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CN117120168A - 用于分离颗粒的微流控设备和方法 - Google Patents

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CN117120168A
CN117120168A CN202280022675.9A CN202280022675A CN117120168A CN 117120168 A CN117120168 A CN 117120168A CN 202280022675 A CN202280022675 A CN 202280022675A CN 117120168 A CN117120168 A CN 117120168A
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dep
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fluid
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F·比安科
N·通纳
R·洛芙奇克
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Brand Technology Co ltd
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Abstract

设想形成本发明的目的，一种用于标识和/或分离小颗粒的微流控芯片(100、200、800、900)，包括至少第一微流控通道(110、210)、位于所述通道(110、210)内部的壁上的至少第一介电泳产生电场生成单元(DEP单元，140、240)、位于所述第一通道(110、210)内部的在相对于所述DEP单元(140、240)位于其中的壁的相对壁上的至少一个免疫亲和捕获区(150、250)和电耦合至所述DEP单元(140、240)的电压源(160、260)，其中所述第一通道(110、210)包括用于流体通过所述通道(110、210)的通道流动路径的通道第一端(112、212)和通道第二端(114、214)。另一个目的是一种从流体样品中标识和/或分离小颗粒的方法，包括使用根据本发明的微流控芯片。

Description

用于分离颗粒的微流控设备和方法
背景技术
细胞外囊泡(EV)在不同的生理和病理条件下从大多数细胞中释放出来，并作为细胞间通信中的生物活性介质扮演着关键角色。近年来，科学研究已将其注意力集中于理解EV的角色、它们在若干疾病进展中的参与，以及它们作为生物标志物在诊断、治疗和药物输送系统开发中的潜在角色。
EV在所有体液(例如血液、尿液、脑脊液)中被标识出，并且可以跨越多种生物屏障。
存在3个主要的EV类别：外泌体、微泡和凋亡小体，通过大小、含量、生物发生和生物物理特性被明显区分：
i)外泌体是小的均质囊泡(直径30-150nm)，其源自在将管腔内囊泡分类到其正确目的地(诸如溶酶体或细胞外环境)中所牵涉的内体网络。具体地，它们在多泡体(MVB)内形成，这些多泡体与质膜融合，以有利于它们的细胞外释放。
ii)从起源细胞的质膜脱落的微泡，它们在大小上非常异质(100至800nm)，携带起源细胞的选定的细胞特异性受体和表面标记，并以取决于起源细胞的生理和病理条件的生化和分子含量为特征。
iii)凋亡小体要大得多(500nm-4μm)，并且是作为细胞收缩后增加的静水压的结果而从垂死的凋亡细胞上分离的泡。
EV表达特定于起源组织和细胞并反映组织或细胞的生理状态的表面标记。
围绕EV作为诊断生物标记物的潜在来源的日益增长的兴趣已经推动了其分离和含量分析创新方案的开发。
Ibsen等人在ACS Nano,2017,11:6641-6651中描述了介电泳(DEP)从血浆中捕获外泌体和微泡。DEP是无标签、快速且准确的。然而，该方案不是那么特异性的：即使电极上将包被有抗体，由于强聚集，也将很难避免非特异性捕获。
