CN117157406A

CN117157406A - 具有一种或多种用于增强异种移植物存活和耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和动物

Info

Publication number: CN117157406A
Application number: CN202180090204.7A
Authority: CN
Inventors: J·莱; 覃文宁; 阚一楠; J·克拉布特雷; M·尤德; D·赫加; D·安格勒斯·阿尔博雷斯; R·阿南德; P·佩拉特; R·厄恩斯特; V·帕拉加斯
Original assignee: E Create Biotechnology Co ltd
Current assignee: E Create Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2023-12-01

Abstract

本公开涉及具有一种或多种用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物。此外，本公开涉及制备和使用具有一种或多种所述经修饰基因的所述细胞、组织、器官和/或动物的方法。

Description

具有一种或多种用于增强异种移植物存活和耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和动物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年11月13日提交的美国临时申请号63/113,650、2021年7月2日提交的美国临时申请号63/218,080；和2021年9月23日提交的美国临时申请号63/247,544的优先权。前述申请中的每一个都通过引用以其整体并入本文。

以电子方式提交的文本文件的说明

将在此一起以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：EGEN_023_03WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2021年11月11日，文件大小：约2.35兆字节)。

背景技术

在过去的几十年中，用于移植的人体器官和组织的短缺日益严重，并且是最重要的未满足的医疗需求之一。异种移植有潜力几乎无限制地供应用于慢性器官衰竭患者的移植器官。器官大小和生理上的相似性，再加上基因工程消除分子不兼容性，使猪成为了肾异种移植的选择供体。临床前研究表明，猪肾异种移植可以延长非人灵长类动物接受者数周至数月的生命(Higginbotham 2015,Iwase 2015b)。然而，由于猪与人之间的进化距离，猪器官以多种形式触发了人免疫系统的排斥反应，包括(i)超急性排斥反应；(ii)急性体液排斥反应，由血栓调节失调和II型内皮细胞(EC)激活伴白细胞募集组成；(iii)血栓性微血管病，由血管内血栓形成伴血小板消耗以及EC激活、纤维蛋白沉积和由于缺乏血栓调节而引起的血栓形成组成，以及(iv)慢性血管病。这些不良事件至少部分是由于供体与接受者之间的分子不兼容性，特别是关于参与补体、凝血、炎症和免疫反应系统的基因。异种器官(例如，猪)的临床使用被这些免疫学不兼容性阻碍，所述不兼容性迄今已阻止了猪细胞、组织和血管化猪器官在临床异种移植中的使用。

在过去的二十年中，已鉴定了减少猪与人之间的种间不兼容性的几种基因修饰。然而，这些先前鉴定的基因修饰尚未实现长期异种移植物存活。此外，大规模基因组工程的技术局限性阻碍了这些修饰在单个动物中的整合。

发明内容

需要开发具有新颖的基因修饰组合的猪细胞、组织、器官和/或猪动物，用于异种移植和开发相关方法。

本公开提供了包含导致增强的免疫学兼容性的基因修饰的细胞、组织、器官和动物，以及用于产生这些细胞、组织、器官和动物的载体和方法，以及这些细胞、组织、器官和动物在异种移植中的用途。

基因修饰通过引入猪中的若干种修饰提高了异种移植物的兼容性。这些修饰消除了已知会刺激宿主抗移植物反应的抗原的表达。此外，蛋白质的过度表达有助于调节对移植物的另外反应，以优化移植宿主中的移植物存活率。本文公开了表达提供对宿主反应的控制的蛋白质的盒。所述盒可以在核酸中组合使用，所述核酸在本文中也称为有效载荷，被引入猪的基因组中。

有效载荷可含有表达多种蛋白质的凝血盒，所述多种蛋白质中的每一种可调节宿主凝血反应的一个或多个方面。例如，所表达的减少或消除与移植物相关的凝血的蛋白质可以包括THBD和TFPI。THBD通过将凝血酶从促凝血酶转化为抗凝血酶来减少血液凝固。TFPI通过抑制因子VIIa和凝血酶原酶来阻断血液凝固的激活。

有效载荷可以含有表达多种蛋白质的补体调节盒，所述多种蛋白质中的每一种可调节宿主补体反应的一个或多个方面，从而减少补体沉积，并由此减少抗移植物免疫反应。所表达的减少或消除移植物上的补体沉积的蛋白质可以包括CD46、CD55或CD59。CD46是辅因子，有助于由血清因子I使补体成分C3b和C4b失活。通过限制补体级联转化酶的扩增，CD55间接阻断膜攻击复合物的形成。补体激活后在细胞膜表面形成膜攻击复合物，并且膜攻击复合物使得发生补体介导的细胞裂解。CD59阻止C9聚合和形成膜攻击复合物。

有效载荷可以含有先天免疫盒，所述先天免疫盒减少宿主针对移植物的先天免疫反应。所表达的抑制针对移植物的先天免疫攻击的蛋白质可以包括B2M、HLA-E和CD47。B2M和HLA-E减少自然杀伤(NK)细胞介导的移植细胞裂解。CD47抑制巨噬细胞吞噬作用。任选地，盒可以是先天免疫和炎症盒，并且除了先天免疫调节组分外还表达降低炎症的另外的蛋白质；例如A20和HO1。A20降低响应于外部刺激的NF-κB激活。HO1通过切割血红素基团导致形成胆绿素、一氧化碳和亚铁的释放来预防血管炎症。

本文提供了一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145和167-168的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD59的第二顺反子，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；以及

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种具有选自SEQID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，所述核酸包含所述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，所述核酸包含所述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:24、25、29、202、203和207的序列。

本文提供了包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(c)先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)编码A20的第三顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(iv)编码HO1的第四顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(v)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(vi)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(vi)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，所述核酸包含所述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，所述核酸包含所述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:204的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)编码CD39的第三顺反子，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；(iv)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(v)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(vi)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD59的第二顺反子，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；(iii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iv)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(v)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(vi)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；以及

(c)先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)编码A20的第三顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(iv)编码HO1的第四顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(v)编码PD-L1的第五顺反子，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91；(vi)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(vii)选自SEQID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(vii)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，所述核酸包含所述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，所述核酸包含所述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:23、27、28、201、205和206的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码PROCR的第二顺反子，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码A20的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码HO1的第二顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；以及(c)补体调节和先天免疫盒，所述补体调节和先天免疫盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iv)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(v)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(vi)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，本文公开的核酸包含所述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，核酸包含所述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:30或SEQID NO:208的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码PROCR的第二顺反子，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181；(iii)编码TFPI的第三顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQID NO:94-96、103和187；(iv)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(v)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(vi)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；以及

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:31-34和209-212的序列。

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，以及

(c)先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)编码A20的第三顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(iv)编码HO1的第四顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(v)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(vi)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合，以及(vii)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:215的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)编码CD39的第三顺反子，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；(iv)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(v)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(vi)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD59的第二顺反子，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；(iii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iv)编码A20的第四顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(v)编码HO1的第五顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(vi)编码PD-L1的第六顺反子，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91；(vii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(viii)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(ix)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，以及

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:213的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，以及

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:36、40、214和218的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55的第二顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)编码A20的第三顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(iv)编码HO1的第四顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(v)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(vi)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(vii)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；以及

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:41、42、219和220的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)编码CD39的第三顺反子，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；(iv)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(v)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(vi)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，

(b)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD59的第二顺反子，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；(iii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iv)编码A20的第四顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(v)编码HO1的第五顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(vi)编码PD-L1的第六顺反子，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91；(vii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(viii)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；以及(ix)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，以及

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的三个。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:38、39、173、216、217和226的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；以及

(d)细胞免疫和凝血盒，所述细胞免疫和凝血盒包含：(i)编码LEA29Y的第一顺反子，其中LEA29Y的核酸序列选自SEQ ID NO:87-88；(ii)编码CD39的第二顺反子，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:221的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(d)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码A20的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码PD-L1的第二顺反子，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:44、172、222和225的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合；(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，以及

(d)细胞凋亡和凝血盒，所述细胞免疫和凝血盒包含：(i)编码XIAP的第一顺反子，其中XIAP的核酸序列选自SEQ ID NO:110；(ii)编码CD39的第二顺反子，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:106；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:223的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽；

(d)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含：(i)编码A20的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码LEA29Y的第二顺反子，其中LEA29Y的核酸序列选自SEQ ID NO:87-88；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112-125、和154-156、159-162、190-192的聚A序列，及其组合，以及(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:224的序列。

在实施方案中，本文提供了一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血和先天免疫盒，所述凝血和先天免疫盒包含：(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83和180；(iii)编码EPCR蛋白的第三顺反子，其中EPCR的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iv)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(v)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(vi)至少一种由选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽；

(b)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含：(i)编码A20蛋白的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码HO1蛋白的第二顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(iii)选自SEQID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合，以及(v)至少一种由选自SEQID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽；以及

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55蛋白的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种由选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:227的序列。

(b)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含：(i)编码A20蛋白的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码CTLA-4蛋白的第二顺反子，其中CTLA-4的核酸序列选自SEQ ID NO:87-88、174和186；(iii)选自SEQID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种由选自SEQID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽；以及

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55蛋白的第三顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；(v)至少一种由选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:175或SEQ ID NO:228的序列。

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中编码所述THBD蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI蛋白的第二顺反子，其中编码所述TFPI蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ IDNO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种由选自SEQID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽；

(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD47蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种由选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽；

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中编码所述CD46蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD55蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种由选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:176或SEQ ID NO:229的序列。

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中编码所述CD46蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、253-258、262-264；(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD55蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种由选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽；以及

(d)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码A20蛋白的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码HO1蛋白的第二顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(iii)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；(iv)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列，及其组合；以及(v)至少一种由选自SEQ IDNO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽。

在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，前述核酸包含前述多顺反子盒中的四个。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:177或SEQ ID NO:230的序列。

本文提供了一种包含CD46顺反子的核酸，所述CD46顺反子包含选自SEQ ID NO:72、73、185和200的核酸序列或由其组成。本文提供了一种包含THBD顺反子的核酸，所述THBD顺反子包含选自SEQ ID NO:99-102和166中任一个的核酸序列或由其组成。在实施方案中，本文提供了一种包含含有CD46顺反子的核酸的细胞，所述CD46顺反子包含选自SEQID NO:72、73、185和200的核酸序列或由其组成。在实施方案中，本文提供了一种包含含有THBD顺反子的核酸的细胞，所述THBD顺反子包含选自SEQ ID NO:99-102和166中任一个的核酸序列或由其组成。在实施方案中，本文提供了包含如下细胞的组织、器官或动物，所述细胞包含含有CD46顺反子的核酸，所述CD46顺反子包含选自SEQ ID NO:72、73、185和200的核酸序列或由其组成。在实施方案中，本文提供了包含如下细胞的组织、器官或动物，所述细胞包含含有THBD顺反子的核酸，所述THBD顺反子包含选自SEQ ID NO:99-102和166的核酸序列或由其组成。

在实施方案中，本文所述的核酸包含选自SEQ ID NO:146-150和244的5'loxP位点和3'loxP位点。在实施方案中，本文所述的核酸包含选自SEQ ID NO:49-58和163-164的5'绝缘子位点和3'绝缘子位点。在实施方案中，本文所述的核酸包含具有选自SEQ ID NO:47-48的序列的5’指导RNA(gRNA)靶序列和3’gRNA靶序列及其组合。在实施方案中，本文所述的核酸包含具有SEQ ID NO:19-22、157和193中任一个的序列的遍在染色质开放元件(UCOE)。在实施方案中，本文所述的核酸包含：(i)位于5’多顺反子盒的5’端并具有SEQ ID NO:17或18的序列的第一反向末端重复序列(ITR)，以及(ii)位于3’多顺反子盒的3’端并具有SEQID NO:15或16的序列的第二ITR。在实施方案中，本文所述的核酸包含至少两个多顺反子盒。在实施方案中，本文所述的核酸包含至少三个多顺反子盒。在实施方案中，本文所述的核酸包含至少四个多顺反子盒。在实施方案中，本文所述的核酸包含荧光蛋白。在实施方案中，本文所述的核酸包含具有SEQ ID NO:111、242或246的序列的绿色荧光蛋白。

在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的载体。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的细胞。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的胰岛细胞。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的猪细胞。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的器官或组织。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的动物。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的猪。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的猪，其中所述猪不含PERV。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的动物，其中所述动物包含至少一种失活的糖类抗原产生基因。在实施方案中，本文提供了包含任何前述核酸的动物，其中所述动物包含至少一种失活的糖类抗原产生基因，并且其中所述失活的糖类抗原产生基因是糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)、β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)或其组合。

在实施方案中，本文提供了具有SEQ ID NO:23至46、172-177和201-230中任一个的连续核酸序列。在实施方案中，所述连续核酸序列为至少约1kb。在实施方案中，所述连续核酸序列的长度为至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少16kb、至少17kb、至少18kb、至少19kb、至少20kb、至少21kb、至少22kb、至少23kb、至少24kb、至少25kb、至少26kb、至少27kb、至少28kb、至少29kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少45kb、至少50kb、至少55kb、至少60kb或至少65kb。在实施方案中，所述连续核酸序列编码前述多顺反子盒中的一个或多个。在实施方案中，所述连续核酸序列编码前述多顺反子盒中的至少两个。在实施方案中，所述连续核酸序列编码前述多顺反子盒中的至少三个。在实施方案中，所述连续核酸序列编码前述多顺反子盒中的至少四个。

在实施方案中，本文提供了具有SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中任一个的染色体整合形式。

在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的连续核酸序列。在实施方案中，本文提供了与SEQ IDNO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少95％相同的连续核酸序列。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少96％相同的连续核酸序列。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少97％相同的连续核酸序列。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少98％相同的连续核酸序列。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少99％相同的连续核酸序列。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少95％相同的连续核酸序列，其中所述序列编码至少两个多顺反子盒。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少95％相同的连续核酸序列，其中所述序列编码至少三个多顺反子盒。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少95％相同的连续核酸序列，其中所述序列编码至少四个多顺反子盒。在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23至46、172-177和201-230中的任一个至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的连续核酸序列。

在实施方案中，本文提供了编码由所述多顺反子盒中的任一个表达的多顺反子基因产物多肽的连续核酸序列。在实施方案中，本文提供了一种多肽，所述多肽包含由本文所述的多顺反子盒中的任一个的顺反子编码的一种或多种蛋白质。

在实施方案中，本文提供了与SEQ ID NO:23至46、172-177和201-230中任一项的非编码序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同以及与SEQ IDNO:23至46、172-177和201-230中任一项的编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。

在实施方案中，本文提供了一种对细胞进行基因修饰的方法，所述方法包括：(i)敲除猪内源性反转录病毒(PERV)元件；(ii)敲除糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶基因(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)、β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)或其任何组合；并且(iii)敲入如权利要求1-14中任一项所述的任何一个或多个多顺反子盒。在实施方案中，首先进行步骤(i)，其次进行步骤(ii)，并且最后进行步骤(iii)。在实施方案中，首先进行步骤(i)，其次进行步骤(iii)，并且最后进行步骤(ii)。在实施方案中，首先进行步骤(ii)，其次进行步骤(i)，并且最后进行步骤(iii)。在实施方案中，首先进行步骤(iii)，其次进行步骤(i)，并且最后进行步骤(ii)。在实施方案中，首先进行步骤(ii)，其次进行步骤(iii)，并且最后进行步骤(i)。在实施方案中，首先进行步骤(iii)，其次进行步骤(ii)，并且最后进行步骤(i)。在实施方案中，本文提供了通过任何前述方法产生的经基因修饰的细胞。在实施方案中，本文提供了包含所述经基因修饰的细胞的动物、器官或组织。在实施方案中，所述动物是猪或人。

在实施方案中，本文提供了着陆架(landing pad)，其中所述着陆架是包含第一loxP位点、第二loxP位点、启动子和聚A序列的核酸。在实施方案中，所述着陆架包含绝缘子序列。在实施方案中，所述着陆架包含荧光蛋白。在实施方案中，所述着陆架包含SEQ IDNO:248或249的核酸。在实施方案中，本文提供了包含着陆架的经基因修饰的细胞。在实施方案中，本文提供了包含含有着陆架的经基因修饰的细胞的组织、器官或动物。

在实施方案中，本文提供了包含第一loxP位点、第二loxP位点和本文所述的多顺反子盒中的一个或多个的核酸。在实施方案中，本文提供了包含前述核酸的经基因修饰的细胞。在实施方案中，本文提供了包含前述经基因修饰的细胞的组织、器官或动物。在实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:201-230中任一个的序列或与SEQ ID NO:201-230中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸。在实施方案中，本文提供了一种经基因修饰的细胞，所述经基因修饰的细胞包含SEQ ID NO:201-230中任一个的核酸或与SEQ ID NO:201-230中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸。在实施方案中，本文提供了包含经基因修饰的细胞的组织、器官或动物，所述经基因修饰的细胞包含SEQ ID NO:201-230中任一个的核酸或与SEQ ID NO:201-230中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸。

附图说明

图1A展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1(表示为mEF1α1)启动子控制下的包含TFPI、THBD和CD39顺反子的凝血盒，在hEF1α1启动子控制下的包含CD46、CD55和CD59顺反子的补体调节盒，以及在CAG启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白、CD47、A20、HO1和PD-L1顺反子的先天免疫和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，HBB、bGH或SPAActB)。具有图1A的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.23。

图1B展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1启动子控制下的包含TFPI和THBD的凝血盒，在hEF1α1(表示为hsEF1α1)启动子控制下的包含CD46_LL(表示为CD46)和CD59顺反子的补体调节盒，以及在CAG启动子控制下的包含编码B2M HLA-E融合蛋白的核酸和CD47顺反子的先天免疫盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A或F2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，HBB、btGH或SPAActB)。具有图1B的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.25。

图1C展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1(表示为mEF1α1)启动子控制下的包含TFPI和THBD顺反子的凝血盒，在hEF1α1启动子控制下的包含CD46和CD59顺反子的补体调节盒，以及在CAG启动子控制下的包含编码B2M HLA-E融合蛋白的核酸以及CD47、A20和HO1顺反子的先天免疫和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，HBB、bGH或SPAActB)。具有图1C的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.26。

图1D展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1启动子控制下的包含TFPI和THBD顺反子的凝血盒，在hEF1α1(表示为hsEF1α1)启动子控制下的包含CD46和CD59顺反子的补体调节盒，以及在CAG启动子控制下的包含编码B2M HLA-E融合蛋白的核酸和CD47顺反子的先天免疫盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，HBB、btGH或SPAActB)。具有图1D的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.24。

图2A展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1启动子控制下的包含TFPI、THBD和CD39顺反子的凝血盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含CD46i、CD59和CD55顺反子的补体调节盒，以及在CAG启动子控制下的包含编码B2M HLA-E融合蛋白的核酸以及CD47、A20、HO1和PD-L1顺反子的先天免疫和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，HBB、btGH、或SPA/hsActB)。具有图2A的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.27。

图2B展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含TFPI、THBD和CD39的凝血盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含CD46i、CD59和CD55顺反子的补体调节盒，以及在CAG启动子控制下的包含编码B2M HLA-E融合蛋白的核酸以及CD47、A20、HO1和PD-L1顺反子的先天免疫和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，HBB、btGH、或SPA/hsActB)。具有图2B的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.28。

图2C展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1启动子控制下的包含TFPI和THBD的凝血盒，在hEF1α1(表示为hsEF1α1)启动子控制下的包含CD46_LL(表示为CD46)和CD59的补体调节盒，以及在CAG启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或SPAActB)。具有图2C的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.29。

图2D展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含PROCR和THBD的凝血盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含A20和HO1的炎症和细胞凋亡盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46i、CD55和CD47的补体调节和先天免疫盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH、或SPA hsActB)。具有图2D的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.30。

图2E展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含TFPI、PROCR和THBD(表示为THBDda)的凝血盒，在ssHSPA8(表示为ssHSPA8(ATACseq))启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da)和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图2E的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.31。

图2F展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI、PROCR和THBDda的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da)和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图2F的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.32。

图2G展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI、PROCR和THBDda的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da)和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图2G的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.33。

图2H展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含TFPI、PROCR和THBDda的凝血盒，在ssEF1α1(表示为ssEEF1α1(ATACseq))启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da)和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图2H的盒的示例性核酸是SEQID NO.34。

图2I展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含CD47-2、PROCR和THBDda的凝血和先天免疫盒，在ssHSPA8启动子(表示为“ssHSPA8(ATACseq)”)控制下的包含ssA20和ssHO1的细胞凋亡和细胞免疫盒；以及在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A、P2A*)的核酸或IRES(例如，IRES(FMDV)或IRES(EMCV))隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图2I的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.174。

图2J展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含CD47-2、PROCR和THBDda的凝血和先天免疫盒，在ssHSPA8启动子(表示为“ssHSPA8(ATACseq)”)控制下的包含ssA20和LEA29Y(表示为“LEA29Y-Ig”)的细胞凋亡和细胞免疫盒；以及在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A、P2A*)的核酸或IRES(例如，IRES(FMDV)或IRES(EMCV))隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图2J的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.175。

图3A展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1(表示为mEF1α1)启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在hEF1α1启动子控制下的包含TFPI、THBD和CD39的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46i、CD55、CD59、A20、HO1和PD-L1(表示为PDL1)的补体调节和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A、P2Amut1、E2A、F2A、P2Amut2、P2Amut3、T2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或SPAActB)。具有图3A的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.35。

图3B展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1启动子控制下的包含TFPI和THBD的凝血盒，在hEF1α1(表示为hsEF1α1)启动子控制下的包含CD46i和CD55的补体调节盒，在CAG启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒。每个盒内的基因由编码2A肽(T2A、F2A、P2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或SPAActB)。具有图3B的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.36。

图3C展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在mmEF1α1启动子控制下的包含PROCR和THBD的凝血盒，在hEF1α1(表示为hsEF1α1)启动子控制下的包含CD46i和CD55的补体调节盒，在CAG启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白、CD47、A20和HO1的先天免疫和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A、T2A、F2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或SPAActB)。具有图3C的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.37。

图4A展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在hsHSPA8启动子控制下的包含TFPI、THBD和CD39的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da)、CD55、CD59、A20、HO1和PD-L1的补体调节和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、P2Amut2、P2Amut3、T2A、F2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图4A的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.38。

图4B展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在hsHSPA8启动子控制下的包含TFPI、THBD和CD39的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da2(表示为CD46da)、CD55、CD59、A20、HO1和PD-L1的补体调节和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、P2Amut2、P2Amut3、T2A、F2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图4B的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.39。

图4C展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在hsHSPA8启动子控制下的包含TFPI和THBD的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46i和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH、或SPA/ACTB)。具有图4C的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.40。

图4D展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在hsHSPA8启动子控制下的包含TFPI和THBD的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da)、CD55、A20和HO1的补体调节和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图4D的盒的示例性核酸是SEQ IDNO.41。

图4E展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在hsHSPA8启动子控制下的包含TFPI和THBD的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da2(表示为CD46da)、CD55、A20和HO1的补体调节和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图4E的盒的示例性核酸是SEQID NO.42。

图4F展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47(表示为CD47_2)的先天免疫盒，在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI、THBD和CD39的凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da2(表示为CD46da)、CD55、CD59、A20、HO1和PD-L1的补体调节和炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A、P2Amut1、E2A、F2A、P2Amut2、PTAmut3、T2A)的核酸或IRES隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图4F的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.173。

图4G展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含TFPI(表示为“TFPI*”)和THBDda的凝血盒，在ssHSPA8启动子(表示为“ssHSPA8(ATAC seq)”)控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47-2的先天免疫盒；以及在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55的补体调节盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A)的核酸或IRES(例如，IRES(FMDV)或IRES(EMCV))隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH或hsGH)。具有图4G的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.176。

图4H展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含TFPI(TFPI*)和THBDda的凝血盒；在ssHSPA8启动子(表示为“ssHSPA8(ATAC seq)”)控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47-2的先天免疫盒；在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55的补体调节盒；以及在ssEF1α1启动子(表示为“ssEEF1A1”)控制下的炎症和细胞凋亡盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A、P2A*)的核酸或IRES(例如，IRES(FMDV)或IRES(EMCV))隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、ocHBB、btGH或hsGH)。具有图4H的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.177。

图5A展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI(ΔP-Sel)和THBDda的凝血盒，在ssUBC启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含CTLA-4(例如LEA29Y)和CD39的细胞免疫和凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da(BC1))和CD55的补体调节盒。该核酸还包含凝血盒5’端的GFP(标记的d2GFP)。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，SPA/PTCH2 pA、hsHBB、btGH或hsGH)。具有图5A的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.43。

图5B展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI(ΔP-Sel)和THBDda的凝血盒，在ssUBC启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含A20和PD-L1的炎症和细胞凋亡盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da(BC1))和CD55的补体调节盒。该核酸还包含凝血盒5’端的GFP(标记的d2GFP)。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，SPA/PTCH2、hsHBB、btGH或hsGH)。具有图5B的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.44。

图5C展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI(ΔP-Sel)和THBDda的凝血盒，在ssUBC启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含XIAP和CD39的细胞凋亡和凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da(BC1))和CD55的补体调节盒。该核酸还包含凝血盒5’端的GFP(标记的d2GFP)。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，SPA/PTCH2、hsHBB、btGH或hsGH)。具有图5C的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.45。

图5D展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI(ΔP-Sel)和THBDda的凝血盒，在ssUBC启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含CTLA-4(例如LEA29Y)和A20的细胞凋亡和细胞免疫盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da(BC1))和CD55的补体调节盒。该核酸还包含凝血盒5’端的GFP(标记的d2GFP)。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，SPA/PTCH2、hsHBB、btGH或hsGH)。具有图5D的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.46。

图5E展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI(ΔP-Sel)和THBDda的凝血盒，在ssUBC启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含LEA29Y和CD39的细胞免疫和凝血盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da(BC1))和CD55的补体调节盒。该核酸还包含凝血盒5’端的GFP(标记的d2GFP)。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，SPA/PTCH2 pA、hsHBB、btGH或hsGH)。具有图5A的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.43。

图5F展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssHSPA8启动子控制下的包含TFPI(ΔP-Sel)和THBDda的凝血盒，在ssUBC启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，在ssEF1α1启动子控制下的包含LEA29Y和A20的细胞凋亡和细胞免疫盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da1(表示为CD46da(BC1))和CD55的补体调节盒。该核酸还包含凝血盒5’端的GFP(标记的d2GFP)。每个盒内的基因由编码2A肽(E2A、P2A、P2Amut1、F2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，SPA/PTCH2、hsHBB、btGH或hsGH)。具有图5D的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.46。

图6展示了示例性核酸，所述示例性核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47(表示为CD47-2)的先天免疫盒，在hsHSPA8启动子控制下的包含A20、HO1和PD-L1的炎症和细胞凋亡盒，在CAG启动子控制下的包含CD46da2(表示为CD46da(BC2))、CD55和CD59的补体调节盒，以及在ssICAM2启动子控制下的包含TFPI(表示为*TFPI)、CD39和THBDda的凝血盒。每个盒内的基因由编码2A肽(P2A、P2Amut3、T2A、F2A、P2Amut2、P2Amut1和E2A)的核酸隔开。每个盒还含有聚A序列(例如，hsHBB、btGH(标记为“btGH”)、btHBB和hsGH)。具有图6的盒的示例性核酸是SEQ ID NO.172。

