CN117126837B

CN117126837B - 艾蒿醇合成酶及其应用

Info

Publication number: CN117126837B
Application number: CN202311101252.9A
Authority: CN
Inventors: 叶紫玲
Original assignee: Wuhan Hesheng Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Hesheng Technology Co ltd
Priority date: 2023-08-30
Filing date: 2023-08-30
Publication date: 2025-07-11
Anticipated expiration: 2043-08-30
Also published as: CN117126837A; WO2025043776A1

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及艾蒿醇合成酶及其应用。根据来源于植物的艾蒿醇合成酶的氨基酸序列，设计出编码核酸分子，进而制备用于表达新型酶的重组质粒载体和表达系统，可以应用于不同的柑橘类香料的合成，克服植物提取精油的费时费力，并能用于制备多种抗菌、杀虫或除草产品。

Description

艾蒿醇合成酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及艾蒿醇合成酶及其应用。

背景技术

艾蒿是中国传统的民生植物，其提取物以及燃烧产物常用于驱蚊，已有的研究表明艾蒿中富含挥发性萜类化合物，而萜类化合物也因为显著的药理活性备受关注，现有研究对艾蒿的萜类基因的系统表征较少。

艾蒿醇是一种倍半萜类化合物，在多种植物精油(例如，葡萄籽精油、柑橘精油等)中均有报道，具有特殊气味，能够用于食品或日化品中。但植物精油从种植到提炼的整个过程十分复杂，且耗时耗力，需要耗费大量的植物果皮，所以其提取成本相当高，价值也相当昂贵。并且，天然植物提取物中艾蒿醇含量很低，采用天然产物的分离方式很难分离到含有高浓度艾蒿醇的植物精油，因此，寻找更经济的方式来获取高艾蒿醇浓度的具特殊气味精油类物质是实现经济高效、可持续发展的一种必然趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种艾蒿醇合成酶，以及利用该酶在表达系统中制备以艾蒿醇为主要成分的具有特殊香味组合物中的应用，从而实现高效、持续生产的目的。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种艾蒿醇合成酶，所述艾蒿醇合成酶包括(a)来源于植物或真菌的完整蛋白或功能性蛋白片段；或者(b)与(a)具有至少80％以上氨基酸序列同源性的衍生艾蒿醇合成酶。

在可选实施方式中，所述植物选自菊科(Asteraceae)植物。

在可选实施方式中，所述植物选自蒿属(Artemisia)植物。

在可选实施方式中，所述所述植物包括艾蒿(Artemisia argyi)。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇合成酶在表达系统中催化艾蒿醇的合成。

在可选实施方式中，所述表达系统包括真菌表达系统。

在可选实施方式中，所述真菌表达系统包括酵母表达系统。

在可选实施方式中，所述酵母表达系统包括酿酒酵母表达系统。

在可选实施方式中，所述酿酒酵母为重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母含有法尼烯焦磷酸合酶基因。

在可选实施方式中，所述重组酿酒酵母基因组中法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为1～3，进一步为2。

在可选实施方式中，所述重组酿酒酵母基因组中至少一种甲羟戊酸途径相关基因的在1以上。

在可选实施方式中，ERG10基因、ERG13基因、tHMG1基因、ERG12基因、ERG8基因、MVD1基因或IDI1基因中的至少一个基因的拷贝数为1～3，优选为2或3。

在可选实施方式中，所述酿酒酵母基因组中敲除了抑制因子GAL80基因和/或ERG9启动子上游-175～-220范围内的激活顺式元件或其片段。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇合成酶的氨基酸序列包括(a)或(b)：

(a)SEQ ID NO:1；

(b)与(a)具有至少80％、81％、83％、85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％、以上氨基酸序列同一性的衍生艾蒿醇合成酶。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码前述实施方式任一项所述艾蒿醇合成酶的核苷酸序列或与其碱基互补的核苷酸序列。

在可选实施方式中，所述核酸分子包含与SEQ ID No:3所示核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第三方面，本发明提供含有前述实施方式任一项所述核酸分子的重组表达载体，所述重组表达载体的原始载体包括pZY900、pYR017、pYR018或pKlURA100。

第四方面，本发明提供含有前述实施方式任一项所述核酸分子，或者，含有前述实施方式所述重组表达载体的转化体，所述转化体的宿主细胞选自真菌表达系统，优选为酵母表达系统，更优选为酿酒酵母表达系统。

第五方面，本发明提供一种重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母含有前述实施方式任一项所述的核酸分子，或者含有前述实施方式所述的重组表达载体，所述重组酿酒酵母还含有法尼烯焦磷酸合酶基因。

第六方面，本发明提供前述实施方式任一项所述重组酿酒酵母的制备方法，所述制备方法包括步骤：

(a)将前述实施方式任一项所述的核酸分子或者前述实施方式所述的重组表达载体转化进酿酒酵母细胞中；

(b)通过基因编辑增加酿酒酵母基因组中法尼烯焦磷酸合酶基因和/或甲羟戊酸途径相关基因的拷贝数；

所述步骤(a)和步骤(b)的实施顺序不分先后。

在可选实施方式中，所述法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为1～3，进一步为2。

在可选实施方式中，所述制备方法包括，向酿酒酵母细胞中转化抑制因子GAL80基因敲除表达盒和/或ERG9启动子上游激活顺式元件敲除或部分敲除表达盒。

第七方面，本发明提供一种艾蒿醇的制备方法，所述制备方法包括，发酵培养前述实施方式所述的转化体，或者，发酵培养前述实施方式任一项所述的重组酿酒酵母，或者发酵培养采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的重组酿酒酵母，并从发酵产物中回收艾蒿醇。

在可选实施方式中，所述回收的方法包括使用油相萃取发酵产物。

在可选实施方式中，所述油相包括正己烷、正十二烷和/或肉豆蔻酸异丙酯。

在可选实施方式中，所述回收的方法为，发酵过程中，添加油相，发酵结束后，收集油相，分离获得富集于油相中的艾蒿醇。

在可选实施方式中，所述收集油相的方法包括离心。

在可选实施方式中，所述分离的方法包括精馏。

第八方面，本发明提供采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的艾蒿醇在制备抗菌产品、杀虫产品或除草产品中的应用。

在可选实施方式中，所述抗菌产品能够抑制或杀灭的微生物种类包括真菌。

在可选实施方式中，所述真菌包括丝核菌属、根肿菌属、腐霉属、疫霉属、根霉属、黑腐皮壳属、黑星菌属、链核盘菌属、白粉菌属、梨形孢属、粉孢属、轮枝菌属、葡萄孢属、链格孢属、镰孢属、痂圆孢属、赤霉菌属、炭疽菌属、柄锈菌属中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述丝核菌属真菌包括立枯丝核菌。