Yasukawa等人在2014年：世界自动化大会，1569887255，TSI出版社中，描述了负DEP操作，捕获电极之间的抗体包被区域上的细胞。US2019/039060描述了施加于细胞的DEP操作，其中电极吸引细胞或将其推向通道的底板，其中所述细胞正在移动，所述电极被点样(spotted)在所述通道中的定义区域上。这两种技术适用于比EV大一到两个数量级的细胞。
此外，现有方法方式的主要缺点之一在于难以在分离的EV当中区分从特异性细胞获得的EV，其中具有EV的特异性亚群已被证明对于确保在上述应用中的有效使用至关重要。
本发明涉及用于颗粒的、优选地EV亚群的分离的一种设备和一种方法，适合于处理有限量的生物样品。
发明内容
本发明提供了一种微流控系统，包括其组件和用途，用于利用微制造器件或“芯片”来分离颗粒。
附图说明
图1：根据本发明的微流控芯片的示意图。
图2：根据本发明的微流控芯片的实施例A)透视图；B)垂直截面。
图3：操作期间的微通道的横截面的三步示意图A)样液被馈送；B)DEP开启；C)DEP关闭。
图4：EV在抗体包被区域(A)中而不是在BSA包被区域(B)中捕获，荧光染色捕获的EV的示例图片。
图5：仅在存在DEP(B)的情况下，EV才会在抗体包被区域中被捕获，荧光染色捕获的EV的示例图片。
图6：N9囊泡不粘附CD144抗体。
图7：来自小胶质细胞的特异性分离的EV，荧光染色捕获的EV的示例图片。
图8：从MV中提取的miRNA的概况。
图9：根据本发明的微流控芯片的实施例的示意图。
图10：根据本发明的微流控芯片的实施例的示意图。
具体实施方式
应当理解，本文所使用的术语仅出于描述实施例的目的并且不旨在进行限制，因为本教导的范围将仅由所附权利要求限制。
所定义的术语是除了如本教导的技术领域中通常理解和接受的所定义术语的技术和科学含义之外的。
如本文所使用的，并且除了它们的普通含义之外，术语“实质性”或“实质上”意指在本领域普通技术人员可接受的限度或程度内。
如本文所使用的，术语“大致”和“大约”意指在本领域普通技术人员可接受的限度或量内。术语“大约”通常是指所指示的数字的正负15％。例如，“大约10”可以指示8.5至11.5的范围。例如，“大致相同”意味着本领域普通技术人员认为正在被比较的项目是相同的。
在本公开中，数值范围包括定义范围的数字。
如说明书和所附权利要求中所使用的，术语“一”、“一个”和“该”包括单数和复数指示物两者，除非上下文另外明确指出。因此，例如，“通道”包括一个通道和多个通道。
如本文所使用的，术语“微流控环境”意味着包括具有从几个(例如4-5μm)到数百微米的大小的通道的网络的基板。通道被配置为流动、操纵和以其他方式控制微升至皮升范围中的流体。
如本文所使用的，“通道”意味着制品(基板)上或制品(基板)中至少部分引导流体流动的特征。通道可以具有任何横截面形状(圆形、椭圆形、三角形、不规则、正方形或矩形等)并且可以被覆盖或不被覆盖。在其被完全覆盖的实施例中，通道的至少一部分可具有完全封闭的横截面，或者整个通道可沿其整个长度完全封闭，除了其(一个或多个)入口和/或(一个或多个)出口之外。
“免疫亲和捕获区”意味着能够特异性地结合一种或多种颗粒亚群的表面，其中所述表面覆盖有抗体，从而允许抗体-抗原结合，和/或覆盖有与生物素-亲和素-系统或其他类型的生物反应放大系统，即类似于生物素-链霉亲和素的相互作用对，如即亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin和CaptAvidin生物素结合蛋白和亲和基质，如即蛋白A/G、蛋白A、蛋白G和蛋白L。
“颗粒”意味着小体积的材料。在此上下文中，颗粒具有大约800nm的最大尺寸。在实施例中，针对生物颗粒做出参考。在优选的实施例中，所述生物颗粒是囊泡。
出于此描述的目的，所有囊泡是细胞外囊泡(EV)，并且它们被分类如下：
-小型EV(sEV)，具有低于200nm或低于300nm的尺寸。
-中/大型EV(m/lEV)，具有范围从200或300nm到800nm的尺寸。
微流控装置被提供用于分开颗粒。所述装置通常包括芯片，该芯片至少包括通道，该通道包括第一端和第二端，即入口和出口。