图7A示出在用或不用抗GPIb片段化鼠抗体和GPIIb/IIIa抑制剂依替巴肽(ab/依替巴肽)处理的包含含有图2D的多顺反子盒的核酸的猪肝脏异种移植物中组合的动脉和门静脉血流量。

图7B示出在用或不用抗GPIb片段化鼠抗体和GPIIb/IIIa抑制剂依替巴肽(ab/依替巴肽)处理的包含含有图2D的多顺反子盒的核酸的猪肝脏异种移植物中的乳酸清除。

图8A示出用或不用抗GPIb片段化鼠抗体和GPIIb/IIIa抑制剂依替巴肽(ab/依替巴肽)处理的猪肝脏异种移植物中随时间推移的血小板计数，如通过血细胞计数器测量的。

图8B示出用或不用抗GPIb片段化鼠抗体和GPIIb/IIIa抑制剂依替巴肽(ab/依替巴肽)处理的猪肝脏异种移植物中随时间推移的血小板计数，如通过流式细胞术测量的。

图9A示出猪肝脏异种移植物的图像。图像中指示出肝上下腔静脉(IVC)和门静脉。

图9B示出在猪肝脏异种移植物的离体常温灌注期间猪肝脏异种移植物中的乳酸清除。

图10A示出心脏异种移植物中随时间推移的平均肌钙蛋白I浓度(ng/mL)，这些心脏异种移植物储存在冷藏溶液中(CS)或用具有红细胞的含氧Steen溶液灌注(IM)。研究了以下心脏异种移植物：(a)敲除了GGTA1、CMAH和B4GALNT2且具有人补体和血栓调节基因的可变表达的心脏异种移植物(“TKO”)；(b)敲除了GGTA1且表达CD55的心脏异种移植物(“GTKO.hDAF”)；以及(c)野生型心脏异种移植物“WT”。

图10B示出心脏异种移植物中在1小时内的平均肌钙蛋白I浓度(ng/mL)，这些心脏异种移植物储存在冷藏溶液中(CS)或用具有红细胞的含氧Steen溶液灌注(IM)。研究了以下心脏异种移植物：(a)敲除了GGTA1、CMAH和B4GALNT2且具有人补体和血栓调节基因的可变表达的心脏异种移植物(“TKO”)；(b)敲除了GGTA1且表达CD55的心脏异种移植物(“GTKO.hDAF”)；以及(c)野生型心脏异种移植物“WT”。

图10C是心脏异种移植物中1小时和最终时间点的肌钙蛋白I浓度(ng/mL)的图，这些心脏异种移植物储存在冷藏溶液中(CS)或用具有红细胞的含氧Steen溶液灌注(IM)。

图11A是示出储存在冷藏溶液中(CS)的TKO心脏异种移植物随时间推移的心输出量的图。

图11B是示出TKO心脏异种移植物中随时间推移的心输出量的图，这些心脏异种移植物用具有红细胞的含氧Steen溶液灌注(IM)。

图11C是示出储存在冷藏溶液中(CS)的TKO心脏异种移植物随时间推移的心输出量的图。

图11D是示出TKO心脏异种移植物中随时间推移的心输出量的图，这些心脏异种移植物用具有红细胞的含氧Steen溶液灌注(IM)。

图12A是示例性多顺反子盒，其包含聚A(pA)序列、非翻译区(UTR)、内含子、IRES、2A肽和三个顺反子(标记为“1”、“2”和“3”)。

图12B是包含多个多顺反子盒(称为“转录单位1”、“转录单位2”、“转录单位3”和“转录单位4”)的示例性核酸。每个转录单位都含有启动子、聚A(pA)序列和顺反子(标记为“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”和“9”)。所述核酸还包含绝缘子序列(标记为“INS”)、第一loxP位点(标记为“loxP”)和第二loxP位点(标记为“lox66”)。遍在染色质开放元件(UCOE)将第二与第三多顺反子盒隔开。

图13A示出通过流式细胞术得出的包含图2D的多顺反子盒的核酸在供体细胞、猪胎儿细胞和成年猪细胞中的表达。被圈出的细胞包含图2D的多顺反子盒。图13B示出通过免疫组织化学得出的包含图2D的多顺反子盒的核酸在供体细胞、猪胎儿细胞和成年猪细胞中的表达。

图14示出包含图2D的多顺反子盒的耳穿孔衍生细胞(ear punch derived cell，EPDC)表达CD46和CD55。

图15A示出人CD46和CD55在作为对照的来自PL15S猪或来自GGTA1和B4GALNT2双敲除(DKO)猪的耳穿孔衍生细胞(EPDC)或同种型对照染色的细胞上的表面蛋白表达。图15B评估PL15S猪或DKO猪的补体激活。PL15S猪表达图2D的多顺反子盒。

图16A-图16C示出本文所述的核酸提供防止在胰岛细胞中补体沉积的保护。图16A示出在不存在抗CD46和/或抗CD55阻断抗体的情况下，包含含有图2D的多顺反子盒的核酸的细胞提供防止在胰岛细胞中补体沉积的保护。在不存在抗CD46和/或抗CD55阻断抗体的情况下，包含含有图4D的多顺反子盒的核酸的细胞提供防止在胰岛细胞中补体沉积的保护，如C3b的百分比降低(图16C)和C3b的平均荧光强度降低(图16B)所证明的。

图17A-图17B示出CD55和CD46在用包含CD46da的核酸、包含CD55的核酸或包含通过F2A肽连接的CD46da和CD55的核酸转染的KCDC细胞中的表达。图17A示出CD55在与2A肽连接时表达。图17B示出CD46da(标记为“CD46”)在与2A肽连接时表达。图17C示出包含CD46da(“CD46”)和CD55的核酸减少补体沉积。

图18A-图18C示出CD46、CD55和CD59在用以下核酸之一转染的KCDC细胞中的表达：(i)hsCD46da2；(ii)hsCD55；(iii)hsCD59；(iv)hsCD46da2—F2A—hsCD55；(v)hsCD46da2—F2A—hsCD59；(vi)hsCD55—P2A—hsCD59；或(viii)hsCD46da2—F2A—hsCD55—P2A—hsCD59。图18A-图18C示出CD46(图18A)、CD55(图18B)和CD59(图18C)各自表达。图18D示出这些核酸中的每一种的表达减少补体沉积。在图18A-图18D中的每个图中，CD46da2标记为“46”，CD55标记为“55”，以及CD59标记为“59”。

图19A示出CD46同种型BC-Cyt1(“SG_BC1”)、Bc-Cy2(“SG_BC2”)和ABC1(“SG_ABC1”)的表达。图19B示出CD46同种型BC-Cyt1(“SG_BC1”)、Bc-Cy2(“SG_BC2”)和ABC1(“SG_ABC1”)减少补体沉积的能力。包含图2D的多顺反子盒的核酸的表达也减少补体沉积。

图20A示出用包含图2D的多顺反子盒的核酸转染的AEC、KEC、PUVEC和HUVEC细胞表达CD46和CD55(图20A)。图20B示出用包含图4C的多顺反子盒的核酸转染的AEC、KEC、PUVEC和HUVEC细胞表达CD46和CD55(图20B)。图20C示出包含含有图2D的多顺反子盒的核酸的AEC、KEC和PUVEC细胞减少了在AEC、KEC和PUVEC细胞中的补体沉积。图20D示出包含含有图4C的多顺反子盒的核酸的AEC、KEC和PUVEC细胞减少了在AEC、KEC和PUVEC细胞中的补体沉积。

图21A示出即使在供体特异性同种抗体(DSA)的存在下，含有图2D的多顺反子盒(“15S”)的核酸的表达也减少了补体沉积。图21B示出移植后DSA的浓度。“POD”是指移植后的天数。

图22示出实施例1的实验的时间线。

图23示出与实施例1A的动物中的野生型异种移植物相比，在TKO-A和TKO-B异种移植物中CD46、CD55、CD59、HLA-E、CD47和PD-L1表达的图像。

图24示出实施例1A的TKO-C动物中CD46、CD55、CD47、EPCR、THBD、A20和HO1表达的图像。

图25示出实施例1A的TKO-D动物中CD46、CD55、B2M、CD47、TFPI和THBD表达的图像。

图26示出在实施例1A的动物中移植后长达313天的血清肌酐(标记为Cr)的浓度。

图27示出移植后217天(“POD217”)、230天(“POD230”)或105天(“POD105”)，用苏木精和伊红或补体成分C4d染色的肾组织的图像。动物B6接受TKO-B异种移植物。动物C9接受TKO-F异种移植物。动物D2接受TKO-G异种移植物。

图28A示出示例性着陆架。着陆架包含绝缘子序列(HS4)、loxP位点(lox71和lox2272)、聚A序列(SPAAct1 pA和hsHBB pA)、CAG启动子和标记基因(d2BFP)。图28B示出图2I的15S5有效载荷在基因组安全港基因座处的掺入。图28C示出示例性着陆架。着陆架包含loxP位点(loxP和lox 2272)、hsEF1α1、聚A序列(SPAC2 pA)和蓝色荧光蛋白(BFP)。着陆架整合于AAVS1基因组安全港的外显子1与外显子2之间。

图29A-图29E是示出包含TKO-F异种移植物的五只猴子的血尿素氮(BUN)和肌酐的图。

图30A-图30B是示出包含TKO-G异种移植物的两只猴子的BUN和肌酐水平的图。

图31和图32是示出包含含有图2H的多顺反子盒的异种移植物的两只猴子的BUN和肌酐水平的图。

图33示出包含图2E的多顺反子盒的核酸在来自大约克夏(Yorkshire)猪的成纤维细胞中的表达。

图34(见圈出的细胞)示出包含图2E的多顺反子盒的核酸在来自尤卡坦(Yucatan)猪的成纤维细胞中的表达。

图35示出包含图2D的多顺反子盒的核酸在来自尤卡坦猪的成纤维细胞中的表达。

图36(见圈出的细胞)示出包含图2D的多顺反子盒的核酸在来自尤卡坦猪的含有PERV敲除的成纤维细胞中的表达。

图37A示出A20在包含图4A的多顺反子盒的胰岛细胞中的表达。图37B示出A20在包含图4B的多顺反子盒的胰岛细胞中的表达保护细胞免受TNFα介导的细胞凋亡。

图38A-图38C示出实施例1A的TKO-F异种移植物的转基因在组织、肾小球和肾小管中的表达。

图39示出15S4的转基因在包含含有图2H的多顺反子盒的核酸的猴子的组织、肾小球和肾小管中的表达。

图40示出包含含有图2H的多顺反子盒的核酸的猴子的转基因表达的免疫组织化学图像。

图41A-图41D示出图2H(“15S4”)或图2E(“15S1”)的多顺反子盒在包含肾脏异种移植物的猴子中的比较表达。图41A示出通过免疫组织化学得出的转基因表达。图41B-图41D示出整个组织(图41B)、肾小球(图41C)和肾小管(图41D)中的转基因表达。

图42A示出相对于在野生型尤卡坦猪中的表达，15S1转基因在猪胎儿肾中的表达。图42B示出相对于在野生型尤卡坦猪中的表达，15S1转基因在猪新生肾中的表达。图42C示出相对于在野生型尤卡坦猪中的表达，15S1转基因在猪成年肾中的表达。

图43A示出15S1转基因TFPI、EPCR和THBD在猪胎儿、新生和成年肾组织中的表达。图43B示出15S1转基因B2M HLA-E融合蛋白和CD47在猪胎儿、新生和成年肾组织中的表达。图43C示出15S1转基因CD46和CD55在猪胎儿、新生和成年肾组织中的表达。图43D示出15S1转基因中的每一个在两种不同胎儿猪肾组织中的表达。

图44示出CD47由胰岛细胞的表达，所述胰岛细胞包含含有图2H(“15S4”)或图4A(“17M1”)的多顺反子盒的核酸。

图45示出包含图2H的多顺反子盒(“15S4”)的解离的胰岛细胞在保护免于吞噬作用方面优于包含图4A的多顺反子盒(“17M1”)的胰岛细胞。

图46提供了如何产生包含本文所述核酸的转基因猪的例子。

图47A是标准启动子的图示。图47B是包含CpG岛的启动子的图示。

图48A-图48C示出使用包含或缺乏CpG岛的启动子，CD47顺反子在成纤维细胞(图48A)、β胰岛细胞(图48B)和pAEC-SV40细胞(图48C)中的表达。图48D-图48F示出使用包含或缺乏CpG岛的启动子，CD46在成纤维细胞(图48D)、β胰岛细胞(图48E)和pAEC-SV40细胞(图48F)中的表达。图48A-图48F的每个图的x轴表示用于表达顺反子的启动子的SEQ ID NO:。

图49示出胰岛细胞的免疫组织化学图像，所述胰岛细胞包含含有移植在糖尿病小鼠中的图4A的多顺反子盒的核酸。图像示出在单独小鼠中针对胰岛素、胰高血糖素和细胞核的染色。

图50示出实施例16的实验的实验设计。

图51示出接受新生猪胰岛移植物的NSG小鼠的血糖水平，所述新生猪胰岛移植物包含含有图4A的多顺反子盒的核酸。

图52A-图52B示出在接受了新生猪胰岛移植物的两只食蟹猴中的空腹血糖浓度、总胰岛素和猪C肽，所述新生猪胰岛移植物包含含有图4A的多顺反子盒的核酸。

图53A示出表达14P核酸的细胞被保护免于NK细胞介导的裂解。图53B示出与不表达14P和14S核酸的野生型(WT)细胞或K562癌细胞相比，表达14P和14S核酸的细胞被保护免于NK细胞介导的裂解。

图54A示出人EPCR和THBD蛋白在野生型(WT)，GGTA1、B4GALNT2和CMAH三重敲除(TKO)主动脉来源的内皮细胞(AEC)，人脐带来源的内皮细胞(Hu UVEC)和脐带、主动脉或肾脏(KEC)来源的有效载荷15S猪内皮细胞(猪UVEC)上的表面表达如左侧直方图所示。有效载荷15S细胞包含含有图2D的多顺反子盒的核酸。图54B示出表达含有图2D的多顺反子盒“15S”的核酸的各种细胞具有功能性THBD和PROCR，如与不表达15S的细胞相比活化蛋白C浓度升高所表明的。评估了以下细胞类型：肺泡上皮细胞(AEC)、肾上皮细胞(KEC)、人脐静脉内皮细胞(“Hu UVEC”)、猪脐静脉内皮细胞(“猪UVEC”)和心外膜衍生细胞(EPDC)。

图55是说明制备包含本文所述核酸的经基因修饰的动物的示例性方法的图。在第一步骤(第1轮)中，进行CRISPR-Cas9介导的非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复以从细胞(例如成纤维细胞)的基因组中敲除GGTA1、CMAH和B4GALNT2基因(例如TKO)并将着陆架引入细胞中的基因组安全港位点(例如基因组安全港AAVS1位点的内含子1或AAVS1位点的3’端翼区)处。着陆架的引入导致细胞基因组中loxP位点的引入。在第二步骤(第2轮)中，使用重组酶介导的盒交换来引入包含多顺反子盒(例如，有效载荷KI)的核酸。在第三步骤(第3轮)中，使用CRISPR-Cas9 NHEJ敲除猪内源性逆转录病毒元件(PERV)。

图56A示出人CD47蛋白在野生型(WT)和GGTA1加B4GALNT2双敲除(DKO)耳穿孔衍生细胞(EPDC)以及来自PL15S猪的胎儿成纤维细胞(FF)上的表达。图56B示出PL15S猪的吞噬作用减少。吞噬指数由以下等式确定：总吞噬信号除以总吞噬信号加未吞噬信号的总和。图56C示出PL15S细胞被保护免于吞噬作用。PL15S猪表达图2D的多顺反子盒。

具体实施方式

I.定义

术语“猪(pig)”、“猪(swine)”和“猪(porcine)”在本文中可互换使用，是指与家猪物种野猪(Sus scrofa)的各种品种有关的任何动物。

当用于指代蛋白质或多肽的片段或衍生物时，术语“生物活性”意指所述片段或衍生物保留了参考全长蛋白质或多肽的至少一种可测量和/或可检测的生物活性。例如，CRISPR/Cas9蛋白的生物活性片段或衍生物可以能够结合gRNA，有时在本文中也称为单指导RNA(sgRNA)，当与指导RNA复合时结合靶DNA序列，和/或切割一条或多条DNA链。

当在疾病、损伤或障碍的情况下使用时，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“减轻”等在本文中用于通常意指获得所需药理学和/或生理学作用，并且还可以用于指代改善、减轻和/或降低所治疗病症的一种或多种症状的严重性。就完全或部分延迟疾病、病症或其症状的发作或复发而言，所述作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病或病症和/或可归因于所述疾病或病症的不利作用而言，所述作用可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物、特别是人的疾病或病症的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患所述疾病或病症但尚未被诊断为患有所述疾病或病症的受试者中预防所述疾病或病症发生；(b)抑制所述疾病或病症(例如，阻止其发展)；或(c)缓解所述疾病或病症(例如，使所述疾病或病症消退，从而改善一种或多种症状)。

本文中使用的术语“同时”是指与另一事件同时发生的事件，如与另一事件的发生相比，在数秒、数毫秒、数微秒或更短的时间内发生。

本文中使用的术语“敲除(knockout)”(“KO”)或“敲除(knocking out)”是指猪或其他动物或者猪或其他动物中的任何细胞中的基因或缺陷基因的缺失、失活或消融。如本文所用，KO还可以指代执行或已执行了基因或其部分的缺失、失活或消融的方法。

本文中使用的术语“敲入(knockin)”(“KI”)或“敲入(knocking in)”是指猪或其他动物或者猪或其他动物中的任何细胞中的基因的一个或多个核苷酸的添加、替代或突变。如本文所用，KI还可以指代执行或已执行了基因或其部分的一个或多个核苷酸的添加、替代或突变的方法。

关于猪组织、器官或细胞的术语“不含PERV”是指具有至少75％无活性猪内源性反转录病毒(PERV)元件的组织、器官或细胞。PERV元件可以是gag、pol或env基因。在实施方案中，猪组织、器官或细胞是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％不含PERV的。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列在比较时具有的相同核苷酸或氨基酸残基的特定百分比。可以使用可在线获得的工具CLUSTALW2来计算同一性百分比。可以将以下默认参数用于CLUSTALW2配对比对：蛋白质权重矩阵＝Gonnet；空位开放＝10；空位延伸＝0.1。

术语“保守取代”是指在以下氨基酸组中一个氨基酸交换为另一个：(i)脂肪族氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(ii)具有羟基的氨基酸(丝氨酸和苏氨酸)；(iii)酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)；(iv)具有酰胺侧链的氨基酸(天冬酰胺和谷氨酰胺)；(v)碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)；(vii)具有芳族侧链的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)。在实施方案中，本文提供了编码含有保守取代的蛋白质的核酸。例如，蛋白质可具有丙氨酸被缬氨酸的保守取代。在一些方面，编码的蛋白的氨基酸改变的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。

如本文所用，术语“多顺反子盒”是指在单个启动子和聚A序列控制下编码两个或更多个“顺反子”或基因的核酸。术语“多顺反子盒”在本文中与“转录单位”可互换使用。在实施方案中，多顺反子盒包含cDNA。在实施方案中，多顺反子盒包含DNA。在实施方案中，多顺反子盒包含一个或多个内含子。图12A中描绘了示例性多顺反子盒。图12B中描绘了包含多个多顺反子盒的示例性核酸。

如本文所用，术语“控制元件”是指控制顺反子表达的核酸序列。示例性的控制元件包括启动子、增强子、聚A信号和终止子。其表达由控制元件调节的顺反子称为由控制元件可操作地控制。

如本文所用，例如关于核酸或细胞的术语“分离的”是指已被纯化以使其与其他组分分离的核酸或细胞；例如，分离的核酸可以从用于产生核酸的细菌细胞中纯化，或者细胞可以从用于治疗目的的动物中分离。

如本文所用，术语“异源的”是指与宿主生物体的内源核酸的表达相反，在生物体中作为重组DNA操作的结果调节核酸的表达。通常，顺反子和/或调节顺反子表达的一个或多个控制元件是人工的或来源于与宿主生物体不同的物种。在一些方面，顺反子和控制元件可以来自与宿主生物体相同的物种，但是通过重组方法引入，与等同的天然顺反子相比，所述重组方法改变顺反子的控制和表达。

II.包含一个或多个多顺反子盒的核酸

猪异种移植物与人器官大小和生理学广泛兼容，并且在伦理上被美国普通人群所接受。然而，异种移植的猪组织引发一系列复杂的事件，导致移植物排斥反应，包括：由于存在针对猪抗原的预先形成的抗体而导致的超急性排斥反应，补体激活和高凝状态，以及由于分子不兼容性而导致的先天性和适应性免疫反应增强。本公开使用基因工程方法来解决当前异种移植的缺点。

本公开提供了包含用于对细胞、器官、组织和动物进行基因工程化的一个或多个多顺反子盒的核酸。

在实施方案中，本文提供了包含约1与约10个之间的多顺反子盒的核酸。例如，所述核酸可包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个多顺反子盒。每个多顺反子盒包含两个或更多个选自以下的顺反子：CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、PROCR、CD39、B2M、HLA-E、CD47、A20、PD-L1、HO1、CTLA-4(例如LEA29Y)、XIAP及其组合。在实施方案中，所述多顺反子盒的侧翼是绝缘子序列、loxP位点或其组合。

在实施方案中，多顺反子盒的每个顺反子被编码2A多肽的核酸或包含内部核糖体进入位点(IRES)的序列隔开。在实施方案中，1、2、3、4或5个多顺反子盒不包含编码2A多肽的核酸。每个多顺反子盒都在启动子的控制之下。示例性启动子描述于表B中。每个多顺反子盒还包含一个或多个聚A(也称为“polyA”)和/或终止子序列。示例性聚A序列和/或终止子序列提供于表C中。

当顺反子、启动子或聚A序列的名称在顺反子、启动子或聚A序列名称之前含有小写字母时，小写字母是指分离出顺反子的属和种。例如，ssA20是指来自野猪(Sus scrofa)的A20，hsCD46是指来自智人(Homo sapiens)的CD46，mmA20是指来自小家鼠(Musmusculus)的A20，并且btA20是指来自家牛(Bos taurus)的A20。当在顺反子、启动子或聚A序列名称之前使用小写字母“s”时，s是指野猪。当在顺反子、启动子或聚A序列名称之前使用小写字母“h”时，h是指智人。当在顺反子、启动子或聚A序列名称之前使用小写字母“m”时，m是指小家鼠。

在实施方案中，顺反子的核酸序列提供于表A中。表A的NCBI参考序列、基因ID和蛋白质ID通过引用并入本文。在实施方案中，顺反子是猪顺反子。在实施方案中，顺反子是人顺反子。在实施方案中，顺反子是小鼠顺反子。