在可选实施方式中，所述杀虫产品能够驱除或杀灭的昆虫种类包括蚊科、盲蝽科或飞虱科昆虫。

在可选实施方式中，所述蚊科昆虫包括伊蚊属(Aedes)、疟蚊属(Anopheles)、丛蚊属(Armigeres)、苛蚊属(Coquillettidia)、家蚊属(Culex)、绒蚊属(culiseta)、费蚊属(Ficalbia)、黑蚊属(Heizmznnia)、嗜血蚊属(Hemagogus)、霍蚊属(Hodgesia)、芋蚊属(Malaya)、沼蚊属(Mansonia)、妙蚊属(Minmomyia)、直蚊属(Orthopodomyia)、煞蚊属(Sabethes)、土蚊属(Topomyia)、巨蚊属(Toxorhynchites)、翠蚊属(Tripteroides)、尤蚊属(Udaya)、小蚊属(Uranotaenia)中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述伊蚊属的昆虫包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)。

在可选实施方式中，所述盲蝽科昆虫包括瘦盲蝽属(Genus Acomocera)、苜蓿盲蝽属(Genus Adelphococris)、短角盲蝽属(Genus Agnocoris)、鹿角树盲蝽属(GenusAlcecoris)、点盾盲蝽属(Genus Alloeotomus)、肩盲蝽属(Genus Allorhinocoris)、驼盲蝽属(Genus Angerianus)、拟束盲蝽属(Genus Apilophorus)、异丽盲蝽属(GenusApolygopsis)、后丽盲蝽属(Genus Apolygus)、树丽盲蝽属(Genus Arbolygus)、拟猬盲蝽属(Genus Argenis)、隆树盲蝽属(Genus Astroscopometopus)、隆胸盲蝽属(GenusBertsa)、毛翅盲蝽属(Genus Blepharidopterus)、毛膜盲蝽属(Genus Bothriomiris)、沟盲蝽属(Genus Bothynotus)、短鞘盲蝽属(Genus Brachycoleus)、蕨盲蝽属(GenusBryocoris)、弯脊盲蝽属(Genus Campylotropis)、粗领盲蝽属(Genus Capsodes)、原盲蝽属(Genus Capsus)、木富蝽属(Genus Castanopsides)、纹唇盲蝽属(GenusCharagochilus)、耳盲蝽属(Genus Cheilocapsidea)、乌毛盲蝽属(Genus Cheilocapsus)、光盲蝽属(Genus Chilocrates)、刻领盲蝽属(Genus Chrysorrhanis)、环盲蝽属(GenusCimicicapsus)、棒角盲蝽属(Genus Cimidaeorus)、俊盲蝽属(Genus Closterotomus)、皮盲蝽属(Genus Coridromius)、淡盲蝽属(Genus Creontiades)、塞盲蝽属(GenusCylapofulvuitius)、细爪盲蝽属(Genus Cylapomorpha)、胝突盲蝽属(GenusCyllecoris)、拟草盲蝽属(Genus Cyphodemidea)、弓盲蝽属(Genus Cyrtopeltis)、盔盲蝽属(Genus Cyrtorhinus)、齿爪盲蝽属(Genus Deraeocoris)、间嵴盲蝽属(GenusDichrooscytus)、显胝盲蝽属(Genus Dicyphus)、狄盲蝽属(Genus Dimia)、榕盲蝽属(Genus Dioclerus)、长盲蝽属(Genus Dolichomiris)、多盲蝽属(Genus Dortus)、戟盲蝽属(Genus Dryophilocoris)、跃盲蝽属(Genus Ectmetopterus)、箬盲蝽属(GenusElthemidea)曙丽盲蝽属(Genus Eolygus)、隆颚盲蝽属(Genus Erimiris)、芋盲蝽属(Genus Ernestinus)、真颈盲蝽属(Genus Eupachypeltis)、宽颜盲蝽属(GenusEurvopicoris)、缘顶盲蝽属(Genus Eurystylomorpha)、拟厚盲蝽属(GenusEurystylopsis)、厚盲蝽属(Genus Eurystylus)、粗角盲蝽属(Genus Excentricus)、菲盲蝽属(Genus Felisacus)、亮盲蝽属(Genus Finqulus)、尖头盲蝽属(Genus Fulvius)、球首盲蝽属(Genus Globiceps)、拟肿角盲蝽属(Genus Guisardinus)、肿角盲蝽属(GenusGuisardus)、跳盲蝽属(Genus Halticus)、薯蓣盲蝽属(Genus Harpedona)、亥盲蝽属(Genus Hekista)、角盲蝽属(Genus Helopeltis)、异草盲蝽属(Genus Heterolyqus)、混毛盲蝽属(Genus Heteropantilius)、皱斑盲蝽属(Genus Hyalopeplinus)、透翅盲蝽属(Genus Hyalopeplus)、稀盲蝽属(Genus Hyoidea)、明翅盲蝽属(Genus Isabel)、稀树盲蝽属(Genus Isometopidea)、树盲蝽属(Genus Isometopus)、杰氏盲蝽属(GenusJessopocoris)、藜盲蝽属(Genus Labopidea)、突眼盲蝽属(Genus Labops)、毛盲蝽属(Genus Lasiomiris)、宽平盲蝽属(Genus Latizanchius)、圆额盲蝽属(GenusLeptopterna)、厘盲蝽属(Genus Liistonotus)、遮颜盲蝽属(Genus Loristes)、低角盲蝽属(Genus Lygidea)、拟丽盲蝽属(Genus Lygocorides)、丽盲蝽属(Genus Lygocoris)、草盲蝽属(Genus Lygus)、巨室盲蝽属(Genus Macrolonius)、长颈盲蝽属(GenusMacrolophus)、硕丽盲蝽属(Genus Macrolygus)、柔盲蝽属(Genus Malacocorisella)、曼盲蝽属(Genus Mansoniella)、竹盲蝽属(Genus Mecistoscelis)、昧盲蝽属(GenusMecomma)、沟顶盲蝽属(Genus Megacoelum)、纹翅盲蝽属(Genus Mermitelocerus)、水杉盲蝽属(Genus Metasequoiamiris)、米盲蝽属(Genus Michailocoris)、微盲蝽属(GenusMonalocoris)、侎树盲蝽属(Genus Myiomma)、垂头盲蝽属(Genus Myrmecophyes)、蚁盲蝽属(Genus Myrmecoris)、篁盲蝽属(Genus Mystilus)、新丽盲蝽属(Genus Neolygus)、烟盲蝽属(Genus Nesidiocoris)、蚁盲蝽属(Genus Nicostratus)、伸额盲蝽属(GenusNotostir)、毛盾盲蝽属(Genus Onomaus)、东盲蝽属(Genus Orientomiris)、直头盲蝽属(Genus Orhocephalus)、奥盲蝽属(Genus Orthops)、合垫盲蝽属(Genus Orthotylus)、颈盲蝽属(Genus Pachypeltis)、桂树盲蝽属(Genus Paloniella)、延额盲蝽属(GenusPantilius)、拟壮盲蝽属(Genus Paracyphodema)、棱缘盲蝽属(Genus Paramiridius)、显领盲蝽属(Genus Paranx)、拟颈盲蝽属(Genus Parapachypeltis)、峰盾盲蝽属(GenusPeltidolygus)、佩盲蝽属(Genus Peritropis)、拟植盲蝽属(Genus Phytocoridea)、植盲蝽属(Genus Phytocoris)、松盲蝽属(Genus Pinalitus)、异盲蝽属(Genus Polymerus)、帕盲蝽属(Genus Poppiocapsidea)、喙盲蝽属(Genus Proboscidocoris)、蕉盲蝽属(GenusProdromus)、始丽盲蝽属(Genus Prolygus)、撒盲蝽属(Genus Psallops)、泡盾盲蝽属(Genus Pseudodoniella)、突额盲蝽属(Genus Pseudoloxops)、拉盲蝽属(GenusRaawelellus)、罗盲蝽属(Genus Reuterista)、杆盲蝽属(Genus Rhabdomiris)、无齿细爪盲蝽属(Genus Rhinocylapidius)、鲨盲蝽属(Genus Rhinomiris)、球盾盲蝽属(GenusRhopaliceschatus)、萨盲蝽属(Genus Sabactiopus)、棱额盲蝽属(Genus Salignus)、迈盲蝽属(Genus Scirtetellus)、息奈盲蝽属(Genus Sinevi)、锡兰盲蝽属(GenusSinghalesia)、奇树盲蝽属(Genus Sophianus)、狭盲蝽属(Genus Stenodema)、纤盲蝽属(Genus Stenotus)、军配盲蝽属(Genus Stethoconus)、阔盲蝽属(GenusStrongylocoris)、苏盲蝽属(Genus Sulawesifaulvius)、泰盲蝽属(GenusTailorilygus)、畸角盲蝽属(Genus Teratocoris)、毛眼盲蝽属(Genus Termatophylum)、瘤猬盲蝽属(Genus Tinginotopsis)、猬盲蝽属(Genus Tinginotum)、刻爪盲蝽属(GenusTolongia)、瘦树盲蝽属(Genus Totta)、赤须盲蝽属(Genus Trigonotylus)、图盲蝽属(Genus Tupiocoris)、榆盲蝽属(Genus Ulmica)、黄楔盲蝽属(Genus Ulmocyllus)、平盲蝽属(Genus Zanchius)、凹缘盲蝽属(Genus Zonodoropsis)中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述苜蓿盲蝽属(Genus Adelphococris)的昆虫包括黑盲蝽。

