与表达载体介导的递送相比具有优势。例如，与使用表达载体相比，可以在更精确的时间和有限的时间内添加一定量的Cas、gRNA或RNP。从载体表达的组分可能以不同的量和不同的时间产生，这使得在没有脱靶编辑的情况下很难实现一致的基因编辑。此外，预先形成的Cas和gRNA复合物(RNP)不能用表达载体递送。

在一个方面，本主题描述了连接到固体支撑件(例如，条带、聚合物、珠粒或纳米颗粒)的细胞。所述支撑件或支架可以是多孔或非多孔固体支撑件。已知的支撑件或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。为了实现本主题的目的，载体的性质可以在某种程度上是可溶的或不可溶的。支撑材料实际上可以具有任何可能的结构配置。因此，支撑结构可以是球形的，如珠状的，或圆柱形的，如试管的内表面或棒的外表面。作为选择，表面可以是平坦的，例如片材或测试条等。优选的支撑件包括聚苯乙烯磁珠。

在其他方面，固体支撑件包括聚合物，细胞与聚合物化学结合、固定在此聚合物上、分散在其中或与其相关联。聚合物支撑件可以是聚合物的网络，并且可以以小珠的形式(例如，通过悬浮聚合作用)制备。可以用根据本发明的含有有效载荷的水溶液喷洒这种支架上的细胞，以将所需化合物递送到支架的细胞质中。示例性支架包括支架和其他可植入的医疗设备或结构。

实施例4

醇对RNP(核糖核蛋白)编辑效率的影响——通过图1和23所示的示例性递送平台递送后。

使用图1和23所示的示例性递送平台进行实验以确定醇(例如乙醇)对递送后RNP编辑效率的影响。此外，进行实验以确定在通过图1和23中所示的示例性递送平台RNP之后用于编辑的最佳乙醇浓度。例如，确定了允许最佳Cas9诱导编辑的最大乙醇浓度。乙醇的增加允许更多的货物递送到细胞，从而提高编辑效率。

Cas9 RNP-TRAC(T细胞受体α常数)sgRNA(单引导RNA)以2:1的比例以0.4μg/μL制备(相当于每1x10⁶细胞3.3μg)；用0％、5％、10％和15％的乙醇和RNP制备S缓冲液(32.5mM蔗糖；106mM氯化钾；5mM HEPES)溶液，并在图1和图23所示的示例性递送平台上用每个乙醇浓度的S缓冲液进行实验。TRAC指导RNA序列：AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:1)。在实施方案中，至少两个外源性货物同时递送，这意味着两个外源货物被同时递送(例如，双重递送)。例如，免疫细胞(包括外源性货物)可以被操纵以包括第二外源性货物。实验设计如图29所示。

“S缓冲液”包括在4℃下持续5分钟的低渗生理缓冲溶液(78mM蔗糖、30mM KCl、30mM乙酸钾、12mM HEPES)(MedepalliK.等人，Nanotechnology 2013；24(20)；通过引用整体并入本文)。在一些实施例中，S缓冲液中的乙酸钾被乙酸铵替代。S缓冲液在国际申请WO2016/065341中进一步描述，例如，在第[0228]-[0229]段处，在此通过引用将其全部并入本文。例如，本文所述的一系列实验中使用的S缓冲液包括32.5mM蔗糖；106mM氯化钾；和5mMHEPES。

结论：CD3(分化簇3)编辑效率(例如，监测TRAC-RNP)在每种乙醇浓度下使用图1和图23所示的示例性递送平台在递送后进行测试。参见图30和图31，图30描绘了用靶向CD3的抗体染色的细胞的代表性流式细胞术图(从活的群体中门控)。

图31A显示了条形图，其显示CD3编辑的水平随着乙醇浓度的增加而适度增加(0％EtOH和58％CD3编辑到15％EtOH和66％CD3编辑)，并且在图31B的表中进一步总结了结果。在图32的条形图中总结了在乙醇浓度增加时的存活率百分比，以及由递送前、递送后(第3天)和递送后(第5天)组成的时间点。