表A

在实施方案中，多顺反子盒包含编码β-2微球蛋白(B2M)的核酸。B2M基因编码血清蛋白，发现该血清蛋白与几乎所有有核细胞表面上的主要组织相容性复合体(MHC)I类重链缔合。在实施方案中，多顺反子盒包含编码主要组织相容性复合体1类E(HLA-E)的核酸。HLA-E属于HLA I类重链旁系同源物。该I类分子是包含重链和轻链(β-2微球蛋白)的异二聚体。在实施方案中，多顺反子盒包含编码B2M和HLA-E蛋白的核酸。在实施方案中，多顺反子盒包含编码B2M和HLA-E的融合蛋白(其被称为“B2M HLA-E融合蛋白”)的核酸。在实施方案中，B2MHLA-E融合蛋白由与选自SEQ ID NO:62、66或105的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列编码。在实施方案中，B2M HLA-E融合蛋白包含肽表位。在实施方案中，肽表位由具有SEQ IDNO:260或SEQ ID NO:261的序列的核酸编码。包含肽表位的B2M HLA-E融合蛋白在本文中称为“单链三聚体”。在实施方案中，表位的氨基酸序列是VMAPRTLIL(SEQ ID NO:197)或VMAPRTLFL(SEQ ID NO:198)。在实施方案中，表位的氨基酸序列是MAPRTLIL(SEQ ID NO:251)或MAPRTLFL(SEQ ID NO:252)。在实施方案中，表位位于B2M-HLA-E融合蛋白的N末端。具有由SEQ ID NO:23、24、26、201、202和204表示的序列的核酸编码包含肽表位的B2M HLA-E融合蛋白，所述肽表位具有由SEQ ID NO:251表示的氨基酸序列。具有由SEQ ID NO:31、32、33、34、39、30、41、42、43、44、45、46、172、173、176、177、209-212、216、217、219-226、229和230表示的序列的核酸编码包含肽表位的B2MHLA-E融合蛋白，所述肽表位具有由SEQ IDNO:198表示的氨基酸序列。具有由SEQ ID NO:25、27-29、35-37、40、203、205-207、213-215和218表示的序列的核酸编码包含肽表位的B2M HLA-E融合蛋白，所述肽表位具有由SEQ IDNO:197表示的氨基酸序列。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码血红素加氧酶-1(HO1)的核酸。HO1是血红素分解代谢中必不可少的酶，可切割血红素形成胆绿素和一氧化碳(一种假定的神经递质)，胆绿素随后被胆绿素还原酶转化为胆红素。血红素加氧酶活性由其底物血红素和各种非血红素物质诱导。在实施方案中，编码HO1的核酸分离自野猪。在实施方案中，HO1由与选自SEQID NO:63、109、165、183和189的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码A20蛋白的核酸。A20蛋白是一种锌指蛋白和泛素编辑酶，并且已显示可抑制NF-κB激活以及TNF介导的细胞凋亡。A20蛋白兼具泛素连接酶和去泛素化酶活性，参与细胞因子介导的免疫和炎症反应。在实施方案中，编码A20蛋白的核酸分离自野猪。在实施方案中，A20蛋白由具有与选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码分化簇39(CD39)蛋白的核酸。该基因编码的蛋白质是质膜蛋白，可将细胞外ATP和ADP水解为AMP。在实施方案中，CD39由具有与选自SEQID NO:67-70、106、253-258和262-264的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码分化簇46(CD46)蛋白的核酸。该基因编码的蛋白质是I型膜蛋白，并且是补体系统的调节部分。编码的蛋白质具有辅因子活性，可通过血清因子I使得补体成分C3b和C4b失活，从而保护宿主细胞免受补体的损害。在实施方案中，CD46由具有与选自SEQ ID NO:71-76和185的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的核酸编码。在实施方案中，CD46包含剪接位点突变，其中去除了受体位点和供体位点。CD46_LL(SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:258或SEQ ID NO:254)、CD46da1(SEQ ID NO:72)、CD46da2(SEQ ID NO:73)、CD46da(SEQ ID NO:72、73、185、200或256)、以及CD46i(SEQ ID NO:74-75、SEQ ID NO:255)是指具有剪接位点突变的CD46蛋白。在实施方案中，包含编码CD46蛋白的基因的多顺反子盒编码选自CD46 C1、CD46 C2、CD46 BC1、CD46 BC2和CD46 ABC1的CD46同种型。编码CD46BC1蛋白同种型的顺反子具有SEQ ID NO:263的核酸序列。编码CD46 BC2蛋白同种型的顺反子具有SEQ ID NO:264的核酸序列。这些同种型在以下参考文献中进行了描述，所述参考文献以其全文并入本文：Human Genetics第136卷,第421-435页(2017)。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码分化簇47(CD47)蛋白的核酸。CD47蛋白是膜蛋白，所述膜蛋白参与细胞粘附到细胞外基质时发生的细胞内钙浓度的增加。CD47蛋白也是血小板反应蛋白C末端细胞结合结构域的受体，并且可在膜转运和信号转导中发挥作用。CD47蛋白包含IgV结构域、跨膜结构域和C末端结构域。CD47蛋白C末端结构域有四种同种型：同种型1、同种型2、同种型3和同种型4。同种型1的长度为4个氨基酸，并且在上皮细胞和内皮细胞中表达。同种型2的长度为16个氨基酸，并且是CD47表达最丰富的同种型。同种型2在造血细胞、内皮细胞和上皮细胞中表达。同种型3的长度为23个氨基酸，以及同种型4的长度为36个氨基酸。同种型3和4在神经元、肠和睾丸中表达。在实施方案中，CD47由具有与选自SEQ ID NO:77-83、180和259的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的核酸编码。在实施方案中，CD47是同种型1、2、3或4。在实施方案中，CD47是CD47同种型2(CD47-2)。在实施方案中，CD47-2由具有选自SEQ ID NO:78、80、83和180中任一个的序列的核酸编码。在实施方案中，CD47是CD47同种型1(CD47-1)。在实施方案中，CD47-1由具有SEQ ID NO:259的序列的核酸编码。在实施方案中，多顺反子盒包含编码与SEQ ID NO:201相比具有S64A突变、S79A突变或其组合的CD47蛋白的核酸。以下文章描述了S64A和S79A突变，并通过引用以其整体并入本文：J BiolChem.2011年4月29日；286(17):14991-5002。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码分化簇55(CD55)蛋白的核酸。该基因编码参与补体级联调节的糖蛋白。编码的蛋白质与补体蛋白结合加速了它们的衰变，从而破坏了级联并防止对宿主细胞造成损害。在实施方案中，CD55蛋白由具有与选自SEQ ID NO:84、85、107和184的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码分化簇59(CD59)蛋白的核酸。CD59蛋白是调节补体介导的细胞裂解的细胞表面糖蛋白，并且参与淋巴细胞信号转导。CD59蛋白是补体膜攻击复合物的强效抑制剂，其中在该复合物组装过程中，它会结合补体C8和/或C9，从而抑制多拷贝的C9向复合物中的掺入，所述掺入是渗透孔形成所必需的。在实施方案中，CD59由具有与选自SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:108的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码CTLA-4蛋白的核酸。在实施方案中，所述核酸编码CTLA-4蛋白的细胞外结构域。在实施方案中，CTLA-4蛋白的细胞外结构域包含相对于SEQ ID NO:199的L104E突变、A29Y突变或二者。在实施方案中，编码CTLA-4的核酸包括编码免疫球蛋白或其片段的核酸。在实施方案中，免疫球蛋白的片段是κ轻链或λ轻链。在实施方案中，其片段是免疫球蛋白重链。在实施方案中，其片段是免疫球蛋白重链的CH1、CH2、CH3或CH4结构域。在实施方案中，其片段是免疫球蛋白的可变重结构域或可变轻结构域。在实施方案中，编码CLTA-4蛋白或其片段和免疫球蛋白或其片段的核酸是LEA29Y。在实施方案中，编码CTLA-4蛋白或其片段和免疫球蛋白或其片段的核酸包含CTLA-4的细胞外结构域(SEQ ID NO:199)(其相对于SEQ ID NO:199具有L104E突变和A29Y突变)、以及人免疫球蛋白1的铰链、CH2和CH3结构域。LEA29Y的核酸序列编码具有以下氨基酸序列的蛋白质：MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:196)。LEA29Y以高亲和力结合人B7.1/CD80和B7.2/CD86，因此是对经由该途径的T细胞共刺激的有效抑制剂。以下参考文献描述了LEA29Y，并通过引用整体并入本文：国际公开号2001/092337和Wolf-vanBuerck等人Scientific Reports.7:3572(2017)。在实施方案中，CTLA-4由具有与选自SEQID NO:87、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:186的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)蛋白的核酸。PD-L1蛋白是由造血和非造血细胞(如T细胞和B细胞)以及各种类型的肿瘤细胞表达的免疫抑制受体配体。PD-L1蛋白是I型跨膜蛋白，其具有免疫球蛋白V样和C样结构域。该配体与其受体的相互作用抑制了T细胞激活和细胞因子的产生。在实施方案中，PD-L1由与选自SEQID NO:89-91的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码内皮蛋白c受体(EPCR)蛋白的核酸。编码EPCR的基因称为PROCR。EPCR结合活化蛋白C。在实施方案中，EPCR由与选自SEQ ID NO:92、93和181的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸编码。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码组织因子途径抑制剂(TFPI)蛋白的核酸。由TFPI编码的蛋白质抑制因子X，并抑制VIIa/组织因子活性。在实施方案中，TFPI由与选自SEQ ID NO:94-96、103和187的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸编码。在实施方案中，TFPI是TFPI即CD4跨膜结构域(NM_000616)或其片段与P-选择素胞质尾(NM_003005)或其片段之间的融合物。在实施方案中，TFPI缺乏P-选择素尾部并且在本文中称为TFPI(ΔP-Sel)。在实施方案中，CD4跨膜结构域包含具有NM_000616的NCBI RefSeq ID的CD4的氨基酸166至435。在实施方案中，P-选择素胞质尾包含具有NM_003005的NCBI RefSeq ID的P-选择素的氨基酸797至830。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码凝血调节蛋白(THBD)的核酸。THBD蛋白是与凝血酶结合的内皮特异性I型膜受体。这种结合导致蛋白C的激活，从而降解凝血因子Va和VIIIa并减少凝血酶的产生量。在实施方案中，THBD蛋白由与选自SEQ ID NO:97-102、166、265-266的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸编码。在实施方案中，编码THBD蛋白的基因是“THBDda”。THBDda是编码含有剪接位点突变的THBD的顺反子。在实施方案中，THBDda顺反子具有与选自SEQ ID NO:99-102、166和266的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。

在实施方案中，多顺反子盒包含编码X染色体连锁的细胞凋亡抑制剂(XIAP)蛋白的核酸。在实施方案中，XIAP由与SEQ ID NO:110的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸编码。该基因编码属于细胞凋亡抑制蛋白家族的蛋白质。

在实施方案中，本文所述的任何顺反子包含起始密码子或终止密码子。多顺反子盒被组织为使得转录从盒的5'引发端一直进行到3'端，以促进每个顺反子的表达。单独的顺反子可以添加或去除起始密码子或终止密码子以促进多顺反子的表达。

在实施方案中，多顺反子盒包含两个或更多个共享功能的顺反子，例如，参与补体调节、凝血、先天免疫、炎症和细胞凋亡以及细胞免疫的基因。在实施方案中，多顺反子盒包含两个或更多个具有不同功能的顺反子。

在实施方案中，本文所述的核酸包含一个或多个选自以下的多顺反子盒：凝血盒、补体调节盒、补体调节和炎症和细胞凋亡盒、先天免疫盒、先天免疫和炎症和细胞凋亡盒、炎症和细胞凋亡盒、补体调节和先天免疫盒、细胞免疫和凝血盒、细胞凋亡和凝血盒、以及细胞凋亡和细胞免疫盒。

在实施方案中，凝血盒包含一个或多个选自THBD、TFPI、CD39和PROCR的顺反子。在实施方案中，凝血盒包含一个或多个选自THBD和TFPI的顺反子。在实施方案中，凝血盒包含一个或多个选自THBD、TFPI和CD39的顺反子。在实施方案中，凝血盒包含一个或多个选自PROCR和THBD的顺反子。在实施方案中，凝血盒包含一个或多个选自TFPI、PROCR和THBD的顺反子。

在实施方案中，补体调节盒包含一个或多个选自CD46、C59和CD55的顺反子。在实施方案中，补体调节盒包含一个或多个选自CD46和CD59的顺反子。在实施方案中，补体调节盒包含一个或多个选自CD46和CD55的顺反子。在实施方案中，补体调节盒包含一个或多个选自CD46、CD55和CD59的顺反子。在实施方案中，补体调节盒包含一个或多个选自CD55和CD59的顺反子。在实施方案中，包含补体调节盒的核酸防止补体沉积。例如，图18D示出与缺乏顺反子CD46、CD55和CD59的核酸的表达相比，包含顺反子CD46、CD55、CD59或其组合的核酸的表达减少了补体蛋白C3b的沉积。

在实施方案中，补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自由CD46、CD55、CD59、A20、HO1和PD-L1组成的组的顺反子。在实施方案中，补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自CD46、CD55、CD59、A20、HO1和PD-L1的顺反子。在实施方案中，补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自CD46、CD55、A20和HO1的顺反子。

在实施方案中，先天免疫盒包含一个或多个选自B2M、HLA-E、B2MHLA-E融合蛋白、CD47及其组合的顺反子。在实施方案中，先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的顺反子和CD47顺反子。

在实施方案中，先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自B2M、HLA-E、B2M HLA-E融合蛋白、CD47、A20、HO1、PD-L1及其组合的顺反子。在实施方案中，先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含B2M顺反子、HLA-E顺反子、编码B2M HLA-E融合蛋白的顺反子、CD47顺反子、A20顺反子、HO1顺反子和PD-L1顺反子中的一个或多个。在实施方案中，先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自B2M、HLA-E、B2M HLA-E融合蛋白、CD47、A20和HO1的顺反子。在实施方案中，先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自编码B2MHLA-E融合蛋白的顺反子、CD47、A20和HO1的顺反子。

在实施方案中，炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自A20、HO1和PD-L1的顺反子。在实施方案中，炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自A20和HO1的顺反子。在实施方案中，炎症和细胞凋亡盒包含一个或多个选自A20和PD-L1的顺反子。

在实施方案中，补体调节和先天免疫盒包含一个或多个选自CD46、CD55、CD47、B2M、HLA-E、B2M HLA-E融合蛋白及其组合的顺反子。在实施方案中，补体调节和先天免疫盒包含一个或多个选自CD46、CD55和CD47的顺反子。

在实施方案中，细胞免疫和凝血盒包含一个或多个选自LEA29Y、CD39、TFPI、THBD和PROCR的顺反子。在实施方案中，细胞免疫和凝血盒包含CTLA-4(例如，LEA29Y)顺反子和CD39顺反子。

在实施方案中，细胞凋亡和凝血盒包含一个或多个选自THBD、TFPI、CD39、PROCR和XIAP的顺反子。在实施方案中，细胞凋亡和凝血盒包含XIAP顺反子和CD39顺反子。

在实施方案中，细胞凋亡和细胞免疫盒包含一个或多个选自A20、PD-L1、HO1和CTLA-4(例如，LEA29Y)的顺反子。在实施方案中，细胞凋亡和细胞免疫盒包含A20和CTLA-4(例如，LEA29Y)顺反子。在实施方案中，细胞凋亡和细胞免疫盒包含A20和HO1顺反子。在实施方案中，A20顺反子、HO1顺反子或二者来自野猪。

在实施方案中，凝血和先天免疫盒包含一个或多个选自以下的顺反子：THBD顺反子、TFPI顺反子、CD39顺反子、PROCR顺反子、B2M顺反子、HLA-E顺反子、编码B2M HLA-E融合蛋白的顺反子和CD47顺反子。在实施方案中，凝血和先天免疫盒包含THBD顺反子、CD47顺反子和PROCR顺反子。

在实施方案中，核酸包含第一多顺反子盒、第二多顺反子盒和第三多顺反子盒，其中所述第一多顺反子盒位于所述第二多顺反子盒的5’端，并且所述第二多顺反子盒位于所述第三多顺反子盒的5’端。在实施方案中，凝血盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，补体调节盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，补体调节和炎症和细胞凋亡盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，先天免疫盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，先天免疫和炎症和细胞凋亡盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，炎症和细胞凋亡盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，补体调节和先天免疫盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，细胞免疫和凝血盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，细胞凋亡和凝血盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，细胞凋亡和细胞免疫盒是第一、第二或第三多顺反子盒。在实施方案中，凝血和先天免疫盒是第一、第二或第三多顺反子盒。

在实施方案中，核酸包含第一多顺反子盒、第二多顺反子盒、第三多顺反子盒和第四多顺反子盒，其中所述第一多顺反子盒位于所述第二多顺反子盒的5’端，所述第二多顺反子盒位于所述第三多顺反子盒的5’端，并且所述第三多顺反子盒位于所述第四多顺反子盒的5’端。在实施方案中，凝血盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，补体调节盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，补体调节和炎症和细胞凋亡盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，先天免疫盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，先天免疫和炎症和细胞凋亡盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，炎症和细胞凋亡盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，补体调节和先天免疫盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，细胞免疫和凝血盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，细胞凋亡和凝血盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，细胞凋亡和细胞免疫盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。在实施方案中，凝血和先天免疫盒是第一、第二、第三或第四多顺反子盒。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、补体调节盒和先天免疫盒。在实施方案中，凝血盒位于补体调节盒的5’端。在实施方案中，补体调节盒位于先天免疫盒的5’端。在实施方案中，凝血盒位于补体调节盒的5’端，并且补体调节盒位于先天免疫盒的5’端。在实施方案中，凝血盒位于先天免疫盒的5’端，并且先天免疫盒位于补体调节盒的5’端。在实施方案中，先天免疫盒位于凝血盒的5’端，并且凝血盒位于补体调节盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、补体调节盒、以及先天免疫和炎症和细胞凋亡盒。在实施方案中，凝血盒位于补体调节盒的5’端，并且补体调节盒位于先天免疫和细胞凋亡盒的5’端。在实施方案中，补体调节盒位于先天免疫和细胞凋亡盒的5’端。在实施方案中，凝血盒位于补体调节盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、炎症和细胞凋亡盒、以及补体调节和先天免疫盒。在实施方案中，凝血盒位于炎症和细胞凋亡盒的5’端，并且炎症和细胞凋亡盒位于补体调节和先天免疫盒的5’端。在实施方案中，凝血盒位于炎症和细胞凋亡盒的5’端。在实施方案中，炎症和细胞凋亡盒位于补体调节和先天免疫盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、补体调节和炎症和细胞凋亡盒、以及先天免疫盒。在实施方案中，先天免疫盒位于凝血盒的5’端，并且凝血盒位于补体调节和炎症和细胞凋亡盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、补体调节盒、先天免疫盒、以及细胞免疫和凝血盒。在实施方案中，凝血盒位于先天免疫盒的5’端。在实施方案中，先天免疫盒位于细胞免疫和凝血盒的5’端。在实施方案中，细胞免疫和凝血盒位于补体调节盒的5’端。在实施方案中，凝血盒位于先天免疫盒的5’端，先天免疫盒位于细胞免疫和凝血盒的5’端，并且细胞免疫和凝血盒位于补体调节盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、补体调节盒、先天免疫盒、以及细胞凋亡和炎症盒。在实施方案中，凝血盒位于先天免疫盒的5’端，先天免疫盒位于细胞凋亡和炎症盒的5’端，并且细胞凋亡和炎症盒位于补体调节盒的5’端。在实施方案中，凝血盒位于先天免疫盒的5’端，先天免疫盒位于补体调节盒的5’端，并且补体调节盒位于细胞凋亡和炎症盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、补体调节盒、先天免疫盒、以及细胞凋亡和凝血盒。在实施方案中，凝血盒位于先天免疫盒的5’端，先天免疫盒位于细胞凋亡和凝血盒的5’端，并且细胞免疫和凝血盒位于补体调节盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血盒、补体调节盒、先天免疫盒、以及细胞凋亡和细胞免疫盒。在实施方案中，凝血盒位于先天免疫盒的5’端，先天免疫盒位于细胞凋亡和细胞免疫盒的5’端，并且细胞凋亡和细胞免疫盒位于补体调节盒的5’端。

在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸包含凝血和先天免疫盒、细胞凋亡和细胞免疫盒、以及补体调节盒。在实施方案中，凝血和先天免疫盒位于细胞凋亡和细胞免疫盒的5’端，并且细胞凋亡和细胞免疫盒位于补体调节盒的5’端。

在实施方案中，包含至少一个多顺反子盒的核酸包含一个或多个启动子，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个启动子。在实施方案中，包含至少一个多顺反子盒的核酸含有用于每个多顺反子盒的不同启动子。启动子是DNA序列，它定义了RNA聚合酶转录多顺反子盒的起始位置。在实施方案中，启动子源自猪基因。在实施方案中，启动子源自小鼠基因。在实施方案中，启动子源自人基因。在实施方案中，启动子是真核翻译延伸因子1α1(缩写为“EF1α1”或“EEF1α1”)启动子。EF1α1启动子是组成型启动子。在实施方案中，启动子是CAG启动子。CAG启动子包含与鸡β-肌动蛋白启动子融合的巨细胞病毒增强子和兔β-珠蛋白基因的剪接受体。在实施方案中，启动子是肌动蛋白γ1(ACTG1)启动子。在实施方案中，启动子是热休克蛋白家族A成员8(HSPA8)启动子。在实施方案中，启动子是泛素C(UBC)启动子。在实施方案中，启动子是细胞内粘附分子2(ICAM2)启动子。在实施方案中，启动子包括EF1α1、CAG、ACTG1、HSPA8、UBC或ICAM2启动子。在实施方案中，启动子包含在5'或3'端的延伸。在实施方案中，延伸是内含子或其片段。内含子可以从内源性启动子基因(例如EF1α1、CAG、ACTG1、HSPA8、UBC或ICAM2)得到或从其他来源提供。

在实施方案中，启动子包含CpG岛。CpG岛是具有升高的GC含量和高密度CpG二核苷酸的区域。在实施方案中，CpG岛位于启动子的外显子序列的5’端。在实施方案中，CpG岛包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的GC含量。在实施方案中，CpG岛包含约500个碱基对(bp)至约3千碱基对(kb)。在实施方案中，CpG岛包含约500bp至约5kb。在实施方案中，CpG岛包含约1kb至约3kb。例如，CpG岛可包含至少约500bp、至少约1kb、至少约1.5kb、至少约2kb、至少约2.5kb、至少约3kb、至少约3.5kb、至少约4kb、至少约4.5kb或至少约5kb。相比之下，标准启动子的长度为约100-200个碱基对。在实施方案中，CpG岛含有大于0.60的CpG二核苷酸的观察数量与预期数量的比率。在实施方案中，CpG岛包含非甲基化的CpG二核苷酸。在实施方案中，CpG岛包含甲基化的CpG二核苷酸。以下参考文献描述了CpG岛：J Mol Bio.1987年7月20日；196(2):261-82；Nat Rev Mol Cell Biol.2018年10月；19(10):621-637；Biochem Biophys ResCommun.2009年5月15日；382(4):643-645。这些参考文献中的每一个均以其整体并入本文。

在本文所述的核酸或多顺反子盒中包含的启动子的非限制性例子示于表B中。在实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO:126-145、167、168、178、179、231-238、247和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。

表B

名称	SEQ ID NO.
		CAG	126-128,247,250
hsACTG1	129
		hsEF1α1，也称为“hEF1α1”	130-132,231-232
hsHSPA8	133
		mmEF1α1，也称为“mEF1a1”	134-135
ssEEF1α1，也称为“ssEEF1A1(ATACseq)”	136-138,179,233-235
		ssHSPA8，也称为“ssHSPA8(ATACseq)”	139-140,142-145,236-238
ssUBC	141,168,178
		ssICAM2	167

在实施方案中，核酸内的每个启动子是不同的。在实施方案中，核酸内的第一启动子和第二启动子是相同的。在实施方案中，核酸的每个多顺反子盒包含不同的启动子。在实施方案中，启动子是位于有义链上的正向启动子。在实施方案中，启动子是位于反义链上的反向启动子。

在图1A-图1D、图2A-图2J、图3A-图3C、图4A-图4H、图5A-图5F和图6中正向启动子用正向箭头表示，而反向启动子用反向箭头表示。

在实施方案中，本文所述的任何盒可包含来自表B的任何启动子。启动子和多顺反子盒的示例性排列见于图1A-图1D、图2A-图2J、图3A-图3C、图4A-图4H、图5A-图5F和图6中。

在实施方案中，本文提供了从5'到3'含有第一多顺反子盒、第二多顺反子盒和第三多顺反子盒的核酸。在实施方案中，第一多顺反子盒和第二多顺反子盒在启动不同链上盒转录的启动子的控制下。例如，第一多顺反子盒可以包含正向启动子，并且第二多顺反子盒可以包含反向启动子。可替代地，第一多顺反子盒可以包含反向启动子，并且第二多顺反子盒可以包含正向启动子。在实施方案中，第二多顺反子盒和第三多顺反子盒在启动不同链上盒转录的启动子的控制下。例如，第二多顺反子盒可以包含正向启动子，并且第三多顺反子盒可以包含反向启动子。可替代地，第二多顺反子盒可以包含反向启动子，并且第三多顺反子盒可以包含正向启动子。在实施方案中，第一多顺反子盒在正向启动子的控制下，第二多顺反子盒在反向启动子的控制下，并且第三多顺反子盒在正向启动子的控制下。在实施方案中，第一多顺反子盒在反向启动子的控制下，第二多顺反子盒在正向启动子的控制下，并且第三多顺反子盒在反向启动子的控制下。

在实施方案中，本文提供了从5'到3'含有第一多顺反子盒、第二多顺反子盒、第三多顺反子盒和第四多顺反子盒的核酸。在实施方案中，第一多顺反子盒和第二多顺反子盒在启动不同链上盒转录的启动子的控制下。例如，第一多顺反子盒可以包含正向启动子，并且第二多顺反子盒可以包含反向启动子。可替代地，第一多顺反子盒可以包含反向启动子，并且第二多顺反子盒可以包含正向启动子。在实施方案中，第二多顺反子盒和第三多顺反子盒在启动不同链上盒转录的启动子的控制下。例如，第二多顺反子盒可以包含正向启动子，并且第三多顺反子盒可以包含反向启动子。可替代地，第二多顺反子盒可以包含反向启动子，并且第三多顺反子盒可以包含正向启动子。在实施方案中，第三多顺反子盒和第四多顺反子盒在启动不同链上盒转录的启动子的控制下。例如，第三多顺反子盒可以包含正向启动子，并且第四多顺反子盒可以包含反向启动子。可替代地，第三多顺反子盒可以包含反向启动子，并且第四多顺反子盒可以包含正向启动子。在实施方案中，第一多顺反子盒在反向启动子的控制下，第二多顺反子盒在正向启动子的控制下，第三多顺反子盒在反向启动子的控制下，并且第四多顺反子盒在正向启动子的控制下。在实施方案中，第一多顺反子盒在正向启动子的控制下，第二多顺反子盒在反向启动子的控制下，第三多顺反子盒在正向启动子的控制下，并且第四多顺反子盒在反向启动子的控制下。

在实施方案中，包含至少一个多顺反子盒的核酸包含一个或多个聚A序列。在实施方案中，聚A序列来自人生长激素(GH)基因。在实施方案中，聚A序列来自β珠蛋白(HBB)基因。在实施方案中，聚A来自SV40病毒。在实施方案中，聚A序列是合成聚A(pA)。示例性聚A序列见表C。在实施方案中，本文所述的任何盒可包含来自表C的任何聚A序列。在实施方案中，聚A序列包含与选自SEQ ID NO:112-125、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。

多顺反子盒内的聚A序列的示例性排列见于图1A-图1D、图2A-图2J、图3A-图3C、图4A-图4H、图5A-图5F和图6中。在实施方案中，本文所述的核酸包含来自表C的位于多顺反子盒5’端的一个或多个聚A序列。在实施方案中，聚A序列包含终止子。在实施方案中，本文所述的核酸包含来自表C的位于多顺反子盒3’端的一个或多个聚A序列。

表C

在实施方案中，聚A序列包含合成pA(SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:125)和转录终止子ACTB(SEQ ID NO:158)。在实施方案中，聚A序列包含合成pA和转录终止子。在实施方案中，转录终止子是ACTB。在实施方案中，ACTB具有SEQ ID NO:118的核酸序列。在实施方案中，聚A序列和终止子序列的存在终止了多顺反子盒的转录。在实施方案中，与多顺反子盒仅包含聚A序列时相比，当多顺反子盒包含聚A序列和终止子二者时，多顺反子盒的转录更有效地终止。在实施方案中，终止子选自以下文献中描述的任何终止子序列，该文献通过引用以其整体并入本文：Nojima等人Cell Reports 3,1080-1092(2013)。

在实施方案中，核酸在核酸内的第一个或最后一个多顺反子盒的5'或3’端包含聚A序列和转录终止子(例如，ACTB)。在第一个或最后一个多顺反子盒的5'或3’端包含转录终止子终止由上游基因组启动子介导的转录。因此，仅转录多顺反子盒。

在实施方案中，多顺反子盒内的顺反子被编码2A多肽(本文也称为“2A肽”)的核酸序列隔开。术语2A多肽是指在细胞中蛋白质翻译过程中诱导核糖体跳跃的自切割肽。在实施方案中，多顺反子盒包含一种或多种选自E2A、F2A、P2A和T2A多肽的2A多肽。在实施方案中，多顺反子盒编码来自选自SEQ ID NO.1和9的核酸序列的E2A多肽。在实施方案中，多顺反子盒包含由具有选自SEQ ID NO.2和10的序列的核酸编码的F2A多肽。在实施方案中，多顺反子盒包含由具有选自SEQ IDNO.3-6、12-14和169的序列的核酸编码的P2A多肽。在实施方案中，多顺反子盒包含由具有序列SEQ ID NO:11的核酸编码的T2A多肽。Liu等人描述了另外的2A多肽，并通过引用以其整体并入本文：Liu等人Scientific Reports,第7卷,文章2193(2017)。在实施方案中，在本文所述的核酸内编码2A多肽的每种核酸编码不同的氨基酸序列。

在实施方案中，当含有由2A肽隔开的顺反子的多顺反子盒被表达时，表达的顺反子可包含2A肽或其片段的N末端脯氨酸、C末端融合物、或其组合。在实施方案中，表达的顺反子包含2A肽的C末端融合物，其中2A肽缺少C末端脯氨酸。

