CN117159598A

CN117159598A - 植物乳植杆菌Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途及产品

Info

Publication number: CN117159598A
Application number: CN202311446478.2A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 杨绿竹; 朱明明; 刘欢; 孔素芬; 朱建国
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2023-11-02
Filing date: 2023-11-02
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2043-11-02
Also published as: CN117159598B

Abstract

本发明植物乳植杆菌Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途及产品属于微生物技术领域。本发明提供保藏编号为CCTCC No:M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途。基于该菌株Lp18，本发明还提供以其作为活性成分的增强免疫的药物、和具有增强免疫功能的保健食品。本发明提供的植物乳植杆菌Lp18能有效缓解免疫抑制小鼠的体重下降、改善脏器指数、修复肠道组织损伤、调节肠道菌群并具有广谱抑菌性能。

Description

植物乳植杆菌Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途及产品

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及植物乳植杆菌Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途及产品。

背景技术

免疫系统具有抵御病原微生物及预防感染疾病的能力。当机体免疫系统受损时，免疫反应会被抑制，导致机体防御、识别及清除外来抗原或病原微生物等的能力下降，严重危害健康。临床上许多药物的使用会带来一定的副作用。因此，合理使用免疫增强剂防治免疫抑制性疾病至关重要。

益生菌被定义为“活的微生物，当摄入足够数量时，对宿主的健康有益”，其对胃肠道中胃酸、胆汁耐受，可定植在肠道内，增强宿主免疫系统。益生菌可作用于信号通路而影响机体炎症和免疫反应。Th细胞通过分泌大量细胞因子发挥免疫学效应，Th1细胞分泌与细胞免疫相关的细胞因子（IL-2，TNF-α），Th2分泌与体液免疫相关的细胞因子（IL-4，IL-6，IL-10）。益生菌能够调节Th1和Th2细胞因子的分泌，维持细胞因子分泌动态平衡，从而调节或协助免疫应答。益生菌还可促进分泌型免疫球蛋白A（SIgA）分泌，防止病原菌侵入肠道，调节肠黏膜免疫系统。

肠道微生物对免疫系统有重要影响，肠道微生态失调降低肠粘膜屏障的完整性，使肠道内病原菌增加，有益菌减少，导致机体免疫系统紊乱、出现炎症或氧化应激等，从而引发相关疾病。肠道微生物可与宿主小肠上皮细胞、细菌相互作用来维持肠道稳态，增强宿主免疫功能。益生菌改变宿主特定部位的菌群组成，可抑制病原菌在肠道内定植，并激活免疫应答清除病原菌，维持宿主肠黏膜保护层健康。此外，一些菌株可以通过产生细菌素来抑制有害细菌的生长。益生菌还可通过发酵碳水化合物，产生短链脂肪酸（SCFAs），为细胞提供能量，抑制肠道炎症。

植物乳植杆菌是一种重要的功能性益生菌，这类菌株已被报道具有缓解结肠炎、抗氧化、降血糖等多种功能，同时其免疫调节的作用也已见报道。然而，目前已报道的具有免疫调节作用的植物乳植杆菌功能较为单一，尚无法同时实现修复肠道损伤、促进多种细胞因子分泌、调节肠道菌群平衡、广谱抗菌等多种功能。

因此，本领域仍然需要开发更多的具有免疫增强作用且功能丰富、抗菌能力较强的植物乳植杆菌新菌株。

发明内容

为了解决现有技术存在的：具有免疫调节作用的植物乳植杆菌功能较为单一，尚无法同时实现修复肠道损伤、促进多种细胞因子分泌、调节肠道菌群平衡、广谱抗菌等多种功能的问题，并基于本领域的上述需求，本发明提供植物乳植杆菌Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途及产品。