在可选实施方式中，所述飞虱科昆虫包括褐飞虱属(Nilaparvata)、白脊飞虱属(Unkanodes)、拟白脊飞虱属(Neunkanodes)、灰飞虱属(Laodelphax)、黎氏飞虱属(Ribautodelphax)、美伽飞虱属(Megadelphax)、缪氏飞虱属(Muirodelphax)、芳飞虱属(Fangdelphax)、腹突飞虱属(Neoterthrona)、支叉飞虱(Ramidelphax)、淡脊飞虱属(Neuterthron)、奇臀飞虱属(Miranus)、长唇基飞虱属(Sogata)、拟长唇基飞虱属(Parasogata)、棒突飞虱属(Neometopina)、大褐飞虱属(Changeondelphax)、绿飞虱属(Chloriona)、派洛飞虱属(Paradelphacodes)、拟褐飞虱属(Muellerianella)中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述飞虱科昆虫包括褐飞虱(Delphacidae)。

在可选实施方式中，除草产品能够抑制或杀灭的植物种类包括十字花科、菊科、茄科、旋花科、茜草科、景天科、大麻科、蓼科、石竹科、苋科、马齿苋科、毛茛科、蔷薇科、车前科、葡萄科、大戟科、伞形科、唇形科、锦葵科、禾本科、莎草科、灯芯草科、百合科、鸭跖草科、石蒜科、泽泻科中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述十字花科植物包括拟南芥属(Arabidopsis)、葱芥属(Alliaria)、庭荠属(Alyssum)、寒原荠属(Aphragmus)、鼠耳芥属(Arabidopsis)、南芥属(Arabis)、辣根属(Armoracia)、异药芥属(Atelanthera)、山芥属(Barbarea)、团扇荠属(Berteroa)、锥果芥属(Berteroella)、芸苔属(Brassica)、肉叶荠属(Braya)、匙荠属(Bunias)、亚麻荠属(Camelina)、荠属(Capsella)、碎米荠属(Cardamine)、群心菜属(Cardaria)、桂竹香属(Cheiranthus)、离子芥属(Chorispora)、高原芥属(Christolea)、香芥属(Clausia)、岩荠属(Cochlearia)、穴丝荠属(Coelonema)、线果芥属(Conringia)、臭荠属(Coronopus)、两节荠属(Crambe)、隐子芥属(Cryptospora)、播娘蒿属(Descurainia)、双脊荠属(Dilophia)、异蕊芥属(Dimorphostemon)、二行芥属(Diplotaxis)、蛇头荠属(Dipoma)、异果芥属(Diptychocarpus)、花旗杆属(Dontostemon)、葶苈属(Draba)、芝麻菜属(Eruca)、糖芥属(Erysimum)、乌头荠属(Euclidium)、山萮菜属(Eutrema)、四棱荠属(Goldbachia)、藏荠属(Hedinia)、半脊荠属(Hemilophia)、香花芥属(Hesperis)、薄果荠属(Hymenolobus)、屈曲花属(Iberis)、菘蓝属(Isatis)、绵果荠属(Lachnoloma)、独行菜属(Lepidium)、丝叶芥属(Leptaleum)、弯梗芥属(Lignariella)、脱喙荠属(Litwinowia)、香雪球属(Lobularia)、弯蕊芥属(Loxostemon)、长柄芥属(Macropodium)、涩荠属(Malcolmia)、紫罗兰属(Matthiola)、高河菜属(Megacarpaea)、双果荠属(Megadenia)、小蒜芥属(Microsisymbrium)、小柱芥属(Microstigma)、豆瓣菜属(Nasturtium)、堇叶芥属(Neomartinella)、球果荠属(Neslia)、诸葛菜属(Orychophragmus)、厚壁荠属(Pachypterygium)、条果芥属(Parrya)、腋花芥属(Parryodes)、单花荠属(Pegaeophyton)、藏芥属(Phaeonychium)、宽框荠属(Platycraspedum)、燥原荠属(Ptilotricum)、沙芥属(Pugionium)、簇芥属(Pycnoplinthus)、萝卜属(Raphanus)、蔊菜属(Rorippa)、白芥属(Sinapis)、大蒜芥属(Sisymbrium)、芹叶荠属(Smelowskia)、丛菔属(Solms-Laubachia)、羽裂叶荠属(Sophiopsis)、螺喙荠属(Spirorhynchus)、无隔荠属(Staintoniella)、棒果芥属(Sterigmostemum)、曙南芥属(Stevenia)、革叶荠属(Stroganowia)、连蕊芥属(Synstemon)、棱果芥属(Syrenia)、沟子荠属(Taphrospermum)、舟果荠属(Tauscheria)、四齿芥属(Tetracme)、盐芥属(Thellungiella)、菥蓂属(Thlaspi)、念珠芥属(Torularia)、旗杆芥属(Turritis)、阴山荠属(Yinshania)中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述十字花科植物包括拟南芥属、荠属、碎米荠属、独行菜属、诸葛菜属、葶苈属、盐芥属、糖芥属、播娘蒿属、蔊菜属中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述拟南芥属植物包括拟南芥。

