CN117126898A - 一种通过生物技术制备缬氨酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种通过生物技术制备缬氨酸的工艺，包括如下步骤：利用黄色短杆菌VG2023D‑20进行生物发酵，然后分离纯化获得缬氨酸。本发明发酵效率高，并且采用有机微滤膜除去菌体及其它大分子物质，超滤膜和活性炭结合脱色，具有柔韧性好、分离选择性较高、成本较低等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过生物技术制备缬氨酸的工艺。
背景技术
L-缬氨酸（L-val），学名2-氨基-3-甲基丁酸，是人体八大必需氨基酸之一，与L-亮氨酸、L-异亮氨酸统称为支链氨基酸，在医药、调味品、营养添加剂、饲料添加剂等方面有着广泛的应用。特别是在医药领域，缬氨酸可用于与其他必需氨基酸配制成复合氨基酸注射液，尤其是高支链氨基酸注射液及口服液，不仅可以提高人体免疫力，还能促进病人康复及手术后复原。此外，其还应用于血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，肿瘤患者的营养支持治疗等。
缬氨酸生产方法主要有化学合成法、提取法和发酵法。提取法和化学合成法由于存在原料来源受限制、生产成本高、污染环境等缺陷而难以实现工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。目前来看，L-缬氨酸主要利用菌株进行微生物发酵生产，是非常经济的一种生产方法。因此，利用微生物发酵法生产缬氨酸具有重要意义。
CN103215322A公开了一种提高L-缬氨酸产率的发酵方法，将缬氨酸生产菌接种至含有甜菜碱的发酵培养基中进行发酵，得到L-缬氨酸，甜菜碱可作为缬氨酸生产菌的甲基供体，用于调节细胞内的渗透压、促进脂肪代谢及蛋白质合成等，此外还能够刺激菌体生长、促进产酸。
CN1844356A公开了一种黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产L-缬氨酸的工艺，其以黄色短杆菌CICC10135为出发菌种，选育具有遗传标记(Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)的突变株TV230，使其具有L-缬氨酸的生物合成能力。
“食品与发酵工业2001年，张伟国等人”以L-缬氨酸产生菌黄色短杆菌XQ-2为出发菌株，经诱变处理及定向筛选，获得一株L-缬氨酸高产菌黄色短杆菌XQ-8，其摇瓶发酵72h后，提高了L-缬氨酸产量。
CN101962664A公开了一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺，其以营养缺陷型和缬氨酸渗漏型菌株为生产菌株，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平，通过流加液氨控制pH，并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平，发酵60h后L-缬氨酸的产量和转化率大幅度提高。
CN113913478A公开了一种发酵黄色短杆菌产L-缬氨酸的方法。本发明将gapA和ilvBNC基因通过表达载体导入黄色短杆菌中，筛选获得高产L-缬氨酸菌株的黄色短杆菌工程菌。
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)作为食品安全级的微生物，具有易培养、不产孢子等优点，因此是一类重要的工业生产菌株，可用于生产包括L-缬氨酸在内的多种氨基酸。黄色短杆菌是一种无芽孢的、细胞为短小棒状呈八字排列的革兰氏阳性细菌，属于放线菌目棒状杆菌属。黄色短杆菌中L-缬氨酸的生物合成路径已经明确。葡萄糖经过糖酵解途径生成L-缬氨酸合成的重要前体丙酮酸，丙酮酸再通过4步反应即可合成L-缬氨酸。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种产缬氨酸的高性能菌株，以及利用该菌株通过生物发酵技术制备缬氨酸的工艺。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
生物材料的保藏：黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20，其于2023年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.27546。
一种通过生物技术制备缬氨酸的工艺，其包括如下步骤：利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20进行生物发酵，然后分离纯化获得缬氨酸；所述黄色短杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.27546。
优选地，所述生物发酵包括：将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20种子液按照5%的接种量接入到发酵培养基中进行发酵60h，得到缬氨酸发酵液；发酵条件为：pH6.5，罐压0.03Mpa，风量0.5m3/h，转速200rpm，溶氧20％，温度为34℃；发酵过程中，通过流加氨水维持pH在6.5±0.1，通过流加500g/L的葡萄糖溶液控制还原糖浓度不低于5g/L。