本发明的技术方案如下：

保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途。

所述增强免疫包括：修复损伤肠道、提高细胞因子和免疫球蛋白水平、抑制体重下降、缓解脾脏肿大及胸腺萎缩、调节肠道菌群。

所述细胞因子包括：TNF-α，IL-6，IL-1β，IL-17；

优选地，所述免疫球蛋白指分泌型免疫球蛋白A。

所述调节肠道菌群包括：提高ACE和Chao 1指数。

所述调节肠道菌群还包括：提高毛螺菌科_NK4A136_组（Lachnospiraceae_ NK4A136_group），未分类的颤螺旋菌科（unclassified_Oscillospiraceae），颤杆菌克属（Oscillibacter），另枝菌属（Alistipes），罗氏菌属（Roseburia）和经黏液真杆菌属（Blautia）的相对丰度。

所述缓解脾脏肿大及胸腺萎缩指：降低脾脏指数并升高胸腺指数。

一种增强免疫的药物，包括：药效活性成分；所述药效活性成分包括：保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18。

所述的一种增强免疫的药物，还包括：药学上可接受的辅料。

一种具有增强免疫功能的保健食品，包括：活性成分；所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18。

所述的一种具有增强免疫功能的保健食品，还包括：食用辅料。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18是筛选获得的新菌株，通过对其进行大量实验发现该菌株不仅具有提升各类细胞因子和免疫球蛋白、抑制体重下降、缓解脾脏肿大及胸腺萎缩等免疫增强功能，还具有修复因免疫抑制产生的肠道损伤、调节因免疫抑制影响的肠道菌群紊乱等作用，同时还具有广谱的抗菌能力，因此，本发明提供的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18可用于制备增强免疫的药物或具有增强免疫功能的保健食品。

本发明提供的植物乳植杆菌Lp18对免疫抑制小鼠具有显著的免疫增强作用。本发明所采用的植物乳植杆菌Lp18分离自农家酸奶样品，安全无致病性，其所属的微生物种属在国家公认的可用于普通食品的名单中。通过动物试验并探究其机理，证明其具有改善和缓解免疫抑制带来的各种不利影响的功效。将其广泛应用到食品领域，增大消费者消费的可能性，通过日常摄入就可以达到增强免疫的目的。当然，所采用的植物乳植杆菌Lp18也可以用于制备免疫增强药物中。同时，本发明提供的所述植物乳植杆菌Lp18具有较强耐受能力和广泛的抑菌谱，能够实现工业生产，通过调节细胞因子水平，调节肠道菌群实现显著的增强免疫效果。

本发明植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18的保藏信息如下：

保藏编号：CCTCC No: M 20231524

分类命名：植物乳植杆菌Lp18

拉丁名称：Lactiplantibacillus plantarum Lp18

保藏日期：2023年08月23日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏地址：中国、武汉、武汉大学。

附图说明

图1为本发明实验例1的植物乳植杆菌Lp18的菌落形态图。

图2为本发明实验例1的植物乳植杆菌Lp18的镜检形态图。

图3为本发明实验例4的植物乳植杆菌Lp18的溶血活性检测结果图。

图4为本发明实验例5的各组小鼠的体重变化折线图和脏器指数的柱形图。

图5为本发明实验例5的各组小鼠的回肠组织切片图。

图6为本发明实验例5的各组小鼠的血清细胞因子及分泌型免疫球蛋白A的含量水平柱状图。

图7为本发明实验例5的各组小鼠肠道菌群的OTU数量和α多样性分析结果图。

图8为本发明实验例5的各组小鼠肠道菌群属水平分析结果图。

具体实施方式

以下由特定的具体实验例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。以下实验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

生物材料来源

一、本发明实验例3使用的大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、脆弱拟杆菌均购自广东省微生物菌种保藏中心。缓症链球菌为缓症链球菌菌株5013，该菌株已登录NCBI，其登录号为MT512114；肺炎克雷伯菌为肺炎克雷伯菌菌株587，该菌株已登录NCBI，其登录号为MT573143；巴氏链球菌为巴氏链球菌12758，该菌株已登录NCBI，其登录号为MW445225。

