CN117164845B - 一种聚甲炔纳米簇的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于分子探针技术领域，提供了一种聚甲炔纳米簇的制备方法及其应用，通过聚甲炔纳米簇的制备方法制得的聚甲炔纳米簇在进行血管成像中的应用，在进行血管成像应用时，通过尾静脉注射直接用于成像；制得的聚甲炔纳米簇在进行神经成像中的应用，在进行神经成像时，在坐骨神经的原位直接注射进行成像。相比于传统封装方法无法有效抑制聚集诱导淬灭的缺陷，本方法制备得到的聚甲炔纳米簇能够完全释放聚甲炔染料的亮度潜力，并表现出优越的生物成像性能。

Description

一种聚甲炔纳米簇的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子探针技术领域，尤其涉及一种聚甲炔纳米簇的制备方法及其应用。

背景技术

基于荧光的活体成像由于其广泛的生物医学应用前景和临床转化的潜力而成为了一个快速发展的领域。从生物相容性和生物安全性的角度来看，有机荧光团是最合适的造影剂，因为它们的毒性相对较低。基于分子工程策略许多具有优异性能的NIR-II有机荧光团已经被开发，包括聚甲炔支架。可调的光物理性质、更高的摩尔消光系数和强荧光发射，使聚甲炔支架成为近红外显影剂的优秀候选。但是疏水性聚甲炔染料在用于活体成像之前需要一个关键的亲水化过程。然而，水溶液中显著的溶剂致变色行为和聚集诱导猝灭效应严重限制了聚甲炔染料发挥其亮度潜力。

为了解决这些在开发有效亲水化策略中遇到的挑战，需要一种全新且有效的方法。大多数现有的用于体内成像的近红外二区的聚甲炔染料是通过表面活性剂（如，DSPE-PEG₂₀₀₀，即二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）包封来制备的。然而，所形成的胶束中的大多数染料仍然处于聚集诱导淬灭的状态，这限制了它们在更长的波长窗口中成像的潜力。在这里，我们设计并合成了一系列新的聚甲炔染料，其中Flav骨架因其显著的荧光亮度和高量子产率而被选中。然后通过两步亲水过程对Flav进行修饰，得到聚乙二醇化的Flav(即FlavP₂₀₀₀)。利用FlavP₂₀₀₀和DSPE-PEG₂₀₀₀之间的自适应共组装策略，我们制备了高效发光的DSPE-PEG₂₀₀₀@FlavP₂₀₀₀(简称为DSPE@FlavP₂₀₀₀)纳米粒子。当FlavP₂₀₀₀与DSPE@FlavP₂₀₀₀共组装或与活生物体中的蛋白质原位共组装时，FlavP₂₀₀₀具有自主调节其构象的能力。与使用DSPE-PEG₂₀₀₀直接封装完全疏水性染料的传统封装方法相比，DSPE@FlavP₂₀₀₀表现出显著改善的光物理性质，包括水溶液中的锐吸收和较高的荧光量子产率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚甲炔纳米簇的制备方法及其应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种聚甲炔纳米簇的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1、合成如下结构的聚甲炔染料：

；

；

；

或符合以下结构通式的染料：

；

步骤S2、通过两步亲水过程对Flav进行修饰，得到聚乙二醇化的Flav：

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上式中，n=12时为FlavP₅₅₀；n=44时为FlavP₂₀₀₀；

步骤S3、合成IPA接枝的IPA-FlavP₂₀₀₀：

；

步骤S4、FlavP₂₀₀₀和DSPE-PEG₂₀₀₀之间或FlavP₅₅₀和DSPE-PEG₂₀₀₀之间进行共组装，制得DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP_550。

进一步的，所述DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀共组装纳米簇的制备步骤，具体包括：

a. 将DSPE-PEG₂₀₀₀溶解在DMSO中形成母液；

b. 50微升母液和5微升FlavP₂₀₀₀或FlavP₅₅₀通过涡旋混合，得到混合物；

c. 将混合物加入到PBS中，形成10 ml溶液，将溶液在0-4 ℃下进行超声处理30min，随后在40-60 ℃的烘箱中孵育1 h后，在室温下避光稳定1 h；

d. 通过超滤离心管将步骤c得到的溶液浓缩至1 ml，即获得DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀母液，保存在0-4℃下。

进一步的，所述DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₂₀₀₀的摩尔比或DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₅₅₀的摩尔比为50:1。

进一步的，所述FlavP₂₀₀₀的自组装纳米簇的制备步骤，具体包括：

将2-20 mM的FlavP₂₀₀₀母液溶解在1 ml 的PBS中，得到FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇，保存在0-4℃下。