作为本发明的一个方面，提供了一种微流控装置(例如，微流控芯片)，其从水性流体的流中有效地分离颗粒亚群，优选地EV亚群。根据本发明的微流控装置促进所述颗粒亚群的完全且特异性分开。
图1示意性地图示了根据本发明的微流控装置。所述微流控装置100包括第一微流控通道110、第一DEP单元140、免疫亲和捕获区150和电耦合到DEP单元140的电压源160。
所述微流控通道110包括用于流体通过通道110的通道流动路径的通道第一端112(即，通道入口)和通道第二端114(即，通道出口)，如箭头116所示。流体在通道第一端112处进入通道110，流过通道110，并在通道第二端114处离开通道110。
垂直于流动116，在所述微流控通道110中定义两个部分：上部170和下部171。所述通道110的内表面被定义为上部170中的顶板162和下部171中的底板163。
所述第一DEP单元140沿着所述通道110内部的所述顶板162延伸。在优选实施例中，所述DEP单元140在所述顶板162上方延伸通道110本身的几乎整个长度。
这里描述的几何形状允许形成以与通道110中的流动方向116相同的方式取向的长均匀电场。
所述免疫亲和捕获区150沿着通道110内部的所述底板163延伸。
在本实施例中，DEP单元和免疫亲和捕获区彼此相对位于所述通道110中，其中DEP单元位于上部170中并且免疫亲和捕获区位于下部171中。
在实施例中，用于接收流体样品的通道入口112具有包括在100μm和1mm之间的横截面，以促进流体样品的引入。
通道入口可与通道连通。即，引入到通道入口的流体样品可以在通道中流动并沿着通道流动。
通道可以连接至通道入口。通道可以提供移动路径，允许引入到通道入口的样品通过那里。通道可被提供以允许流体样品移动到出口单元。
流体样品通过使用毛细力、压力和/或离心力作为通道内的动力而移动。
通道例如是微流控通道。微流控通道可以是指样品根据毛细管作用而在其中移动或流动的通道。
微流控装置100包括基板20，基板20可以是彼此相关联的一个或多个基板，以在其间定义流体通道。在一个实施例中，基板20包括绝缘体(例如，玻璃或聚合物)或半导体(例如，硅结构)，其中设备100的各种特征(例如，通道、入口、出口)被设计。这样的特征可以通过使用本领域技术人员已知的微制造技术将那些特征形成到基板20的表面和/或亚表面结构中来做出。
在实施例中，所述通道通过重叠两个基板(作为示例，PMDS基板和/或玻璃)而获得。在此实施例中，微流控芯片包括面向下的通道。微流控芯片被重叠到PDMS盘，使得通道形成。在此实施例中，免疫亲和捕获区位于被方便地功能化的PDMS盘上，DEP单元位于微流控芯片上，或者反之亦然。
作为示例，根据图2A、B，微流控装置200包括重叠到PDMS盘219的六边形微流控芯片218。微流控芯片218和PDMS盘之间的重叠产生(originate)通道210，在此特异性实施例中，8个通道被产生。至少DEP单元240定位在所述微流控芯片218上的所述通道210内部的壁上，至少免疫亲和捕获区250定位在PDMS盘上，因此导致在通道210内部，在相对于所述DEP单元240位于其中的壁的微流控芯片218的相对壁上。微流控装置还包括电耦合到DEP单元240的电压源260。
通道210包括用于流体通过通道210的通道流动路径的通道第一端212(即，通道入口)和通道第二端214(即，通道出口)。在此实施例中，通道出口214连接至出口单元215。
在此实施例中，作为本发明的示例而非限制性的，优选地以PDMS制成的垫圈251位于所述微流控芯片218上方。在所述垫圈251的顶部上设有按压件252。在所述垫圈251上和在所述按压件252上存在连接通道253，通过通道253将作为示例的把通道210连接到外部环境或出口单元215的毛细管255插入。在此实施例中，垫圈允许芯片密封的完美密封。按压件252施加轻微的力，旨在维持芯片的闭合，并且包括用于样品的装载的包括漏斗254的区域。
在此实施例中，螺丝固定桥270、271安装在所述按压件252的顶部，以将夹层结构正确固定到位。
该设备应在拉动和推动模式下工作。然而，拉动模式是优选的，减少分层。
在实施例中，微流控装置是具有并行通道的多路复用装置。