柳叶弯曲杆菌是从成人粪便中分离筛选获得的一株菌株，经形态学鉴定和分子鉴定，该菌株与ATCC14669菌株同源性一致且形态与柳叶弯曲杆菌相同，因此本发明将该菌株鉴定为柳叶弯曲杆菌。

菌株5013、菌株587、菌株12758和柳叶弯曲杆菌菌株目前由申请人实验室保存，申请人承诺自本发明申请日起20年内向公众发放用于验证本发明的技术效果。

二、本发明实验例5使用的BALB/c 雄性小鼠可商购获得。

第1组实施例、本发明的菌株Lp18

本组实施例提供保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途。

在具体的实施例中，所述增强免疫包括：修复损伤肠道、提高细胞因子和免疫球蛋白水平、抑制体重下降、缓解脾脏肿大及胸腺萎缩、调节肠道菌群。

在进一步的实施例中，所述细胞因子包括：TNF-α，IL-6，IL-1β，IL-17；

优选地，所述免疫球蛋白指分泌型免疫球蛋白A。

在一些实施例中，所述调节肠道菌群包括：提高ACE和Chao 1指数。

在另一些实施例中，所述调节肠道菌群还包括：提高毛螺菌科_NK4A136_组（Lachnospiraceae_NK4A136_group），未分类的颤螺旋菌科（unclassified_ Oscillospiraceae），颤杆菌克属（Oscillibacter），另枝菌属（Alistipes），罗氏菌属（Roseburia）和经黏液真杆菌属（Blautia）的相对丰度。

在更具体的实施例中，所述缓解脾脏肿大及胸腺萎缩指：降低脾脏指数并升高胸腺指数。

任何培养、扩繁、发酵、富集、生产、制备、使用、接种、扩增、转化、修饰、改造、销售、许诺销售保藏编号为CCTCC NO: M 20231524的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18的行为，和/或，将保藏编号为CCTCC NO: M 20231524的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18与其他益生菌联用的行为，和/或，用保藏编号为CCTCC NO: M 20231524的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP18制备免疫调节、免疫增强产品均落在本发明的保护范围。

所述其他益生菌包括但不限于：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、婴儿双歧杆菌（即，长双歧杆菌婴儿亚种）、乳双歧杆菌（即，动物双歧乳脂亚种）、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌。

本领域技术人员可根据实际生产需要，结合药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），对药用辅料进行常规选择或调整，进而将保藏编号为CCTCC NO: M 20231524的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18制成不同剂型、不同存储条件、不同保质期的产品，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。

第2组实施例、本发明的药物

本组实施例提供一种增强免疫的药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种增强免疫或调节肠道菌群的药物包括：药效活性成分；所述药效活性成分包括：保藏编号为CCTCC No: M 20231524的一种增强免疫的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18。

在进一步的实施例中，所述的一种增强免疫的药物还包括：药学上可接受的辅料。

在更具体的实施例中，所述药学上可接受的辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》、《微生物菌剂技术研究与应用》等），本领域技术人员可对上述药学上可接受的辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。

在具体的实施例中，所述药物的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。

第3组实施例、本发明的保健食品

本组实施例提供一种具有增强免疫功能的保健食品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种具有增强免疫或调节肠道菌群功能的保健食品包括：活性成分；所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC No: M 20231524的一种增强免疫的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18。

在进一步的实施例中，所述的一种具有增强免疫功能的保健食品还包括：食用辅料。

在更具体的实施例中，所述食用辅料选自：食品添加剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《食品工艺学》、《食品加工新技术》、《食品工艺学实验教程食品工艺学实验教程》等），本领域技术人员可对上述食用辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCCNO: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。

第4组实施例、本发明的抑菌剂

本组实施例提供一种抑菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种抑菌剂包括：抑菌活性成分；所述抑菌活性成分包括：保藏编号为CCTCC No: M 20231524的一种增强免疫的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18。

在进一步的实施例中，所述的一种抑菌剂还包括：辅料。

在更具体的实施例中，所述辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》、《微生物菌剂技术研究与应用》等），本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO: M20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP18制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。

