CN117159557B - 吡啶硫酮锌在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供吡啶硫酮锌在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用。本发明的有益效果为：吡啶硫酮锌针对日本脑炎病毒中的NS2B‑NS3蛋白酶活性具有显著的抑制作用，能够作为日本脑炎病毒中的NS2B‑NS3蛋白酶的抑制剂，有望成为抗日本脑炎病毒感染的潜在药物。

Description

吡啶硫酮锌在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明属于抗日本脑炎药学的技术领域，尤其是涉及吡啶硫酮锌在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用。

背景技术

日本乙型脑炎(JE，Japanese encephalitis)是由日本脑炎病毒(JEV，Japaneseencephalitis virus)引起的急性传染病。日本乙型脑炎的病死率和致残率高，是威胁人群特别是儿童健康的主要传染病之一。夏秋季为发病高峰季节，流行地区分布与媒介蚊虫分布密切相关。中国是乙脑高流行区，在20世纪60年代和70年代初期全国曾发生大流行，后来随着疫苗接种率的提高，发病率大幅降低，但每年仍有近万的病例报告。

JEV主要通过蚊虫叮咬而传播，其中三带喙库蚊是其主要传播媒介。由于蚊虫可携带病毒越冬，并可经卵传代，所以蚊虫不仅为传播媒介，也是长期储存宿主。猪和水鸟类动物作为JEV的扩增宿主，感染JEV后可迅速发育为高病毒血症，再次传染给蚊子。感染患者初期大部分无明显症状，随后可能发生高热，伴有意识萎靡，恶心呕吐等症状，严重者可发展为抽搐，昏迷，瘫痪等。JEV可以引起脑实质广泛病变，以大脑皮质、脑干和基底核的病变最为明显，给患者的愈后恢复带来极大挑战。由于目前尚无治疗日本脑炎的特效药物，医生只能通过对症治疗，例如抗病毒、抗感染、降温、脱水等治疗，所以针对JEV的抑制剂研究是目前较为重要的一个任务。

JEV属于黄病毒属，是一种RNA包膜病毒，具有一个长度约为11kb的单链正向RNA基因组。JEV基因组RNA中的开放阅读框编码约3432个氨基酸的多蛋白前体，后续被自身的NS3蛋白酶或宿主蛋白酶切割为三个结构蛋白与七个非结构蛋白。JEV NS3蛋白酶在JEV基因型中高度保守，具有两个结构域，分别为N端的蛋白酶结构域和C端的RNA解旋酶结构域。而JEVNS2B蛋白是NS3蛋白的辅因子，与NS3的稳定性和底物识别相关。NS3蛋白的N端蛋白酶结构域(180个残基)直接与NS2B的中心约40个氨基酸长度的亲水性结构域相互作用，形成活性丝氨酸蛋白酶。而活性NS2B-NS3蛋白酶是病毒多蛋白水解过程所必需的，在病毒复制和发病机制中起着至关重要的作用。因此，NS2B-NS3可作为研究日本乙型脑炎病毒的抑制剂的一个重要靶标。

吡啶硫酮锌，英文名是Zincpyrithione，是优良的抗鳞片化剂和抗溢脂剂，能有效杀死产生头皮屑的真菌，具有止痒、去头屑、减少脱发和延缓白发产生作用，是高效、安全的止痒去屑剂；同时也可作为优良、广谱、低毒、环保的真菌和细菌的抑菌剂，广泛用于民用涂料、胶粘剂和地毯等领域。但至今，吡啶硫酮锌在抗日本脑炎病毒感染中的应用未见报道。

发明内容

本发明的第一目的是：提供吡啶硫酮锌在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用，可以作为日本脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂，在分子水平上，通过设立阴性对照，发现吡啶硫酮锌对日本脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶有很好的抑制活性，因此该化合物有希望成为抑制日本脑炎病毒感染的潜在药物。

本发明的另一目的是：提供一种治疗日本脑炎病毒感染的药物。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：吡啶硫酮锌在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用。

较佳的，所述吡啶硫酮锌为日本脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂。

较佳的，所述吡啶硫酮锌的结构式为：

一种治疗日本脑炎病毒感染的药物，其包含权利要求书1所述的吡啶硫酮锌以及一种或多种药学上可接受的载体。

较佳的，所述载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂与增效剂中的一种或几种。

较佳的，药物的制剂为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。

根据上述技术方案，能够得出吡啶硫酮锌可以作为日本脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂，并且吡啶硫酮锌对日本脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶活性具有显著的抑制效果，进而能够研发潜在药物，通过新的途径治疗日本脑炎病毒。

附图说明

图1是本发明实施例吡啶硫酮锌对日本脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的抑制作用示意图

图2是本发明实施例吡啶硫酮锌对日本脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制作用的IC₅₀测定示意图

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明：

除非另有定义，下文中所使用的的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的的专业术语只是为了描述具体实施例和对比例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。应当特殊说明的是对于同一种有机物结构可能有多种名称，只要其结构在本专利范围内都属于本专利的保护对象。

除非另有定义，以下实施例中和对比例中的原料、试剂等都可以从市场上够买所得或根据已报导的方法制备所得。

首先进行日本脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的表达与纯化：

S1：从NCBI网站获得JEV NS2B与NS3的基因序列，参考文献方法利用G₄SG₄连接子将两个蛋白基因连接，构建到pET-15b载体上，得到重组质粒进行测序鉴定，然后将测序正确的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。