第九方面，本发明提供一种抗菌剂，所述抗菌剂包含采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的艾蒿醇。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇的有效剂量为10～100ppm。

在可选实施方式中，所述抗菌剂的剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂、粉剂、预混剂、颗粒剂、可溶性粉、内服溶液剂、凝胶剂或软膏剂。

在可选实施方式中，所述抗菌剂能够抑制或杀灭的微生物种类包括真菌。

在可选实施方式中，所述丝核菌属真菌包括立枯丝核菌。

第十方面，本发明提供一种杀虫剂，所述杀虫剂包含采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的艾蒿醇。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇的有效剂量为500～5000ppm。

在可选实施方式中，所述杀虫剂的剂型包括水乳剂、悬浮剂、干粉剂、可湿性粉剂、乳油剂、热雾剂、气雾剂、可溶粒剂、熏蒸剂、饵剂、颗粒剂或缓释剂。

在可选实施方式中，所述杀虫剂能够驱除或杀灭的昆虫种类包括蚊科、盲蝽科或飞虱科昆虫。

在可选实施方式中，所述飞虱科昆虫包括褐飞虱(Delphacidae)。

第十一方面，本发明提供一种除草剂，所述除草剂包含采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的艾蒿醇。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇的有效剂量为25～200ppm。

在可选实施方式中，所述除草剂的剂型包括水剂、乳油剂、悬浮剂、水乳剂、微乳剂、油悬浮剂、微胶囊悬浮剂、可溶性液剂、展膜油剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、可溶性粒剂、干悬浮剂或水分散粒剂。

在可选实施方式中，所述除草剂能够抑制或杀灭的植物种类包括十字花科、菊科、茄科、旋花科、茜草科、景天科、大麻科、蓼科、石竹科、苋科、马齿苋科、毛茛科、蔷薇科、车前科、葡萄科、大戟科、伞形科、唇形科、锦葵科、禾本科、莎草科、灯芯草科、百合科、鸭跖草科、石蒜科、泽泻科等一种或多种。

在可选实施方式中，所述十字花科植物包括拟南芥属Arabidopsis、葱芥属Alliaria、庭荠属Alyssum、寒原荠属Aphragmus、鼠耳芥属Arabidopsis、南芥属Arabis、辣根属Armoracia、异药芥属Atelanthera、山芥属Barbarea、团扇荠属Berteroa、锥果芥属Berteroella、芸苔属Brassica、肉叶荠属Braya、匙荠属Bunias、亚麻荠属Camelina、荠属Capsella、碎米荠属Cardamine、群心菜属Cardaria、桂竹香属Cheiranthus、离子芥属Chorispora、高原芥属Christolea、香芥属Clausia、岩荠属Cochlearia、穴丝荠属Coelonema、线果芥属Conringia、臭荠属Coronopus、两节荠属Crambe、隐子芥属Cryptospora、播娘蒿属Descurainia、双脊荠属Dilophia、异蕊芥属Dimorphostemon、二行芥属Diplotaxis、蛇头荠属Dipoma、异果芥属Diptychocarpus、花旗杆属Dontostemon、葶苈属Draba、芝麻菜属Eruca、糖芥属Erysimum、乌头荠属Euclidium、山萮菜属Eutrema、四棱荠属Goldbachia、藏荠属Hedinia、半脊荠属Hemilophia、香花芥属Hesperis、薄果荠属Hymenolobus、屈曲花属Iberis、菘蓝属Isatis、绵果荠属Lachnoloma、独行菜属Lepidium、丝叶芥属Leptaleum、弯梗芥属Lignariella、脱喙荠属Litwinowia、香雪球属Lobularia、弯蕊芥属Loxostemon、长柄芥属Macropodium、涩荠属Malcolmia、紫罗兰属Matthiola、高河菜属Megacarpaea、双果荠属Megadenia、小蒜芥属Microsisymbrium、小柱芥属Microstigma、豆瓣菜属Nasturtium、堇叶芥属Neomartinella、球果荠属Neslia、诸葛菜属Orychophragmus、厚壁荠属Pachypterygium、条果芥属Parrya、腋花芥属Parryodes、单花荠属Pegaeophyton、藏芥属Phaeonychium、宽框荠属Platycraspedum、燥原荠属Ptilotricum、沙芥属Pugionium、簇芥属Pycnoplinthus、萝卜属Raphanus、蔊菜属Rorippa、白芥属Sinapis、大蒜芥属Sisymbrium、芹叶荠属Smelowskia、丛菔属Solms-Laubachia、羽裂叶荠属Sophiopsis、螺喙荠属Spirorhynchus、无隔荠属Staintoniella、棒果芥属Sterigmostemum、曙南芥属Stevenia、革叶荠属Stroganowia、连蕊芥属Synstemon、棱果芥属Syrenia、沟子荠属Taphrospermum、舟果荠属Tauscheria、四齿芥属Tetracme、盐芥属Thellungiella、菥蓂属Thlaspi、念珠芥属Torularia、旗杆芥属Turritis、阴山荠属Yinshania等一种或多种。