在具体的实施例中，所述产品的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。

在具体的实施例中，所述抑菌剂的抑菌谱包括：大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、肺炎克雷伯菌、缓症链球菌、巴氏链球菌、柳叶弯曲杆菌。

实验例1、植物乳植杆菌的分离筛选与鉴定

（1）菌株的分离筛选

植物乳植杆菌从农家酸奶样品中分离获得。将样品在无菌条件下用0.85%生理盐水梯度稀释，选取合适梯度在LBS琼脂平板上涂布，37 ℃培养48-72小时。肉眼观察菌落形态，挑取疑似单菌落，镜检观察后初步筛选和纯化培养。纯化后的菌株使用MRS液体37 ℃培养8-12小时，离心去上清后重悬于无菌30%甘油水溶液中，-80 ℃保存。

LBS培养基配方（g/L）：酵母浸粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、磷酸二氢钾6.0 g、硫酸亚铁0.034 g、硫酸镁0.575 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠25.0 g、柠檬酸铵2.0 g、硫酸锰0.12g、调pH值5.5后，添加吐温-80 1 mL、冰乙酸1.3 mL，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min。固体培养基添加琼脂15.0 g。

MRS培养基配置方法参照GB4789.35-2016，固体培养基添加1.5%琼脂。

（2）形态学特征和16S rDNA鉴定

植物乳植杆菌的菌落、菌体形态分别见图1和图2。植物乳植杆菌在MRS固体平板上生长良好，单菌落为乳白色、圆形凸起、中等大小、边缘整齐、表面光滑。镜检可见菌体形态为杆状，单个、成对或呈链状排列，符合革兰氏阳性菌的染色特征。

对筛选的目的菌株液体扩培，收集菌体，提取基因组DNA，采用中国发明专利ZL202210478937.4记载的通用引物27F和1492R进行PCR扩增反应。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，共35个循环，最后在72 ℃延伸10 min。随后对PCR扩增产物的含量和纯度进行检测，检测合格后送往武汉金开瑞生物工程有限公司进行测序，根据测序结果利用NCBI数据库中的BLAST工具进行同源性比对，鉴定所得菌株为植物乳植杆菌，根据分子生物学的鉴定结果，确定该菌株为植物乳植杆菌，将其命名为植物乳植杆菌Lp18，并送保藏。

所述植物乳植杆菌Lp18的保藏信息如下：

保藏编号：CCTCC No: M 20231524

分类命名：植物乳植杆菌Lp18

拉丁名称：Lactiplantibacillus plantarum Lp18

保藏日期：2023年08月23日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏地址：中国、武汉、武汉大学。

实验例2、植物乳植杆菌Lp18耐受性实验

人工胃液：配制PBS溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1 mol/l HCl调节pH至2.5，充分溶解后分别用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。

胆盐溶液：在MRS液体培养基中添加0.2%（w/v）的巯基乙酸钠，再加入0.3%的牛胆盐，充分溶解后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。

植物乳植杆菌在MRS液体培养基中活化培养两代。将活化后的菌株菌液离心，弃上清，收集菌体，调整菌液浓度至10⁸CFU/mL。取1 mL菌液离心，PBS清洗两次，离心后收集菌体，分别加入到1 mL模拟人工胃液和模拟人工肠液中，然后置于37 ℃孵育，分别取0 h和3h的消化液检测活菌数，计算存活率。菌株存活率(%)＝Nt/N0×100%，式中N0表示菌株0 h的活菌数(log CFU/mL)，Nt表示菌株3 h的活菌数(log CFU/mL)。

植物乳植杆菌Lp18在胃液和胆盐中的耐受结果见表1。由表1可知，该菌株在胃液、胆盐中处理3 h后存活率分别为99.08%及97.30%，存活率较高，表明该菌株具有较强的胃液胆盐耐受能力。