进一步的，将所述FlavP₂₀₀₀替换为IPA-FlavP₂₀₀₀，得到IPA-FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇。

进一步的，所述IPA-FlavP₂₀₀₀或FlavP₂₀₀₀在体内或体外环境中，与血清或血液中的蛋白质发生原位的共组装。

一种如上述制备方法制得的聚甲炔纳米簇。

一种如上述聚甲炔纳米簇在进行血管成像中的应用，在进行血管成像应用时，通过尾静脉注射直接用于成像。

一种如上述聚甲炔纳米簇在进行神经成像中的应用，在进行神经成像时，在坐骨神经的原位直接注射进行成像。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

与传统的通过表面活性剂直接封装的方法相比，本方法具有制备简单高效，发光效率高等优势。在体内的生物成像应用中，DSPE@FlavP₂₀₀₀能够在1500 nm以上的近红外区对小鼠的脑血管以及后肢血管进行高信噪比成像。FlavP₂₀₀₀和IPA-FlavP₂₀₀₀能够在体内与体外的特定环境下发生解组装引起的亮度激活现象，这种全新的现象是首次发现。同时，IPA-FlavP₂₀₀₀具有显著延长的血液循环时间，这使得其在临床转化中具有了巨大的潜力。

附图说明

图1中，（a）为Flav、ThFlav和PhFlav的吸收光谱；（b）为Flav、ThFlav和PhFlav的荧光发射光谱；（c）为Flav、ThFlav和PhFlav在980 nm激发下的荧光强度值。

图2为本发明中聚甲炔纳米簇的制备过程示意图。

图3中，（a）为FlavP₂₀₀₀或FlavP₅₅₀的亮度优化曲线图；（b）为DSPE@FlavP₂₀₀₀、DSPE@FlavP₅₅₀和DSPE@Flav的吸收谱图；（c）为DSPE@FlavP₂₀₀₀、DSPE@FlavP₅₅₀和DSPE@Flav的荧光发射（亮度优化后比例）；（d）为DSPE@FlavP₂₀₀₀动态光散射粒径分布直方图；（e）为DSPE@FlavP₅₅₀动态光散射粒径分布直方图。

图4中，（a）为DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@Flav用于小鼠的后肢血管成像；（b）为DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@Flav用于小鼠的后肢血管成像的荧光发射；（c）为DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@Flav用于小鼠的脑血管成像；（d）为DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@Flav用于小鼠的脑血管成像的荧光发射。

图5中，（a）为FlavP₂₀₀₀和IPA-FlavP₂₀₀₀在装有不同液体的离心管中的成像图；（b）为对图5（a）中的荧光强度的统计学测量值。

图6中，（a）为FlavP₂₀₀₀和IPA-FlavP₂₀₀₀分别给药后，小鼠后肢血管成像图；（b）为每组四只老鼠的后肢血管的荧光强度的统计学测量值。其中，FlavP₂₀₀₀在给药后1 min时间点的荧光强度值设置为100%；而IPA-FlavP₂₀₀₀在给药后前15 min的荧光强度处于不稳定的增长期，因此设置其在给药后15 min时的荧光强度为100%。

图7中，（a）为大鼠坐骨神经原位注射示意图；（b）为FlavP₂₀₀₀对两组大鼠给药后，在选定时间点对大鼠的坐骨神经进行成像；（c）为IPA-FlavP₂₀₀₀对两组大鼠给药后，在选定时间点对大鼠的坐骨神经进行成像；（d）为FlavP₂₀₀₀给药后，对选定时间点的大鼠坐骨神经成像时，在图示（点划线）横截面处的归一化荧光强度值；（e）为IPA-FlavP₂₀₀₀给药后，对选定时间点的大鼠坐骨神经成像时，在图示（点划线）横截面处的归一化荧光强度值。

图8为本发明中间体2a的核磁氢谱。

图9为本发明中间体2b的核磁氢谱。

图10为本发明中间体3a的核磁氢谱。

图11为本发明中间体3b的核磁氢谱。

图12为本发明中间体3c的核磁氢谱。

图13为本发明中间体4a的核磁氢谱。

图14为本发明中间体4b的核磁氢谱。

图15为本发明中间体4c的核磁氢谱。

图16为本发明聚甲炔染料Flav的核磁氢谱。

图17为本发明聚甲炔染料PhFlav的核磁氢谱。

图18为本发明聚甲炔染料ThFlav的核磁氢谱。

图19为本发明Flav亲水化第一步中间体6a的核磁氢谱。

图20为本发明亲水化修饰后的FlavP₅₅₀的核磁氢谱。

图21为本发明亲水化修饰后的FlavP₂₀₀₀的核磁氢谱。

图22为本发明IPA接枝引入的中间体8a的核磁氢谱。

图23为本发明亲水化修饰后的IPA-FlavP₂₀₀₀的核磁氢谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