在此实施例中，微流控装置包括通过入口馈送的通道，其中所述通道分成多个通道，例如它被分成两个、或三个、或四个、或五个、或六个并行通道。至少第一DEP单元沿着所述并行通道中的每一个的顶板延伸，所述并行通道中的所述DEP单元中的每一个被彼此独立地控制。免疫亲和捕获区沿着所述并行通道中的每一个的底板延伸。所述并行通道中的每一个包括通道第二端。
实施例在图9中被示意性地表示：微流控装置800包括通道810，该通道810通过入口812馈送，分成三个通道821、822、823。包括三个电极841、842、843的DEP单元沿着所述并行通道中的每一个的顶板延伸。免疫亲和捕获区851、852、853沿着所述并行通道中的每一个的底板延伸。所述并行通道中的每一个包括通道第二端814。
所述电极841、842和843在它们之间生成长的均匀电场。
在此实施例中，作为示例，不同起源的EV在免疫亲和捕获区851、852、853的每一个中使用不同的抗体在每个流动路径中被特异性地捕获，其中每个流控路径通向分开的出口814以用于EV亚群的特异性回收。
在实施例中，微流控装置是具有顺序DEP电极阵列和免疫亲和捕获区的多路复用装置900。
在此实施例中，单个通道包括沿流体方向的更多部分。在所述部分的每一个中至少包括沿着顶板的DEP单元和沿着底板的免疫亲和捕获区。所述DEP单元中的每一个是彼此独立控制的。通道被划分成的部分中的每一个具有用于EV亚群的特异性回收的阀。
参考图10所示的实施例，通过入口112馈送的通道910包括三个部分。包括三个电极941、942、943的DEP单元沿着所述部分中的每一个的顶板延伸。免疫亲和捕获区951、952、953沿着所述部分中的每一个延伸。
在此实施例中，作为示例，不同起源的EV在免疫亲和捕获区951、952、953的每一个中使用不同的抗体在每个流动路径中被特异性地捕获，其中每个流控路径通向不同的阀990以用于EV亚群的特异性回收。
试剂5从入口112、812、912流入通道110、810、910中，然后通过出口114、814、914离开。在流体进入所述通道的时间之间，流体在垂直于通量的方向上经受DEP。因此，包含在所述流体中的颗粒被促使朝向免疫亲和捕获区并且被识别的颗粒与该免疫亲和捕获区结合。
开始时，系统充满液体(主要是钝化液体，诸如包含牛血清白蛋白的生理缓冲液(buffer))，直到其在加载区域中被找到为止。然后流体样品被添加。
优选地，其中待分离的颗粒被悬浮的流体样品是包括20-200mM NaCl、0.1-10mMKCl、0.1-10mM Na2HPO4和0.1-6mM KH2PO4、Hepes 10-500mM和蔗糖50-450mM的水性组合物。在实施例中，所述缓冲液还包含葡萄糖(0-100mM)、MgCl2 0-20mM、NaCl 0-200mM、KCl0-40mM、BSA 0-5％(p/V)
所述缓冲液已被证明允许对微流控通量内的微泡的正确处理，以便施加特异性的DEP力并有利于颗粒到捕获区的偏转。
在实施例中，所述DEP被施加有包括在0.1-5MHz(优选工作范围)之间、优选地1与4.5之间，或1.5与4MHz之的频率(W)下的包括在0.1-6.0V(优选工作范围)之间、优选地1与5V之间、还更优选地1.5与4.5V之间的电流强度(I)。
流体优选地以从0、1至5μl/min(优选工作范围)、或1与4之间、或2与4μl/min之间的流速流动。
在优选的实施例中，其中所述颗粒是EV，具有3至10V之间的峰间电压的0.1MHz至20MHz范围内的负DEP将EV推向抗体包被的表面。EV被迫与表面相互作用，减慢速度并在抗体上“滚动”，如果抗体结合发生，则粘附到表面。方法通常包括使流体流过至少一个通道，该流体是包括小颗粒的水性介质。方法还包括使流体经受电场梯度。所述电场由固定至通道壁的至少一个DEP单元生成，以向所述小颗粒施加负介电泳力，其中所述力将小颗粒推向所述通道的相对壁。所述通道的相对壁是免疫亲和捕获区。
图3描述了运行中的微流控芯片。在面板A中，流体样品(白色箭头)被上传到芯片中并填充通道310。DEP 340被打开(面板B中的黑色箭头)，并且颗粒被迫相对于免疫亲和捕获区350移动。最后面板C，DEP关闭，并且特异性地结合到免疫亲和捕获区的颗粒仍然被捕捉，其中流体样品继续从通道的入口流到出口。