优选地，所述分离纯化包括：缬氨酸发酵液经0.1μm孔径的有机微滤膜过滤，除去菌体蛋白及其它大分子物质，收集滤过液，再进行超滤膜过滤，截留分子量400Da，超滤温度为33℃，收集超滤液；往超滤液中添加活性炭，控制活性炭的添加量为0.5%（质量百分比，即每100g溶液含有0.5g活性炭），脱色温度为60℃，脱色时间为90min，板框过滤，收集脱色液；将脱色液进行减压蒸发至有少量晶体析出，然后进入结晶罐，调整pH为6.0，低速搅拌结晶24h，过滤，收集晶体，洗涤，烘干，即得缬氨酸产品。
优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖100g/L，玉米浆20g/L，尿素10g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，生物素0.1mg/L，溶剂为水，pH为6.5±0.1。
本发明的菌株的有益效果主要包括以下几个方面：
本发明通过化学诱变联合紫外诱变筛选出一株高产缬氨酸的突变菌株黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20，最适发酵温度为33-36℃，最适发酵温度范围较出发菌株更宽，而且耐高温，有利于应对发酵后期局部温度过高导致的产酸效率下降。最适温度条件下，同等发酵温度相比较，以33℃为例，VG2023D-20较出发菌株的发酵产酸量提高了22.5%，以34℃为例，VG2023D-20较出发菌株的发酵产酸量提高了23.4%。出发菌株在发酵50h后产缬氨酸产量没有明显提升，而VG2023D-20菌株可以在60h内持续高效率发酵产酸。与出发菌株相比，VG2023D-20菌株的发酵周期更长，提高了10h以上，具有更高的实用价值。发酵后期，会产生大量的酸性副产物，造成局部pH过低，损害菌株的活力，pH在3-7之间VG2023D-20菌株均能够保持较高的活力，而出发菌株的pH范围为5-7之间，说明VG2023D-20更能耐受高pH环境。本发明采用有机微滤膜除去菌体及其它大分子物质，超滤膜和活性炭结合脱色，具有柔韧性好、分离选择性较高、易成型、成本较低等优点。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20，其于2023年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.27546。
出发菌株采集于公司缬氨酸生产车间的发酵废弃菌体，挑取一环接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中，35℃摇床培养24小时，离心收集菌体，用pH7.0磷酸缓冲液悬浮菌体得到浓度为1亿cfu/ml菌液；将菌液和浓度200μg/mL的亚硝基胍溶液按照1:2的体积比混匀，置于培养皿中，采用20W的紫外灯照射，波长254nm；灯与培养皿距离为20cm，照射时间为1min，间隔30min后，再照射1min，共重复照射三次，最终筛选出一株高产缬氨酸的突变菌株黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20。
理化性质：在营养培养基上，培养40小时后，菌落为圆形，边缘整齐，中间有明显突起，半透明有光泽，淡黄色，产缬氨酸，16s DNA检测鉴定该菌株属于黄色短杆菌。出发菌株最适发酵温度为33-34℃，VG2023D-20菌株的最适发酵温度为33-36℃，最适发酵温度范围更宽，而且耐高温，有利于应对发酵后期局部温度过高导致的产酸效率下降；VG2023D-20菌株的生长速度较出发菌株提高了20%以上，突变菌株的生长能力明显提高；pH在3-7之间均能够保持较高的活力；而出发菌株的pH范围为5-7之间，说明VG2023D-20更能耐受高pH环境。
实施例2
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20发酵性能测试。
种子液制备：取菌体划线接入到斜面培养基，33℃恒温培养24h；然后取一个斜面种子，接入到装有100mL的种子培养基的500mL三角瓶中，100rpm摇床，33℃恒温培养24h得到种子液；
发酵罐发酵：接种量为5％，发酵条件：pH6.5，罐压0.03mpa，风量0.5m3/h，转速200rpm，溶氧20％；发酵过程中，通过流加氨水维持pH在6.5±0.1，通过流加500g/L的葡萄糖溶液控制还原糖浓度不低于5g/L；发酵时间为48h。
斜面培养基：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO4 10g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，蛋白胨5g/L，琼脂粉10g/L，溶剂为水，pH为6.5±0.1。
种子培养基：葡萄糖60g/L，酵母浸膏5g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB11mg/L，溶剂为水，pH为6.5±0.1。