本发明一个实施例提供的一种聚甲炔纳米簇的制备方法，包括以下步骤：

合成如下结构的聚甲炔染料：

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；

Flav为发射波长位于近红外二区的一种聚甲炔染料。其主要是由具有多种取代基的含氧杂环和以氯代环己烯为中心的多烯烃组成的大共轭疏水结构。由如上通式所示，PhFlav与ThFlav均为Flav结构的变体，由R₁或R₂取代基替换后得到，相较于Flav，PhFlav与ThFlav的光物理性质如吸收和发射波长均有所改变。

聚甲炔染料Flav、PhFlav以及ThFlav的制备方法，合成路线如下：

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；

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；

上述合成过程中，原料1a和1b分别与路线a中箭头上方所示结构的芳香酮发生羟醛缩合与分子内环化反应，即通过一锅法得到了2a和2b分子。2a和2b分子分别与路线b中所示的二乙胺或二苯胺在催化剂的作用下反应生成了3a、3b和3c分子。3a、3b和3c分子分别与路线c中所示的甲基格氏试剂发生反应，然后使用四氟硼酸淬灭，得到4a、4b和4c分子。4a、4b和4c分子分别与路线d中的箭头上方所示结构在弱碱催化的条件下在不同溶剂中发生反应分别得到七甲炔染料Flav（5a）、PhFlav（5b）以及ThFlav（5c）。

上述方案中为优选实施例，制备过程中，可以选择使用甲醇、乙醇、乙腈、正丁醇、甲苯、二甲苯、乙酸或乙酸酐中的任意一种或几种的组合作为反应溶剂；选择包括但不限于三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、2,6-二叔丁基四甲基吡啶、醋酸铵、醋酸钾、醋酸钠中的任意一种或几种的组合作为弱碱催化剂，选择室温至溶剂的回流温度的某一温度作为反应温度，包括但不限于以上组合。

在本发明的实施例中，优选的，如图1所示，分别给出了Flav、PhFlav以及ThFlav的吸收光谱与荧光发射光谱，并比较了三者在980 nm激发下的荧光强度，最终选出Flav作为下一步的优选实施例。

作为本发明的一种优选实施例，通过两步亲水过程对Flav进行修饰，得到聚乙二醇化的Flav（即FlavP₅₅₀或FlavP₂₀₀₀，其中n=12时为FlavP₅₅₀；n=44时为FlavP₂₀₀₀）。

作为本发明的一种优选实施例，所述DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀共组装纳米簇的制备步骤，具体包括：

a. 将DSPE-PEG₂₀₀₀溶解在DMSO中形成母液（10-100 mM）；

b. 50微升母液和5微升FlavP₂₀₀₀或FlavP₅₅₀（浓度在DMSO中为2-20 mM）通过涡旋混合，得到混合物；其中，涡旋设备的型号为QL-902；

c. 将混合物加入到PBS中，形成10 ml溶液，将溶液在0-4 ℃下进行超声处理30min，随后在40-60 ℃的烘箱中孵育1 h后，在室温下避光稳定1 h；其中，超声仪器的型号为KQ5200DE；

d. 通过超滤离心管（8000 rpm；30000 M.w.）将步骤c得到的溶液浓缩至1 ml，即获得DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀母液，保存在0-4℃下，待用。

作为本发明的一种优选实施例，所述DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₂₀₀₀的摩尔比或DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₅₅₀的摩尔比为50:1。

在本发明实施例中，优选的，如图3所示，制备了基于全新自适应共组装策略的聚甲炔纳米簇，并对其进行亮度优化与表征。具体地，参见图a，通过优化DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₂₀₀₀或DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₅₅₀的摩尔比，最终选定摩尔比为50:1，此时DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀具有更高的亮度。随后测定了DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@FlavP₅₅₀的吸收与荧光发射光谱，参见图b和图c，与传统封装方法的DSPE@Flav（DSPE-PEG₂₀₀₀与Flav的摩尔比也为50:1）相比，DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@FlavP₅₅₀都具有在高波长处显著改善的锐吸收峰，以及显著增强的荧光发射。最后本发明通过动态光散射表征了DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@FlavP₅₅₀的粒径分布特征，参见图d和图e。