优选地，所述小颗粒是囊泡。囊泡通常包含由脂质包膜定义的任何细胞衍生的颗粒或非细胞衍生的颗粒。囊泡可以在其包膜或内部包含任何合适的组分(component)。合适的组分可包括化合物、聚合物、复合物、混合物、聚集体(aggregate)和/或颗粒等。示例性组分可包括蛋白质、肽、小化合物、候选药物、受体、核酸、配体和/或类似物。优选地，所述小颗粒是EV。
在EV的混合群体中，所有EV被迫接触所述相对表面，滚动、跳跃、滑动，但只有感兴趣的EV，即在所述免疫亲和捕获区上识别所述抗体的EV，经历与抗体的特异性结合。
所述免疫亲和捕获区上的抗体有利地是针对主要在感兴趣的细胞或组织中表达的所选蛋白质的特异性抗体。此细胞特异性一方面可以使得细胞特异性的EV被分离，并且另一方面可以使得输送细胞特异性的元素以供分析。
在进一步的实施例中，在所述免疫亲和捕获区上亲和素和生物素缀合物复合物被点样。
然后DEP单元被关闭，并且冲洗溶液在通道内流通。非特异性结合的EV被冲出通道，并且特异性结合的EV保留在抗体包被的表面上。
有利地，这里描述的系统的几何形状允许长时间施加温和的电泳场，其中DEP单元的电极沿着整个通道的顶板分布。在优选实施例中，根据本发明的方法用于分开中/大EV的颗粒。颗粒的大小确定了其电荷电势，与移动颗粒所需的DEP直接相关。
这里提供的系统的几何结构将流体中的颗粒长时间暴露于电场，即，在颗粒从入口移动到出口所需的时间内，颗粒本身被推动并减慢以使其与捕获区接触。
施加在颗粒上的电场足以迫使颗粒本身朝向免疫亲和捕获区移动，而不影响其性质。在更短时间的施加的更强电场将让所述粒子爆炸。
方法：
细胞培养和体外刺激
N9：将小鼠小胶质细胞以20,000个细胞/cm2的密度接种在聚-L-赖氨酸(0.1mg/ml的DW)预包被的平板上并培养过夜。
原代大鼠小胶质细胞：从17-18DIV的P2新生Sprague-Dawley大鼠(Envigo srl)获得了细胞。简言之，500,000个细胞/w被接种在预包被的6孔板(50,000个细胞/cm2)聚-L-赖氨酸(0.1mg/ml的DW)中并培养过夜。
对小胶质细胞的挑战
24小时的培养后，细胞被用Krebs-Ringer Hepes(KRH)溶液(125mM NaCl、5mMKCl、1.2mM KH2PO4、2mM CaCl2、1.2mM MgSO4、25mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)和6mM葡萄糖)轻轻洗涤，并在KRH溶液(60μl/cm2)中用2mM ATP(Sigma-Aldrich)促进MV分泌30分钟
30分钟后，KRH被收集在适当的管中并在4℃下经受差速离心,用于界定粒团(pellet)，该粒团包含要被插入微流控设备中以供分离的EV。
如数据表所示，人真皮微血管内皮细胞[HMVEC，Lonza，#LOCC-2543；批号0000440546]被接种并在EGM-2M内皮培养基(Lonza)中培养。
对内皮细胞的挑战
为了从HMVEC中分离EV，细胞与TNF-α10ng/ml一起孵育18小时，然后从细胞上清液中收集EV。
EV分离
此协定允许以非特异性方式分离在分析中的流体生物样品的上清液中存在的所有EV。
经处理的KRH被收集，并在室温下以300×g被预清除细胞和碎片15分钟。清液被收集并转移到另一个管中。
为了更好地从碎片和膜残留物中纯化样品，从第一离心机获得的上清液经过另一个离心步骤：在4℃下，1200g x 15分钟。上清液被收集。
EV然后通过在4℃下以16,000×g的30分钟的离心步骤从上清液中粒化。
囊泡EV旋转下降后，收集的EV悬浮在50％MicroCATCH缓冲液(25mM MgCl2、5mM葡萄糖、250mM HEPES、12mM KCl)、25％水和25％BSA中，在4％下。
这样获得的悬浮液是上传到根据本发明的芯片中以分离EV的特异性亚组的流体样品。
EV膜染色
分离的EV被用FITC-CFSE染色(Life Technologies)或Yellow CellTrace CFSE(Life Technologies)来染色以允许对样品中的所有EV的检测。探针被选择是因为它们能够穿过质膜并共价结合细胞或囊泡表面上和内部的非特异性(aspecifically)游离胺。