实施例5

图33A和33B示出了当使用0％EtOH递送溶液(图33A，无醇)和12.5％醇(图33B)时，示例递送平台的液滴尺寸与雾化压力的关系。在图33A和33B中，DV90表示直径小于该值的颗粒的部分为90％，DV50表示直径小于此值的颗粒部分为50％，DV10表示直径小于这个值的颗粒部为10％。

在一些实施方案中，不含乙醇的水溶液显示出更大的液滴尺寸(对于雾化溶液的给定压力)，这需要额外考虑工艺条件，以使转染用货物对细胞进行最佳的喷雾覆盖。

在一些实施方式中，当平台使用0％乙醇递送溶液时，可以省略额外的洗涤步骤。喷雾递送的开/关切换速度可以保持恒定。类似地，羽流和喷嘴设计可以用于乙醇或无乙醇溶液。如在实施例6中更详细地描述的，所述系统还可以使用高渗溶液(例如，递送溶液中高得多的盐浓度)提供递送。

对于直径约为10μm的细胞(例如人T细胞)，图33A和33B是显示喷雾液滴尺寸需要施加更高的雾化压力的线图，以保持液滴尺寸范围更接近细胞尺寸，包括避免过大的液滴。使用Malvern Mastersizer 3000激光衍射装置(可从英国Malvem的Malvern Panalytical有限公司，获得；参见(<https://www.malvernpanalytical.com/en/products/product-range/mastersizer-range/mastersizer-3000>)。在一些实施方式中，示例性递送平台可以利用这样的压力，其中喷雾液滴(例如，颗粒)尺寸分布的分布可以包括D90不大于细胞尺寸的5倍的尺寸范围、D90不超过细胞尺寸的3.3倍的范围和/或D90不大于细胞尺寸的约2倍的范围。

实施例6

如图34和图34B、图35A和35B、图36-38所示的高渗递送系统的效果。

在不同体积比的蔗糖缓冲液(45％蔗糖约175mOsm/kg)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)(约300mOsm/kg)的递送溶液中，使用包括0％EtOH在内的各种乙醇浓度研究了递送溶液渗透压的增加(例如高渗溶液的影响)，如下表所示。

表1：在不同乙醇浓度下增加递送溶液渗透压

成分	分子量	浓度(mg/L)
			氯化钾	75.0	200.0
磷酸二氢钠	136.0	200.0
			氯化钠	58.0	8000.0
磷酸氢二钾	268.0	2160.0

结果：图34A和34B以及图35A和35B显示，在溶液中使用12％和27％的乙醇实现的GFP转染增加了来自两种缓冲溶液的蔗糖和氯化钠的比例。在图34A、34B以及35A和35B中，也维持了细胞活力。乙醇对渗透压浓度有较高的影响，如通过测量乙醇在血清中的影响所证明的(参见，例如，Nguyen，M.等人“Front.Med.乙醇的渗透压浓度大于其摩尔浓度吗？2020年1月8日，“Nguyen”通过引用全文并入本文)。本文转载了Nguyen参考文献中的图1(图36)，其示出了基于添加乙醇后测量的血清渗透压和添加乙醇前测量的血清渗压之间的差异以及以mg/dL为单位的血清乙醇浓度，将仅由乙醇引起的渗透压差距相关联的线性回归分析。

本文描述和研究的高渗溶液也增加了转染(图37)。

高渗溶液可以增加转染，也可以降低存活率。高渗溶液优选含有有机组分，如蔗糖或其他药学上可接受的糖，如右旋糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇，以及无机盐，如氯化钠、氯化钾或其他药学可接受的盐。不含乙醇的组合递送溶液可以使用小于300mosm/kg，或大于300mosm/kg，例如高达400mosm/kg或高达500mosm/kg的渗透压。然后可以将所述溶液与不同量的乙醇混合，混合量最高可达50％。糖和无机盐的相对量可能会有所不同，使得水性缓冲混合物的渗透摩尔浓度高达50％来自糖(或其与无机盐的组合)，优选的范围是小于40％，最优选的是小于33％作为糖。在其他实施例中，水性缓冲混合物的渗透压摩尔浓度的高达40％、高达35％、高达34％、高达33％、高达32％、高达31％或高达30％来自糖类(或其与无机盐的组合)。