如图4所示， DSPE@FlavP₂₀₀₀被用于小鼠后肢血管及脑血管成像，并以DSPE@Flav作为对照。具体地，在后肢血管成像开始前，我们首先向两组小鼠分别尾静脉注射等剂量的DSPE@FlavP₂₀₀₀和DSPE@Flav（给药剂量均为500微摩尔，200微升）。随后在给药后1 min左右进行成像。成像条件均为980 nm激发，并使用1500 nm长通滤光片。如图a和图b所示，DSPE@FlavP₂₀₀₀能够以高达44.8的信噪比对小鼠后肢血管进行清晰的成像，而DSPE@Flav则由于聚集诱导淬灭在1500 nm以上的区域没有明显的信号。脑血管成像实验步骤与成像条件与后肢血管成像一致，如图c和图d所示，DSPE@FlavP₂₀₀₀能够以高达44.8的信噪比对小鼠脑血管进行清晰的成像，而DSPE@Flav则由于聚集诱导淬灭在1500 nm以上的区域没有明显的信号。

作为本发明的一种优选实施例，合成IPA-FlavP₂₀₀₀分子，IPA接枝能够通过与白蛋白的动态分子间相互作用来延长被接枝分子在生物体的血液中的循环时间。IPA-FlavP₂₀₀₀分子的结构如下：

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作为本发明的一种优选实施例，所述FlavP₂₀₀₀的自组装纳米簇的制备步骤，具体包括：

将2-20 mM的FlavP₂₀₀₀母液溶解在1 ml 的PBS中，得到FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇，保存在0-4℃下，待用。

作为本发明的一种优选实施例，将所述FlavP₂₀₀₀替换为IPA-FlavP₂₀₀₀，得到IPA-FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇。

作为本发明的一种优选实施例，FlavP₂₀₀₀与IPA-FlavP₂₀₀₀均能够在体外的特定环境下发生解组装引起的亮度激活现象（Brightness activation induced bydisassembly，即BAD现象）并与蛋白质发生原位的共组装。

在本发明实施例中，优选的，参见图5，在PBS中处在聚集诱导淬灭的IPA-FlavP₂₀₀₀和FlavP₂₀₀₀自组装纳米团簇，能够在小鼠全血（mice blood）、小鼠血清（mice serum）、胎牛血清（FBS）、通过超滤离心管过滤后的FBS（FBS after ultrafiltration）中均具有显著的荧光强度（参见图a），这说明了IPA-FlavP₂₀₀₀和FlavP₂₀₀₀自组装纳米团簇在上述介质中发生了一种解组装引发的荧光激活现象，其荧光强度的统计值总结在图b中。值得注意的是，在BSA（50 mg/ml）中并没有观察到这一现象。

我们认为这种解组装引发的荧光激活现象与基于全新自适应共组装策略的聚甲炔纳米簇从本质上是一致的。区别在于前者发生时，血清或者血液中的蛋白质作为了“表面活性剂”的角色，并与IPA-FlavP₂₀₀₀或FlavP₂₀₀₀发生了原位的共组装，因此这种解组装引发的荧光激活现象也应被划分到本发明的核心内容当中。

如图6所示，我们验证了这种解组装引发的荧光激活现象能够在小鼠体内发生。具体的，我们进行了长时间小鼠后肢血管成像监测实验。在成像开始前，我们首先向两组小鼠分别尾静脉注射等剂量的FlavP₂₀₀₀和IPA-FlavP₂₀₀₀（给药剂量均为500微摩尔，200微升）。随后在给药后选定的时间点进行成像（图a）。随后给出统计学荧光强度值随时间变化的曲线（图b）。可以看出，首先原本聚集诱导淬灭的IPA-FlavP₂₀₀₀和FlavP₂₀₀₀自组装纳米团簇在尾静脉注射后均能够点亮小鼠的血管。另外可以看到IPA-FlavP₂₀₀₀荧光强度的血液循环半衰期长达10 h，是FlavP₂₀₀₀（1 h）的10倍。

如图7所示，我们随后进行了大鼠的坐骨神经原位注射与成像实验（图a）。参见图b和图c ，FlavP₂₀₀₀和IPA-FlavP₂₀₀₀分别对两组大鼠给药后（给药剂量均为500微摩尔，2微升，并在实际操作中使用微量注射器），在选定时间点对大鼠的坐骨神经进行成像。参见图d和图e，FlavP₂₀₀₀和IPA-FlavP₂₀₀₀分别给药后，对选定时间点的大鼠坐骨神经成像时，在图示（点划线）横截面处的归一化荧光强度值。我们可以看到这种解组装引发的荧光激活现象也能够在大鼠的神经中发生。FlavP₂₀₀₀和IPA-FlavP₂₀₀₀在给药后0.1 s的荧光强度很低，随后荧光强度逐渐增强，均在给药后约5.5 min达到峰值。