在实施方案中，当位于2A肽的5'端的顺反子被表达时，表达的顺反子包含2A肽的C末端融合物，其中2A肽缺少C末端脯氨酸。在实施方案中，当位于2A肽的3'端的顺反子被表达时，表达的顺反子包含N末端脯氨酸。在实施方案中，当顺反子位于第一2A肽的5'端和第二2A肽的3'端时，表达的顺反子包含2A肽的N末端脯氨酸和C末端融合物，其中2A肽的C末端融合物缺少2A肽的C末端脯氨酸。

在实施方案中，多顺反子盒内的顺反子被内部核糖体进入位点(IRES)隔开。在实施方案中，本文所述的核酸包含具有SEQ ID NO:11、194和195中任一个的核酸序列的一个或多个IRES。在实施方案中，当含有由IRES隔开的顺反子的多顺反子盒被表达时，表达的顺反子是野生型蛋白质。

在实施方案中，本文提供的核酸包含在5’多顺反子盒5’端的第一绝缘子序列和在3’多顺反子盒3’端的第二绝缘子序列。在实施方案中，绝缘子是HS4。在实施方案中，HS4具有选自SEQ ID NO.49-58、163和164中任一个的序列。在实施方案中，HS4防止来自在基因组整合位点处的启动子的转录干扰。

在实施方案中，本文提供的核酸包含：位于5’多顺反子盒的5’端并具有SEQ IDNO:17或18的序列的第一反向末端重复序列(ITR)，以及在3’多顺反子盒的3’端的具有SEQID NO:15或16的序列的第二ITR。在本文提供的核酸中包含ITR使得能够经由PiggyBac转座子介导的基因转移将核酸整合到基因组(例如，猪基因组)中。

在实施方案中，本文提供的核酸包含位于5’多顺反子盒5’端的第一loxP位点和在3’多顺反子盒3’端的第二loxP位点。loxP位点是通过重组酶介导有丝分裂重组的核酸序列。在本文提供的核酸中包含loxP位点使得能够经由重组酶将核酸整合到基因组(例如，猪基因组)中。Maizels等人描述了使用loxP和重组酶的基因组工程，并通过引用以其整体并入本文：Maizels等人J Immunol.2013；191(1)。在实施方案中，第一或第二loxP位点具有选自SEQ ID NO.146-150和244的核酸序列。在实施方案中，本文所述核酸的第一loxP位点与第二loxP位点之间的区域通过重组插入到基因组中。

在实施方案中，本文提供的核酸包含5'和3'指导RNA(gRNA)靶序列(例如，图5A-图5F的FOS_sg1或AAVS_sg3)。gRNA靶序列被指导RNA和核酸酶(例如Cas9)识别。5'指导RNA靶序列与3'gRNA序列之间的区域被指导RNA和核酸酶切割。在实施方案中，在5'与3'gRNA靶序列之间包含多个本文所述的多顺反子盒的核酸部分被整合到细胞、组织、器官或动物中。在实施方案中，使用非同源依赖性靶向整合(HITI)将位于5'gRNA靶序列与3'gRNA靶序列之间的核酸序列克隆到细胞、组织、器官或动物中。Suzuki等人描述了使用HITI的体内基因组编辑，并通过引用以其整体并入本文：Suzuki等人Nature.2016年12月1日；540(7631):144-149。在实施方案中，使用CRISPR介导的同源定向修复(HDR)将位于5'与3'gRNA靶序列之间的核酸序列克隆到细胞、组织、器官或动物中。Hsu等人描述了使用CRISPR介导的HDR进行体内基因组编辑，并通过引用以其整体并入本文：Hsu等人Cell 157,1262-1278(2014)。在实施方案中，5'gRNA靶序列是FOS(SEQ ID NO:47)或AAVS(SEQ ID NO:48)。在实施方案中，3'gRNA靶序列是FOS(SEQ ID NO:47)或AAVS(SEQ ID NO:48)。

loxP位点、绝缘子序列、指导RNA靶序列和多顺反子盒的示例性排列呈现于表D中。

表D

在实施方案中，本文所述的核酸还包含起始密码子。在实施方案中，本文所述的核酸还包含终止密码子。在实施方案中，终止密码子发现在每个多顺反子盒的3'端。在实施方案中，本文所述的核酸包含Kozak序列。在实施方案中，Kozak序列是SEQ ID NO:59或61的核酸。

在实施方案中，本文所述的核酸包含一个或多个遍在染色质开放元件(UCOE)。Neville等人描述了UCOE，并通过引用以其整体并入本文：Neville等人BiotechnologyAdvances 35(2017)557-564。在实施方案中，本文所述核酸的多顺反子盒被UCOE隔开。在实施方案中，UCOE选自Can 6-3、A2CBX3、CBX3、CBX3*和SRF1。在实施方案中，UCOE包含由SEQID NO:19-22、157和193定义的序列中的任一个。

在实施方案中，本文提供的核酸包含荧光蛋白。在实施方案中，荧光蛋白位于5’多顺反子盒的5’端。在实施方案中，荧光蛋白位于3’多顺反子盒的3’端。在实施方案中，荧光蛋白位于ITR、gRNA靶序列、loxP位点或其组合的5’端。在实施方案中，荧光蛋白用于阴性选择。在实施方案中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白。在实施方案中，荧光蛋白是具有SEQ ID NO:111的核酸序列的GFP。在实施方案中，荧光蛋白是具有SEQ ID NO:242或SEQ ID NO:246的核酸序列的BFP。

在实施方案中，本文所述的核酸或其片段中的任一个被整合到染色体中。在实施方案中，其片段是本文所述核酸的连续部分，例如，所述片段可以是本文所述任何核酸的核苷酸的约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约100％。在实施方案中，所述片段包含至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的本文所述任何核酸的核苷酸。

在实施方案中，将包含本文所述核酸的单独组分的片段通过聚合酶链式反应从基因组DNA扩增或合成。相邻片段在其5'或3'端重叠至少50个碱基对。使用酵母同源重组将片段组装成全长核酸。将含有核酸的质粒转化到大肠杆菌中并在其中扩增。

示例性核酸

包含多个多顺反子盒的示例性核酸显示在图1A-图1D、图2A-图2J、图3A-图3C、图4A-图4H、图5A-图5F和图6中。在实施方案中，包含多个多顺反子盒的核酸具有选自SEQ IDNO:23-46、172-177中任一个的序列。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ IDNO.112、120-122、159和190中任一个的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；以及先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259。在实施方案中，CD46是包含SEQ ID NO:71的核酸序列的CD46_LL。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ IDNO.112、120-122、159和190中任一个的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；以及先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ ID NO:112、120-122、159和190中任一个的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；以及先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、编码A20的第三顺反子、编码HO1的第四顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，其中A20的核酸序列选自SEQID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189。在实施方案中，IRES(SEQ ID NO:11)将先天免疫和炎症和细胞凋亡盒的第二与第三顺反子隔开。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫和炎症和细胞凋亡盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ IDNO:20的序列的A2CBX3UCOE。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、编码CD39的第三顺反子、选自SEQ IDNO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、编码CD55的第三顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ ID NO:112、120-122、159和190中任一个的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86和108，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；以及先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、编码A20的第三顺反子、编码HO1的第四顺反子、编码PD-L1的第五顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91。在实施方案中，IRES(SEQ ID NO:11)将先天免疫和炎症和细胞凋亡盒的第二与第三顺反子隔开。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫和炎症和细胞凋亡盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ IDNO.112、120-122、159和190中任一个的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；以及先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259。在实施方案中，CD46是包含SEQ ID NO:71的核酸序列的CD46_LL。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，位于凝血盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:22的序列的SRF。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、编码CD39的第三顺反子、选自SEQ IDNO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、编码CD55的第三顺反子、选自SEQ ID NO:136-138的ssEF1α1启动子、选自SEQ ID NO.112、120-122、159和190中任一个的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；以及先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、编码A20的第三顺反子、编码HO1的第四顺反子、编码PD-L1的第五顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91。在实施方案中，IRES(SEQ ID NO:11)将先天免疫和炎症和细胞凋亡盒的第二与第三顺反子隔开。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫和炎症和细胞凋亡盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3 UCOE。在实施方案中，UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，位于凝血盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:19的序列的Can 6-3UCOE。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:74或SEQID NO:75的核酸序列的CD46i。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、编码CD39的第三顺反子、具有SEQ IDNO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列，及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、编码CD55的第三顺反子、选自SEQ ID NO:136-138的ssEF1α1启动子、选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；以及先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、编码A20的第三顺反子、编码HO1的第四顺反子、编码PD-L1的第五顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91。在实施方案中，IRES(SEQID NO:11)将先天免疫和炎症和细胞凋亡盒的第二与第三顺反子隔开。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫和炎症和细胞凋亡盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ IDNO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3 UCOE。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的核酸序列的CD46i。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码PROCR的第二顺反子、具有SEQ ID NO:19-22、157或193的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181，(b)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：编码A20的第一顺反子、编码HO1的第二顺反子、选自SEQ ID NO:136-138和179的ssEF1α1启动子、选自SEQ ID NO:112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ IDNO:63、109、165、183和189；以及补体调节和先天免疫盒，所述补体调节和先天免疫盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、编码CD55的第三顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，UCOE将炎症和细胞凋亡盒与补体调节和先天免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3 UCOE。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的核酸序列的CD46i。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码PROCR的第二顺反子、编码TFPI的第三顺反子、具有SEQID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、选自SEQ ID NO:139-140的ssHSPA8启动子、以及选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，UCOE将先天免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3 UCOE。在实施方案中，聚A位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，聚A是具有SEQ ID NO:119的序列的SV40 pA。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:72的序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ IDNO:99-102的序列的THBDda。在实施方案中，B2M HLA-E融合蛋白包含HLA-G表位。在实施方案中，CD47是具有SEQ ID NO:80、81或83的序列的CD47-2(例如NM_198793)。在实施方案中，聚A位于补体调节盒的5’或3’端。在实施方案中，位于补体调节盒的5’或3’端的聚A是具有SEQ ID NO:118的序列的SPAActB pA。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ IDNO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，(b)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码PROCR的第二顺反子、编码TFPI的第三顺反子、具有SEQ ID NO:133的序列的hsHSPA8启动子、以及选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181，其中TFPI的核酸序列选自SEQ IDNO:94-96、103和187；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，UCOE将先天免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，聚A位于先天免疫盒的5’或3’端。在实施方案中，聚A是具有SEQ ID NO:119的序列的SV40 pA。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:72的序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ ID NO:99-102的序列的THBDda。在实施方案中，B2M HLA-E融合蛋白包含HLA-G表位。在实施方案中，CD47是具有SEQ ID NO:80、81或83的序列的CD47-2(例如NM_198793)。在实施方案中，聚A位于补体调节盒的5’或3’端。在实施方案中，位于补体调节盒的5’或3’端的聚A是具有SEQ ID NO:118的序列的SPAActB pA。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:47-48的gRNA靶序列。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ IDNO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，(b)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码PROCR的第二顺反子、编码TFPI的第三顺反子、具有SEQ ID NO:133的序列的hsHSPA8启动子、以及选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181，其中TFPI的核酸序列选自SEQ IDNO:94-96、103和187；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，UCOE将先天免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22和157的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，聚A位于先天免疫盒的5’或3’端。在实施方案中，聚A是具有SEQ ID NO:119的序列的SV40 pA。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:72的序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ ID NO:99-102的序列的THBDda。在实施方案中，B2M HLA-E融合蛋白包含HLA-G表位。在实施方案中，CD47是具有SEQ ID NO:80、81或83的序列的CD47-2(例如NM_198793)。在实施方案中，聚A位于补体调节盒的5’或3’端。在实施方案中，位于补体调节盒的5’或3’端的聚A是具有SEQ ID NO:118的序列的SPAActB pA。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:47-48的gRNA靶序列。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码PROCR的第二顺反子、编码TFPI的第三顺反子、具有SEQID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、选自SEQ ID NO:136-138和179的ssEF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ IDNO:77-83、180和259；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，UCOE将先天免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3 UCOE。在实施方案中，聚A位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，聚A是具有SEQ ID NO:119的序列的SV40pA。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:72的序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ ID NO:99-102的序列的THBDda。在实施方案中，B2MHLA-E融合蛋白包含HLA-G表位。在实施方案中，CD47是具有SEQ ID NO:80、81或83的序列的CD47-2(例如NM_198793)。在实施方案中，聚A位于补体调节盒的5’或3’端。在实施方案中，位于补体调节盒的5’或3’端的聚A是具有SEQ ID NO:118的序列的SPAActB pA。在实施方案中，所述核酸包含选自SEQ ID NO:47-48的gRNA靶序列。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBBpA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；以及先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，位于凝血盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:22的序列的SRF。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的核酸序列的CD46i。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含编码THBD的第一顺反子、编码PROCR的第二顺反子、选自SEQ ID NO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ IDNO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBBpA”)序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中PROCR的核酸序列选自SEQ ID NO:92、93和181，(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；以及(c)先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：编码B2MHLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、编码A20的第三顺反子、编码HO1的第四顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ IDNO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和1895。在实施方案中，具有SEQ ID NO:11的序列的IRES将B2M HLA-E融合蛋白和CD47与A20和HO1隔开。一些实施例中，UCOE将补体调节盒与先天免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22和157的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22和157的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，位于凝血盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:22的序列的SRF。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的核酸序列的CD46i。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、选自SEQ IDNO:134-135的小鼠EF1α1启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，(b)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、编码CD39的第三顺反子、选自SEQ ID NO:130-132的人EF1α1启动子、选自SEQ ID NO:112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；以及(c)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD59的第二顺反子、编码CD55的第三顺反子、编码A20的第四顺反子、编码HO1的第五顺反子、编码PD-L1的第六顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91。在实施方案中，具有SEQID NO:11的序列的IRES将CD46、CD55和CD59与A20、HO1和PD-L1隔开。一些实施方案中，UCOE将补体调节盒与先天免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22和157的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22和157的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，位于凝血盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:22的序列的SRF。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的核酸序列的CD46i。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ IDNO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，(b)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:133的hsHSPA8启动子、选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ IDNO:94-96、103和187；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及选自SEQ ID NO.123-125和154-156的SPAActB聚A序列及其组合，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与凝血盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于先天免疫盒的5’或3’端。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于先天免疫盒的5’或3’端。在实施方案中，位于先天免疫盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:22的序列的SRF。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的核酸序列的CD46i。

在一些实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ IDNO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259，(b)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:133的hsHSPA8启动子、选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ IDNO:94-96、103和187；以及(c)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、编码A20的第三顺反子、编码HO1的第四顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189。在实施方案中，具有SEQ ID NO:11的序列的IRES将CD46和CD55与A20和HO1隔开。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与凝血盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，位于凝血盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:22的序列的SRF。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核酸序列的CD46da。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ ID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ IDNO:77-83、180和259，(b)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、编码CD39的第三顺反子、选自SEQ ID NO:133的hsHSPA8启动子、选自SEQ ID NO:112、120-122、159、190的btGHpA序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；以及(c)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、编码CD59的第三顺反子、编码A20的第四顺反子、编码HO1的第五顺反子、编码PD-L1的第六顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:108，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91。在实施方案中，具有SEQ ID NO:11的序列的IRES将CD46、CD55和CD59与A20、HO1和PD-L1隔开。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与凝血盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:20的序列的A2CBX3 UCOE。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22和157的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，具有选自SEQ ID NO:19-22和157的序列的UCOE位于凝血盒的5’或3’端。在实施方案中，位于凝血盒的5’或3’端的UCOE是具有SEQ ID NO:22的序列的SRF。在实施方案中，CD46是具有选自SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核酸序列的CD46da。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ ID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(b)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、编码CD39的第三顺反子、选自SEQ ID NO:142-145的ssHSPA8启动子、选自SEQ ID NO:112、120-122、159、190的btGH pA序列及其组合，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；以及(c)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、编码CD59的第三顺反子、编码A20的第四顺反子、编码HO1的第五顺反子、编码PD-L1的第六顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:108，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91。在实施方案中，具有SEQ ID NO:11的序列的IRES将CD46、CD55和CD59与A20、HO1和PD-L1隔开。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与凝血盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3*UCOE。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:162的核酸序列的SV40 pA。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:142-145的ssHSPA8启动子、具有SEQ ID NO:124的序列的SPA PTCH2 pA序列，其中THBD的核酸序列选自SEQ IDNO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ ID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(c)细胞免疫和凝血盒，所述细胞免疫和凝血盒包含编码CTLA-4(例如LEA29Y)的第一顺反子、编码CD39的第二顺反子、选自SEQ ID NO:136-138和179的ssEF1α1启动子、以及具有SEQ ID NOS:112、120-122、159和190的序列的btGH聚A序列，其中CTLA-4的核酸序列选自SEQ ID NO:87-88和186，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106；以及(d)补体调节盒，所述补体调节盒包含编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列是具有SEQ IDNO:119的核酸序列的SV40 pA。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白是具有SEQ IDNO:111的序列的绿色荧光蛋白。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:72的核酸序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ ID NO.99-102的序列的THBDda。在实施方案中，TFPI包含TFPI和CD4跨膜结构域。在实施方案中，TFPI具有SEQ ID NO:94的序列。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与细胞免疫和凝血盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ IDNO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3*UCOE。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:142-145的ssHSPA8启动子、具有SEQ ID NO:124的序列的SPA PTCH2 pA序列，其中THBD的核酸序列选自SEQ IDNO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ ID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(c)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含编码A20的第一顺反子、编码PD-L1的第二顺反子、选自SEQ ID NO:136-138和179的ssEF1α1启动子、以及具有SEQ ID NO:112、120-122、159、190的序列的btGH聚A序列，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91；以及(d)补体调节盒，所述补体调节盒包含编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ IDNO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:119的核酸序列的SV40 pA。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白是具有SEQ ID NO:111的序列的绿色荧光蛋白。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:72的核酸序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ ID NO.99-102的序列的THBDda。在实施方案中，TFPI包含TFPI和CD4跨膜结构域。在实施方案中，TFPI具有SEQ ID NO:94的序列。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与炎症和细胞凋亡盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3*UCOE。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:142-145的ssHSPA8启动子、具有SEQ ID NO:124的序列的SPA PTCH2 pA序列，其中THBD的核酸序列选自SEQ IDNO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ ID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(c)细胞凋亡和凝血盒，所述细胞凋亡和凝血盒包含编码XIAP的第一顺反子、(ii)编码CD39的第二顺反子、选自SEQ ID NO:136-138和179的ssEF1α1启动子、以及具有选自SEQ IDNO:112、120-122、159、190中任一个的序列的btGH聚A序列，其中XIAP的核酸序列选自SEQID NO:110，其中CD39的核酸序列选自SEQ ID NO:106，以及(d)补体调节盒，所述补体调节盒包含编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ IDNO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:119的核酸序列的SV40 pA。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白是具有SEQ ID NO:111的序列的绿色荧光蛋白。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:72的核酸序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ ID NO.99-102的序列的THBDda。在实施方案中，TFPI包含TFPI和CD4跨膜结构域。在实施方案中，TFPI具有SEQ ID NO:94的序列。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与细胞凋亡和凝血盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3*UCOE。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、选自SEQ ID NO:142-145的ssHSPA8启动子、具有SEQ ID NO:124的序列的SPA PTCH2 pA序列，其中THBD的核酸序列选自SEQ IDNO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187，(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ ID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(c)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含编码A20的第一顺反子、编码CTLA-4(例如LEA29Y)的第二顺反子、选自SEQ ID NO:136-138和179的ssEF1α1启动子、以及具有SEQ ID NO:112、120-122、159和190中任一个的序列的btGH聚A序列，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中CTLA-4的核酸序列选自SEQ ID NO:87-88和186；以及(d)补体调节盒，所述补体调节盒包含编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:113的序列的hsGH聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:119的核酸序列的SV40 pA。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的荧光蛋白是具有SEQ ID NO:111的序列的绿色荧光蛋白。在实施方案中，CD46是具有SEQ ID NO:72的核酸序列的CD46da。在实施方案中，THBD是具有选自SEQ ID NO.99-102的序列的THBDda。在实施方案中，TFPI包含TFPI和CD4跨膜结构域。在实施方案中，TFPI具有SEQ ID NO:94的序列。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与细胞凋亡和细胞免疫盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3*UCOE。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子、编码CD47的第二顺反子、具有SEQ ID NO:141的序列的ssUBC启动子、以及选自SEQ ID NO.114-116和191中任一个的hsHBB聚A(“hsHBB pA”或“HBB pA”)序列及其组合，其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105，其中CD47的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(b)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：编码A20的第一顺反子、编码HO1的第二顺反子、编码PD-L1的第三顺反子、选自SEQ ID NO:139-140、142-145的ssHSPA8启动子、以及具有选自SEQ ID NO:112、120-122、159、190中任一个的序列的btGH聚A序列，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189，其中PD-L1的核酸序列选自SEQ ID NO:89-91；(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含编码CD46的第一顺反子、编码CD55的第二顺反子、编码CD59的第三顺反子、选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子、以及具有SEQ ID NO:160的序列的btHBB聚A序列，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258，其中CD55的核酸序列选自SEQID NO:84、85、107和184，其中CD59的核酸序列选自SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:108；以及(d)凝血盒，所述凝血盒包含：编码THBD的第一顺反子、编码TFPI的第二顺反子、具有SEQ IDNO:167的序列的ssICAM2启动子、以及具有SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:161的序列的hsGH聚A序列，其中THBD的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266，其中TFPI的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187。在实施方案中，TFPI具有SEQ ID NO:96的序列。在实施方案中，UCOE将补体调节盒与炎症和细胞凋亡盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ IDNO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，UCOE是具有SEQ ID NO:21的序列的CBX3*UCOE。在实施方案中，所述核酸包含位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列。在实施方案中，位于所有多顺反子盒的5’或3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:162的核酸序列的SV40 pA。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血和先天免疫盒，所述凝血和先天免疫盒包含：(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ IDNO:97-102、166和265-266；(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQID NO:77-83和180；(ii)编码EPCR蛋白的第三顺反子，其中EPCR的核酸序列选自SEQ IDNO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:141、168和178的ssUBC启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.113和161的hsGH聚A序列；(b)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含(i)编码A20蛋白的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码HO1蛋白的第二顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(iii)选自SEQ ID NO:139-140和142-145的ssHSPA8启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH聚A序列；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258；(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.114-116、191的hsHBB聚A序列。在实施方案中，UCOE将细胞凋亡和细胞免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的5”端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的5”端的聚A序列是具有SEQ ID NO:160的核酸序列的btHBB pA。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列是具有SEQID NO:162或119的核酸序列的SV40 pA。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含：(a)凝血和先天免疫盒，所述凝血和先天免疫盒包含：(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中THBD的核酸序列选自SEQ IDNO:97-102、166和265-266；(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中CD47的核酸序列选自SEQID NO:77-83和180；(ii)编码EPCR蛋白的第三顺反子，其中EPCR的核酸序列选自SEQ IDNO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ ID NO:141、168和178的ssUBC启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.113和161的hsGH聚A序列；(b)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含(i)编码A20蛋白的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码LEA29Y蛋白的第二顺反子，其中LEA29Y的核酸序列选自SEQ ID NO:186；(iii)选自SEQ ID NO:139-140和142-145的ssHSPA8启动子；以及(iv)选自SEQ IDNO.112、120-122、159、190的btGH聚A序列；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258；(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中CD55的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.114-116、191的hsHBB聚A序列。在实施方案中，UCOE将细胞凋亡和细胞免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的5”端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的5”端的聚A序列是具有SEQ ID NO:160的核酸序列的btHBB pA。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:162或119的核酸序列的SV40 pA。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含选自以下的一个或多个多顺反子盒：(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中编码所述THBD蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI蛋白的第二顺反子，其中编码所述TFPI蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ IDNO:141、168、178的ssUBC启动子；(iv)选自SEQ ID NO.113和161的hsGH聚A序列；(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD47蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQ IDNO:139-140、142-145的ssHSPA8启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH聚A序列；以及(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中编码所述CD46蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258；(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD55蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.114-116和191的hsHBB聚A序列。在实施方案中，UCOE将先天免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的5’5’端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的5’5’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:160的核酸序列的btHBB pA。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:162或119的核酸序列的SV40 pA。

在实施方案中，本文提供了如下核酸，所述核酸包含选自以下的一个或多个多顺反子盒：(a)凝血盒，所述凝血盒包含：(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中编码所述THBD蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266；(ii)编码TFPI蛋白的第二顺反子，其中编码所述TFPI蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:94-96、103和187；(iii)选自SEQ IDNO:141、168、178的ssUBC启动子；(iv)选自SEQ ID NO.113和161的hsGH聚A序列；(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:62、66、105；(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD47蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:77-83、180和259；(iii)选自SEQ IDNO:139-140、142-145的ssHSPA8启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.112、120-122、159、190的btGH聚A序列；(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中编码所述CD46蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200、和253-258；(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD55蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:84、85、107和184；(iii)选自SEQ ID NO:126-128的CAG启动子；以及(iv)具有SEQ ID NO:192的核酸序列的ocHBB聚A序列；以及(d)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：(i)编码A20蛋白的第一顺反子，其中A20的核酸序列选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188；(ii)编码HO1蛋白的第二顺反子，其中HO1的核酸序列选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189；(iii)选自SEQ ID NO:136-138、179的ssEEF1α1启动子；以及(iv)选自SEQ ID NO.114-116和191的hsHBB聚A序列。在实施方案中，UCOE将先天免疫盒与补体调节盒隔开。在实施方案中，UCOE具有选自SEQ ID NO:19-22、157和193的序列。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的5’5’端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的5’5’端的聚A序列是具有SEQID NO:160的核酸序列的btHBB pA。在实施方案中，所述核酸包含在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列。在实施方案中，在所有多顺反子盒的3’端的聚A序列是具有SEQ ID NO:162或119的核酸序列的SV40 pA。

III.细胞、组织、器官和动物

具体地，存在许多免疫和功能挑战，涉及先天性和适应性免疫功能。补体和凝血介导的功能障碍是由于供体猪组织与人体生理之间的分子不兼容性而引起的，并导致了急性异种移植失败。预先形成的针对α-1,3-半乳糖基-半乳糖(αGal)表位的抗体通过补体的激活来激活超急性移植排斥反应。糖蛋白GGTA1的基因失活可以减少这种快速的移植物破坏。通过人补体调节蛋白(hCRP)CD46(膜辅因子蛋白)、CD55(补体衰变加速因子)和CD59(MAC抑制蛋白)基因的过表达，保护作用得到进一步改善。

大多数非Gal异种抗体识别由CMAH蛋白合成的唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。此基因在人体中是无活性的，因此，猪Neu5Gc在人体中具有免疫原性。因此，猪CMAH可能必须失活以在异种移植中取得临床成功。尽管补体调节子的表达和GGTA1的敲除减少了超急性排斥反应，但这些基因修饰并不影响急性血管排斥反应(AVR)。

凝血功能障碍，包括血栓性微血管病和全身性消耗性凝血病，甚至在GGTA1敲除和hCRP过表达的情况下也持续存在，这主要是由于猪与非人灵长类动物(NHP)之间的凝血系统的分子不兼容性所致。