在一些实施方案中，递送溶液是高渗的，其中溶液的渗透压受糖(例如，蔗糖、右旋糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇和其他药学上可接受的糖)和无机盐(例如，氯化钠、氯化钾或其他药学可接受的盐)的组合的影响。在一些实施例中，递送溶液可包括一种以上糖类的混合物和一种以上无机盐的混合物。

高达50％的水性缓冲液的渗透摩尔浓度可以由糖的混合物产生。例如，优选的范围包括小于40％，或更优选小于33％的渗透压摩尔浓度由糖产生(例如，水溶液的渗透压浓度由糖或其糖的混合物提供)。

在其他实施方案中，递送溶液(不含醇，但包括至少一种糖和无机盐)可具有小于300mOsm/kg、等于或约300mOsm/kg、高达400mOsm/kg或高达500mOsm/kg的渗透压摩尔浓度。在其它实施例中，递送溶液(不含醇，但包括至少一种糖和一种有机盐)可具有约300mOsm/kg，或约350mOsm/kg，或约400mOsm/kg，或约450mOsm/kg，或约500mOsm/kg的渗透压摩尔浓度。在其他实施例中，递送溶液(不含醇，但包括至少一种糖和一种有机盐)可具有约320mOsm/kg、约330mOsm/kg、约340mOsm/kg、约350mOsm/kg、约360mOsm/kg、约450mOsm/kg、约460mOsm/kg、约470mOsm/kg、约480mOsm/kg、约490mOsm/kg或约500mOsm/kg的渗透压。

其他实施方案

在以上描述和权利要求中，诸如“至少一个”或“一个或多个”之类的短语可以出现在元素或特征的结合列表之后。术语“和/或”也可以出现在两个或多个元素或特征的列表中。除非与所使用该短语的上下文隐含或明确的矛盾，否则该短语旨在指单独列出的任何元素或特征，或与任何其他列举的元素或特征组合的任何列举的元素和特征。例如，短语“A和B中的至少一个”、“A和B中的一个或多个”以及“A和/或B”分别表示“A单独、B单独或A和B一起”。类似的解释也适用于包括三个或三个以上项目的列表。例如，短语“A、B和C中的至少一个”；“A、B和C中的一个或多个”；以及“A、B和/或C”各自旨在表示“A单独、B单独、C单独、A和B一起、A和C一起、B和C一起或A和B和C一起”。此外，上文和权利要求书中使用的术语“基于”旨在表示“至少部分基于”，使得未引用的特征或元素也是允许的。

根据期望的配置，本文描述的主题可以体现在系统、装置、方法和/或物品中。前述描述中阐述的实施方式并不表示与本文所描述的主题一致的所有实施方式。相反，它们仅仅是与所描述的主题相关的方面一致的一些实施例。尽管上面已经详细描述了一些变体，但是其他修改或添加也是可能的。特别地，除了本文所阐述的那些之外，还可以提供其他特征和/或变化。例如，上述实施方式可以针对公开的特征的各种组合和子组合和/或上面公开的几个另外的特征的组合和子结合。此外，附图中描述的和/或本文中描述的逻辑流程不一定需要所示的特定顺序或连续顺序来实现期望的结果。其他实施方式可以在以下权利要求的范围内。

Claims (88)

1.一种方法，其包括：

用细胞和第一培养基的混合物填充细胞工程平台的容器；以及

通过过滤器将所述容器中的第一培养基排出，使所述细胞沉积在所述过滤器上，

其中所述细胞工程平台包括：

雾化器；以及

容器支架，其配置用于接收所述容器；以及

其中所述容器包括过滤器板和形成用于容纳细胞和培养基的孔的上部部分。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将含有有效载荷的递送溶液喷射到沉积在所述过滤器上的细胞上。

3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括在所述腔室内施加终止溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括用第二培养基填充所述容器以将所述细胞从所述过滤器再悬浮。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述排出的第一培养基被重新用作第二培养基。