实施例1、中间体2a、2b、3a、3b、3c、4a、4b、4c、Flav（5a）、PhFlav（5b）、ThFlav（5c）的制备；

2a、2b、3a、3b、3c、4a、4b、4c、Flav（5a）、PhFlav（5b）、ThFlav（5c）结构式及表征数据如下：

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中间体2a：将4-溴-2-羟基苯乙酮（1 mmol）与2,6-二甲氧基苯甲醛（1 mmol）一齐与吡啶（0.5 mmol）溶解在二甲基亚砜（10 ml）中，加入一当量的碘单质，混合物溶液在氮气保护下150℃加热搅拌回流24 h。反应完成后用TLC板监测，乙酸乙酯萃取反应混合物三次并用水洗多次，有机层用无水硫酸镁充分干燥并过滤，旋蒸除去有机溶剂得到粗产品，经柱层析法分离提纯得到淡黄色固体2a（产率67%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.11 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H), 7.42(t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.42 (s, 1H), 3.80 (s, 6H).LC-HRMS (ESI-TOF): calcd. for C₁₇H₁₃BrO₄ [M + H]⁺ 360.9997; found 361.0082；

中间体2b：2b与2a的合成步骤以及原料当量比基本一致。纯化后的产品为黄色固体比纯化后2a的颜色更深（产率为63%）。¹H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.07 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.78 – 7.70 (m, 2H), 7.61 (dd, J = 5.0, 1.2 Hz, 1H), 7.54 (dd,J = 8.5, 1.7 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 5.0, 3.8 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H). LC-HRMS(ESI-TOF): calcd. for C₁₃H₇BrO₂S [M + H]⁺ 306.9350; found 306.9439；

中间体3a：将2a（1 mmol）、Sphos-Pd-G3（0.1 mmol）、Sphos（0.1 mmol）和碳酸铯（1.5 mmol）共同溶解在绝干甲苯（0.175 M）中，然后向混合物溶液中加入二乙胺（3 mmol），混合溶液进行“冻暖抽”操作三次，提供无水无氧的体系环境。溶液在110℃下搅拌回流，溶液逐渐变为红棕色。24 h后反应完成，使用TLC法监测。混合物溶液使用二氯甲烷萃取三次，随后用无水硫酸镁充分干燥并过滤，旋蒸除去有机溶剂得到粗产品，经柱层析纯化后得到黄色油状产物（产率81%）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.80 (d, J = 9.1 Hz, 1H),7.47 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 9.1, 2.4 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 8.5Hz, 2H), 6.54 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.76 (s, 6H), 3.44 (q, J =7.0 Hz, 4H), 1.11 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-HRMS (ESI-TOF): calcd. for C₂₁H₂₃NO₄[M + H]⁺ 353.1627; found 354.1680；

中间体3b：3b的合成步骤以及反应原料和催化剂的当量比与3a的合成保持一致（产率为70%）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.53 – 7.18(m, 11H), 6.89 (dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.55 (d,J = 2.2 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 3.74 (s, 6H). LC-HRMS (ESI-TOF): calcd. forC₂₉H₂₃NO₄ [M + H]⁺ 449.1627; found 450.1696；

中间体3c：3c与3a的合成步骤以及反应原料之间和催化剂的当量比保持一致（产率为68%）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.94 (ddd, J = 15.6, 4.4, 1.2 Hz, 2H),7.77 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 5.0, 3.7 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 9.1,2.4 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.33 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.47 (q, J = 7.0 Hz,4H), 1.15 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-HRMS (ESI-TOF): calcd. for C₁₇H₁₇NO₂S [M + H]⁺299.0980; found 300.1062；

中间体4a：将3a（1 mmol）溶解在绝干的四氢呋喃（0.1 M）中，冰水浴使溶液温度降到0℃以下，将0℃保存的甲基氯化镁（溶解在四氢呋喃中，1.0 M，2.4 mmol）在冰水浴下逐滴缓慢加入到上述溶液中，撤去冰水浴，反应体系逐渐恢复到室温。过夜反应。反应完成后用TLC以乙酸乙酯/正己烷（1:10）混合溶剂体系监测反应情况，反应混合物使用四氟硼酸（水溶液，5%）耦合淬灭，然后用二氯甲烷/水体系进行萃取，使用无水硫酸镁充分干燥，过滤并旋蒸除去有机溶剂。粗产品在乙酸乙酯溶液中纯化析出得到暗红色固体产物（产率85%）。¹HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 8.5 Hz, 1H),7.59 – 7.57 (m, 2H), 7.18 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.82(s, 6H), 3.76 – 3.67 (m, 4H), 2.89 (s, 1H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-HRMS(ESI-TOF): calcd. for C₂₂H₂₆NO₃ ⁺ [M]⁺ 352.1907; found 352.1914；