实验例3、植物乳植杆菌Lp18拮抗病原菌实验

一、植物乳植杆菌Lp18菌液制备：将植物乳植杆菌Lp18按一定比例接种至液体MRS培养基中，37 ℃过夜培养，得到拮抗菌液。指标菌菌液制备：将大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌菌株分别在LB固体平板培养基上活化，37 ℃培养24 h，挑取菌苔至生理盐水制备菌悬液10⁸CFU/ml；单增李斯特菌在BHI厌氧管中37 ℃过夜培养，调整菌悬液浓度至10⁸CFU/ml；脆弱拟杆菌在TSA+5%羊血琼脂平板 37 ℃厌氧培养24 小时，挑取菌苔至生理盐水调整菌悬液浓度至10⁸CFU/ml；肺炎克雷伯菌、缓症链球菌和巴氏链球菌在BHI加5%羊血固体培养基37 ℃培养16 h，调整菌悬液浓度至10⁸CFU/mL。

二、抑菌圈实验：将各病原菌对应培养基冷却至55 ℃左右，与指示菌株菌悬液按一定比例混匀，调节指示菌浓度为10⁶CFU/ml，然后迅速倾注预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，在每孔中加入200 μl拮抗菌液（10⁸CFU/ml），以200 μl无菌MRS液体培养基作为空白对照，静置数分钟后，放入37 ℃恒温培养箱中，培养24 h后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌三个重复，结果见表2。

植物乳植杆菌Lp18对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、脆弱拟杆菌、肺炎克雷伯菌、缓症链球菌、巴氏链球菌和柳叶弯曲杆菌均具有抑制能力。体现出植物乳植杆菌Lp18具有抑制多种病原菌的生长的能力。

三、共培养抑菌实验

植物乳植杆菌制备：植物乳植杆菌Lp18接种于MRS液体培养基中，37℃恒温静置过夜培养。

病原菌的制备：将致病菌株脆弱拟杆菌接种于TSA+5%羊血琼脂平板 37 ℃厌氧培养24 小时，再用无菌PBS洗下菌体，调节菌液浓度，用于后续实验。单核增生李斯特菌接种于BHI厌氧管液体培养基中37℃厌氧过夜培养，制备病原菌液。

共培养实验：植物乳植杆菌Lp18与病原菌分别按10⁸CFU/mL及10⁷CFU/mL接种至7mL BHI厌氧管液体培养基，静置培养16 小时，分别使用PALCAM琼脂培养基、BBE琼脂培养基计数检测单核增生李斯特菌及脆弱拟杆菌活菌数，结果如表3所示。

由表3可得，植物乳植杆菌Lp18能较好的抑制单核增生李斯特菌与脆弱拟杆菌的生长，对此两种菌的抑菌能力较强，抑制率达99%以上。

实验例4、植物乳植杆菌Lp18溶血活性检测

待测菌株经MRS液体培养基活化后，离心去上清，留菌泥备用。将菌泥划线接种于含5%羊血的哥伦比亚血琼脂培养基上，37 ℃培养36—48小时后观察平板上菌落周围有无溶血圈出现，以化脓性链球菌为质控菌株。菌株溶血活性检测结果见图3。由图3可知：化脓性链球菌出现明显的透明溶血圈，为β溶血，待测菌株及LGG周围无明显溶血现象，表明无溶血能力。

实施例5、植物乳植杆菌Lp18在缓解免疫抑制小鼠中的应用

小鼠免疫低下模型建立：

无特定病原体的BALB/c雄性小鼠（18-20 g）购自北京斯贝福生物科技有限公司，饲养在湖北省食品药品安全评价中心动物室，饲养温度保持在22±2 ℃，湿度50±5%，明暗循环12 小时，允许自由饮水、饮食。实验前小鼠先适应性饲养一周，而后将小鼠随机分为三组，分别为：正常对照组（NC）、免疫抑制组（MC）、植物乳植杆菌组（Lp18）。整个实验期间，NC组和MC组小鼠每天灌胃0.2 mL无菌生理盐水，Lp18组小鼠灌胃等量的植物乳植杆菌菌悬液（活菌数为5×10⁹CFU/mL）。在实验第8~10天，MC组和Lp18组小鼠连续注射环磷酰胺（CTX，80mg/kg/d）3天建立免疫抑制小鼠模型，NC组注射等体积无菌生理盐水。第15天处死小鼠，收集样品用于后续分析。详细的动物实验如表4所示。