6.根据权利要求4所述的方法，进一步包括搅动所述容器。

7.根据权利要求4所述的方法，进一步包括从所述容器中提取所述再悬浮的细胞。

8.根据权利要求4所述的方法，其中填充所述容器是使用泵和控制器自动进行的。

9.根据前述任一权利要求所述的方法，进一步包括在所述容器内培养所述细胞。

10.根据前述任一权利要求所述的方法，其中从所述容器中排出所述第一培养基是通过向所述容器的底部提供真空来进行的。

11.根据前述任一权利要求所述的方法，其中从所述容器中排出所述第一培养基是通过重力执行的。

12.根据权利要求3所述的方法，其中施加所述终止溶液是为了清洗所述细胞而进行的。

13.根据权利要求4所述的方法，其中用所述第二培养基填充所述腔室是作为细胞清洗过程、细胞浓度改变过程和细胞培养基改变过程中的至少一种进行的。

14.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述容器包括可释放地连接到所述过滤器板的下部部分。

15.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述容器包括存储器，其存储表征至少一个工艺参数的数据。

16.根据权利要求15所述的方法，进一步包括：

由所述细胞工程平台的控制器从所述存储器读取所述至少一个工艺参数；以及

利用所述至少一个工艺参数执行至少一个处理步骤。

17.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述容器包括存储器，其存储表征实验标识符的数据。

18.根据权利要求1-17任一权利要求所述的方法，其中所述容器包括腔室。

19.一种系统，其包括：

壳体，其包括容器支架，配置用于接收容器，所述容器包括过滤器板和形成孔的上部部分；

递送溶液施加器，其配置用于向所述孔递送雾化后的递送溶液；

显示器；以及

控制器，其包括配置用于显示至少一个工艺参数的电路。

20.根据权利要求19所述的系统，其中所述容器支架配置用于倾斜或振动所述容器。

21.根据权利要求19-20中任一权利要求所述的系统，其中所述递送溶液施加器包括喷头。

22.根据权利要求19-21中任一权利要求所述的系统，其中所述容器的尺寸设定为容纳少于1x 10⁷T细胞。

23.根据权利要求19-22中任一权利要求所述的系统，其中所述系统被配置用于自动地：

将雾化的递送溶液施加到所述容器内的过滤器上形成的细胞单层上。

24.根据权利要求19-23中任一权利要求所述的系统，其中所述递送溶液施加器包括雾化器。

25.根据权利要求24所述的系统，其中所述递送溶液施加器进一步包括质量流量控制器或体积流量控制器，用于调节气体流量以操作所述雾化器。

26.根据权利要求19-25中任一权利要求所述的系统，其中所述递送溶液施加器配置为每次致动递送10-300微升所述递送溶液。

27.根据权利要求19-26中任一权利要求所述的系统，进一步包括容纳所述递送溶液的储存容器，其中所述递送溶液包括水溶液，所述水溶液包括有效载荷。

28.根据权利要求27所述的系统，其中所述水溶液包括浓度大于0.2％(v/v)的醇，并且所述醇包括乙醇。

29.根据权利要求28所述的系统，其中所述水溶液包括大于5％的乙醇。

30.根据权利要求28所述的系统，其中所述水溶液包括5-30％的乙醇。

31.根据权利要求27所述的系统，其中所述水溶液不含醇。

32.根据权利要求27所述的系统，其中所述水溶液包括

12.5-500mM KCl。

33.根据权利要求27所述的系统，其中所述水溶液包括106mMKCl。

34.根据权利要求19-33中任一权利要求所述的系统，其中所述孔配置用于包含非粘附细胞群。

35.根据权利要求34所述的系统，其中所述非粘附细胞包括外周血单核细胞。

36.根据权利要求34所述的系统，其中所述非粘附细胞包括免疫细胞。

37.根据权利要求34所述的系统，其中所述非粘附细胞包括T淋巴细胞。

38.根据权利要求19-27中任一权利要求所述的系统，其中所述有效载荷包括信使核糖核酸(mRNA)。

39.根据权利要求38所述的系统，其中所述mRNA编码基因编辑组合物。