在可选实施方式中，所述十字花科植物包括拟南芥属、荠属、碎米荠属、独行菜属、诸葛菜属、葶苈属、盐芥属、糖芥属、播娘蒿属、蔊菜属的一种或多种。

在可选实施方式中，所述拟南芥属植物包括拟南芥。

本发明分别从艾蒿和真菌中筛选得到具有艾蒿醇合成活性的合成酶，依据筛选得到的艾蒿醇合成酶的氨基酸序列设计出编码核酸分子，进而制备用于表达艾蒿醇合成酶的重组质粒载体和表达系统，有潜力应用到艾蒿醇的高产合成，弥补植物提取的费时费力，促进抗菌、驱虫和除草产品的工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为质粒p900A19、p905A19和p908A19的构建示意图；

图2为质粒p900-V5-15和p900-VvPNSelnt的构建示意图；

图3为菌株J900A19发酵产物的GC-MS检测结果；

图4为A19产物的¹H NMR谱(600MHz,CDCl₃)；

图5为A19产物的¹³C NMR谱(150MHz,CDCl₃)；

图6为A19产物的COSY和ROESY的拓扑结构图；

图7为A19产物的COSY谱图；

图8为A19产物的ROESY谱图；

图9为A19产物的X-RAY晶体结构图；

图10为(+)-intermedeol对埃及伊蚊的驱避率，横坐标为(+)-intermedeol浓度，纵坐标为驱避率，不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图11为(+)-intermedeol对褐飞虱的驱避效果，横坐标为(+)-intermedeol浓度，纵坐标为褐飞虱选择不同味道源的比例，不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图12横坐标为(+)-intermedeol浓度，纵坐标为中黑盲蝽选择不同味道源的比例，不同字母表示差异显著(P<0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图13为(+)-intermedeol对立枯丝核菌的抑菌效果实验，横坐标为(+)-intermedeol浓度，纵坐标为抑菌圈的直径和抑菌率；

图14为(+)-intermedeol对拟南芥幼苗生长抑制实验，横坐标为(+)-intermedeol浓度，纵坐标为幼苗根的长度。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

(Ⅰ)定义或术语

本发明涉及的相关定义或术语，应用以下缩写。除非另有定义，否则本文所用的全部科技术语都具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下术语在下文提供。

1、艾蒿醇合成酶

本发明所述艾蒿醇合成酶，是指在本发明之前未被成功分离、纯化获得的艾蒿醇合成酶。这是由于艾蒿醇为一种萜类化合物，传统的萜类合成酶通常为天然酶，自然环境下植物细胞中表达的具有萜类合成的酶通常为适应植物细胞表达系统和萜类合成系统的，而本发明提供的艾蒿醇合成酶，是一种能够成功在人工构建的表达系统中表达，并能够合成艾蒿醇的新型酶。

2、同源性

本发明所述“同源性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽或区域之间序列相同性的百分比，例如可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性，目前已有许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法可供本领域技术人员根据实际需求进行常规选择。

3、表达

本发明所述表达是指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。

4、宿主细胞

本发明所述宿主细胞是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。

5、载体

本发明所述载体是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。

(Ⅱ)详细技术方案

在具体的实施方式中，第一方面，本发明提供一种艾蒿醇合成酶，所述艾蒿醇合成酶包括(a)来源于植物或真菌的完整蛋白或功能性蛋白片段；或者(b)与(a)具有至少80％以上氨基酸序列同源性的衍生艾蒿醇合成酶。

由于植物生长周期长、产量难以控制。相较于细菌，真菌的培养难度更大，生长速度更慢，因此，开发植物或真菌来源蛋白的微生物替代生产方法，相较于培养植物和真菌提取对应蛋白的方法具有更大的经济价值和社会意义。

在一些优选的实施方式中，上述衍生过程可以为氨基酸位点采用同类(具有类似的化学性质或者功能)的另一种氨基酸进行取代。作为示例，可根据氨基酸的侧链性质将其分为：(1)非极性氨基酸：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性氨基酸：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，可基于共同的侧链特性将氨基酸分为：(1)疏水氨基酸：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水氨基酸：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性氨基酸：Asp、Glu；(4)碱性氨基酸：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的氨基酸：Gly、Pro；(6)芳香族氨基酸：Trp、Tyr、Phe。在上述同一性质分类中的氨基酸发生彼此之间的保守取代对于多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有或基本上没有影响。

在可选实施方式中，所述植物选自菊科(Asteraceae)植物。

在可选实施方式中，所述植物选自蒿属(Artemisia)植物。

在可选实施方式中，所述所述植物包括艾蒿(Artemisia argyi)。

在可选实施方式中，所述表达系统包括真菌表达系统。

在可选实施方式中，所述真菌表达系统包括酵母表达系统。

本发明通过基因编辑在酿酒酵母中引入艾蒿醇合成基因，对酿酒酵母基因组中与艾蒿醇表达相关代谢通路进行调整，增加重组酿酒酵母中的甲羟戊酸途径涉及相关酶的基因以及法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数，从而显著提高艾蒿醇的产量。

(a)SEQ ID NO:1；

第四方面，本发明提供一种转化体，所述转化体含有前述实施方式任一项所述核酸分子，或者，含有前述实施方式所述重组表达载体的转化体，所述转化体的宿主细胞选自真菌表达系统，优选为酵母表达系统，更优选为酿酒酵母表达系统。

所述步骤(a)和步骤(b)的实施顺序不分先后。

在可选实施方式中，所述收集油相的方法包括离心。

在可选实施方式中，所述分离的方法包括精馏。

在可选实施方式中，所述丝核菌属真菌包括立枯丝核菌。

在可选实施方式中，所述飞虱科昆虫包括褐飞虱(Delphacidae)。

在可选实施方式中，所述拟南芥属植物包括拟南芥。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇的有效剂量为10～100ppm。

在可选实施方式中，所述真菌包括丝核菌属、根肿菌属、腐霉属、疫霉属、根霉属、黑腐皮壳属、黑星菌属、链核盘菌属、白粉菌属、梨形孢属、粉孢属、轮枝菌属、葡萄孢属、链格孢属、镰孢属、痂圆孢属、赤霉菌属、炭疽菌属、柄锈菌属等一种或多种。

在可选实施方式中，所述丝核菌属真菌包括立枯丝核菌。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇的有效剂量为500～5000ppm。