（1）小鼠体重及脏器指数变化

实验期间每天对小鼠进行称重并记录，观察小鼠的体重变化。实验结束后处死小鼠，收集小鼠的脾脏和胸腺，称重，计算免疫器官指数。脾脏/胸腺指数（mg/g）=脾脏/胸腺质量（mg）/体重（g）。连续注射CTX三天后，MC组和LP组小鼠体重下降，其中MC组小鼠体重下降严重，停止给药后，MC组与Lp18组小鼠体重仍持续下降，第14天时，Lp18组小鼠体重显著高于MC组（p<0.01，图4中的A图）。其中，MC组小鼠体重比给药前下降21.3%，LP组小鼠体重比给药前下降5.4%，Lp18显著抑制了小鼠的体重下降。由图4中的B图-C图可知，与NC组相比，CTX处理显著提高了小鼠的脾脏指数（p<0.001），降低胸腺指数（p<0.0001）。植物乳植杆菌Lp18干预后，小鼠的脾脏指数显著低于MC组（p<0.05），为MC组的74.5%，胸腺指数显著高于MC组（p<0.001），为MC组的4.2倍。说明植物乳植杆菌Lp18能够调节免疫反应，延缓小鼠体重下降、有效缓解脾脏肿大及胸腺萎缩。

（2）小鼠回肠组织病理观察

处死小鼠后，收集小鼠回肠组织0.5 cm，用10%甲醛溶液浸泡固定，再进行苏木精-伊红（HE）染色，最后使用光学显微镜观察肠结构。如图5所示，可以看到NC组回肠组织完整，形态结构正常，上皮绒毛细长排列整齐，未见明显病变。MC组回肠黏膜损伤严重，肠肌层及肠腺缺失，肠绒毛被破坏并严重减少，肠组织结构不完整，可见炎性细胞浸润。与MC组相比，Lp18组小鼠肠道损伤得到恢复，肠道形态结构较为完整，表明植物乳植杆菌Lp18能够增强肠黏膜屏障，减少回肠组织损伤。

（3）小鼠血清细胞因子及免疫球蛋白A含量测定

实验结束后，采集小鼠眼眶血，将血液于室温静置30 min后，离心（3000 r/min，10min），收集上层血清，按照ELISA试剂盒厂家说明书的检测方法分别测定每组小鼠外周血细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-6（IL-6），白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-17（IL-17）及分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的含量。结果如图6所示，与对照组相比， TNF-α和IL-17含量在MC组中极显著降低（p<0.01），IL-6和IL-1β含量显著降低（p<0.05）。植物乳植杆菌Lp18干预后，显著提高了小鼠血清中TNF-α，IL-6，IL-1β，IL-17及SIgA的水平（p<0.05，p<0.001）。其中血清中SIgA含量为模型组的1.7倍，显著高于模型组。表明植物乳植杆菌Lp18可以促进机体细胞因子分泌及机体肠黏膜免疫功能、维持肠道内稳态，进而提高机体免疫力，维持机体健康。

（4）植物乳植杆菌调节免疫抑制小鼠肠道菌群

实验结束后处死小鼠、解剖小鼠，收集其盲肠内容物，对小鼠盲肠内容物进行16S测序和分析。如图7的A图所示，MC组与NC组共有OTU数为366，LP组与NC组共有OTU数为511，表明植物乳植杆菌Lp18干预能够增加免疫抑制小鼠与正常喂养小鼠肠道内的共有菌群。小鼠肠道菌群α-多样性分析显示（图7的B图），与对照组相比，模型组小鼠肠道菌群的ACE和Chao 1指数显著降低（p<0.001），说明CTX诱导小鼠肠道菌群紊乱、造成肠道菌群多样性下降。喂食植物乳植杆菌后小鼠肠道菌群ACE和Chao 1指数均显著高于模型组p<0.05），表明Lp18能调节肠道菌群，增加免疫低下小鼠的肠道菌群的丰富度。