40.根据权利要求39所述的系统，其中所述基因编辑组合物减少PD-1的表达。

41.根据权利要求38所述的系统，其中所述mRNA编码嵌合抗原受体。

42.根据权利要求19-41中任一权利要求所述的系统，其中所述系统被配置用于将货物化合物或组合物递送至哺乳动物细胞。

43.根据权利要求19-42中任一权利要求所述的系统，其中所述非粘附细胞包括单层。

44.根据权利要求19-43中任一权利要求所述的系统，其中所述容器包括存储器，其存储表征至少一个工艺参数的数据。

45.根据权利要求44所述的系统，其中所述控制器进一步配置用于：

通过所述电路从所述存储器读取表征所述至少一个工艺参数的数据，以及

通过所述电路利用所述至少一个工艺参数执行至少一个处理步骤。

46.根据权利要求19-45中任一权利要求所述的系统，其中所述容器包括存储器，其存储表征实验标识符的数据。

47.一种系统，其包括：

壳体，其包括：

基座，

至少一个控制器，所述控制器包括配置用于控制所述系统的操作的电路，以及

显示器；

一个或多个流体回路，其包括至少一个阀门、至少一个泵、一个注射器和至少一个流体检测传感器；

腔室组件，其容纳在从壳体的前表面延伸的铰接框架内，其中所述腔室组件在操作中与大气条件密封并包括过滤器；

至少一个介质容器；

至少一个细胞培养容器，其通过所述一个或多个流体回路与所述腔室组件流体连接；以及

至少一个收集托盘，其配置用于接收所述介质或细胞。

48.根据权利要求47所述的系统，其中所述铰接框架配置用于搅动所述腔室组件。

49.根据权利要求47-48中任一权利要求所述的系统，其中所述腔室组件包括存储器，其存储表征至少一个工艺参数的数据。

50.根据权利要求49所述的系统，其中所述至少一个控制器配置用于：

通过所述电路从所述存储器读取表征所述至少一个工艺参数的数据，以及

通过所述电路利用所述至少一个工艺参数执行至少一个处理步骤。

51.根据权利要求47-50所述的系统，其中所述腔室组件包括存储器，其存储表征实验标识符的数据。

52.根据权利要求47-51中任一权利要求所述的系统，其中所述系统的操作包括细胞清洗过程、细胞浓度改变过程和细胞培养改变过程中的至少一种。

53.根据权利要求47-52中任一权利要求所述的系统，其中所述显示器包括人机界面，其配置用于接收与所述系统的操作相关联的输入。

54.根据权利要求47-53中任一权利要求所述的系统，其中所述铰接框架配置为相对于所述系统布置在其上的水平表面铰接到0-10.0度、10.1-15.0度、15.1-20.0度、20.1-25.0度、

25.1-30.0度、30.1-35.0度、35.1-40.0度或40.1-45.0度之间的角度。

55.根据权利要求47-54中任一权利要求所述的系统，其中所述铰接框架配置用于以预定或用户定义的频率在两个角度之间振荡。

56.根据权利要求55所述的系统，其中所述预定或用户定义的频率在0-0.5kHz、0.51-1.0kHz、1.1-1.5kHz、1.51-2.0kHz、

2.01-2.5kHz之间，或大于2.51kHz。

57.根据权利要求47-56中任一权利要求所述的系统，其中所述至少一个收集托盘包括冷却元件或加热元件。

58.根据权利要求47-57中任一权利要求所述的系统，其中所述基座包括布置在所述至少一个收集托盘下方的秤。

59.根据权利要求47-58中任一权利要求所述的系统，其中所述至少一个流体检测传感器相对于所述一个或多个流体回路中的至少一个流体回路布置。

60.根据权利要求59所述的系统，其中第一流体检测传感器配置用于在所述至少一个流体回路的第一位置处，并且第二流体检测传感器配置用于在所述至少一个流体回路的第二位置处，所述第一流体检测传感器和第二流体检测传感器可操作地用于计算所述至少一个流体回路的第一位置和第二位置之间的介质体积。

61.根据权利要求47-60中任一权利要求所述的系统，其中所述至少一个泵是蠕动泵。

62.根据权利要求47-61中任一权利要求所述的系统，其中所述系统包括注射器保持器用于保持所述注射器，所述注射器保持器包括光学传感器，其配置用于确定所述注射器内的流体水平或所述注射器的柱塞的位置。