S2：转化后的BL21(DE3)细胞涂布至含有氨苄抗性的平板上，培养箱过夜培养后挑取单克隆菌落至小试管LB培养基进行活化培养5-6h，转接至大瓶LB培养基进行扩大培养，37℃培养至菌液OD₆₀₀约为0.6，将培养箱降温至16℃，加入异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达16-18h。

S3：诱导后的菌液转移至收菌桶，使用大型落地离心机离心处理收集菌体，倒掉上清，将沉淀菌体重悬于破菌缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，pH 7.5)，利用超声细胞破碎仪进行超声破菌，最后使用低温高速离心机在4℃，10000rpm条件下进行离心处理。

S4：将所得上清倒入含有Ni-NTA填料的亲和层析柱中，使用低浓度与高浓度咪唑缓冲液进行洗杂洗脱，获得目的蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。

S5：利用阴离子交换层析和尺寸排阻层析进一步纯化从而获得具有电荷均一性的高纯度的目的蛋白。

得到纯化后的日本脑炎NS2B-NS3蛋白，以荧光共振能量转移原理为基础，针对日本脑炎NS2B-NS3蛋白建立一个稳定的抑制剂筛选体系：

荧光底物的制备：采用纯度为95％的Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC多肽化合物(购自上海吉尔生化有限公司)作为荧光底物；随后确定酶活缓冲液成分为20mM Tris，30％甘油，0.5mM CHAPS，pH 9.0，用于稀释上述纯化后的日本脑炎NS2B-NS3蛋白；

筛药体系为100μL，包括89μL JEV NS2B-NS3 pro溶液(终浓度2μM)，1μL化合物(终浓度20μM)和10μL荧光底物(终浓度20μM)；测定荧光强度的仪器为Infinite M1000 Pro全波长多功能微孔板检测仪，检测时相应的入射和发射波长分别为355nm和460nm。

筛选的步骤为：

S1：首先向96孔黑色酶标板中加入89μL蛋白溶液和1μL化合物，37℃条件下孵育5min，然后迅速加入10μL荧光底物，使用酶标仪进行荧光监测；

同时设计阴性对照试验，将1μL化合物使用1μL 95％DMSO代替，其他实验条件不变。

S2：用酶标仪测定酶动力学曲线，分析前300s的斜率作为酶促反应的初速度，设定V₀为不加抑制剂的初速度，V_i为加抑制剂的初速度；根据初速度，计算出各化合物对JEVNS2B-NS3 pro的抑制率Ir(Inhibition Rate，Ir)(1-V_i/V₀)以及剩余活性Ra(ResidualActivity，Ra)(V_i/V₀)。

S3：对于抑制率Ir>70％的化合物，需要进行复筛并进行荧光淬灭实验，从而排除操作失误产生的假阳性结果。首先向96孔黑色酶标板中加入89μL蛋白溶液，37℃条件下孵育5min，然后迅速加入10μL荧光底物，使用酶标仪进行荧光监测，直至荧光强度不再发生明显变化，记录此时荧光值为Q₁，再在酶标板中加入1μL抑制剂，记录当下荧光值为Q₂。然后通过公式：

Q_r＝(Q₁-Q₂)/Q_2*100％

计算出荧光淬灭率Q_r；若荧光淬灭率小于20％，则可排除假阳性；若荧光淬灭率大于等于20％，则为假阳性。

如图1所示，将吡啶硫酮锌进行代入，吡啶硫酮锌对JEV NS2B-NS3 pro的抑制率Ir>90％，并且荧光淬灭实验中荧光淬灭率小于20％，可以判定，吡啶硫酮锌可以作为抑制剂对日本脑炎蛋白起到抑制作用，并且抑制率较高，能够起到较好的作用。

针对吡啶硫酮锌IC₅₀进行测定：

首先，将实验所需的蛋白JEV NS2B-NS3 pro稀释为终浓度2μM，再配置终浓度为20μM的底物Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC。

之后根据筛药体系的初筛所得结果，将抑制剂终浓度粗略设定为17个，分别是320μM、160μM、80μM、40μM、20μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.312μM、0.156μM、0.078μM、0.039μM、0.019μM、0.010μM、0.005μM、0.002μM；

先将JEV NS2B-NS3 pro与各个浓度的吡啶硫酮锌混匀在37℃静置孵育10min，随后加入10μL荧光底物，酶标仪记录荧光值与时间的变化曲线。使用Graphpad prism 8.0软件分析JEV NS2B-NS3 pro反应初速率，得到吡啶硫酮锌浓度倒数值与抑制率Ir的关系曲线，最终求出IC₅₀值。

如图2所示，在底物浓度为20μM时测得IC₅₀为0.53±0.21μM，在制备抗日本脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，有成为抗日本脑炎病毒感染的潜在药物的希望。

根据上述实验可知，吡啶硫酮锌可以作为日本脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂，所以能够制备一种用于预防或治疗日本脑炎病毒感染的药物，其活性成分为吡啶硫酮锌，该药物包含上述含有吡啶硫酮锌以及一种或多种药学上可接受的载体。

载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。而且本发明中涉及的专业术语和其他材料仅是为了明确阐述本发明的优势和效果，不应作为本发明创新性的限制。以上实施例是针对本发明实际应用效果的一部分说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡是本领域人员在本发明的基础上所做出的的改进和替换均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.吡啶硫酮锌在制备治疗日本脑炎病毒感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述吡啶硫酮锌为日本脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述吡啶硫酮锌的结构式为：

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