在可选实施方式中，所述飞虱科昆虫包括褐飞虱(Delphacidae)。

在可选实施方式中，所述艾蒿醇的有效剂量为25～200ppm。

在可选实施方式中，所述除草剂的剂型包括水剂、乳油剂、悬浮剂、水乳剂、微乳剂、油悬浮剂、微胶囊悬浮剂、可溶性液剂、展膜油剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、可溶性粒剂、干悬浮剂或水分散粒剂。在可选实施方式中，所述除草剂能够抑制或杀灭的植物种类包括十字花科、菊科、茄科、旋花科、茜草科、景天科、大麻科、蓼科、石竹科、苋科、马齿苋科、毛茛科、蔷薇科、车前科、葡萄科、大戟科、伞形科、唇形科、锦葵科、禾本科、莎草科、灯芯草科、百合科、鸭跖草科、石蒜科、泽泻科等一种或多种十字花科植物。在可选实施方式中，所述十字花科植物包括拟南芥属Arabidopsis、葱芥属Alliaria、庭荠属Alyssum、寒原荠属Aphragmus、鼠耳芥属Arabidopsis、南芥属Arabis、辣根属Armoracia、异药芥属Atelanthera、山芥属Barbarea、团扇荠属Berteroa、锥果芥属Berteroella、芸苔属Brassica、肉叶荠属Braya、匙荠属Bunias、亚麻荠属Camelina、荠属Capsella、碎米荠属Cardamine、群心菜属Cardaria、桂竹香属Cheiranthus、离子芥属Chorispora、高原芥属Christolea、香芥属Clausia、岩荠属Cochlearia、穴丝荠属Coelonema、线果芥属Conringia、臭荠属Coronopus、两节荠属Crambe、隐子芥属Cryptospora、播娘蒿属Descurainia、双脊荠属Dilophia、异蕊芥属Dimorphostemon、二行芥属Diplotaxis、蛇头荠属Dipoma、异果芥属Diptychocarpus、花旗杆属Dontostemon、葶苈属Draba、芝麻菜属Eruca、糖芥属Erysimum、乌头荠属Euclidium、山萮菜属Eutrema、四棱荠属Goldbachia、藏荠属Hedinia、半脊荠属Hemilophia、香花芥属Hesperis、薄果荠属Hymenolobus、屈曲花属Iberis、菘蓝属Isatis、绵果荠属Lachnoloma、独行菜属Lepidium、丝叶芥属Leptaleum、弯梗芥属Lignariella、脱喙荠属Litwinowia、香雪球属Lobularia、弯蕊芥属Loxostemon、长柄芥属Macropodium、涩荠属Malcolmia、紫罗兰属Matthiola、高河菜属Megacarpaea、双果荠属Megadenia、小蒜芥属Microsisymbrium、小柱芥属Microstigma、豆瓣菜属Nasturtium、堇叶芥属Neomartinella、球果荠属Neslia、诸葛菜属Orychophragmus、厚壁荠属Pachypterygium、条果芥属Parrya、腋花芥属Parryodes、单花荠属Pegaeophyton、藏芥属Phaeonychium、宽框荠属Platycraspedum、燥原荠属Ptilotricum、沙芥属Pugionium、簇芥属Pycnoplinthus、萝卜属Raphanus、蔊菜属Rorippa、白芥属Sinapis、大蒜芥属Sisymbrium、芹叶荠属Smelowskia、丛菔属Solms-Laubachia、羽裂叶荠属Sophiopsis、螺喙荠属Spirorhynchus、无隔荠属Staintoniella、棒果芥属Sterigmostemum、曙南芥属Stevenia、革叶荠属Stroganowia、连蕊芥属Synstemon、棱果芥属Syrenia、沟子荠属Taphrospermum、舟果荠属Tauscheria、四齿芥属Tetracme、盐芥属Thellungiella、菥蓂属Thlaspi、念珠芥属Torularia、旗杆芥属Turritis、阴山荠属Yinshania等一种或多种。

在可选实施方式中，所述拟南芥属植物包括拟南芥。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1艾蒿来源艾蒿醇合成酶表达载体构建

对NCBI数据库bioproject:PRJNA722539的Artemisia argyi(艾蒿)的转录组数据进行分析，得到具有潜在艾蒿醇合成功能的合成酶(AaTPS19)，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：

MATVDVNTNLQVNTKTTIEHVRPLAKFPPSIWGDCFLSFVLDNSKMQTYAKTMEEPKEQLRQMIVDPTIDINEKLNLIYFVYRLGLTYLFVEEIDGQLDSLFNELNLIDYQEADLYTISVHFQVFRTHGYKLSCDVFNKFKDCNTGAFKEEIVADVKGMLTFYESAQLRIREESILDEAFSFTEAQLIKSLEKTIERKLAQQVKHALETPVHRGHPMVEARLFFIHFEEECSRYDSLVKLAKVHFNYLQLLQKEELRIVSKWWKDMDFQVITPYVRDRVPELYLWILSLFFEPYYSQARIITTKIILLLLVLDDTYDAYATIEEIRLLTDAINRWDVSAMERLPEYIKPFYEILLNEYVGFNKQVSQEGKAHLVDASKQAFQEIARGYLKEAEWRHSGEVPSFEEYIKIGLTTSTHDLLCKSSLIGMGKIVTEEAFTWYLSHPPIMTASELISRLSDDVMTFEFERERAPTATSVDAYIKTYGVSETVAIEKLKKMAENAWKDINEGCLKPRKVPMDLLAPIVSLARMIEVAYKYNDGFTFPEKTLKEYITLLFQVSVPM。