63.根据权利要求62所述的系统，其中所述光学传感器包括多个光学传感器的阵列。

64.根据权利要求47-63中任一权利要求所述的系统，其中所述系统包括少一个电连接器，其配置为将仪器通信地连接到所述系统。

65.根据权利要求64所述的系统，其中所述仪器包括温度计、比重计、气压计、光电体积描记器传感器、称重传感器、生化传感器、光学传感器、换能器或微电子机器中的至少一种。

66.根据权利要求47-65中任一权利要求所述的系统，其中所述系统包括至少一个第一气体连接器，其通过第一气体回路将第一气体供应源连接至所述腔室组件。

67.根据权利要求66所述的系统，其中所述系统包括第二气体连接器，其通过第二气体回路将第二气体供应源连接至所述腔室组件，所述第二连接器配置用于独立于所述至少一个第一气体连接器操作。

68.根据权利要求47-67中任一权利要求所述的系统，其中所述系统包括至少一个吊架，其配置用于将介质源布置在所述腔室组件的上方。

69.根据权利要求68所述的系统，其中所述吊架包括配置在其内以确定所述介质源的重量的秤。

70.根据权利要求47-69中任一权利要求所述的系统，其中所述系统包括条形码读取器。

71.根据权利要求47-70中任一权利要求所述的系统，其中所述系统包括管焊接器。

72.根据权利要求47-71中任一权利要求所述的系统，其中所述系统包括至少部分地包围所述腔室组件的绝缘护套或导电护套。

73.根据权利要求47-72中任一权利要求所述的系统，其中所述腔室组件的内部表面包括配置为帮助细胞迁移或粘附至所述内部表面的涂层或图案。

74.根据权利要求47-73中任一权利要求所述的系统，其中所述腔室组件包括可从下部部分移除的上部部分，其中所述下部部分包括过滤器。

75.根据权利要求47-74中任一权利要求所述的系统，其中所述过滤器包括配置用于帮助细胞迁移或粘附到所述过滤器的涂层或图案。

76.根据权利要求66-74中任一权利要求所述的系统，其中所述上部部分包括气体端口，在所述气体端口处接收来自所述第一气体回路的气体。

77.根据权利要求67-76中任一权利要求所述的系统，其中所述上部部分包括空气扩散器开口和位于所述空气扩散器开口内的空气扩散器，所述空气扩散器连接到所述第二气体回路。

78.根据权利要求74-77中任一权利要求所述的系统，其中所述上部部分包括喷头开口和位于所述喷头开口内的喷头。

79.根据权利要求66-78中任一权利要求所述的系统，其中所述喷头包括连接到所述第一气体回路的气体入口端口和连接到包括有效载荷和醇的等渗水溶液源的流体入口端口。

80.根据权利要求47-79中任一权利要求所述的系统，其中所述至少一个控制器配置用于控制所述腔室组件内的压力、温度和气体成分中的一个或多个。

81.根据权利要求80所述的系统，其中所述气体成分包括二氧化碳、氮气和氧气中的至少一种。

82.根据权利要求47-81中任一权利要求所述的系统，其中所述腔室组件包括加热元件。

83.根据权利要求47-82中任一权利要求所述的系统，其中所述系统配置用于孵育细胞的生物反应器。

84.根据权利要求47-83中任一权利要求所述的系统，其中所述系统配置用于在细胞冷冻保存过程中使用。

85.根据权利要求47-84中任一权利要求所述的系统，其中所述系统配置用于在细胞透化过程中使用。

86.根据权利要求47-85中任一权利要求所述的系统，其中所述系统配置用于在细胞转导过程中使用。

87.根据权利要求47-86中任一权利要求所述的系统，其中所述系统配置用于在细胞转染过程中使用。

88.一种用于在没有醇的情况下将货物递送至细胞的装置，所述装置包括：

壳体，其包括：

底座，

至少一个控制器，其包括配置用于控制所述装置的操作的电路，以及

显示器；

一个或多个流体回路，其包括至少一个阀门、至少一个泵、一个注射器和至少一个流体检测传感器；

腔室组件，其容纳在从壳体的前表面延伸的铰接框架内，其中所述腔室组件在操作中与大气条件密封并包括过滤器；

至少一个介质容器；

至少一个细胞培养容器，其通过所述一个或多个流体回路流体连接至所述腔室组件；以及

至少一个收集托盘，其配置用于接收介质或细胞。