根据文献，样品悬浮在最终体积为500μL的PBS中的CSFE中，不含MV(20μL VCT 50μM+480μL PBS-最终CSFE浓度：2μM)，在37℃下避光孵育45分钟，每10分钟轻轻混合一次。
通过向EV样品添加少量PBS或KRH缓冲液(即500-700μl)，未结合的染料通过洗涤去除。染色的EV在4℃下16,000g x 30分钟分离。
示例1：组装根据本发明实施例的设备
参考图2，包括用于DEP和SU-8通道的电极阵列的六边形微流控芯片被放置在3D打印设备中。通道朝下。芯片是用金属电极图案化的玻璃芯片(Ti：5nm，Pd：100nm)。
组装后，PDMS圆盘(约1mm厚)被放置在芯片上以封闭通道。此PDMS圆盘是用抗体功能化的。
垫圈和按压件以及具有弹性按压件的桥被用于毛细管与芯片的对齐以及无泄漏连接。
使用倒置显微镜(图2B中的290)，允许从底部观察芯片内部的样品。
在本实施例中，芯片工作在拉动模式，因此减少了PDMS从芯片上剥离的机会。
示例2：抗体包被和BSA钝化
将示例1中描述的PDMS盘与抗体溶液一起在37℃下孵育至少1小时。
PDMS板用于保护区域免受抗体溶液的影响。用水冲洗后，保护性PDMS被移除了，并且盘被用水冲洗第二次并在氮气流下干燥。
未包被区域被用4％BSA溶液对钝化以用于芯片的初始填充。
如图4中所示，若干实验环节的示例，在抗体(区域A)上观察到了有效的EV捕获，而在BSA(区域B)上几乎没有任何捕获。在这里呈现的实验中，DEP参数如下：2MHz方形，4.5V。
流体流为0.025μl/min
例如，方便使用的抗体混合物如下：
用于小胶质细胞EV捕获的抗体：
-抗CD11b细胞外抗体(Life Technologies)；
-抗TMEM119细胞外抗体(Abcam)；
-抗-Iba1细胞外抗体(Life Technologies)。
用于内皮细胞EV捕获的抗体：
-抗CD144细胞外抗体(Life Technologies)；
-抗CD62E细胞外抗体(Life Technologies)；
-抗CD31细胞外抗体(Life Technologies)；
-抗CD106细胞外抗体(Life Technologies)。
混合物的最终浓度为15μg/ml。
示例3：DEP效果评估
将如段落EV分离中详述的所获得的包括N9微泡的流体样品，上传至示例1中示例的芯片中。
在第一步中，DEP关闭并且微泡流入通道高度的中心，而没有在抗体包被的表面上被捕获(图5A)。
在第二步中，DEP开启并且微泡在用TMEM119抗体包被的免疫亲和捕获区上被捕获(图5B)。
这指示需要DEP来使微泡与表面接触。
工作设置：2MHZ方形，5.5V，流量0.01μl/min，MicroCATCH缓冲液。
示例4：细胞特异性EV分离
制备了具有两个不同免疫亲和捕获区的芯片。第一区不含任何抗体，第二区包括CD144抗体。包括N9微泡的流体样品被上传到微流控芯片中。
工作设置如下：2MHz方形，5.5V，流量0.01μl/min，MicroCATCH缓冲液。N9囊泡不粘附于CD144(图6)。实验运行了半个多小时。一些粘附事件(少于10个)被观察到。反之亦然，MV在免疫亲和捕获区与N9特异性Ab混合物特异性结合(图6B)。
示例5：细胞特异性EV分离
制备了根据本发明的包括三个不同的免疫亲和捕获区的芯片。在第一区上(图7A)，没有抗体存在。在第二区中(图7B)，有TMEM119 Ab，在第三区中(图7C)，有CD144。芯片已被上传有包含内皮囊泡和小胶质细胞囊泡的流体样品。
图7是显示在TMEM119阳性捕获区中DEP之后分离的小胶质细胞MV(1型)的代表性图片(图7B)。当DEP被施加到用内皮标记CD44包被的捕获区域中的相同流体样品时(图7C)，无小胶质细胞囊泡被捕获。在此相同区域，观察不同的荧光通道，已在上面指示的染色的内皮囊泡被CD144抗体捕获(数据未显示)
示例6：关于分离的细胞特异性MV的分子分析
根据示例5分离的MV被处理用于随后的生物化学和分子分析。图8报告了从小胶质细胞MV中提取的miRNA的峰值。