中间体4b：4b的合成步骤以及反应原料的当量比与4a的合成均保持一致（产率80%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.20 (d, J = 9.5 Hz, 1H) 7.59 (s, 1H), 7.53 –7.47 (m, 5H), 7.41 – 7.36 (m, 3H), 7.33-7.30 (m, 4H), 6.97 (s, 1H), 6.66 (d,J = 8.5 Hz, 2H), 3.84 (s, 6H), 3.02 (s, 3H). LC-HRMS (ESI-TOF): calcd. forC₃₀H₂₆NO₃ ⁺ [M]⁺ 448.1907; found 448.1910；

中间体4c：4c与4a的合成步骤以及反应原料的当量比保持一致（产率为78%）。¹HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.39 (dd, J = 4.0, 1.3 Hz, 1H), 8.31 (dd, J = 4.9,1.2 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.51 – 7.40 (m, 2H),7.20 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.71 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 2.82 (s, 3H), 1.24 (t, J= 7.0 Hz, 6H). LC-HRMS (ESI-TOF): calcd. for C₁₈H₂₀NO⁺ [M]⁺ 298.1260; found298.1267；

Flav（5a）：将4a（1 mmol）、N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐（0.45 mmol）和2,6-二叔丁基-4-甲基吡啶（3 mmol）全部溶解在正丁醇（0.165M）和甲苯（0.35 M）的混合溶剂中，进行“冻抽暖”操作三次，然后将反应体系加热到100℃，搅拌反应10 min得粗产品，然后经过柱层析纯化得到终产物，为深紫黑色固体（产率为40%）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.10 – 7.72 (m, 4H), 7.37 (t, J = 8.8 Hz,2H), 7.00 – 6.56 (m, 10H), 6.62 (s, 2H), 3.66 (s, 12H), 3.48 – 3.35 (m, 8H),2.76 – 2.6 (m, 4H), 1.91 – 1.76 (m, 2H), 1.10 (t, J = 6.4 Hz, 12H). LC-HRMS(ESI-TOF): calcd. for C₅₂H₅₆ClN₂O₆ ⁺ [M]⁺ 839.3821; found 839.3788；

PhFlav（5b）：Ph-Flav的合成路线基本与Flav一致，第一步反应完全相同，仅是第二步反应中反应原料之一的二乙胺被替换成为了二苯胺（产率为37%）。¹H NMR (400 MHz,CD₃CN) δ 8.29 – 8.18 (m, 2H), 8.02 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.59 – 7.36 (m, 16H),7.34 – 7.23 (m, 8H), 7.17 (s, 2H), 7.04 – 6.93 (m, 2H), 6.89 (s, 2H), 6.69(d, J = 8.3 Hz, 4H), 3.85 (s, 12H), 2.93 – 2.84 (m, 4H), 2.16 – 2.05 (m, 2H).MALDI-TOF-MS: calcd. for C₆₈H₅₆ClN₂O₆ ⁺ [M]⁺ 1031.382; found 1031.907；

ThFlav（5c）：将4c（1 mmol）、N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐（0.45 mmol）和醋酸钠（3 mmol）共同加入绝干的烧瓶中，并溶解在无水乙醇（0.5 M）中，进行“冻抽暖”操作三次，然后将反应体系加热到80℃，回流并搅拌10 min得粗产品，然后经过柱层析纯化得到终产物，为深紫色固体（产率为40%）。¹H NMR (400 MHz,CD₃CN) δ 8.19 – 7.93 (m, 8H), 7.52 – 7.29 (m, 4H), 7.07 – 6.79 (m, 4H), 6.70– 6.55 (m, 2H), 3.59 – 3.45 (m, 8H), 2.86 – 2.76 (m, 4H), 1.95 – 1.84 (m,2H), 1.18 (t, J = 7.6 Hz, 12H). LC-HRMS (ESI-TOF): calcd. for C₄₄H₄₄ClN₂O₂S₂ ⁺[M]⁺ 731.2527; found 731.2471。