尽管其他人试图产生用于安全异种移植的转基因猪，但由于构建能力的限制和转基因之间的转录干扰，这些转基因猪仅携带有限数量的转基因。这些方法被证明不足以克服异种移植物不兼容性。例如，美国专利公开号2018/0249688利用了具有不同转基因组合的多顺反子表达载体。重要的是，这些多顺反子载体仅包含4个转基因，并被用于产生具有6个基因修饰(包括αGal的KO(GTKO))的猪。在本公开中，利用了KO、KI和基因组替代策略的组合。首次产生了从单个基因座表达多于6种转基因的不含PERV的猪。

本文描述和公开的实施方案提供了在同一头猪内实现更多基因修饰数量的平台。通过这项工作，将猪细胞用多于六个转基因进行基因修饰，以产生免疫兼容的细胞、组织、器官、猪和后代。使用CRISPR-Cas9，功能上敲除了多个基因，包括GGTA1、CMAH和β4GALNT2，以消除由预先形成的人抗猪抗体识别的聚糖。PiggyBAC介导的整合或CRISPR介导的整合用于整合本文所述的一种或多种多顺反子盒(例如，凝血盒、补体调节盒、先天免疫盒、先天免疫和炎症和细胞凋亡盒、细胞免疫和凝血盒、细胞凋亡和凝血盒、细胞凋亡和细胞免疫盒、炎症和细胞凋亡盒、补体调节和先天免疫盒、补体调节和炎症和细胞凋亡盒)。另外，通过CRISPR-Cas9敲除猪细胞的猪内源性反转录病毒(PERV)基因。

在实施方案中，本文提供了包含本文所述的多顺反子盒的细胞。在实施方案中，本文提供了包含本文所述的核酸的细胞。在实施方案中，所述细胞是猪细胞。在实施方案中，所述细胞是原代猪细胞。在实施方案中，所述细胞是克隆的。在实施方案中，选择克隆细胞并对其进行基因分型。扩增具有正确基因型的细胞以支持猪克隆。在基因组安全港基因座处包含一种或多种本文所述的多顺反子盒的细胞通过体细胞核转移被克隆到猪中。在实施方案中，本文提供了经基因修饰的动物，其包含含有本文所述的一种或多种多顺反子盒的细胞。在实施方案中，所述经基因修饰的动物用非基因修饰的动物繁殖。在实施方案中，所述经基因修饰的动物用另一经基因修饰的动物繁殖。本文提供了用另一经基因修饰的动物或非基因修饰的动物繁殖经基因修饰的动物所产生的后代。在实施方案中，本文提供了来自后代的细胞、组织或器官。

在实施方案中，用于产生转基因猪的猪供体细胞基本上不含PERV，展现出GGTA1、CMAH和β4GALNT2的敲除，展现出本文所述的一个或多个多顺反子盒的敲入，或展现出前述特征的任何组合。

本公开提供了具有多个经修饰基因的细胞、组织、器官和动物，以及产生它们的方法。在实施方案中，所述细胞、组织、器官获自动物或者是动物。在实施方案中，所述动物是哺乳动物。在实施方案中，所述哺乳动物是非人哺乳动物，在实施方案中，非人哺乳动物是例如马类、灵长类动物、猪、家牛、水牛、野牛、母牛、绵羊、山羊、犬类或猫类。在实施方案中，非人哺乳动物是有蹄类动物。在实施方案中，有蹄类动物是马、犀牛、猎兔犬、家牛、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、绵羊、河马、鲸、海豚或鼠海豚。在实施方案中，哺乳动物是猪类哺乳动物。

根据本公开的基因的修饰用于改善供体与接受者之间的分子兼容性并减少不良事件，包括超急性排斥反应、急性体液排斥反应、血栓性微血管病和慢性血管病。例如，超急性排斥反应发生在非常短的时间跨度内，通常在移植后的几分钟到几小时内发生，并且是由补体激活和移植内皮细胞的预先形成的抗体引起的，进而导致促凝变化，其导致止血并最终破坏移植器官。在某些实施方案中，所述细胞、组织、器官和动物产生减少的超急性排斥反应。

在实施方案中，本公开提供了具有多个经修饰基因的一种或多种细胞、组织、器官或动物。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得多个基因已被添加、缺失、失活、破坏，其部分已被切除，或者基因序列已被改变。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有约5至约20种经修饰基因，例如约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20种已被修饰的基因。在实施方案中，已被修饰的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种基因是从单个基因座表达的。在实施方案中，已被修饰的5、10或12种基因是从单个基因座表达的。在实施方案中，已被修饰的12种基因是从单个基因座表达的。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有多于20、多于15、多于10、多于5、多于3、或多于2种已被修饰的基因。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有多于10、多于5、多于3、多于2或多于1种已被修饰的基因。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有一个拷贝的所述经修饰基因，并且在其他实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有多于一个拷贝的所述一种或多种经修饰基因，如多于2、多于3、多于4、多于5、多于6、多于7、多于8、多于9、多于10、多于15、多于20、多于25、多于30、多于35、多于40、多于50、多于60、多于70、多于80、多于90或多于100个拷贝的所述经修饰基因。在实施方案中，所述细胞具有1个拷贝与约100个拷贝之间、1个拷贝与约90个拷贝之间、1个拷贝与约80个拷贝之间、1个拷贝与约70个拷贝之间、1个拷贝与约60个拷贝之间、1个拷贝与约50个拷贝之间、1个拷贝与约40个拷贝之间、1个拷贝与约30个拷贝之间、约5个拷贝与约20个拷贝之间、约10个拷贝与约15个拷贝之间、约10个拷贝与约15个拷贝之间、或1个拷贝与约5个拷贝之间的一种或多种经修饰基因。

在实施方案中，本公开提供了具有多个拷贝的一种或多种经修饰基因的一种或多种细胞、组织、器官或动物。例如，所述细胞、组织、器官或动物可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、约10、约15、约20、约25、约30或更多个拷贝的一种或多种经修饰基因。

在实施方案中，所述一种或多种细胞是原代细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是体细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是出生后细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是成年细胞(例如，成年耳成纤维细胞)。在实施方案中，所述一种或多种细胞是胎儿/胚胎细胞(例如，胚胎卵裂球)。在实施方案中，所述一种或多种细胞是种系细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是卵母细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是干细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是来自原代细胞系的细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞选自：上皮细胞、肝脏细胞、颗粒细胞、脂肪细胞。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞是成纤维细胞。在实施方案中，所述成纤维细胞是雌性胎儿成纤维细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是在体外的。在实施方案中，所述一种或多种细胞是在体内的。在实施方案中，所述一种或多种细胞是单细胞。在实施方案中，所述一种或多种细胞是细胞集落的成员。在实施方案中，所述细胞是胰岛细胞。

在实施方案中，所述一种或多种细胞是猪细胞。猪细胞起源或衍生的品种的非限制性例子包括任何以下猪品种：美国长白猪(American Landrace)、美国大约克夏猪(American Yorkshire)、Aksai Black Pied猪、昂格尔恩鞍背猪(Angeln saddleback)、阿巴拉契亚英国猪(Appalachian English)、阿拉帕瓦岛猪(Arapawa Island)、奥克兰群岛猪(Auckland Island)、澳大利亚大约克夏猪(Australian Yorkshire)、Babi Kampung猪、巴川猪(Ba Xuyen)、班图猪(Bantu)、巴斯克猪(Basque)、巴兹纳猪(Bazna)、北京黑猪(Beijing Black)、白俄罗斯黑杂色猪(Belarus Black Pied)、比利时长白猪(BelgianLandrace)、孟加拉国棕Shannaj猪(Bengali Brown Shannaj)、本特海姆黑斑猪(BentheimBlack Pied)、巴克夏猪(巴克夏猪)、比萨罗猪(Bisaro)、班古尔猪(Bangur)、黑斯拉夫尼亚猪(Black Slavonian)、黑色加那利猪(Black Canarian)、Breitovo猪、英国长白猪(British Landrace)、英国罗布泊猪(British Lop)、英国白肩猪(British Saddleback)、保加利亚白猪(Bulgarian White)、Cambrough猪、广东猪(Cantonese)、凯尔特猪(Celtic)、查托穆尔西亚猪(Chato Murciano)、切斯特白猪(Chester White)、清迈黑猪(ChiangmaiBlackpig)、乔克托猪(Choctaw Hog)、克里奥尔猪(Creole)、捷克改良白猪(CzechImproved White)、丹麦长白猪(Danish Landrace)、丹麦Protest猪(Danish Protest)、杂色猪(Dermantsi Pied)、Li Yan猪、杜洛克猪(Duroc)、荷兰长白猪(Dutch Landrace)、东长白猪(East Landrace)、东巴尔干猪(East Balkan)、埃塞克斯猪(Essex)、爱沙尼亚培根猪(Estonian Bacon)、枫泾猪(Fengjing)、芬兰长白猪(Finnish Landrace)、林山猪(ForestMountain)、法国长白猪(French Landrace)、加斯科涅猪(Gascon)、德国长白猪(GermanLandrace)、格洛斯特郡花猪(Gloucestershire Old Spots)、哥廷根小型猪(Gottingenminipig)、格莱斯猪(Grice)、几内亚猪(Guinea Hog)、汉普郡猪(Hampshire)、汉特猪(Hante)、赫里福德猪(Hereford)、Hezuo猪、霍根猪(Hogan Hog)、亨廷顿黑猪(HuntingtonBlack Hog)、伊比利亚猪(Iberian)、意大利长白猪(Italian Landrace)、日本长白猪(Japanese Landrace)、济州黑猪(Jeju Black)、金华猪(Jinhua)、卡克黑提安猪(Kakhetian)、可乐猪(Kele)、克麦罗沃猪(Kemerovo)、韩国本土猪(Korean Native)、克斯烤普捷猪(Krskopolje)、库内昆猪(Kunekune)、拉孔布猪(Lamcombe)、大黑猪(LargeBlack)、大黑白猪(Large Black-White)、大白猪(Large White)、拉脱维亚白猪(LatvianWhite)、Leicoma猪、立陶宛本土猪(Lithuanian Native)、立陶宛白猪(LithuanianWhite)、林肯郡卷毛猪(Lincolnshire Curly-Coated)、利夫内猪(Livny)、Malhado deAlcobaca猪、曼加利察猪(Mangalitsa)、梅山猪(Meishan)、中白猪(Middle White)、民猪(Minzhu)、Minokawa Buta猪、蒙开猪(Mong Cai)、Mora Romagnola猪、莫拉猪(Moura)、Mukota猪、缪尔福特猪(Mulefoot)、穆罗姆猪(Murom)、米尔霍罗德猪(Myrhorod)、Nero deiNebrodi猪、内江猪(Neijiang)、新西兰猪(New Zealand)、宁乡猪(Ningxiang)、北高加索猪(North Caucasian)、北西伯利亚猪(North Siberian)、挪威长白猪(NorwegianLandrace)、挪威大约克夏猪(Norwegian Yorkshire)、Ossabaw岛猪(Ossabaw Island)、牛津桑迪黑猪(Oxford Sandy and Black)、Pakchong 5猪、菲律宾本土猪(PhilippineNative)、皮特兰猪(Pietrain)、波中猪(Poland China)、红垂猪(Red Wattle)、Saddleback猪、Semirechensk猪、西伯利亚黑斑猪(Siberian Black Pied)、小黑猪(Small Black)、小白猪(Small White)、斑点猪(Spots)、Surabaya Babi猪、施韦比施哈尔猪(Swabian-Hall)、瑞典长白猪(Swedish Landrace)、燕腹燕子曼加利察猪(Swallow Belied Mangalitza)、太湖猪(Taihu pig)、塔姆沃思猪(Tamworth)、Thuoc Nhieu猪、藏猪(Tibetan)、东京-X猪(Tokyo-X)、齐维利斯克猪(Tsivilsk)、Turopolje猪、乌斑草原猪(Ukrainian SpottedSteppe)、乌白草原猪(Ukrainian White Steppe)、乌尔茹姆猪(Urzhum)、越南大肚猪(Vietnamese Potbelly)、威尔士猪(Welsh)、威赛克斯白肩猪(Wessex Saddleback)、西法白猪(West French White)、Windsnyer猪、五指山猪(Wuzhishanm)、雅南猪(Yanan)、大约克夏猪和约克夏蓝白猪(Yorkshire Blue and White)。在实施方案中，所述猪细胞是大约克夏和尤卡坦猪细胞。

在实施方案中，已经对本公开的细胞、组织、器官或动物进行基因修饰，使得一种或多种基因已经通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，或者所述基因序列的一部分已经被改变。

在实施方案中，本公开的细胞、组织、器官或动物包含使一种或多种基因失活的一个或多个突变。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物包含一个或多个突变或表观遗传变化，其导致具有所述一个或多个突变的一种或多种基因的表达减少或消除。在实施方案中，通过对存在于所述细胞、组织、器官或动物中的一种或多种核酸进行基因修饰来使所述一种或多种基因失活。在实施方案中，一种或多种基因的失活通过测定来证实。在实施方案中，所述测定是感染性测定、反转录酶PCR测定、RNA-seq、实时PCR或连接PCR定位测定。

特定基因型

为了提供细胞、组织、器官和动物对人临床使用是安全且有效的，对本公开的细胞、组织、器官和动物(例如，供体猪)进行了基因工程化，以使其具有增强的补体(即补体毒性)、凝血、炎症(即细胞凋亡/炎症)、免疫(即细胞毒性)和/或免疫调节系统，使它们在人体中兼容。敲除(KO)、敲入(KI)(在本文中也称为转基因(TG))和/或基因组替代策略的新颖组合提供了增强的补体、凝血、炎症、免疫和/或免疫调节系统。使用各种方法评估使得猪细胞和器官与人兼容的基因的表达。此类方法的非限制性例子包括流式细胞术、免疫组织化学和RNA测序。

例如因基因KO而缺乏主要异种碳水化合物(xenogenic carbohydrate)抗原表达的细胞、组织、器官和动物在异种移植过程中减少或消除体液排斥反应。三种主要的异种碳水化合物抗原包括通过糖基转移酶/糖基水解酶GGTA1、CMAH和B4GALNT2产生的那些抗原。这些基因的功能丧失的目的是减少和/或消除预先形成的抗猪抗体与猪移植物内皮的结合。

将关键补体、凝血、炎症、免疫和/或免疫调节因子插入一个或多个基因组基因座，例如安全港基因组基因座(如AAVS1)中，将有助于调节人补体系统以及自然杀伤(NK)、巨噬细胞和T细胞功能。非限制性例子包括通过KI使hCD46、hCD55和hCD59过表达以抑制人补体级联；将vWF人源化以防止未调节的血小板封存和血栓性微血管病，例如通过人源化猪vWF序列的A1结构域和/或侧翼区域；B2M-HLA-E SCT的KI，以提供针对人NK细胞细胞毒性的保护和猪细胞的人源化；以及CD47、CD39、THBD、TFPI、A20的KI，以起到免疫抑制剂、免疫调节剂和/或抗凝剂的作用。

在实施方案中，已经对本公开的细胞、组织、器官或动物进行基因修饰，使得一种或多种基因或其部分已经通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰。在实施方案中，本公开提供了具有多个经修饰基因的经分离的细胞、组织、器官或动物。在实施方案中，所述经修饰基因包括以下中的一种或多种：αGGTA1、β4GalNT2、CMAH、THBD、TFPI、CD39、HO1、CD46、CD55、CD59、主要组织相容性复合体I类E单链三聚体(HLA-E SCT)、A20、PD-L1、CD47、猪白细胞抗原1(SLA-1)、SLA-2、SLA-3、vWF、B2M、DQA、DRA、PROCR、B2M、HLA-E、CTLA-4(例如LEA29Y)以及XIAP。

在实施方案中，所述经修饰基因是GGTA1、B4GalNT2、CMAH或其任何组合。在实施方案中，GGTA1、B4GalNT2和/或CMAH是遗传上KO的。在实施方案中，所述经修饰基因是MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，MHC-II基因DQA和DRA，内源性vWF，CD9，脱唾液酸糖蛋白受体，至少一种补体抑制剂基因(例如，C3、CD46、CD55和CD59)及其任何组合。在实施方案中，CD46、CD55和/或CD59是遗传上KI的。

在一个实施方案中，已经用转基因表达载体对本公开的细胞、组织、器官或动物进行基因修饰，所述转基因表达载体包含CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、EPCR、CD39、B2M、HLA-E、CD47、A20、PD-L1、HO1、CTLA-4(例如LEA29Y)、XIAP或其任何组合。在一个实施方案中，已经对本公开的细胞、组织、器官或动物进行进一步基因修饰以具有GGTA1、B4GalNT2、CMAH或其任何组合的降低的表达或无表达，例如通过基因KO来修饰。

可以通过任何方法对本公开的细胞、组织、器官或动物进行基因修饰。在实施方案中，使用包含多个多顺反子盒的核酸修饰本公开的细胞、组织、器官或动物。用于本文公开和描述的敲除(KO)、敲入(KI)和/或基因组替代策略的合适方法的非限制性例子包括使用Cas9、Cas12a(Cpf1)或其他CRISPR核酸内切酶的CRISPR介导的基因修饰、Argonaute核酸内切酶、转录激活因子样(TAL)效应子和核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、表达载体、转座子系统(例如PiggyBac转座酶)或其任何组合。

本公开的细胞、组织、器官或动物可以是不含PERV的。例如，本公开的细胞、组织、器官或动物可以具有从它们的基因组功能性地缺失的PERV拷贝。本公开的细胞、组织、器官或动物可以在其基因组中具有功能性地失活的PERV拷贝。如果将猪细胞、组织或器官移植到人接受者中，则PERV表示危险因素。PERV从正常猪细胞中释放出来并具有感染性。PERV-A和PERV-B是感染几个物种细胞的多嗜性病毒，所述物种中包括人(例如，它们是异嗜性的)；而PERV-C是仅感染猪细胞的嗜亲性病毒。功能性缺失PERV拷贝的非限制性方法披露且描述于Niu 2017和WIPO公开号WO2018/195402中，两者均通过引用以其整体并入本文。在实施方案中，将猪基因工程化为不含PERV-A、PERV-B或PERV-C(或其任何组合)。

在实施方案中，本公开的细胞、组织、器官或动物的另外的基因通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分或者基因序列的部分而被修饰。在实施方案中，所述修饰包括缺失以下基因中的一种或多种：MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，MHC-II基因DQA和DRA，内源性vWF，CD9，脱唾液酸糖蛋白受体，和C3，以及表达以下转基因中的一种或多种：PD-L1、外源性vWF、HLA-E、HLA-G、B2M和CIITA-DN。在实施方案中，所述修饰包括缺失以下基因中的一种或多种：α半乳糖基转移酶1、GGTA1、β4GALN2和CMAH，以及表达以下转基因中的一种或多种：CD46、CD55、CD59、CD47、HO1、A20、TNFR1-Ig、CD39、THBD、TFPI、EPCR、PD-1、CTLA-4(例如LEA29Y)、CD73、SOD3、CXCL12、FasL、CXCR3、CD39L1、GLP-1R、M3R、IL35、IL12A和EB13。在实施方案中，所述经修饰基因是CD46、CD55、CD59、CD47、HO1、A20、TNFR1-Ig、CD39、THBD、TFPI、EPCR、PD-1、CTLA-4(例如LEA29Y)、CD73、SOD3、CXCL12、FasL、CXCR3、CD39L1、GLP-1R、M3R、IL35、IL12A和EB13。

在实施方案中，本公开的细胞、组织、器官或动物包含一种或多种经基因修饰的基因。经基因修饰的基因可含有一个或多个核苷酸的添加、一个或多个核苷酸的缺失、或一个或多个核苷酸的突变。在实施方案中，经基因修饰的基因被破坏。在实施方案中，经基因修饰的基因的转录和/或翻译被破坏。在实施方案中，经基因修饰的基因失活。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物包含不存在于野生型细胞、组织、器官或动物中的转基因或其部分。在实施方案中，所述转基因是外源基因。在实施方案中，所述转基因是内源基因。在实施方案中，本公开的细胞、组织、器官或动物包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含如本文所述的一个或多个多顺反子盒。

在实施方案中，所述经修饰基因是MHC I类基因。在实施方案中，所述经修饰的MHCI类基因包括以下SLA-1、SLA-2、SLA-3和B2M中的一种或多种。在实施方案中，所述经修饰基因是SLA-1、SLA-2和/或SLA-3。在实施方案中，所述经修饰基因是B2M。在实施方案中，所述经修饰的MHC I类基因包括以下SLA-1、SLA-2、SLA-3和B2M中的一种或多种。在实施方案中，将所述经修饰的B2M、SLA-1、SLA-2和/或SLA-3基因和/或其部分用人HLA-E基因、人HLA-G基因、人B2M基因和/或人(显性阴性突变II类反式激活因子因子)CIITA-DN基因和/或其部分替代。在实施方案中，所述经修饰基因是条件性和/或诱导性修饰的。在实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一种或多种经修饰基因。在实施方案中，本文提供了包含B2M、SLA-1、SLA-2或SLA-3基因或其任何基因组合的经分离的细胞、组织、器官或动物，这些基因被条件性改变并被人HLA-E基因、人HLA-G基因、人B2M基因和/或人CIITA-DN基因的至少一部分替代。

在实施方案中，本文提供了包含经修饰的MHC II类基因的细胞、组织、器官或动物。在实施方案中，所述经修饰的MHC II类基因是DRQ、DRA或其任何组合。经基因修饰的MHCII类基因可含有一个或多个核苷酸的添加、一个或多个核苷酸的缺失、或一个或多个核苷酸的突变。在实施方案中，经基因修饰的MHC II类基因被破坏。在实施方案中，经基因修饰的MHC II类基因的转录和/或翻译被破坏。在实施方案中，经基因修饰的MHC II类基因失活。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物包含不存在于野生型细胞、组织、器官或动物中的MHC II类转基因或其部分。在实施方案中，所述经修饰基因是条件性和/或诱导性修饰的。在实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一种或多种经修饰基因。在实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变的DRQ和/或DRA基因或其任何组合。

在实施方案中，本文提供了包含经修饰的vWF基因和/或vWF相关基因的细胞、组织、器官或动物。经基因修饰的vWF基因和/或vWF相关基因可含有一个或多个核苷酸的添加、一个或多个核苷酸的缺失、或一个或多个核苷酸的突变。在实施方案中，经基因修饰的vWF基因和/或vWF相关基因被破坏。在实施方案中，经基因修饰的vWF基因和/或vWF相关基因的转录和/或翻译被破坏。在实施方案中，经基因修饰的vWF基因和/或vWF相关基因失活。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物包含不存在于野生型细胞、组织、器官或动物中的vWF基因和/或vWF相关基因转基因或其部分。在实施方案中，将所述经修饰的vWF基因和/或其部分用人vWF基因和/或其部分替代。在实施方案中，将所述经修饰的vWF基因、经修饰的vWF相关基因和/或其一个或多个部分用人vWF基因、一个或多个人vWF相关基因和/或其部分替代。在实施方案中，所述经修饰的vWF基因和/或vWF相关基因是条件性和/或诱导性修饰的。在实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一种或多种经修饰基因。在实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变的vWF、vWF相关基因、其一个或多个部分或其任何组合，以及用人vWF基因、人vWF基因的至少部分、一种或多种其他人vWF相关基因、一种或多种人vWF相关基因的至少部分或其任何组合替代所述条件性改变的基因。在实施方案中，使用gRNA修饰所述vWF基因，所述gRNA被设计用于在内源性猪基因组中启动HDR替代，并在将被人序列替代的区域附近切割。

在实施方案中，本文提供了包含一种或多种经修饰的补体基因的细胞、组织、器官或动物。在实施方案中，所述补体基因是C3。经基因修饰的补体基因可含有一个或多个核苷酸的添加、一个或多个核苷酸的缺失、或一个或多个核苷酸的突变。在实施方案中，经基因修饰的补体基因被破坏。在实施方案中，经基因修饰的补体基因的转录和/或翻译被破坏。在实施方案中，经基因修饰的补体基因失活。在实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物包含不存在于野生型细胞、组织、器官或动物中的补体基因或其部分。在实施方案中，所述经修饰的C3基因和/或补体基因是条件性和/或诱导性修饰的。在实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一种或多种经修饰基因。在实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变的C3、补体基因、其一个或多个部分或其任何组合。在实施方案中，使用gRNA修饰所述C3基因。

在实施方案中，所述经修饰基因是C3的敲除。在实施方案中，所述经修饰基因是PD-L1的敲入。在实施方案中，所述经修饰基因是猪vWF的人源化vWF。在实施方案中，所述经修饰基因是MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3的条件性敲入。

在实施方案中，宿主对经基因修饰的细胞、组织或器官没有或基本上没有引发免疫反应。

在实施方案中，本公开提供了从本文所公开细胞中的任一种获得的核酸。在实施方案中，对所述细胞中的一种或多种核酸进行基因修饰，使得改变所述细胞中的一种或多种基因，或者另外修饰所述细胞的基因组。在实施方案中，使用本领域已知和/或本文公开的任何基因修饰系统对所述基因或其部分进行基因修饰。在实施方案中，所述基因修饰系统是TALEN、锌指核酸酶和/或基于CRISPR的系统。在实施方案中，所述基因修饰系统是CRISPR-Cas9系统。在实施方案中，所述基因修饰系统是II类II型CRISPR系统。在实施方案中，所述基因修饰系统是II类V型CRISPR系统。在实施方案中，对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞中的一种或多种基因或其部分失活，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一种或多种基因或其部分(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因或其部分会诱导免疫反应)的表达降低。在实施方案中，对所述细胞进行基因修饰以增加一种或多种人基因或其部分的表达。在实施方案中，对所述细胞进行基因修饰以增加一种或多种人源化基因或其部分的表达。在实施方案中，对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞中的一种或多种基因或其部分失活，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一种或多种基因(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因会抑制免疫反应)的表达增加。在实施方案中，对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞中的一种或多种基因或其部分失活，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一种或多种基因(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因会诱导免疫反应)的表达降低，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一种或多种基因(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因会抑制免疫反应)的表达增加。

在实施方案中，本公开提供了从经基因修饰的细胞克隆的胚胎。以下参考文献描述了从经基因修饰的细胞产生胚胎，并通过引用以其整体并入本文：Kim等人(2016).PLoSONE:11(7):e0160289。在实施方案中，从经基因修饰的细胞中提取一种或多种经基因修饰的核酸并将其克隆到不同的细胞中。例如，在体细胞核移植中，将来自经基因修饰的细胞的经基因修饰的核酸引入去核卵母细胞中。在实施方案中，卵母细胞可以通过以下方式去核：在极体附近进行部分透明带解剖，然后在解剖区处压出细胞质。在实施方案中，使用具有锋利斜尖的注射移液管将经基因修饰的细胞注射至停滞在减数分裂2期的去核卵母细胞中。停滞在减数分裂2期的卵母细胞通常被称为“卵”。在实施方案中，通过融合和激活卵母细胞产生胚胎。在实施方案中，通过向卵母细胞递送电脉冲来融合卵母细胞。这样的胚胎在本文中可以被称为“经基因修饰的胚胎”。在实施方案中，通过用6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、离子霉素或其组合处理来激活经基因修饰的胚胎。在实施方案中，将经基因修饰的胚胎用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)处理。在实施方案中，将经基因修饰的胚胎转移到接受者雌性猪的输卵管。在实施方案中，在激活后12小时至4天，将经基因修饰的胚胎转移到接受者雌性猪的输卵管。例如，在激活后约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约1.25天、约1.5天、约1.75天、约2天、约2.25天、约2.5天、约2.75天、约3天、约3.25天、约3.5天、约3.75天、或约4天，将经基因修饰的胚胎转移到接受者雌性猪的输卵管。在实施方案中，在激活后20至24小时，将经基因修饰的胚胎转移到接受者雌性猪的输卵管。参见例如，Cibelli 1998和美国专利号6,548,741。在实施方案中，在转移经基因修饰的胚胎后大约20-21天，检查接受者雌性的妊娠。