Claims (11)

1.一种用于标识和/或分离小颗粒的微流控芯片(100、200、800、900)，包括至少第一微流控通道(110、210)、至少第一介电泳产生电场生成单元(DEP单元，140、240)、至少一个免疫亲和捕获区(150、250)和电耦合至所述DEP单元(140、240)的电压源(160、260)，其中所述第一通道(110、210)包括用于流体通过所述通道(110、210)的通道流动路径的通道第一端(112、212)和通道第二端(114、214)，垂直于所述流动(116)在所述微流控通道(110、210)中定义了两个部分：上部(170)和下部(171)，其中所述通道(110)的内表面被定为所述上部(170)中的顶板(162)和所述下部(171)中的底板(163)，其中所述免疫亲和捕获区(150、250)沿着所述通道(110)内部的所述底板(163)延伸，
其特征在于
所述至少第一DEP单元(140、240)沿着所述通道(110)内部的所述顶板(162)延伸所述通道本身的几乎所有长度，电极沿着所述流动(116)取向。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其中所述至少一个DEP单元(140、240)在垂直于所述通道(110、210)中的所述流体流动的方向上针对所述通道的几乎所有长度生成非均匀电场。
3.如权利要求1或2所述的微流控芯片，包括基板20，在于包括彼此相关联的一个或多个基板，以在其间定义流体通道。
4.如权利要求1至3中任一项所述的微流控芯片，包括位于所述微流控芯片(218)上方的垫圈(251)和位于所述垫圈的顶部的按压件(252)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的微流控芯片，其中具有第一端(812)的所述微流控通道(810)分成多个通道(811、812、813)，所述多个通道中的每一个通道(821、822、823)包括一个或多个独立的DEP单元和至少一个免疫亲和捕获区(851、852、853)，所述免疫亲和捕获区在相对于所述DEP单元位于其中的壁的相对壁上，所述多个通道中的每一个通道(821、822、823)包括通道第二端(814)。
6.如权利要求1至4中任一项所述的微流控芯片，其中所述微流控装置是具有沿着单个通道(910)线性排列的顺序的DEP单元和免疫亲和捕获区(951、952、953)以及在所述捕获区中的每一个捕获区(951、952、953)的出口处的阀(990)的多路复用装置，所述通道(910)包括第一端(912)和第二端(914)。
7.一种用于从流体样品中标识和/或分离小颗粒的方法，包括使用如权利要求1所述的微流控芯片。
8.如权利要求7所述的方法，包括：
-将流体样品注入到入口单元中；
-利用介电泳产生电极生成垂直于主通道的方向的使所述样品中的颗粒经受介电泳朝向免疫亲和捕获区移动的非均匀电场；
-让目标颗粒特异性结合在所述免疫亲和捕获区上。
9.如权利要求7或8所述的方法，包括将所述流体样品注入到入口单元中，其中所述流体是包括20-200mM NaCl、0.1-10mM KCl、0.1-10mM Na2HPO4和0.1-6mM KH2PO4、Hepes 10-500mM、蔗糖50-450mM、葡萄糖0.1-100mM、MgCl2 0.1-20mM、NaCl 0-200mM、KCl 0.1-40mM、BSA 0.1-5％(p/V)的水性组合物。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中DEP被施加有包括在0.1-5MHz之间、优选地在1与4.5之间、或在1.5与4MHz之间的频率(W)下的包括在0.1-6.0V之间、优选地在1与5V之间、还更优选地在1.5与4.5V之间的电流强度(I)。
11.如权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述流体以从0、1至5μl/min的流速流动。
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