发酵培养基：葡萄糖100g/L，玉米浆20g/L，尿素10g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，生物素0.1mg/L，溶剂为水，pH为6.5±0.1。
出发菌株采用上述相同的工艺进行种子液制备和发酵。在不同温度条件下，检测发酵液中缬氨酸产量（单位g/L）见表1：
表1
如上表1所示，出发菌株最适发酵温度为33-34℃，VG2023D-20的最适发酵温度为33-36℃，最适发酵温度范围更宽，有利于应对发酵后期局部温度过高导致的产酸效率下降，如上表1所示，诱变菌株和出发菌株均在34℃温度下的发酵产量最高，温度升高到36℃时，出发菌株由47.9g/L下降到42.2g/L，下降了13.5%；诱变菌株VG2023D-20由59.1g/L下降到57.7g/L，仅仅下降了2.4%。VG2023D-20最适温度的范围内，同等发酵温度相比较，以33℃为例，VG2023D-20较出发菌株的发酵产酸量提高了22.5%，以34℃为例，VG2023D-20较出发菌株的发酵产酸量提高了23.4%。
实施例3
发酵周期比较：发酵周期是决定发酵产量的重要因素，我们比较了VG2023D-20和出发菌株的发酵周期。种子液的制备参照实施例2。
发酵工艺为：接种量为5％，发酵条件：pH6.5，罐压0.03mpa，风量0.5m3/h，转速200rpm，溶氧20％，温度为34℃；发酵过程中，通过流加氨水维持pH在6.5±0.1，通过流加500g/L的葡萄糖溶液控制还原糖浓度不低于5g/L；
发酵培养基：葡萄糖100g/L，玉米浆20g/L，尿素10g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，生物素0.1mg/L，溶剂为水，pH为6.5±0.1。
分别在30,40,50,60,70（时间单位为h），五个时间点检测发酵液中缬氨酸产量（g/L）。具体结果见表2。
表2
结论：如上表2所示，出发菌株在发酵50h后产缬氨酸产量没有明显提升，而VG2023D-20菌株可以在60h内持续高效率发酵产酸。与出发菌株相比，VG2023D-20菌株的发酵周期更长，提高了10h以上，具有更高的实用价值。
实施例4
分离提取制备缬氨酸。
综合上述发酵工艺，考虑产量和成本之间的平衡，选择发酵周期为60h。
发酵工艺同实施例3。缬氨酸的分离纯化工艺如下：
缬氨酸发酵液经0.1μm孔径的有机微滤膜过滤，除去菌体蛋白及其它大分子物质，收集滤过液，再进行超滤膜过滤，截留分子量400Da，超滤温度为33℃，收集超滤液；往超滤液中添加活性炭，控制活性炭的添加量为0.5%（质量分数），脱色温度为60℃，脱色时间为90min，板框过滤，收集脱色液；将脱色液进行减压蒸发至有少量晶体析出，然后进入结晶罐，调整pH为6.0，低速搅拌结晶24h，过滤，收集晶体，洗涤，烘干，即得缬氨酸产品。本发明缬氨酸提取收率在76%左右，经HPLC检测纯度达到93%以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种通过生物技术制备缬氨酸的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20进行生物发酵，然后分离纯化获得缬氨酸；所述黄色短杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27546。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述生物发酵包括：将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) VG2023D-20种子液按照5%的接种量接入到发酵培养基中发酵60h，得到缬氨酸发酵液；发酵条件为：pH6.5，罐压0.03Mpa，风量0.5m3/h，转速200rpm，溶氧20％，温度为34℃；发酵过程中，通过流加氨水维持pH在6.5±0.1，通过流加500g/L的葡萄糖溶液控制还原糖浓度不低于5g/L。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述分离纯化包括：缬氨酸发酵液经0.1μm孔径的有机微滤膜过滤，除去菌体蛋白及其它大分子物质，收集滤过液，再进行超滤膜过滤，截留分子量400Da，超滤温度为33℃，收集超滤液；往超滤液中添加活性炭，脱色温度为60℃，脱色时间为90min，板框过滤去除活性炭，收集脱色液；将脱色液进行减压蒸发至有少量晶体析出，然后进入结晶罐，调整pH为6.0，低速搅拌结晶24h，过滤，收集晶体，洗涤，烘干，即得缬氨酸产品。
4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖100g/L，玉米浆20g/L，尿素10g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，生物素0.1mg/L，溶剂为水，pH为6.5±0.1。
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