在实施方案中，使经基因修饰的胚胎生长成出生后基因修饰的动物。在实施方案中，所述出生后基因修饰的动物是新生基因修饰的动物。在实施方案中，所述经基因修饰的猪是幼年基因修饰的动物。在实施方案中，所述经基因修饰的动物是成年基因修饰的动物(例如，大于5-6个月)。在实施方案中，所述经基因修饰的动物是雌性基因修饰的动物。在实施方案中，所述动物是雄性基因修饰的动物。在实施方案中，所述经基因修饰的动物用非基因修饰的动物繁殖。在实施方案中，所述经基因修饰的动物用另一种经基因修饰的动物繁殖。在实施方案中，将所述经基因修饰的猪用具有减少的活性病毒或没有活性病毒的另一种经基因修饰的动物繁殖。在实施方案中，将所述经基因修饰的动物用第二经基因修饰的动物繁殖，所述第二经基因修饰的动物已进行基因修饰，使得来自所述第二经基因修饰的动物的细胞、组织或器官如果移植到人体不太可能诱导免疫反应。

在实施方案中，所述经基因修饰的动物是具有一种或多种经修饰基因的动物，并在妊娠后至少一个月、至少6个月、至少1年、至少5年、至少10年维持相同或相似的一种或多种经修饰基因的表达或失活水平。在实施方案中，即使在从非病毒失活的代孕者分娩之后或在与其他非病毒失活的动物一起处于设施/空间中之后，所述经基因修饰的动物仍保持基因修饰，作为经基因修饰的猪具有一种或多种经修饰基因。

在实施方案中，本公开提供了从本文所述的任何出生后基因修饰的猪获得的细胞、组织或器官。在实施方案中，所述细胞、组织或器官选自肝脏、肾脏、肺、心脏、胰腺、肌肉、血液和骨骼。在特定实施方案中，所述器官是肝脏、肾脏、肺或心脏。在实施方案中，来自所述出生后基因修饰的猪的细胞选自：胰岛、肺上皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝脏细胞、非实质肝脏细胞、胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝脏血管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞、窦细胞、脉络丛细胞、成纤维细胞、支援细胞、神经元细胞、干细胞和肾上腺嗜铬细胞。在实施方案中，已将经基因修饰的器官、组织或细胞与它们的自然环境分离(即，与它们正在其中生长的猪分离)。在实施方案中，与自然环境的分离意指与自然环境的总体物理分离，例如，从经基因修饰的供体动物中移出，以及改变经基因修饰的器官、组织或细胞与它们直接接触的邻近细胞的关系(例如，通过解离)。

IV.产生细胞、组织、器官或动物的方法

本公开提供了产生具有一种或多种核酸的细胞、组织、器官或动物的方法，所述一种或多种核酸包含本文所述的一个或多个多顺反子盒。在实施方案中，本公开提供了在本文公开的任何细胞中失活、缺失或以其他方式破坏一种或多种基因或其部分的方法，所述方法包括向所述细胞施用对基因具有特异性的基因编辑试剂，其中所述试剂破坏所述基因的转录和/或翻译。在实施方案中，所述试剂靶向所述基因的起始密码子并抑制所述基因的转录。在实施方案中，所述试剂靶向所述基因中的外显子，并且所述试剂诱导所述基因中的移码突变。在实施方案中，所述试剂将失活突变引入所述基因中。在实施方案中，所述试剂抑制所述基因的转录。

在实施方案中，本公开提供了在体内改变一种或多种基因或其部分的方法，所述方法包括向所述细胞施用对基因具有特异性的基因编辑试剂，其中所述试剂改变所述基因的序列，如通过使所述基因人源化或以其他方式改变所述基因的天然(例如野生型)序列。

在实施方案中，本公开提供了表达包含一个或多个多顺反子盒或其部分的一种或多种核酸的方法，所述方法包括向细胞施用包含一个或多个多顺反子盒或其部分的基因编辑试剂，其中所述试剂引入包含一个或多个多顺反子盒的核酸序列。在实施方案中，所述试剂是核酸序列，如质粒、载体等。在实施方案中，所述核酸序列包括一种或多种核酸序列，如启动子、转基因和/或另外的基因。在实施方案中，所述核酸序列或其部分源自一个或多个物种和/或一个或多个来源。在实施方案中，所述物种是将接收经基因修饰的细胞、组织或器官的物种。在实施方案中，所述物种是人。在其他实施方案中，所述物种是非人的，如哺乳动物、动物、细菌和/或病毒。

在实施方案中，本文公开的任何试剂是多核苷酸。在实施方案中，所述多核苷酸编码本文所述的核酸酶和/或切口酶和/或RNA或DNA分子中的一种或多种。在实施方案中，将所述多核苷酸试剂引入一种或多种细胞中。在实施方案中，以使得一种或多种细胞瞬时表达所述多核苷酸的方式将所述多核苷酸引入所述一种或多种细胞中。在实施方案中，以使得一种或多种细胞稳定表达所述多核苷酸的方式将所述多核苷酸引入所述一种或多种细胞中。在实施方案中，以使得所述多核苷酸稳定地并入细胞基因组中的方式引入所述多核苷酸。在实施方案中，将所述多核苷酸与一个或多个可转座元件一起引入。在实施方案中，所述可转座元件是编码转座酶的多核苷酸序列。在实施方案中，所述可转座元件是编码PiggyBac转座酶的多核苷酸序列。在实施方案中，所述可转座元件是可诱导的。在实施方案中，所述可转座元件是多西环素可诱导的。在实施方案中，所述多核苷酸进一步包含选择性标记物。在实施方案中，所述选择性标记物是嘌呤霉素抗性标记物。在实施方案中，所述选择性标记物是荧光蛋白(例如，GFP)。

在实施方案中，所述试剂是用于靶向细胞中的DNA的核酸酶或切口酶。在实施方案中，所述试剂特异性地靶向基因并抑制其表达。在实施方案中，所述试剂包含转录阻遏物结构域。在实施方案中，所述转录阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)。

在实施方案中，所述试剂是任何可编程核酸酶。在实施方案中，所述试剂是天然归巢大范围核酸酶。在实施方案中，所述试剂是基于TALEN的试剂、基于ZFN的试剂或基于CRISPR的试剂，或其任何生物活性片段、融合物、衍生物或组合。基于CRISPR的试剂包括例如，II类II型和V型系统，包括例如Cas9和Cpf1的各种物种变体。在实施方案中，所述试剂是脱氨酶或编码脱氨酶的核酸。在实施方案中，将细胞基因工程化以稳定和/或瞬时表达基于TALEN的试剂、基于ZFN的试剂和/或基于CRISPR的试剂。

在实施方案中，本文所述的任何核酸或其片段被整合到宿主细胞的基因组中。核酸可以通过重组酶介导的盒交换、PiggyBac转座子介导的基因转移、CRISPR介导的同源依赖性重组或CRISPR介导的非同源依赖性靶向整合而整合到细胞中。

在实施方案中，本文所述的任何核酸或其片段在包含着陆架的基因组安全港基因座处被整合到宿主细胞中。图28A和图28C提供了示例性着陆架。基因组安全港基因座的非限制性例子包括AAVS1、CCR5和Fos5。在实施方案中，着陆架插入AAVS1位点的内含子1中。在实施方案中，着陆架引入AAVS1位点的3’侧翼区。在实施方案中，所述着陆架包含Ank2基因、Cpsf4基因、C-Mos基因、Fos1基因或腺相关病毒整合位点(AAVS)。美国专利号8,980,579描述了染色体着陆架并且通过引用以其整体并入本文。在实施方案中，所述着陆架包含腺相关病毒整合位点(AAVS)或Fos1基因。在实施方案中，所述着陆架包含绝缘子序列(例如HS4)。在实施方案中，所述着陆架包含一个或多个loxP位点。在实施方案中，所述着陆架包含两个loxP位点。在实施方案中，所述着陆架包含聚A序列。在实施方案中，所述聚A序列包含终止子。在实施方案中，所述着陆架包含标记物，如蓝色荧光蛋白(BFP)。在实施方案中，所述着陆架包含启动子。在实施方案中，所述启动子包含表B中的任一个序列。在实施方案中，所述聚A序列包含表C中的任一个序列。在实施方案中，从5'到3'，所述着陆架包含第一绝缘子序列、loxP位点、启动子、荧光蛋白、聚A序列、第二loxP位点、第二绝缘子位点和聚A序列。在实施方案中，从5'到3'，所述着陆架包含第一loxP位点、启动子、荧光蛋白、聚A序列和第二loxP位点。在实施方案中，所述着陆架包含SEQ ID NO:248或249的核酸序列。

在实施方案中，所述着陆架通过重组酶介导的盒交换而整合到基因组安全港基因座中。在实施方案中，所述着陆架通过CRISPR-Cas9同源定向修复(HDR)整合到基因组安全港基因座中。

在实施方案中，本文提供了包含着陆架的细胞、器官或组织。在实施方案中，本文提供了包含着陆架的细胞、器官或组织，所述着陆架包含SEQ ID NO:248或249的核酸序列。

在实施方案中，在将着陆架引入细胞之后，将图1A-图1D、图2A-图2J、图3A-图3C、图4A-图4H、图5A-图5F或图6中任一个的多顺反子盒引入细胞中。在实施方案中，图1A-图1D、图2A-图2J、图3A-图3C、图4A-图4H、图5A-图5F或图6中任一个的多顺反子盒替代着陆架的聚A序列和标记基因。可以使用重组酶介导的盒交换或CRISPR-Cas9 HDR进行多顺反子盒的整合。图28B提供了15S5有效载荷(参见图2I)整合到图28A的着陆架中的图示。在实施方案中，整合到基因组安全港基因座中的核酸包含与核酸5'和3'端的基因组整合位点同源的序列。在实施方案中，包含图1A-图1D、图2A-图2J、图3A-图3C、图4A-图4H、图5A-图5F或图6中任一个的多顺反子盒的核酸包含与核酸5'和3'端的基因组整合位点同源的序列。

在实施方案中，本文提供了一种产生经基因修饰的细胞的方法，所述方法包括(i)敲除GGTA1、CMAH和β4GALNT2；(ii)敲除一种或多种PERV元件(例如，PERV pol、env、gag基因或其组合)；(iii)敲入本文所述的任何一个或多个多顺反子盒。前述方法可以按照以下任一顺序进行：(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)。在实施方案中，组织、器官或动物包含根据任何前述方法产生的细胞。在实施方案中，所述细胞是猪细胞。在实施方案中，所述细胞是原代猪细胞。在实施方案中，所述细胞是人细胞。

V.治疗方法

在实施方案中，本文公开的任何经基因修饰的细胞、组织或器官可以用于治疗与经基因修饰的细胞不同物种的受试者。在实施方案中，本公开提供了将本文所述的任何经基因修饰的细胞、组织或器官移植到有需要的受试者中的方法。在实施方案中，所述受试者是人。在实施方案中，所述受试者是非人灵长类动物。在实施方案中，所述受试者是猪、猿、人、犬、猫、猴子、狐猴、黑猩猩、倭黑猩猩、猩猩、长臂猿、牛、马、鸟、绵羊或大猩猩。

在实施方案中，用于本文公开的任何方法的经基因修饰的器官可以选自经基因修饰的猪的心脏、肺、肝脏、眼睛、垂体、甲状腺、甲状旁腺、食道、胸腺、肾上腺、阑尾、膀胱、胆囊、小肠、大肠、小肠、肾脏、胰腺、脾、胃、皮肤和/或前列腺。在实施方案中，用于本文公开的任何方法的经基因修饰的组织可以选自经基因修饰的猪的软骨(例如，食道软骨、膝盖软骨、耳软骨、鼻子软骨)、肌肉(例如但不限于平滑肌和心脏(例如心脏瓣膜))、腱、韧带、骨(例如，骨髓)、角膜、中耳和静脉。在实施方案中，用于本文公开的任何方法的经基因修饰的细胞包括血细胞、皮肤毛囊、毛囊和/或干细胞。还可以向器官或组织的任何部分(例如，眼睛的部分，如角膜)施用本公开的组合物。

在实施方案中，从猪分离心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾，所述猪已被基因修饰以包含(a)GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失或破坏；(b)从猪基因组中单个多转基因盒表达的CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、PROCR、CD39、B2M、HLA-E、CD47、A20、PD-L1、HO1、CTLA-4(例如LEA29Y)、XIAP及其组合(例如其人或人源化拷贝)的添加；和(c)所有PERV拷贝的功能性缺失。在实施方案中，从猪分离心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾，所述猪已被基因修饰以包含(a)GGTA1、CMAH和B4GALNT2的功能性破坏；(b)从猪基因组中单个多转基因盒表达的CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、PROCR、CD39、B2M、HLA-E、CD47、A20、PD-L1、HO1、CTLA-4(例如LEA29Y)、XIAP转基因及其组合(例如其人源化拷贝)的添加；和(c)所有PERV拷贝的功能性失活。在某些实施方案中，所述猪已被进一步基因修饰以具有人源化vWF、ASGR1的缺失和/或B2M基因的缺失。

在实施方案中，在移植之前，将器官在2℃与约37℃之间的温度下储存。例如，在实施方案中，将器官在约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃的温度下储存。在实施方案中，将器官在约2℃至约8℃的温度下、约4℃至约8℃、或约20℃至约25℃的温度下储存。在实施方案中，在移植之前，将器官储存在冰上。

在实施方案中，在移植之前，将器官储存在器官保存溶液中。在实施方案中，器官保存溶液含有组氨酸、色氨酸、酮戊二酸盐、氯化钠、人血清白蛋白、右旋糖酐40、葡萄糖、甘露糖醇、蔗糖、柠檬酸盐、羟乙基-呱嗪-乙烷磺酸(HEPES)、钠离子、钾离子、乳糖醛酸盐、棉子糖、谷胱甘肽、别嘌呤醇、镁离子、海藻糖、N-乙酰半胱氨酸、二丁酰cAMP、硝酸甘油或其组合。在实施方案中，器官保存溶液是含氧的。在实施方案中，器官保存溶液包含0.9％氯化钠。将器官储存在组氨酸-色氨酸酮戊二酸盐中。

在实施方案中，在移植之前用灌注液灌注器官。提及器官时，术语“灌注”是指通过器官泵送流体(例如，灌注液)。在实施方案中，将灌注液通过循环系统或淋巴系统递送至器官。在实施方案中，将灌注液递送至器官的血管。在实施方案中，灌注液是器官保存溶液。在实施方案中，灌注液包括血浆、全血、红细胞、血红蛋白、人血清白蛋白或其组合。在实施方案中，灌注液包括肝素化的人全血。在实施方案中，灌注液是含氧的。

在实施方案中，灌注液包含结合糖蛋白1B(GPIb)的抗体或其抗体片段。其抗体片段可以是可变重结构域、可变轻结构域、恒定轻链、恒定重链结构域(CH1、CH2、CH3或CH4)或其任何组合。在实施方案中，其抗体片段是抗原结合片段(Fab)。在实施方案中，结合GPIb的抗体或其片段是鼠或人抗体。在实施方案中，灌注液包含依替巴肽。在实施方案中，灌注液包含依替巴肽和结合糖蛋白1B(GPIb)的抗体或其抗体片段。

在实施方案中，将器官在30mmHg与约100mmHg之间的压力下灌注。例如，将器官在约30mmHg、约35mmHg、约40mmHg、约45mmHg、约50mmHg、约55mmHg、约60mmHg、约65mmHg、约70mmHg、约75mmHg、约80mmHg、约85mmHg、约90mmHg、约95mmHg或约100mmHg的压力下灌注。在实施方案中，将器官在约40mmHg至约75mmHg的压力下灌注。

在实施方案中，将器官在约2℃与约37℃之间的温度下灌注。例如，在实施方案中，将器官在约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃的温度下灌注。在实施方案中，将器官在约20℃至约25℃的温度下灌注。

在实施方案中，将器官灌注约5分钟至约2天。例如，将器官灌注约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约1小时、约1.25小时、约1.5小时、约1.75小时、约2小时、约2.25小时、约2.5小时、约2.75小时、约3小时、约3.25小时、约3.5小时、约3.75小时、约4小时、约4.25小时、约4.5小时、约4.75小时、约5小时、约5.25小时、约5.5小时、约5.75小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约1天、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约37小时、约38小时、约39小时、约40小时、约41小时、约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时、或约2天。

在实施方案中，将器官进行灌注并随后在约4℃至约8℃的温度下储存。

在实施方案中，接受已根据本文所述的任一种方法储存和/或灌注的器官的移植的受试者展现出与接受未曾根据前述方法之一储存和/或灌注的器官的移植的受试者相比降低约50％至约100％之间的肌钙蛋白I水平。例如，接受已根据本文所述的任一种方法储存和/或灌注的器官的移植的受试者的肌钙蛋白I水平展现出比接受未曾根据前述方法之一储存和/或灌注的器官的移植的受试者的肌钙蛋白I水平低约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约100％的肌钙蛋白水平。

在实施方案中，接受已根据本文所述的任一种方法储存和/或灌注的器官的移植的受试者未展现出血小板减少症。在实施方案中，在接受未曾根据前述方法之一储存和/或灌注的器官的移植的患者之后，接受已根据本文所述的任一种方法储存和/或灌注的器官的移植的受试者展现出血小板减少症。在实施方案中，接受已根据本文所述的任一种方法储存和/或灌注的器官的移植的受试者展现出比接受未曾根据前述方法之一储存和/或灌注的器官的移植的受试者高15％至约500％的血小板计数。例如，接受已根据本文所述的任一种方法储存和/或灌注的器官的移植的受试者展现出比接受未曾根据前述方法之一储存和/或灌注的器官的移植的受试者高约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％或约500％的血小板计数。根据本领域已知的任何方法测量血小板计数。例如，使用血细胞计数器或流式细胞术测量血小板计数。

在实施方案中，在移植之前、在与器官移植基本相同的时间(例如，在移植的1小时内)或在器官移植之后，对受试者施用诱导疗法。在涉及器官移植时，术语“诱导疗法”是指降低器官排斥反应风险的任何物质。在实施方案中，诱导疗法包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、利妥昔单抗、抗CD154抗体或其抗体片段、霉酚酸酯、雷帕霉素、他克莫司、泼尼松或其组合。

在实施方案中，一旦异种移植到人或非人灵长类动物中，异种移植的器官(例如，心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、脾)展现出持续的功能，持续超过约300天、超过约1年、超过约1.5年、超过约2年、超过约2.5年、超过约3年、超过约3.5年、超过约4年、超过约4.5年、超过约5年、超过约5.5年、超过约6年、超过约6.5年、超过约7年、超过约7.5年、超过约8年、超过约8.5年、超过约9年、超过约9.5年或超过约10年。

在实施方案中，本公开提供了对患有导致器官、组织或细胞功能受损、不足或缺乏的疾病、障碍或损伤的受试者的治疗。在实施方案中，所述受试者遭受了导致损害受试者的一种或多种细胞、组织或器官的损伤或创伤(例如，车祸)。在实施方案中，所述受试者遭受了火或酸灼伤。在实施方案中，所述受试者患有导致器官、组织或细胞功能受损、不足或缺乏的疾病或障碍。在实施方案中，所述受试者患有自身免疫疾病。在实施方案中，所述受试者患有器官衰竭。在实施方案中，所述疾病选自：心脏病(例如，动脉粥样硬化)、扩张型心肌病、严重的冠状动脉疾病、瘢痕心脏组织、心脏的先天缺陷、I型或II型糖尿病、肝炎、囊性纤维化、肝硬化、肾脏衰竭、狼疮、硬皮病、IgA肾脏病、多囊性肾脏病、心肌梗塞、肺气肿、慢性支气管炎、闭塞性细支气管炎、肺动脉高压、先天性膈疝、先天性表面活性蛋白B缺乏症和先天性囊性肺气肿性肺病、原发性胆汁性胆管炎、硬化性胆管炎、胆道闭锁、酒精中毒、威尔逊病、血色素沉着病和/或α-1抗胰蛋白酶缺乏症。

在实施方案中，将本公开的任何经基因修饰的细胞、组织和/或器官与经基因修饰的供体分离并施用非供体受试者宿主。在本文中使用的“施用(administering)”或“施用(administration)”包括但不限于引入、施加、注射、植入、移植(grafting)、缝合和移植(transplanting)。根据本公开，可以通过导致本公开的器官、组织、细胞或组合物定位在所希望位点处的方法或途径来施用所述经基因修饰的细胞、组织和/或器官。可以通过任何合适的途径将本公开的器官、组织、细胞或组合物施用于受试者，所述合适的途径导致将细胞递送至受试者中的所希望位置，其中所述细胞的至少一部分保持活力。在一些实施方案中，所述细胞的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(无论是单独还是作为组织或器官的部分)在施用于受试者后保持活力。施用本公开的器官、组织、细胞或组合物的方法是本领域熟知的。在实施方案中，将所述细胞、组织和/或器官移植到宿主中。在实施方案中，将所述细胞、组织和/或器官注射到宿主中。在实施方案中，将所述细胞、组织和/或器官移植到宿主表面(例如，骨骼或皮肤)上。

在实施方案中，将已被基因修饰以含有以下的心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾移植到宿主中：GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失或破坏；来自猪基因组中单个多转基因盒的CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、PROCR、CD39、B2M、HLA-E、CD47、A20、PD-L1、HO1、CTLA-4(例如LEA29Y)、XIAP及其组合的表达；以及所有PERV拷贝的缺失。在实施方案中，将已被基因修饰以含有以下的心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾移植到宿主中：GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失；来自猪基因组中单个多转基因盒的CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、PROCR、CD39、B2M、HLA-E、CD47、A20、PD-L1、HO1、CTLA-4(例如LEA29Y)、XIAP及其组合中的一种或多种的表达；以及所有PERV拷贝的功能性失活。在实施方案中，移植的心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、脾或其部分存活并起作用持续约1天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约9个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年或更久的时间段。

在实施方案中，将有必要保护经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官免受被给予所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官的宿主的免疫系统的影响。例如，在实施方案中，将经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官与基质或包衣(例如，明胶)一起给予，以保护所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官免受来自宿主的免疫反应的影响。在实施方案中，所述基质或包衣是可生物降解的基质或包衣。在实施方案中，所述基质或包衣是天然的。在其他实施方案中，所述基质或包衣是合成的。

在实施方案中，将所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官与免疫抑制化合物一起施用。在实施方案中，所述免疫抑制化合物是小分子、肽、抗体和/或核酸(例如，反义或siRNA分子)。在实施方案中，所述免疫抑制化合物是小分子。在实施方案中，所述小分子是类固醇、mTOR抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、抗增殖剂或IMDH抑制剂。在实施方案中，所述小分子选自皮质类固醇(例如，泼尼松、布地奈德、泼尼松龙)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢霉素、他克莫司)、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)、IMDH抑制剂(硫唑嘌呤、来氟米特、霉酚酸酯)、抗生素(例如，放线菌素D、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素)和甲氨蝶呤，或其盐或衍生物。在实施方案中，所述免疫抑制化合物是选自以下的多肽：CTLA-4、抗b7抗体、阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、艾塞吉珠单抗、那他珠单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、优特吉努单抗、维多利珠单抗、巴司利昔单抗、达克利珠单抗和莫罗单抗。

在实施方案中，待施用受试者的所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官已被进一步基因修饰，使得它们不太可能在受试者中诱导免疫反应。在实施方案中，所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官已被进一步基因修饰，使得它们不表达功能性免疫刺激分子。

VI.实施例

提供以下实施例以举例说明本公开，并且仅出于说明目的，并且不应将其解释为限制本公开的范围。

实施例1A：在食蟹猴中具有三重异种抗原敲除和多种人转基因的肾脏异种移植物的移植物存活

目的：评价插入的人转基因(hTG)影响来自经基因修饰以缺失三种糖类异种抗原GGTA1、CMAH和B4GALN2(三重敲除，TKO)的猪的肾脏异种移植物的体内存活的能力。

方法：十七只食蟹猴接受了来自四种不同TKO猪品系(TKO-A、TKO-B、TKO-F和TKO-G)的肾脏，这些猪品系具有包括以下的hTG的不同表达：免疫调节基因(IMRG；HLA-E、CD46、B2M和PDL1)、补体调节基因(CPRG；CD46、CD55和CD59)和凝血调节基因(CGRG；THBD、TFPI和EPCR)。TKO-A猪品系包含国际公开号2020/228810的有效载荷10，将所述文献通过引用以其整体并入本文。TKO-B包含国际公开号2020/228810的有效载荷9，将所述文献通过引用以其整体并入本文。TKO-F包含图2D的多顺反子盒。TKO-G包含图4C的多顺反子盒。接受者在移植前2天用包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和利妥昔单抗的诱导疗法处理，然后每周用抗CD154抗体(20mg/kg)处理以及每天用霉酚酸酯处理。前两个月还施用雷帕霉素(rapa)或他克莫司和泼尼松(tac)。图22示出了实验的时间线。

表1总结了每种TKO猪品系的转基因表达。“N/A”表示不含特定转基因的TKO猪品系，“-”表示TKO猪品系含有特定转基因，但转基因不表达；“+”表示TKO猪品系含有特定转基因并且转基因表达。

表1：每种TKO猪品系中转基因的表达

表2总结了施用于每只猴子的诱导疗法。

表2：TKO加hTG接受者中的免疫抑制方案和异种移植存活

结果：TKO-A表达更高的IMRG和更低的CPRG，而TKO-B表达更高的CPRG和更低的IMRG。TKO-F具有CGRG、THBD和EPCR的高表达，而TKO-G具有CGRG、THBD和TFPI的中等表达以及CPRG的高表达(表1)。在TKO-A组中，第一个接受者在第2天因血栓性微血管病(TMA)而失去其异种移植物，而第二个接受者在第61天因T细胞介导的排斥反应和抗体介导的排斥反应(AMR)而发生排斥反应。在TKO-B的6个接受者中，2只猴子因在第15天出现输尿管并发症并在第20天出现急性移植物血栓形成而失去异种移植物。在其他四个接受者中，尽管其中一个在第71天因TMA失去了其移植物，但所有其他三个接受者都存活了更长时间(135、265和316天)，并且仅在由于感染并发症导致免疫抑制减少后才出现排斥反应。在7个TKO-F接受者中，尽管因AMR/TMA，2个在早期(第8天和第9天)失去其异种移植物并且另一个在第45天失去其异种移植物，但其余4个接受者目前状况良好长达190天，没有任何排斥反应或感染并发症。最后，两个TKO-G接受者也状况良好长达＞90天、＞103天(表2)，肾功能正常，并且在它们的程序性活检中没有任何排斥反应证据。