对各组间小鼠盲肠内容物中属水平相对丰度的变化进行分析，结果显示，模型组中毛螺菌科_NK4A136_组（Lachnospiraceae_NK4A136_group），未分类的颤螺旋菌科（unclassified_Oscillospiraceae），颤杆菌克属（Oscillibacter），另枝菌属（Alistipes），罗氏菌属（Roseburia）和经黏液真杆菌属（Blautia）相对丰度与对照组相比显著降低（p<0.05，p<0.01），螺杆菌属（Helicobacter）和未分类的优杆菌属coprostanoligenes组（unclassified_[Eubacterium]_coprostanoligenes_group）相对丰度较对照组显著上升（p<0.05，p<0.01），植物乳植杆菌Lp18处理能有效改善这种现象（图8）。与MC组相比，植物乳植杆菌Lp18组小鼠肠道中毛螺菌科_NK4A136_组，未分类的颤螺旋菌科，颤杆菌克属，另枝菌属，罗氏菌属和经黏液真杆菌属的相对丰度显著上升（p<0.05，p<0.01，图8的A图-F图），尤其是另枝菌属，罗氏菌属和经黏液真杆菌属，其相对丰度达到或高于对照组水平，而螺杆菌属和未分类的优杆菌属coprostanoligenes组相对丰度显著下降（p<0.05，p<0.01，图8的G图-H图）。毛螺菌科_NK4A136_组，未分类的颤螺旋菌科，颤杆菌克属及另枝菌属能发酵碳水化合物，产生SCFAs，为宿主细胞提供能力，并具有抗炎作用；文献《Blautia—a new functional genus with potential probiotic properties》报道经黏液真杆菌属除能调节SCFAs 的产生外还可产生细菌素从而防止病原体在肠道内定植。结果表明，植物乳植杆菌Lp18能够显著增加有益菌的丰度，降低有害菌的丰度，促进肠道菌群稳态恢复，进而增强肠道屏障功能，提升宿主的免疫力。

Claims

1. 保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途。

2. 根据权利要求1所述的保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途，其特征在于，所述增强免疫包括：修复损伤肠道、提高细胞因子和免疫球蛋白水平、抑制体重下降、缓解脾脏肿大及胸腺萎缩、调节肠道菌群。

3. 根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途，其特征在于，所述细胞因子包括：TNF-α，IL-6，IL-1β，IL-17；

和/或，所述免疫球蛋白指分泌型免疫球蛋白A。

4. 根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途，其特征在于，所述调节肠道菌群包括：提高ACE和Chao 1指数。

5. 根据权利要求4所述的保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途，其特征在于，所述调节肠道菌群还包括：提高毛螺菌科_NK4A136_组（Lachnospiraceae_ NK4A136_group），未分类的颤螺旋菌科（unclassified_Oscillospiraceae），颤杆菌克属（Oscillibacter），另枝菌属（Alistipes），罗氏菌属（Roseburia）和经黏液真杆菌属（Blautia）的相对丰度。

6. 根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18在制备增强免疫的药物或保健食品方面的用途，其特征在于，所述缓解脾脏肿大及胸腺萎缩指：降低脾脏指数并升高胸腺指数。

7. 一种增强免疫的药物，其特征在于，包括：药效活性成分；所述药效活性成分包括：保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18。

8.根据权利要求7所述的一种增强免疫的药物，其特征在于，还包括：药学上可接受的辅料。

9. 一种具有增强免疫功能的保健食品，其特征在于，包括：活性成分；所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC No: M 20231524的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株Lp18。

10.根据权利要求9所述的一种具有增强免疫功能的保健食品，其特征在于，还包括：食用辅料。