实施例2、亲水化FlavP₂₀₀₀和FlavP₅₅₀的制备；

结构式及制备过程如下：

；

；

上述合成过程中，Flav（5a）首先与巯基丙酸在弱碱条件下发生亲核取代反应得到6a分子，6a分子随后与两种不同分子量的甲氧基封端的氨基聚乙二醇发生反应得到FlavP₅₅₀或FlavP₂₀₀₀。

中间体6a：将3-巯基丙酸（3 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（3 mmol）加入到干燥的烧瓶中，并溶解在无水DMSO （0.1 M）中，混合物在室温下搅拌30 min。随后在搅拌下向混合物中加入Flav （5a）（1 mmol），并在保护气体气氛下加热至70℃，反应1h。通过TLC监测反应。粗产物通过硅胶快速柱色谱纯化，得到6a为紫黑色固体（产率为70%）。¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ 8.60 – 8.46 (m, 2H), 7.91 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 8.4 Hz,2H), 7.02 (s, 2H), 6.93 – 6.78 (m, 4H), 6.66 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 6.50 (s,2H), 3.83 (s, 12H), 3.55 – 3.35 (m, 8H), 3.00 – 2.89 (m, 2H), 2.75 – 2.89 (m,4H), 1.96 – 1.82 (m, 2H), 1.53 – 1.50 (m, 2H), 1.30 – 1.18 (m, 12H). MALDI-TOF-MS: calcd. for C₅₅H₆₁N₂O₈S⁺ [M]⁺ 909.414; found 909.026；

产品FlavP₂₀₀₀和FlavP₅₅₀：将6a（1 mmol）和2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（1 mmol）加入到干燥的烧瓶中，并溶解在无水THF （0.1 M）中，混合物在室温下搅拌30 min。随后向混合物中加入mPEG₂₀₀₀- NH₂/ mPEG₅₅₀- NH₂ (1.1 mmol)和N,N-二异丙基乙胺（2 mmol），然后在保护气体气氛下搅拌12 h。通过TLC监测反应。粗产物通过硅胶快速柱色谱纯化，得到黑色固体（产率为67%）。¹H NMR of FlavP₂₀₀₀ (400 MHz,CDCl₃) δ 8.83 – 7.96 (m, 4H), 7.60 – 7.35 (m, 6H), 7.02 – 6.64 (m, 8H), 3.85(s, 12H), 3.65 (s, 201H), 3.57 – 3.52 (m, 8H), 3.39 (s, 3H), 2.83 – 2.71 (m,2H), 2.60 – 2.52 (m, 4H), 2.27 – 2.17 (m, 2H), 2.06 – 1.96 (m, 2H), 1.66 –1.57 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.3 Hz, 12H). FlavP₂₀₀₀ was confirmed using MALDI-TOF-MS. Expected M.W. 1441, Measured M.W. 1449; ¹H NMR of FlavP₅₅₀ (400 MHz,CDCl₃) δ 8.79 – 7.95 (m, 4H), 7.63 – 7.39 (m, 6H), 7.00 – 6.89 (m, 4H), 6.68(d, J = 8.8 Hz, 4H), 3.85 (s, 12H), 3.65 (s, 56H), 3.57 – 3.53 (m, 8H), 3.38(s, 3H), 2.84 – 2.74 (m, 2H), 2.61 – 2.49 (m, 4H), 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H),1.95 – 1.91 (m, 2H), 1.64 – 1.59 (m, 5H), 1.34 – 1.31 (m, 12H). FlavP₅₅₀ wasconfirmed using MALDI-TOF-MS. Expected M.W. 2891, Measured M.W. 2901。

实施例3、IPA-FlavP₂₀₀₀的制备；

结构式及制备过程如下：

；

中间体8a：将6a（1 mmol）和2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（1 mmol）加入到干燥的烧瓶中，并溶解在无水DMF(0.1 M)中，混合物在室温下搅拌30 min。随后向混合物中加入原料7a（1.1 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（2 mmol），然后在保护气体气氛下搅拌12 h。通过TLC监测反应。粗产物通过硅胶快速柱色谱纯化，得到IPA-Flav（8a），为黑色固体（产率为70%）。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.54 (s, 2H), 7.93(d, J = 9.3 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 7.08– 6.91 (m, 4H), 6.89 (d, J = 7.9 Hz, 4H), 6.67 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 6.57 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 6.54 – 6.46 (m, 2H), 6.19 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 6.19 (q, J =6.2 Hz, 1H), 3.83 (s, 12H), 3.58 (s, 3H), 3.54 – 3.41 (m, 8H), 3.09 (q, J =6.2 Hz, 2H), 3.02 – 2.87 (m, 2H), 2.79 – 2.60 (m, 4H), 2.50 (t, J = 7.9 Hz,2H), 2.44 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.16 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.98 – 1.87 (m, 2H),1.85 – 1.78 (m, 2H), 1.63 – 1.57 (m, 4H), 1.34 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 1.25 (t,J = 7.1 Hz, 12H). MALDI-TOF-MS: calcd. for C₇₂H₈₄IN₄O₁₀S⁺ [M]⁺ 1323.4947; found1322.860；