图23示出与野生型异种移植物相比，在TKO-A和TKO-B异种移植物中CD46、CD55、CD59、HLA-E、CD47和PD-L1表达的图像。图24示出TKO-C中CD46、CD55、CD47、EPCR、THBD、A20和HO1表达的图像。图25示出TKO-D中CD46、CD55、B2M、CD47、TFPI和THBD表达的图像。图26示出在移植后长达313天的肌酐(标记为Cr)的浓度。图27示出用苏木精和伊红或补体成分C4d染色的肾组织的图像。

图29A-图29E是示出包含TKO-F异种移植物的五只猴子的血尿素氮(BUN)和肌酐水平的图。图29A的猴子在器官移植后已存活320天。图29B的猴子在器官移植后已存活313天。图29C的猴子在器官移植后已存活201天。图29D的猴子在器官移植后已存活121天。对图29A-图29C的猴子每7天施用包含20mg/kg aCD40L的免疫抑制方案。在第254天，图29A的猴子的aCD40L的给药频率从每7天给药转换为每10天给药。在第240天，图29B的猴子的aCD40L的给药频率从每7天给药转换为每10天给药。在第128天，图29C的猴子的aCD40L的给药频率从每7天给药转换为每10天给药。图29E的猴子接受了同样不含PERV的TKO-F异种移植物。该数据显示，包含TKO-F异种移植物的猴子的BUN和肌酐水平在移植后数百天内保持稳定。

图30A-图30B是示出包含TKO-G异种移植物的两只猴子的血尿素氮(BUN)和肌酐水平的图。对两只动物每7天施用包含20mg/kg aCD40L的免疫抑制方案，直到第200天。在第200天，每10天对动物施用aCD40L。

图38A-图38C示出TKO-F异种移植物的转基因在组织、肾小球和肾小管中的表达。

该数据显示人CGRG的表达提供用于猪肾脏异种移植物的长期存活。

实施例1B：在食蟹猴中具有三重异种抗原敲除和多种人转基因的肾脏异种移植物的移植物存活

方法：食蟹猴接受来自包含图2H或图2E的多顺反子盒的猪的肾脏。图2H的多顺反子盒(“15S4”)包含在ssUBC启动子控制下的包含TFPI、THBD和PROCR转基因的凝血盒，在ssEEF1α1启动子控制下的包含B2MHLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55转基因的补体调节盒。图2E的多顺反子盒(“15S1”)包含在ssUBC启动子控制下的包含TFPI、THBD和PROCR转基因的凝血盒，在ssHSPA8启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒，以及在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55转基因的补体调节盒。

图39示出15S4的转基因在猴子的组织、肾小球和肾小管中的表达。图40示出通过免疫组织化学得出的15S4的转基因的表达。图41A-图41D示出15S1和15S4的转基因均表达。然而，15S1的先天免疫盒展现出优于15S4的表达。

接受包含15S4转基因的移植物的三只猴子中有两只在移植后保持稳定至少50天。图31和图32是示出这两只猴子的血尿素氮(BUN)和肌酐水平的图。图31的猴子的移植物在移植后68天稳定并且正在被监测。图32的猴子的移植物在移植后54天稳定并且正在被监测。

实施例1C：包含图2E的多顺反子盒的核酸在胎儿、新生和成年组织中的表达

目的：评价包含图2E的多顺反子盒(“15S1”)的核酸在猪生命周期的不同阶段的表达。表3示出15S1转基因在胎儿、新生(1天大)和成年(4个月大)猪组织中的表达。

表3：15S1转基因在胎儿、新生和成年猪组织中的表达

所有转基因都在胎儿、新生和成年组织中表达。图42A示出相对于在野生型尤卡坦猪中的表达，15S1转基因在猪胎儿肾中的表达。图42B示出相对于在野生型尤卡坦猪中的表达，15S1转基因在猪新生肾中的表达。图42C示出相对于在野生型尤卡坦猪中的表达，15S1转基因在猪成年肾中的表达。图43A示出15S1转基因TFPI、EPCR和THBD在猪胎儿、新生和成年肾组织中的表达。图43B示出15S1转基因B2M HLA-E融合蛋白和CD47在猪胎儿、新生和成年肾组织中的表达。图43C示出15S1转基因CD46和CD55在猪胎儿、新生和成年肾组织中的表达。图43D示出15S1转基因中的每一个在两种不同胎儿猪肾组织中的表达。

实施例2：GPIb和GPIIb/IIIa共同抑制延迟猪肝脏异种移植物中的消耗性血小板减少症

目的：猪肝脏异种植物存活受到血小板减少症的损害，所述血小板减少症在异种移植物再灌注后立即开始。在猪肝脏异种移植中存活的非人灵长类动物受试者在移植后7-10天恢复其血小板计数。在离体机器灌注模型中评价对于经由GPIb和GPIIb/IIIa机制的血小板激活和粘附的抑制对在异种移植物再灌注后血小板减少症发展的影响。该研究中使用的肝脏异种移植物来自野生型猪，或来自含有GGTA1、β4GalNT2、CMAH的敲除加上靶向补体、炎症和凝血调节的修饰的基因工程化猪(本文称为“猪2.F”)。猪2.F包含图2D的多顺反子盒。

方法：使用肝素化的人全血和血浆灌注液对肝脏进行常温机器灌注。将灌注液用抗GPIb片段化鼠抗体(ab)和GPIIb/IIIa抑制剂依替巴肽处理，之后进行猪2.F肝脏插管(n＝3)。没有药物疗法的猪2.F灌注(n＝3)作为对照进行。当血管阻力阻止门静脉血流时终止灌注。通过血细胞计数器和在福尔马林固定样品内通过流式细胞术，在整个灌注期间测量血小板计数。

结果：平均灌注时间为：用ab和依替巴肽灌注的猪2.F肝脏为12小时，以及未用ab和依替巴肽(ab/依替巴肽)处理的肝脏为10小时。在用ab/依替巴肽处理的猪2.F肝脏与未用ab/依替巴肽处理的肝脏之间，在组合的动脉和门静脉血流量或乳酸清除方面没有差异(图7A，图7B)。然而，如通过使用血细胞计数器得出的血小板计数(图8A)和通过流式细胞术得出的血小板计数(图8B)所测量，在灌注的前4小时内用ab/依替巴肽处理出人意料地延迟了血小板减少症。

实施例3：开发用于将遗传上猪异种移植物移植到非人灵长类动物的免缺血异种移植方法

目的：缺血再灌注损伤(IRI)是在缺血或缺氧时期后血液供应返回组织时发生的组织损伤。IRI可导致器官移植物的排斥反应。开发了一种减轻缺血再灌注损伤的方法，以用于将肝脏异种移植物从经基因修饰的猪移植到非人灵长类动物模型。经基因修饰的猪包含图2D的多顺反子盒。

方法：获得两个肝脏以用于采用免缺血技术移植。为了原位建立动脉和门脉流入，对肠系膜上动脉和门静脉移植物插管。随着肝脏完全动员，夹紧肝上下腔静脉(IVC)，用携带灌注液的基于脱细胞血红蛋白的氧气启动流动，并将肝脏切除并在泵上转移到TransMedics机器(TransMedics，安多弗(Andover)，马塞诸塞州)。图9A示出肝脏的图像。通过离体常温灌注监测乳酸清除。选择两只低抗猪三重敲除主动脉内皮细胞滴度的狒狒作为接受者，并使其经历标准肝切除术伴腔静脉搭桥术。在植入过程中，在仍在泵上的同时，完成肝上腔静脉和门静脉吻合，之后建立自然灌注。狒狒从麻醉中恢复，并返回笼子进行术后护理。每四小时收集一次血液用于实验室分析，直至安乐死。

结果：在离体灌注期间，平均灌注液乳酸从3.5降至0.3(图9B)。狒狒平均无肝时间为52分钟，平均总植入时间(肝切除术至胆管完成)为190分钟。两只狒狒在无肝阶段期间都需要最少的苯肾上腺素支持，并随后在建立自然循环后戒断。两只狒狒都在结案时拔管并返回笼子，但由于乳酸酸中毒、凝血功能障碍和多系统器官衰竭，在平均8.5小时后需要安乐死。这项研究显示，使用经基因修饰的异种移植物可以实现免缺血异种移植方法。

实施例4：冷藏(CS)或灌注(IM)对心脏异种移植物功能的影响

目的：在初始心脏异种移植物功能障碍(ICXD)的离体模型中评价储存温度和灌注对经基因修饰的猪心脏异种移植物心脏功能的影响。经基因修饰的猪心脏含有(a)三种特定异种基因糖类基因敲除(GGTA1、β4GalNT2、CMAH：称为“TKO”，即三重敲除)，并具有人补体调节基因和血栓调节基因的可变表达(n＝13)，或(b)GGTA1敲除并敲入CD55(称为“GTKO.hCD55”)。还在野生型猪心脏(称为“WT”)中评价冷藏(CS)或灌注(IM)后的心脏功能。

方法：在用冷藏溶液(UW，4℃)冲洗后，获得来自经基因修饰的猪或野生型(WT)猪的心脏，并在冷盐水(0.9％w/w，4℃：冷藏(CS))中储存3小时，或用具有红细胞(RBC)的含氧Steen溶液灌注(IM)。在室温下启动40mmHg的IM灌注持续20分钟，以促进均匀的移植物灌注，之后冷却至4℃，用于剩余的储存期。在特定时间点在工作心脏装备上评估心脏功能和实验室参数，同时灌注新鲜收集的肝素化全人血。肌钙蛋白I用作心肌损伤的标记物。

结果：总计19颗心脏被离体灌注，其中10颗采用CS(TKO n＝6，GTKO.hCD55 n＝1，WT n＝3)，以及9颗采用IM(TKO n＝7，GTKO.hCD55n＝1，WT n＝1)。在IM组中离体灌注1小时后，平均肌钙蛋白I阐述(ng/mL)显著降低(70.2ng/mL相对279.5ng/mL；p＝0.038)，但在最终时间点不是这样(图10A-图10C)。类似地，TKO心脏的心脏功能(响应于增加的充盈压的心输出量所测量)在CS后随时间降低，而IM储存的心脏功能随时间改善(图11A-图11D)。相对于CS心脏，在离体工作心脏灌注的第一个小时内，IM显著降低了心肌损伤：心脏损伤(肌钙蛋白释放)减弱，并且在一些用IM处理的TKO心脏中延迟了移植物衰竭。这些结果显示，在最初暴露于人血液期间，IM减弱了经基因修饰的猪心脏的ICXD。

实施例5：包含一个或多个多顺反子盒的核酸在猪供体细胞、猪胎儿细胞和从成年猪分离的细胞中的表达

目的：评价包含图2D的多顺反子盒的猪细胞在SCNT、猪胎儿细胞和从成年猪分离的细胞中的蛋白质表达。图13A示出通过流式细胞术得出的每个顺反子的表达。被圈出的细胞包含图2D的多顺反子盒。图13B示出通过免疫组织化学得出的每个顺反子的表达。

实施例6：包含CD46或CD55转基因的核酸保护细胞免于补体介导的裂解

目的：评价含有转基因CD46和CD55的核酸通过结合补体蛋白(例如补体成分3b(C3b)和补体成分4b(C4b))保护细胞免于补体介导的裂解的能力。有效载荷15S(PL15S)猪表达图2D的多顺反子盒。

方法/结果：图14A-图14B示出CD55(图14A)和CD46(图14B)在细胞表面的表达。图15A示出人CD46和CD55在作为对照的来自PL15S猪或来自GGTA1和B4GALNT2双敲除(DKO)猪的耳穿孔衍生细胞(EPDC)或同种型对照染色的细胞上的表面蛋白表达。图15B评估PL15S猪或DKO猪的补体激活。将来自相同DKO或PL15S猪的EPDC与缺乏补体成分6的25％人血清(血清(C6-))一起孵育。C6缺陷型血清用于消除膜攻击复合物对细胞的裂解，这是补体激活的最后步骤，以便通过流式细胞术评估补体成分C3b由于C3激活而在猪细胞表面上的沉积。在一些条件下，将细胞与饱和量的针对人CD46(a-CD46)和/或人CD55(a-CD55)的阻断抗体预孵育以评估这些蛋白质对补体调节的个体贡献。热灭活血清(HIS)在一种条件下用作阴性对照，因为热灭活了血清中的补体。表达人CD46和CD55蛋白的PL15S细胞被保护免于C3b沉积在细胞表面上。当人CD46和CD55都被阻断时，保护丧失并且观察到完全的C3b沉积。

实施例7：包含CD46或CD55转基因的核酸保护胰岛细胞免于补体介导的裂解

目的：评价含有转基因CD46和CD55的核酸通过结合补体蛋白(例如补体成分3b(C3b)和补体成分4b(C4b))保护胰岛细胞免于补体介导的裂解的能力。将胰岛细胞用含有图2D的盒(“15S”)的核酸或含有图4D的盒(“17S1”)的核酸转染。

图16A示出在不存在阻断抗体(结合CD46或CD55的抗体)的情况下，表达15S的细胞与不表达15S的细胞或表达CD46和CD55的细胞相比减少补体沉积。

图16B-图16C示出在不存在阻断抗体的情况下，表达17S的细胞减少补体沉积。在阻断CD46、CD55或二者的抗体的存在下，补体沉积未减少。

该数据一起显示胰岛细胞表面上的CD46和CD55是功能性的。

实施例8：当转基因通过2A肽连接时，包含转基因CD46、CD55或CD59的核酸减少补体沉积

目的：评价了2A肽的存在对CD46、CD55和CD59减少补体沉积的能力的影响。

引入一种2A肽对CD46和CD55的表达和功能的影响：将KCDC细胞用包含CD46da的核酸、包含CD55的核酸、或包含由F2A肽连接的CD46da和CD55的核酸转染。图17A示出CD55当连接到2A肽时表达。图17B示出CD46da(标记的“CD46”)当连接到2A肽时表达。图17C示出包含CD46da和CD55的核酸减少补体沉积。

引入两种2A肽对CD46、CD55和CD59的表达和功能的影响：将KCDC细胞用以下核酸之一转染：(i)hsCD46da2；(ii)hsCD55；(iii)hsCD59；(iv)hsCD46da2—F2A—hsCD55；(v)hsCD46da2—F2A—hsCD59；(vi)hsCD55—P2A—hsCD59；或(viii)hsCD46da2—F2A—hsCD55—P2A—hsCD59。图18A-图18C示出CD46(图18A)、CD55(图18B)和CD59(图18C)各自在这些构建体中表达。这些构建体中的每一个也减少了补体沉积(图18D)。

实施例9：CD46同种型选择对补体沉积的影响

目的：评价不同CD46同种型表达和防止补体蛋白沉积的能力。

方法和结果：图19A示出了人CD46在来源于用CD46的主要同种型转染的肾皮质的猪细胞(SG-ABC1、SG-BC2、SG-BC1)上，在来源于有效载荷15S猪的主动脉来源的内皮细胞(PL15S AEC)上和在人脐静脉细胞(作为阳性对照的HUVEC)上的稳健表面表达。未转染的肾皮质来源的猪细胞(空)用作阴性对照。在25％正常人血清中孵育后，表达人CD46同种型的细胞、PL15S AEC或未转染细胞(空)上的表面C3b沉积显示在右图中。表达人CD46的所有同种型的细胞被保护免于C3b沉积，而不表达CD46的未转染细胞表现出高C3b沉积(图19B)。

实施例10：包含CD46和CD55的核酸在多种上皮细胞(EC)类型中的表达的效果

目的：评价在含有图2D的多顺反子盒(“15S”)的核酸以及含有图4C的多顺反子盒(“17P”)的核酸中CD46和CD55的表达和功能

方法和结果：将肺泡上皮细胞(AEC)、肾上皮细胞(KEC)、猪脐静脉内皮细胞(PUVEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用15S或17P转染。用15S(图20A)或17P(图20B)转染的AEC、KEC、PUVEC和HUVEC细胞表达CD46和CD55，而未用15S或17P转染的TKO对照细胞则不表达。在不存在阻断CD46、CD55或二者的抗体的情况下，15S(图20C)和17P(图20D)均减少了AEC、KEC和PUVEC细胞中的补体沉积。

实施例11：包含CD46和CD55的核酸诱导防止器官排斥反应的保护

评价了在供体特异性同种抗体(DSA)的存在下含有图2D的盒(“15S”)的核酸的表达效果。

图14示出了人CD46和CD55蛋白在主动脉来源的内皮细胞(AEC)或同种型对照染色的细胞上的表面表达，所述主动脉来源的内皮细胞来自有效载荷15S(PL15S)猪或来自作为对照的GGTA1、B4GALNT2和CMAH三重敲除猪(TKO AEC)。用移植了PL15S肾的非人灵长类接受者的25％血清孵育后，在移植后的多个时间点取TKO和PL15S AEC上C3b沉积(图21A)。PL15S细胞被保护免于C3b沉积，而缺乏人CD46和CD55表达的TKO细胞随时间表现出显著的C3b沉积，表明PL15S细胞上的人CD46和CD55保护细胞免于补体激活。不表达15S的细胞具有高50％至700％的补体沉积。

同样的TKO细胞也用于测量移植后抗-猪IgG或IgM抗体的发展。将TKO细胞与来自非人灵长类动物的相同血清样品一起孵育(右线图)，并通过流式细胞术测量结合的免疫球蛋白。IgG抗体随时间发展，而IgM抗体不随时间发展(图21B)。即使在猪反应性IgG抗体的存在下，补体激活也受到人CD46和CD55蛋白的控制。

实施例12：包含图2E的多顺反子盒的核酸在各种细胞类型中的表达

目的和方法：评价包含图2E的多顺反子盒的核酸在各种细胞类型中的表达。图2E的核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含TFPI、PROCR和THBDda的凝血盒；在ssHSPA8启动子控制下的包含B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒；以及在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55的补体调节盒。

在成纤维细胞中的表达。图33示出每种转基因在来自大约克夏猪的成纤维细胞中表达。图34(见圈出的细胞)示出每种转基因在来自尤卡坦猪的成纤维细胞中表达。

实施例13：包含图2D的多顺反子盒的核酸在各种细胞类型中的表达

目的和方法：评价包含图2D的多顺反子盒的核酸在各种细胞类型中的表达。图2D的核酸包含：在ssUBC启动子控制下的包含PROCR和THBD的凝血盒；在ssEF1α1启动子控制下的包含A20和HO1的炎症和细胞凋亡盒；以及在CAG启动子控制下的包含CD46i、CD47和CD55的补体调节和先天免疫盒。

在成纤维细胞中的表达。图35示出每种转基因在来自大约克夏猪的成纤维细胞中表达。

在含有PERV敲除的成纤维细胞中的表达图36示出每种转基因在含有PERV敲除的成纤维细胞中表达。不含PERV的细胞在图36中圈出。

实施例14：包含图2H或图4A的多顺反子盒的核酸在胰岛细胞中的表达

目的和方法：评价包含图2H或图4A的多顺反子盒的核酸在胰岛细胞中的表达。图2H的核酸(“15S4”)包含：在ssUBC启动子控制下的包含TFPI、PROCR和THBDda的凝血盒；在ssEF1α1启动子控制下的含有B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒；以及在CAG启动子控制下的包含CD46da和CD55的补体调节盒。图4A的核酸(“17M1”)包含：在ssUBC启动子控制下的含有B2M HLA-E融合蛋白和CD47的先天免疫盒；在hsHSPA8启动子控制下的包含TFPI*、CD39和THBD的凝血盒；以及在CAG启动子控制下的包含CD46da、CD55、CD59、A20、HO1和PD-L1的补体调节和炎症和细胞凋亡盒。

人A20转基因蛋白的鉴定：还在包含17M1(PL17M1)的猪中评价了人A20转基因蛋白的活性。图37A是来自PL17M1或野生型(WT)猪的胰岛细胞的Western印迹分析，用人A20或β肌动蛋白(B肌动蛋白)的特异性抗体探测，A20或β肌动蛋白是用作细胞裂解物上样对照的管家基因。Western印迹显示PL17M1胰岛细胞表达人A20蛋白。用重组人TNFa处理猪细胞以诱导参与细胞凋亡的胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7(胱天蛋白酶3/7)蛋白的激活。胱天蛋白酶3/7活性通过在胱天蛋白酶蛋白存在下发生的前发光探针裂解后的发光来测定。A20保护细胞免受TNFa介导的信号，包括胱天蛋白酶蛋白诱导的细胞凋亡。表达A20蛋白的PL17M1细胞显示降低的发光，表明保护细胞免于TNFa介导的细胞凋亡(图37B)。

图37A示出A20在包含图4A的多顺反子盒的胰岛细胞中的表达。

表达15S4和17M1的多顺反子盒的胰岛细胞各自表达CD47。与17M1胰岛相比，15S4胰岛表达的CD47的水平更高(图44)。

评价了表达15S4和17M1的胰岛细胞防止吞噬作用的能力。简而言之，在单核细胞的存在下孵育用pH敏感荧光染料标记的胰岛细胞。在不存在单核细胞的情况下孵育胰岛细胞，作为阴性对照。在吞噬过程中，吞噬体的细胞外环境pH变为酸性。因此，吞噬量可以通过酸度来量化，用“总红色面积”表示。

15S4胰岛细胞和17M1细胞均防止吞噬作用。然而，解离的15S4胰岛细胞在防止吞噬作用方面优于17M1细胞(图45)。

实施例15：包含在启动子上游的CpG岛的核酸的表达

目的和方法：评价启动子选择对顺反子表达的影响。CD46转基因或CD47转基因在成纤维细胞、β胰岛细胞和肺动脉内皮细胞(pAEC)-SV40细胞系中表达。表4提供了用于表达CD46的启动子的特征。表5提供了用于表达CD47的启动子的特征。通过流式细胞术评价顺反子表达。

表4：用于表达CD46的启动子

启动子名称	SEQ ID NO:	启动子大小(kb)	CpG岛
				hsEF1α1	231	1.7	是
ssEF1α1	233	2	是
				ssEF1α1	234	1.5	是
ssEF1α1	235	1	否

表5：用于表达CD47的启动子

启动子名称	SEQ ID NO:	启动子大小(kb)	CpG岛
				CAG	250	1.7	是
ssHSPA8	236	2.5	是
				ssHSPA8	237	1.9	是
ssHSPA8	238	1.3	否

结果：与缺乏CpG岛的标准启动子相比，CD46和CD47的表达在由包含CpG岛的启动子控制时更强(图48A-图48F)

实施例16：包含新生猪胰岛(NPI)的糖尿病小鼠中的胰岛细胞功能，所述新生猪胰岛包含含有图4A的多顺反子盒的核酸

目的/方法：评价包含表达包含图4A的多顺反子盒的核酸的NPI的糖尿病小鼠中的胰岛细胞功能。

结果：图49示出胰岛素和胰高血糖素在八只小鼠中的六只中表达。

实施例17：包含新生猪胰岛(NPI)的糖尿病NOD scidγ(NSG)小鼠中的胰岛细胞功能，所述新生猪胰岛包含含有图4A的多顺反子盒的核酸

目的/方法：评价包含表达包含图4A的多顺反子盒的核酸的NPI的糖尿病NSG小鼠中的胰岛细胞功能。图50示出实验的示意图。

结果：图51示出NSG小鼠中的血糖水平。结果显示，NPI保护小鼠免于糖尿病。

实施例18：包含含有图4A的多顺反子盒的核酸的食蟹猴中的胰岛细胞功能

目的/方法：评价包含表达包含图4A的多顺反子盒的核酸的新生猪胰岛(NPI)的食蟹猴中的胰岛细胞功能。

结果：图52A-图52B示出两只食蟹猴的空腹血糖浓度、总胰岛素和猪C-肽。图52B的猴子展现了猪C-肽。猪C-肽是胰岛素分泌的标记物。该数据显示NPI对胰岛素的产生是有功能的。

实施例19：包含HLA-E转基因的核酸保护细胞免于NK细胞裂解

目的：评价了包含编码HLA-E的顺反子(以编码B2M HLA-E融合蛋白的顺反子形式)的核酸保护细胞免于自然杀伤(NK)细胞介导的裂解的能力。评价了以下核酸：(a)表达图1D的多顺反子盒(“14P”)的核酸，和(b)表达图1C的多顺反子盒(“14S”)的核酸。14P和14S各自包含编码B2M HLA-E融合蛋白的基因。评价了B2M HLA-E融合蛋白的两种变体：(i)包含肽表位VMAPRTLIL(SEQ ID NO:197)的B2MHLA-E融合蛋白(在图53B中标记为“Val”)，以及(ii)包含肽表位MAPRTLIL(SEQ ID NO:251)的B2M HLA-E融合蛋白(在图53A-图53B中标记为“无Val”)。

方法：人HLA-E转基因的活性通过将表达有效载荷的钙黄绿素标记的耳穿孔衍生的猪细胞(EPDC)与从外周血分离的人NK细胞共培养数小时，然后使用读板仪测量由于NK介导的细胞裂解而由细胞释放的钙黄绿素来测定。

结果：在图53A中，显示了猪细胞上人HLA-E转基因的代表性表面蛋白表达。在图53B中，进行NK细胞试验以评价表达有效载荷14P或14S(PL14P或PL14S)和HLA-E转基因构建体的猪细胞，所述构建体含有编码具有或不具有缬氨酸的负载肽的序列(分别为PL14P/SVal或PL14P/S无val)。不表达人HLA-E转基因的野生型(WT)EPDC或K562细胞(已知容易被人NK细胞裂解的人无限增殖化骨髓性白血病细胞系)作为试验的阳性对照被包括在内。表达人HLA-E转基因的猪细胞被保护免于NK细胞介导的裂解，并且具有缬氨酸负载肽的细胞被更好地保护。

实施例20：核酸表达功能性THBD和PROCR转基因

目的：评价含有图2D的多顺反子盒(“15S”)的核酸中THBD和PROCR的功能。

方法和结果：人EPCR和THBD蛋白在野生型(WT)，GGTA1、B4GALNT2和CMAH三重敲除(TKO)主动脉来源的内皮细胞(AEC)，人脐带来源的内皮细胞(Hu UVEC)和来自脐带(猪UVEC)、主动脉或肾(KEC)的有效载荷15S猪内皮细胞上的表面表达显示在左直方图中(图54A)。将这些细胞与重组人蛋白C一起孵育，通过比色变化测定活化蛋白C的产生，并在平板读数器上读数。与缺乏人EPCR和THBD的野生型猪AEC相比，PL15S猪的所有猪细胞都具有功能性EPCR和THBD蛋白，如存在活化蛋白C所证实的。(图54B)。