对上述合成酶的编码基因按照酿酒酵母密码子优化后合成，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

ATGGCTACTGTTGATGTTAATACAAACTTACAAGTCAACACAAAGACTACTATTGAACATGTTAGACCATTAGCTAAATTCCCACCATCTATTTGGGGTGATTGTTTTTTATCTTTCGTTTTAGACAACTCCAAGATGCAAACTTATGCTAAAACTATGGAAGAACCAAAAGAACAATTGAGACAAATGATTGTTGACCCAACTATTGATATTAACGAAAAATTGAACCTGATCTACTTCGTTTATAGATTGGGTTTAACTTACTTGTTCGTTGAAGAAATTGACGGTCAATTGGATTCTTTATTTAACGAATTGAACCTGATTGACTACCAAGAAGCTGATTTATATACAATTTCCGTTCATTTCCAGGTTTTTAGAACTCATGGTTATAAATTGTCCTGTGATGTTTTTAACAAGTTCAAAGATTGCAACACTGGTGCTTTTAAAGAAGAAATTGTTGCTGATGTTAAGGGTATGTTAACATTTTATGAGTCTGCTCAATTGAGAATTAGAGAAGAATCTATTCTGGATGAAGCATTTTCTTTTACTGAAGCTCAATTGATTAAGTCTTTGGAAAAAACAATCGAGAGAAAATTGGCTCAACAAGTTAAACATGCTTTGGAAACACCAGTTCATAGAGGTCATCCAATGGTTGAAGCTAGATTATTTTTTATCCACTTCGAAGAAGAGTGTTCTAGATATGATTCTTTAGTTAAGCTGGCTAAAGTTCATTTTAACTATTTGCAACTGCTGCAAAAAGAAGAATTGAGAATTGTTTCTAAGTGGTGGAAAGATATGGATTTTCAAGTTATTACCCCATATGTTAGAGATAGAGTTCCAGAATTATACTTGTGGATTTTATCTTTGTTCTTCGAACCATATTACTCTCAAGCTAGAATTATTACTACCAAAATCATCTTGCTGTTGTTGGTTTTAGATGATACTTATGATGCTTACGCTACTATTGAAGAAATTAGATTACTGACTGACGCTATTAATAGATGGGATGTTTCTGCTATGGAAAGATTGCCAGAATATATTAAACCATTCTACGAAATCCTGTTGAATGAATATGTTGGTTTTAACAAGCAGGTTTCTCAAGAAGGTAAAGCTCATTTAGTTGATGCTTCTAAACAAGCATTTCAAGAAATTGCTAGAGGTTATTTAAAGGAAGCTGAATGGAGACATTCTGGTGAAGTTCCATCTTTTGAAGAATATATTAAGATCGGTCTGACTACATCTACACATGATTTGTTATGTAAGTCTTCTTTGATCGGTATGGGTAAAATTGTTACAGAAGAAGCATTTACTTGGTATTTGTCTCATCCACCAATTATGACAGCTTCTGAATTAATTTCTAGGTTATCTGATGACGTTATGACATTTGAATTTGAAAGAGAAAGGGCTCCAACTGCTACTTCTGTTGATGCTTATATTAAAACTTACGGTGTTTCTGAAACCGTTGCTATTGAAAAATTAAAGAAGATGGCTGAAAACGCTTGGAAAGATATTAATGAAGGTTGTTTAAAGCCCAGAAAAGTTCCAATGGATTTATTAGCTCCAATTGTTTCTTTGGCTAGAATGATTGAAGTTGCTTATAAATACAACGACGGTTTTACTTTTCCAGAAAAAACTTTAAAGGAGTACATCACTTTGTTGTTTCAAGTTTCTGTTCCAATGTAA。

以SEQ ID NO.3为模版，设计特异基因引物对P1/P2，利用VAZYME公司的Phanta高保真酶通过PCR扩增获得密码子优化后的合成酶的基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900(采用与专利CN202210473488.4相同的方法)中，经过测序确认无误后，获得含有该基因的酵母表达载体，命名为p900A19。质粒p900A19构建示意图见图1。

使用引物P3/P4、P5/P6，分别以pYR017(见专利202210473488.4)、p900A19为模板扩增获得长片段(包含Ura3左同源臂、组氨酸筛选标记、CYC1终止子、tHMG1基因、GAL1-GAL10启动子、PGK1终止子、Ura3右同源臂、质粒骨架)和AaTPS19的编码基因。随后使用酵母组装的方法，将以上片段在酿酒酵母体内重组构建p905A19。质粒p905A19构建示意图见图1。

引物	序列(5’～3’)
		P3	CAAGTTTCTGTTCCAATGtaaATTGAATTGAATTGAAATCGATAG(SEQ ID NO.7)
P4	GTATTAACATCAACAGTAGCCATtatagttttttctccttgacg(SEQ ID NO.8)
		P5	cgtcaaggagaaaaaactataATGGCTACTGTTGATGTTAATAC(SEQ ID NO.9)
P6	CTATCGATTTCAATTCAATTCAATttaCATTGGAACAGAAACTTG(SEQ ID NO.10)

使用引物P7/P8、P9/P10，分别以pYR018(见专利202210473488.4)、p900A19为模板扩增获得长片段(包含yprcdelta15左同源臂、色氨酸筛选标记、GPM1终止子、GAL1-GAL10启动子、PGK1终止子、yprcdelta15右同源臂、质粒骨架)和AaTPS19编码基因。随后使用酵母组装的方法，将以上片段在酿酒酵母体内重组构建p908A19。质粒p908A19构建示意图见图1。

引物	序列(5’～3’)
		P7	CAAGTTTCTGTTCCAATGtaaATTGAATTGAATTGAAATCGATAG(SEQ ID NO.11)
P8	GTATTAACATCAACAGTAGCCATtatagttttttctccttgacg(SEQ ID NO.12)
		P9	cgtcaaggagaaaaaactataATGGCTACTGTTGATGTTAATAC(SEQ ID NO.9)
P10	CTATCGATTTCAATTCAATTCAATttaCATTGGAACAGAAACTTG(SEQ ID NO.10)

实施例2基因编辑质粒以及敲除盒构建

使用引物P11/P12以质粒pKlURA100(见文献Zhang,Yueping et al.“A gRNA-tRNAarray for CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae.”Nature communications vol.10,1 1053.5 Mar.2019,doi:10.1038/s41467-019-09005-3)为模板扩增获得片段。随后使用Goldengate(Zhang,Yueping et al.“AgRNA-tRNAarray for CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing inSaccharomyces cerevisiae.”Nature communications vol.10,1 1053.5 Mar.2019,doi:10.1038/s41467-019-09005-3)的方法，将以上片段和pCas进行组装，构建获得质粒pYH395。

引物	序列(5’～3’)
		P11	aaaggtctcagatcttttccactgcactttgcatgttttagagctagaaatagcaagtt(SEQ ID NO.20)
P12	aaaggtctcaaaactctagactttttcgatgatgtagtttct(SEQ ID NO.21)

使用引物P13/P14、P15/P16以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组为模板扩增获得两个片段，随后使用引物P13、P16，以获得的两个片段为模板，进行重叠延伸PCR，获得ERG9启动子上游激活顺式元件(-220至-175)敲除元件。

引物	序列(5’～3’)
		P13	atagaagacgaacattgtacgatac(SEQ ID NO.22)
P14	acccaaaaccgataacgccttccgataagtcggtattgttgttgaagatg(SEQ ID NO.23)
		P15	tcaacaacaataccgacttatcggaaggcgttatcggttttgg(SEQ ID NO.24)
P16	aatttctcgtggaagtgacg(SEQ ID NO.25)

使用引物P33/P34以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增片段X-4左侧同源臂，使用引物P35/P36以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增片段终止子TADH1，使用引物P37/P38以p900A19为模板扩增含pGAL1-pGAL10和AaTPS19基因片段，使用引物P39/P40以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增含X-4右侧同源臂，使用引物P41/P42以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增终止子TCPS1片段，利用重叠延伸PCR，使用引物P33/P40，以以上所有片段为模板，获得AaTPS19-C4敲入盒。