产品IPA-FlavP₂₀₀₀：将8a（1 mmol）和2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（1 mmol）加入到干燥的烧瓶中，并溶解在无水四氢呋喃(0.1 M)中，混合物在室温下搅拌30 min。随后向混合物中加入mPEG₂₀₀₀- NH₂ (1.1 mmol)和N,N-二异丙基乙胺（2 mmol），然后在保护气体气氛下搅拌12 h。通过TLC监测反应。粗产物通过硅胶快速柱色谱纯化，得到黑色固体（产率为41%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.55 (d, J = 13.5 Hz,2H), 7.92 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 8.4 Hz,2H), 7.05 (s, 2H), 6.96 – 6.79 (m, 6H), 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 6.51 (s,2H), 3.83 (s, 12H), 3.65 (s, 194H), 3.50 – 3.45 (m, 8H), 3.39 (s, 3H), 3.05 –2.92 (m, 2H), 2.84 – 2.69 (m, 4H), 2.61 – 2.50 (m, 4H), 2.33 – 2.21 (m, 4H),2.00 – 1.84 (m, 6H), 1.63 – 1.59 (m, 2H), 1.30 – 1.19 (m, 12H). IPA-FlavP₂₀₀₀was confirmed using MALDI-TOF-MS. Expected M.W. 3291, Measured M.W. 3303。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (7)

1.一种聚甲炔纳米簇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1、合成如下结构的聚甲炔染料：

；

步骤S2、通过两步亲水过程对Flav进行修饰，得到聚乙二醇化的Flav：

；

上式中，n=12时为FlavP₅₅₀；n=44时为FlavP₂₀₀₀；

步骤S3、FlavP₂₀₀₀和DSPE-PEG₂₀₀₀之间或FlavP₅₅₀和DSPE-PEG₂₀₀₀之间进行共组装，制得DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀。

2.根据权利要求1所述的聚甲炔纳米簇的制备方法，其特征在于，所述DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀共组装纳米簇的制备步骤，具体包括：

a. 将DSPE-PEG₂₀₀₀溶解在DMSO中形成母液；

b. 50微升母液和5微升FlavP₂₀₀₀或FlavP₅₅₀通过涡旋混合，得到混合物；

c. 将混合物加入到PBS中，形成10 ml溶液，将溶液在0-4 ℃下进行超声处理30 min，随后在40-60 ℃的烘箱中孵育1 h后，在室温下避光稳定1 h；

d. 通过超滤离心管将步骤c得到的溶液浓缩至1 ml，即获得DSPE@FlavP₂₀₀₀或DSPE@FlavP₅₅₀母液，保存在0-4℃下。

3.根据权利要求2所述的聚甲炔纳米簇的制备方法，其特征在于，所述DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₂₀₀₀的摩尔比或DSPE-PEG₂₀₀₀与FlavP₅₅₀的摩尔比为50:1。

4.一种聚甲炔纳米簇的制备方法，其特征在于，包括：

制备FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇或制备IPA-FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇；

制备FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇的具体步骤包括：

将2-20 mM的FlavP₂₀₀₀母液溶解在1 ml 的PBS中，得到FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇，保存在0-4℃下；

制备IPA-FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇的具体步骤包括：

合成IPA接枝的IPA-FlavP₂₀₀₀；将2-20 mM的IPA-FlavP₂₀₀₀母液溶解在1 ml 的PBS中，得到IPA-FlavP₂₀₀₀自组装纳米簇，保存在0-4℃下；

其中，下式中，n=44时为FlavP₂₀₀₀；

；

IPA分子的结构式如下：

；

IPA-FlavP₂₀₀₀的结构式如下：

。

5.一种根据权利要求1-4任一所述的制备方法制得的聚甲炔纳米簇。

6.一种根据权利要求5所述的聚甲炔纳米簇在制备进行血管成像试剂中的应用。

7.一种根据权利要求5所述的聚甲炔纳米簇在制备进行神经成像试剂中的应用。