实施例21：表达CD47蛋白的核酸防止吞噬作用

人CD47蛋白在野生型(WT)和GGTA1加B4GALNT2双敲除(DKO)耳穿孔来源的细胞(EPDC)和来自PL15S猪的胎儿成纤维细胞(FF)上的表面表达(图57A)。在标记的猪细胞与标记的原代人单核细胞共培养后测量吞噬作用，并通过流式细胞术评估单核细胞吞噬的标记的猪细胞的量。用吞噬指数(由以下等式确定：总吞噬信号除以总吞噬信号加未吞噬信号的总和)来评价表达CD47转基因的PL15S细胞的吞噬作用的降低(图57B)。目标指数表明共培养期后存在的PL15S细胞的量较高，因为保护细胞免受吞噬作用(图57C)。

缩写

急性血管排斥反应(AVR)；活化部分凝血活酶时间(APTT)；腺相关病毒整合位点1(AAVS1)；丙氨酸转氨酶(ALT)；白蛋白(ALB)；α1,3-半乳糖基-半乳糖(Gal或αGal)；抗体介导的排斥反应(AMR)；抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)；天冬氨酸转氨酶(AST)；β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GalNT2)；β-2微球蛋白(B2M)；分化簇39(CD39)；分化簇47(CD47)；成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)；II类反式激活因子显性负性(CIITA-DN)；CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)；补体因子3(C3)；补体因子3敲除(C3-KO)；全血细胞计数(CBC)；C-X-C基序趋化因子受体3(CXCR3)；C-X-C基序趋化因子受体12(CXCR12)；胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)；脱氧核糖核酸(DNA)；DQα(DQA)；DRα(DRA)；微滴数字式pCR(ddPCR)；外-5'核苷酸酶(CD73)；延伸因子1α(EF1α)；内皮细胞(EC)；内皮蛋白C受体(EPCR)；离体肝脏异种灌注(EVLXP)；Fas配体(FasL)；纤维蛋白原水平(FIB)；荧光激活细胞分选(FACS)；新鲜冷冻血浆(FFP)；绿色荧光蛋白(GFP)；肾小球滤过率(GFR)；胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)；糖蛋白IIb/IIIa(GpIIb/IIIa)；糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶1(GGTA1)；GGTA敲除(GTKO)；指导核糖核酸(gRNA)；苏木精和伊红(H+E)；肝动脉血栓形成(HAT)；人胚胎肾脏293(HEK293)；血红素加氧酶(HO1)；同源定向修复(HDR)；人血液和血浆(hWB+P)；人膜辅因子蛋白(hCD46)；人补体衰变加速因子(hCD55)；人补体调节蛋白(hCRP)；人白细胞抗原(HLA)；人白细胞抗原-E(HLA-E)；人MAC抑制因子(hCD59)；免疫球蛋白G(IgG)；酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；免疫球蛋白M(IgM)；免疫组织化学(IHC)；肌苷单磷酸脱氢酶(IMDH)；白介素12(IL12)；白介素35(IL35)；国际标准化比率(INR)；细胞内粘附分子-2(ICAM2)；杀伤抑制受体(KIR)；敲入(KI)；敲除(KO)；Krüppel相关盒(KRAB)；肝脏功能测试(LFT)；长末端重复序列(LTR)；主要组织相容性复合体I类(MHC I类)；主要组织相容性复合体II类(MHC II类)；主要组织相容性复合体I类E单链三聚体(HLA-ESCT)；雷帕霉素的机制性靶标(mTOR)；信使核糖核酸(mRNA)；肾病饮食改进(MDRD)；混合淋巴细胞反应(MLR)；霉酚酸酯(MMF)；自然杀伤细胞(NK)；N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)；神经源性分化1(NeuroD)；非人灵长类动物(NHP)；非同源末端连接(NHEJ)；原位肝脏异种移植(OLTx)；群体反应性抗体(PRA)；外周血单核细胞(PBMC)；猪肾脏-15细胞(PK15)；猪内源性反转录病毒(PERV)；猪内源性反转录病毒敲除(PERV KO)；程序性死亡配体1(PD-L1)；聚合酶链式反应(PCR)；猪主动脉内皮细胞系(PEC-A或pAEC)；钾(K)；凝血酶原时间(PT)和国际标准化比率(PT-NIR)；定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)；重组酶介导的盒交换(RMCE)；红细胞(RBC)；核糖核酸测序(RNAseq)；反转录聚合酶链式反应(RT-PCT)；sgRNA(单指导RNA)；小干扰核糖核酸(siRNA)；钠(Na)；体细胞核转移(SCNT)；超氧化物歧化酶3(SOD3)；猪白细胞抗原(SLA)；T细胞介导的排斥反应(TCMR)；凝血酶-抗凝血酶III(TAT)；凝血调节蛋白(THBD、TBM或TM)；血栓性微血管病(TMA)；组织因子途径抑制剂(TFPI)；拓扑异构酶(TOPO)；总胆红素(Tbili)；转录激活因子样(TAL)效应子和核酸酶(TALEN)；肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(A20)；肿瘤坏死因子受体1免疫球蛋白(TNFR1-Ig)；遍在染色质开放元件(UCOE)；血管性血友病因子(vWF)；全基因组测序(WGS)；野生型(WT)；锌指核酸酶(ZFN)。

引用并入

将本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于所有目的通过引用以其整体而并入。然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请并非且也不应当被视为承认或任何形式的教导它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家公知常识的一部分。

Claims

1.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中编码所述THBD蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:97-102、166和265-266的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(ii)编码TFPI蛋白的第二顺反子，其中编码所述TFPI蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:94-96、103和187的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iii)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；

(iv)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；以及

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中编码所述CD46蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:71-76、185、200和253-258的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(ii)编码CD59蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD59蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:86、108的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开；以及

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(i)编码B2M HLA-E融合蛋白的第一顺反子，其中编码所述B2MHLA-E融合蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:62、66、105的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD47蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:77-83、180和259的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开。

2.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(iii)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(ii)编码CD59蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD59蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:86、108；

(c)先天免疫和炎症和细胞凋亡盒，所述先天免疫和炎症和细胞凋亡盒包含：

(iii)编码A20蛋白的第三顺反子，其中编码所述A20蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:64-65、104、182和188的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iv)编码HO1蛋白的第四顺反子，其中编码所述HO1蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；

(vi)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；以及

(vi)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开。

3.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(iii)编码CD39蛋白的第三顺反子，其中所述CD39蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:67-70及SEQ ID NO:106的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iv)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；以及

(v)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；

(vi)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中CD46的核酸序列与选自SEQ ID NO:71-76、185、200和253-258的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(ii)编码CD59蛋白的第二顺反子，其中CD59的核酸序列与选自SEQ ID NO:86、108的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iii)编码CD55蛋白的第三顺反子，其中CD55的核酸序列与选自SEQ ID NO:84、85、107和184的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(vi)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开；以及

(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中CD47的核酸序列与选自SEQ ID NO:77-83、180和259的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iii)编码A20蛋白的第三顺反子，其中A20的核酸序列与选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iv)编码HO1蛋白的第四顺反子，其中HO1的核酸序列与选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)编码PD-L1蛋白的第五顺反子，其中PD-L1的核酸序列与选自SEQ ID NO:89-91的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(vi)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；

(vii)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；以及

(viii)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQID NO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开。

4.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(i)编码THBD蛋白的第一顺反子，其中THBD的核酸序列与选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(ii)编码EPCR蛋白的第二顺反子，其中EPCR的核酸序列与选自SEQ ID NO:92、93和181的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iv)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；

(b)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：

(i)编码A20蛋白的第一顺反子，其中A20的核酸序列与选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(ii)编码HO1蛋白的第二顺反子，其中HO1的核酸序列与选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(c)补体调节和先天免疫盒，所述补体调节和先天免疫盒包含：

(iv)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；

(v)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；以及

5.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(iii)编码TFPI蛋白的第三顺反子，其中TFPI的核酸序列与选自SEQ ID NO:94-96、103和187的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中CD55的核酸序列与选自SEQ ID NO:84、85、107和184的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

6.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开，以及

(v)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；以及

(vi)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合，以及

(vii)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开。

7.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(ii)编码TFPI蛋白的第二顺反子，其中TFPI的核酸序列与选自SEQ ID NO:94-96、103和187的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iii)编码CD39蛋白的第三顺反子，其中CD39的核酸序列与选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(b)补体调节和炎症和细胞凋亡盒，所述补体调节和炎症和细胞凋亡盒包含：

(iv)编码A20蛋白的第四顺反子，其中A20的核酸序列与选自SEQ ID NO:64-65、104、182和188的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)编码HO1蛋白的第五顺反子，其中HO1的核酸序列与选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(vi)编码PD-L1蛋白的第六顺反子，其中PD-L1的核酸序列与选自SEQ ID NO:89-91的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(vii)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；

(viii)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；

(ix)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开，以及

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

8.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(i)编码CD46蛋白的第一顺反子，其中CD46的核酸序列选自SEQ ID NO:71-76、185、200和253-258；

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(iv)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合，以及

9.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(iii)启动子，所述启动子具有与选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列；以及

(vii)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开；以及

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

10.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(vi)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的IRES序列分开，

(vi)编码PDL1蛋白的第六顺反子，其中PDL1的核酸序列与选自SEQ ID NO:89-91的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(viii)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合；以及

(ix)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开，以及

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

11.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开，

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(iv)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合，

(d)细胞免疫和凝血盒，所述细胞免疫和凝血盒包含：

(i)编码CTLA-4蛋白的第一顺反子，其中CTLA-4的核酸序列与选自SEQ ID NO:87-88和186的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，

(ii)编码CD39蛋白的第二顺反子，其中CD39的核酸序列与选自SEQ ID NO:67-70和SEQID NO:106的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

12.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(iii)任选地，编码CD39蛋白的第三顺反子，其中CD39的核酸序列与选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(vi)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的IRES序列分开，

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(iii)任选地，编码CD59蛋白的第三顺反子，其中CD59的核酸序列与选自SEQ ID NO:86、108的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(d)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：

(ii)编码PD-L1蛋白的第二顺反子，其中PD-L1的核酸序列与选自SEQ ID NO:89-91的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iii)任选地，编码HO1蛋白的第三顺反子，其中HO1的核酸序列与选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合，以及

13.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(d)细胞凋亡和凝血盒，所述细胞凋亡和凝血盒包含：

(i)编码XIAP蛋白的第一顺反子，其中XIAP的核酸序列与SEQ ID NO:110具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(ii)编码CD39蛋白的第二顺反子，其中CD39的核酸序列与选自SEQ ID NO:106的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

14.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(d)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含：

(ii)编码CTLA-4蛋白的第二顺反子，其中CTLA-4的核酸序列与选自SEQ ID NO:87-88和186的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的IRES序列分开。

15.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(v)至少一种具有选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列的2A多肽，

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(v)至少一种2A多肽，所述2A多肽由与选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(d)细胞免疫和凝血盒，所述细胞免疫和凝血盒包含：

(i)编码LEA29Y蛋白的第一顺反子，其与SEQ ID NO:186具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，

(v)至少一种2A多肽，所述2A多肽由与选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码。

16.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(v)任选地，其中一种或多种编码的蛋白被2A多肽分开，所述2A多肽由与选自SEQ IDNO:1-10、12-14和169的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码，或被与选自SEQ ID NO:11、194和195的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的IRES序列分开；

(b)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(c)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(ii)编码LEA29Y蛋白的第二顺反子，其中所述LEA29Y顺反子的核酸序列与SEQ ID NO:186具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

17.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血和先天免疫盒，所述凝血和先天免疫盒包含：

(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中CD47的核酸序列与选自SEQ ID NO:77-83和180的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(iii)编码EPCR蛋白的第三顺反子，其中EPCR的核酸序列与选自SEQ ID NO:94-96、103和187的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(v)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的聚A序列，及其组合，

(b)细胞凋亡和细胞免疫盒，所述细胞凋亡和细胞免疫盒包含：

(v)至少一种2A多肽，所述2A多肽由与选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列编码；以及

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(iv)与选自SEQ ID NO:112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性的聚A序列，及其组合；

18.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血和先天免疫盒，所述凝血和先天免疫盒包含：

(ii)编码CTLA-4蛋白的第二顺反子，其中CTLA-4的核酸序列与选自SEQ ID NO:87-88、174和186的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

19.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(ii)编码CD47蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD47蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:77-83和259的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(ii)编码CD55蛋白的第二顺反子，其中编码所述CD55蛋白的核酸序列与选自SEQ IDNO:84、85、107和184的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；

20.一种包含一个或多个多顺反子盒的核酸，所述一个或多个多顺反子盒选自：

(a)凝血盒，所述凝血盒包含：

(b)先天免疫盒，所述先天免疫盒包含：

(c)补体调节盒，所述补体调节盒包含：

(d)炎症和细胞凋亡盒，所述炎症和细胞凋亡盒包含：

21.如权利要求1-20中任一项所述的核酸，其中所述启动子包含CpG岛。

22.如权利要求21所述的核酸，其中所述CpG岛包含至少500个碱基对，包含至少50％的GC含量，包含CpG二核苷酸，或其任何组合。

23.如权利要求1-22中任一项所述的核酸，其包含转录终止子。

24.如权利要求23所述的核酸，其中所述转录终止子位于所述聚A序列的3’端。

25.如权利要求1-24中任一项所述的核酸，其中所述CD46顺反子的核酸序列选自72、73、185和200。

26.如权利要求1-24中任一项所述的核酸，其中所述CD46顺反子的核酸序列选自SEQID NO:74和SEQ ID NO:75。

27.如权利要求1-24中任一项所述的核酸，其中所述CD46顺反子的核酸序列是SEQ IDNO:71。

28.如权利要求1-27中任一项所述的核酸，其中所述CD47顺反子编码CD47同种型2。

29.如权利要求28所述的核酸，其中所述编码CD47同种型2的顺反子具有选自SEQ IDNO:78、83和180中任一个的核酸序列。

30.如权利要求1-29中任一项所述的核酸，其中所述THBD顺反子包含选自SEQ ID NO:99-102和166中任一个的核酸序列或由其组成。

31.如权利要求15或16所述的核酸，其中LEA29Y是编码具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的蛋白质的核酸。

32.如权利要求15或16所述的核酸，其中LEA29Y是包含SEQ ID NO:186的核酸序列的核酸。

33.如权利要求1-32中任一项所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:146-150和244的5'loxP位点和3'loxP位点。

34.如权利要求1-33中任一项所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:49-58和163-164的5'绝缘子位点和3'绝缘子位点。

35.如权利要求1-34中任一项所述的核酸，其包含具有选自SEQ ID NO:47-48的序列的5’指导RNA(gRNA)靶序列和3’gRNA靶序列及其组合。

36.如权利要求1-35中任一项所述的核酸，其包含具有SEQ ID NO:19-22、157和193中任一个的序列的遍在染色质开放元件(UCOE)。

37.如权利要求1-36中任一项所述的核酸，其包含

(i)位于5’多顺反子盒的5’端并具有SEQ ID NO:17或18的序列的第一反向末端重复序列(ITR)，以及

(ii)位于3’多顺反子盒的3’端并具有SEQ ID NO:15或16的序列的第二ITR。

38.如权利要求1-37中任一项所述的核酸，其包含一个多顺反子盒。

39.如权利要求1-37中任一项所述的核酸，其包含至少两个多顺反子盒。

40.如权利要求1-37中任一项所述的核酸，其包含至少三个多顺反子盒。

41.如权利要求1-37中任一项所述的核酸，其包含四个多顺反子盒。

42.如权利要求1-41中任一项所述的核酸，其包含荧光蛋白。

43.如权利要求42所述的核酸，其中所述荧光蛋白具有SEQ ID NO:111、242或246的序列。

44.如权利要求1所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:24、25、29、202、203和207的核酸序列。

45.如权利要求2所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:26和204的核酸序列。

46.如权利要求3所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:23、27、28、201、205和206的核酸序列。

47.如权利要求4所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:30和208的核酸序列。

48.如权利要求5所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:31-34和209-212的核酸序列。

49.如权利要求6所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:37和215的核酸序列。

50.如权利要求7所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:35和213的核酸序列。

51.如权利要求8所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:36、40、214和218的核酸序列。

52.如权利要求9所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:41、42、219和220的核酸序列。

53.如权利要求10所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:38、39、173、216、217和226的核酸序列。

54.如权利要求11所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:43和221的核酸序列。

55.如权利要求11所述的核酸，其中CTLA-4是LEA29Y。

56.如权利要求14所述的核酸，其中CTLA-4是LEA29Y。

57.如权利要求12所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:44、172、222和225的核酸序列。

58.如权利要求13所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:45和223的核酸序列。

59.如权利要求14所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:46和224的核酸序列。

60.如权利要求17所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:174和227的核酸序列。

61.如权利要求18所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:175和228的核酸序列。

62.如权利要求19所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:176和229的核酸序列。

63.如权利要求20所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:177和230的核酸序列。

64.一种包含CD46顺反子的核酸，所述CD46顺反子包含选自72、73、185、200和256的核酸序列或由其组成。

65.一种包含THBD顺反子的核酸，所述THBD顺反子包含选自SEQ ID NO:99-102、166和266中任一个的核酸序列或由其组成。

66.一种包含如权利要求1-65中任一项所述的核酸的载体。

67.一种包含如权利要求1-65中任一项所述的核酸的经基因修饰的细胞。

68.如权利要求67所述的经基因修饰的细胞，其中所述细胞是胰岛细胞。

69.如权利要求67所述的经基因修饰的细胞，其中所述细胞是猪细胞。

70.如权利要求67-69中任一项所述的经基因修饰的细胞，其中所述细胞是不含PERV的。

71.如权利要求67-70中任一项所述的经基因修饰的细胞，其中所述细胞包含至少一种失活的糖类抗原产生基因。

72.如权利要求71所述的经基因修饰的细胞，其中所述至少一种失活的糖类抗原产生基因是糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)、β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)或其组合。

73.一种器官或组织，其包含如权利要求1-65中任一项所述的核酸或如权利要求67-72中任一项所述的细胞。

74.一种动物，其包含如权利要求1-65中任一项所述的核酸、如权利要求67-72中任一项所述的细胞或如权利要求73所述的器官或组织。

75.如权利要求74所述的动物，其中所述动物是猪类哺乳动物或人。

76.如权利要求74或75所述的动物，其中所述动物是不含PERV的猪类哺乳动物。

77.如权利要求74-76中任一项所述的动物，其包含至少一种失活的糖类抗原产生基因。

78.如权利要求77所述的动物，其中所述至少一种失活的糖类抗原产生基因是糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)、β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)或其组合。

79.一种具有SEQ ID NO:23-46、172-177或201-230中任一个的连续核酸序列。

80.如权利要求79所述的连续核酸序列，其包含至少约1kb的连续核苷酸序列。

81.如权利要求80所述的连续核酸序列，其中所述序列的长度为至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少16kb、至少17kb、至少18kb、至少19kb、至少20kb、至少21kb、至少22kb、至少23kb、至少24kb、至少25kb、至少26kb、至少27kb、至少28kb、至少29kb或至少30kb。

82.如权利要求79-81中任一项所述的连续核酸序列，其中所述序列编码一个或多个如权利要求1-20中任一项所述的多顺反子盒。

83.如权利要求79-82中任一项所述的连续核酸序列，其中所述序列编码至少两个如权利要求1-16中任一项所述的多顺反子盒。

84.如权利要求57所述的连续核酸序列，其中所述序列编码至少三个如权利要求1-16中任一项所述的多顺反子盒。

85.如权利要求57所述的连续核酸序列，其中所述序列编码至少四个如权利要求1-16中任一项所述的多顺反子盒。

86.SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中任一个的染色体整合形式。

87.一种与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个95％相同的连续核酸序列。

88.如权利要求87所述的连续核酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少96％相同。

89.如权利要求65所述的连续核酸序列，其中所述序列与SEQ IDNO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少97％相同。

90.如权利要求65所述的连续核酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少98％相同。

91.如权利要求65所述的连续核酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少99％相同。

92.如权利要求65所述的连续核酸序列，其中所述序列编码至少两个如权利要求1-20中任一项所述的多顺反子盒。

93.如权利要求65所述的连续核酸序列，其中所述序列编码至少三个如权利要求1-20中任一项所述的多顺反子盒。

94.如权利要求65所述的连续核酸序列，其中所述序列编码至少四个如权利要求1-20中任一项所述的多顺反子盒。

95.如权利要求92-94中任一项所述的连续核酸序列，其中所述序列与SEQ ID NO:23-46、172-177和201-230中的任一个至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

96.一种编码由如权利要求1-20中任一项所述的多顺反子盒中的任一个表达的多顺反子基因产物多肽的连续核酸序列。

97.一种多肽，其包含由如权利要求1-20中任一项所述的多顺反子盒中的任一个的顺反子编码的一种或多种蛋白质。

98.一种对细胞进行基因修饰的方法，其包括：

(i)敲除猪内源性反转录病毒(PERV)元件；

(ii)敲除糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶基因(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)、β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)或其任何组合；并且

(iii)敲入如权利要求1-20中任一项所述的任何一个或多个多顺反子盒。

99.如权利要求98所述的方法，其中首先进行步骤(i)，其次进行步骤(ii)，并且最后进行步骤(iii)。

100.如权利要求98所述的方法，其中首先进行步骤(i)，其次进行步骤(iii)，并且最后进行步骤(ii)。

101.如权利要求98所述的方法，其中首先进行步骤(ii)，其次进行步骤(i)，并且最后进行步骤(iii)。

102.如权利要求98所述的方法，其中首先进行步骤(iii)，其次进行步骤(i)，并且最后进行步骤(ii)。

103.如权利要求98所述的方法，其中首先进行步骤(ii)，其次进行步骤(iii)，并且最后进行步骤(i)。

104.如权利要求98所述的方法，其中首先进行步骤(iii)，其次进行步骤(ii)，并且最后进行步骤(i)。

105.一种通过如权利要求98-104中任一项所述的方法产生的经基因修饰的细胞。

106.一种包含如权利要求105所述的经基因修饰的细胞的组织、器官或动物。

107.如权利要求106所述的动物，其中所述动物是人或猪类哺乳动物。

108.一种包含第一loxP位点、第二loxP位点、启动子和聚A序列的核酸。

109.如权利要求108所述的核酸，其与SEQ ID NO:248或249的核酸序列具有至少90％同一性。

110.一种包含如权利要求108或109所述的核酸的经基因修饰的细胞。

111.一种包含如权利要求110所述的细胞的组织、器官或动物。

112.一种包含第一loxP位点、第二loxP位点和一个或多个如权利要求1-20所述的多顺反子盒的核酸。

113.一种包含如权利要求112所述的核酸的经基因修饰的细胞。

114.一种包含如权利要求113所述的细胞的组织、器官或动物。

115.如权利要求112所述的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO:201-230中任一个的核酸序列。

116.一种与SEQ ID NO:201-230中任一个的核酸具有至少80％同一性的核酸。

117.一种与SEQ ID NO:201-230中任一个的核酸具有至少85％同一性的核酸。

118.一种与SEQ ID NO:201-230中任一个的核酸具有至少90％同一性的核酸。

119.一种与SEQ ID NO:201-230中的任一个具有至少95％同一性的核酸。

120.一种与SEQ ID NO:201-230中的任一个具有至少97％同一性的核酸。

121.一种与SEQ ID NO:201-230中的任一个具有至少99％同一性的核酸。

122.一种包含SEQ ID NO:201-230中任一个的核酸。

123.一种包含如权利要求122所述的核酸的经基因修饰的细胞。

124.一种包含如权利要求67-72、105、110或123中任一项所述的细胞的组织、器官或动物。

125.一种非人哺乳动物，其包含如权利要求67-72、105、110或123中任一项所述的细胞。

126.一种核酸，其包含SEQ ID NO:1-195和205-250中的任一个或其组合。

127.一种经基因修饰的细胞，其包含如权利要求126所述的核酸。

128.如权利要求127所述的经基因修饰的细胞，其中所述细胞是无PERV的。

129.如权利要求127或128所述的经基因修饰的细胞，其包含至少一个失活的糖类抗原产生基因。

130.如权利要求129所述的经基因修饰的细胞，其中所述至少一种失活的糖类抗原产生基因是糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)、β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)或其组合。

131.如权利要求127-130中任一项所述的经基因修饰的细胞，其中所述细胞重组表达：

(a)一种或多种调节凝血的蛋白质；

(b)一种或多种调节先天免疫的蛋白质；

(c)一种或多种调节补体沉积的蛋白质，及任选地

(d)一种或多种调节炎症的蛋白质，及任选地

(e)一种或多种调节细胞凋亡的蛋白质；并且其中

(f)所述细胞任选地包含α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)中1、2或3个的敲除。

132.一种包含如权利要求127-131中任一项所述的经基因修饰的细胞的器官、组织或动物。

133.一种包含如权利要求127-131中任一项所述的经基因修饰的细胞的非人哺乳动物。

134.一种重组编码选自(a)-(d)的一种或多种蛋白质的核酸：

(a)THBD蛋白、和/或TFPI蛋白、和/或CD39蛋白、和/或EPCR蛋白；和/或XIAP蛋白质，以及

(b)CD46蛋白和/或CD55蛋白和/或CD59蛋白；以及

(c)B2M HLA-E融合蛋白和/或CD47蛋白，以及

(d)A20蛋白、和/或PD-L1蛋白、和/或CTLA-4蛋白、和/或HO1蛋白。

135.如权利要求134所述的核酸，其中每种蛋白质的表达由(a)、(b)和(c)中每一个的一个或多个控制元件控制：

(a)选自SEQ ID NO:126-145、167-168、178-179、231-238和250的启动子；

(b)选自SEQ ID NO.112-125、154-156、159-162、190-192和239-240的聚A序列；以及

(c)由选自SEQ ID NO:1-10、12-14和159-162的序列编码的2A多肽。

136.如权利要求134或135所述的核酸，

其中编码所述THBD蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:97-102、166和265-266的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中编码所述TFPI蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:94-96、103和187的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中编码所述CD46蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:71-76、185、200和253-258的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中编码所述B2M HLA-E融合蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:62、66、105的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中编码所述CD47蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:77-83、180和259的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中编码所述CD55蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:84、85、107和184的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中编码所述CD59蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:86和108的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中编码所述A20蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:64、65、104、182和188的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中EPCR的核酸序列与选自SEQ ID NO:92-93和181的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中HO1的核酸序列与选自SEQ ID NO:63、109、165、183和189的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中CD39的核酸序列与选自SEQ ID NO:67-70和SEQ ID NO:106的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中XIAP的核酸序列与SEQ ID NO:110的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

其中CTLA-4的核酸序列与选自SEQ ID NO:87、88、186的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；以及

其中PD-L1的核酸序列与选自SEQ ID NO:89-91的序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

137.一种经基因修饰的细胞，其包含如权利要求134-136中任一项所述的核酸：

其中所述细胞包含编码α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(β4GALNT2)中1、2或3个的基因的敲除。