使用引物P43/P44以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增片段XI-1左侧同源臂，使用引物P45/P46以AaTPS19-C4敲入盒为模板，扩增TADH1，pGAL1-pGAL10，AaTPS19基因片段和TCPS1区域，使用引物P47/P48以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增含XI-1右侧同源臂，利用重叠延伸PCR，使用引物P43/P48，以以上所有片段为模板，获得AaTPS19-C5敲入盒。

使用引物P49/P50以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增片段XII-5左侧同源臂，使用引物P51/P52以AaTPS19-C4敲入盒为模板，扩增TADH1，pGAL1-pGAL10、AaTPS19基因片段和TCPS1区域，使用引物P53/P54以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增含XII-5右侧同源臂，利用重叠延伸PCR，使用引物P49/P54，以以上所有片段为模板，获得AaTPS19-C6敲入盒。

使用引物5211-F/R、5212-F/R、5213-F/R，分别以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS426质粒、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组为模板扩增获得三个片段，随后使用引物5211-F、5213-R以获得的三个片段为模板，进行重叠延伸PCR，获得pZY521敲除盒。

引物	序列(5’～3’)
		5211_F	caatggtctaggtagtggcattcg(SEQ ID NO.48)
5211-R	cgactcactatagggcgaattgggtacgacgggagtggaaagaacgg(SEQ ID NO.49)
		5212-F	tcccgttctttccactcccgtcgtacccaattcgccctatagtgag(SEQ ID NO.50)
5212-R	gccaagcacagggcaagatgctttcacagcttgtctgtaagcgga(SEQ ID NO.51)
		5213-F	gcatccgcttacagacaagctgtgaaagcatcttgccctgtgctt(SEQ ID NO.52)
5213-R	gattccatgctaccttccatggttg(SEQ ID NO.53)

pHM012是靶向X-4、XI-1和XII-5位点的gRNA 质粒，用于Crispr-Cas9基因编辑技术中靶点识别切割酿酒酵母基因组DNA 的工具质粒。(1)以pstgRNA质粒为模板，该质粒来源于参考文献：A gRNA-tRNA array for CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genomeediting in Saccharomyces cerevisiae(DOI:10.1038/s41467-019-09005-3)，用引物X-4_scaffold F和tGly_XI-1R通过PCR扩增得到含X-4位点gRNA，gRNA scaffold，tGly和部分XI-1位点gRNA的质粒片段；(2)以pstgRNA质粒为模板，用引物XI-1_scaffold F和tGly_XII-5R通过PCR扩增得到含部分XI-1位点gRNA，gRNA scaffold，tGly和部分XII-5位点gRNA的质粒片段；(3)以pKlURA3 100质粒(所述pKlURA3 100的来源：A gRNA-tRNA array forCRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae)为模板，用引物XII-5_scaffold F和pKIURA3-R-common通过PCR扩增得到片段含XII-5位点gRNA，gRNA scaffold，SUF17终止子和URA筛选标签)；(4)使用Golden Gate组装方法将上述三个片段与pCas9载体进行组装，大肠杆菌转化，酶切验证和测序正确后得到质粒pHM012。

4)菌株构建(艾蒿来源基因)

通过PEG/LiAC方法将p900A19质粒转化到酵母菌株JCR27感受态中，涂布于SD-URA筛选平板上，培养3d后，使用诺唯赞PCR试剂进行菌落PCR验证，将阳性菌命名为J900A19。(酵母菌株JCR27的构建见文献Siemon,T.,et al.(2020)."Semisynthesis of plant-derived englerin A enabled by microbe engineering of guaia-6,10(14)-diene asbuilding block."Journal of the American Chemical Society 142(6):2760-2765.)。

使用限制性内切酶MssI将质粒p900A19线性化，回收含有法尼基焦磷酸合酶基因以及AaTPS19基因的片段，通过PEG/LiAC方法将该片段导入到酵母菌株JCR27感受态中，进行酵母菌落PCR验证后，将阳性菌命名为JA191。

菌株JA191相较CEN.PK2-1D菌株，加强了MVA途径，过表达整个MVA途径，在此基础上，又过表达了法尼基焦磷酸合酶基因以及AaTPS19基因，菌株JA191中各基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20、AaTPS19＝2、2、2、2、2、2、2、2、1。

进一步利用NotI内切酶酶切p908A19回收含有AaTPS19基因片段，类似地转化酵母菌株JA191感受态细胞后，进行酵母菌落PCR验证，获得阳性菌JA192，菌株JA192中各基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20、AaTPS19＝2、2、2、2、2、2、2、2、2。

同理，利用MssI内切酶酶切p905A19回收含有AaTPS19基因片段，通过PEG/LiAC方法将该片段导入到酵母菌株JA192感受态中，进行酵母菌落PCR验证后，将阳性菌命名为JA193，菌株JA193中各基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20、AaTPS19＝2、2、3、2、2、2、2、2、3。

将质粒pYH395和ERG9启动子上游激活顺式元件(-220至-175)敲除元件通过醋酸锂法共同转入至菌株JA193中，菌落经PCR验证敲除的正确性，随后使用YPD液体培养基(20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖)培养，220rpm摇床，30度培养8小时后水洗，将菌划5-FOA平板(李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.)，30℃培养箱培养3天，从平板上挑菌继续菌落PCR验证敲除的正确性，正确的菌株命名为JA194。

本步骤用于敲除ERG9启动子上游激活顺式元件(-220至-175)，ERG9编码的角鲨烯合成酶以FPP为底物合成角鲨烯，为倍半萜化合物合成途径的竞争途径，ERG9启动子上游激活顺式元件的敲除可下调角鲨烯合成途径，减少角鲨烯合成途径竞争消耗倍半萜化合物合成所需的底物，有利于进一步提高倍半萜化合物的产量。

进一步将质粒pHM012和AaTPS19-C4敲入盒、AaTPS19-C5敲入盒、AaTPS19-C6敲入盒通过醋酸锂法共同转入至菌株JA194，操作步骤同以上敲除ERG9启动子上游激活顺式元件(-220至-175)敲除元件，经过菌落PCR验证得到菌株JA196。获得阳性菌JA196菌株，JA195中各基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20、AaTPS19＝2、2、3、2、2、2、2、2、6。

最后将pZY521敲除盒使用醋酸锂法转入菌株JA196中，获得菌株JA197。本步骤的作用是敲除转录抑制因子GAL80，从而可以使转入菌中的目的基因可以在不需要诱导剂的情况下即可自主表达，有利于降低发酵成品，还可进一步提高倍半萜化合物的产量。

实施例3摇瓶发酵

将J900A19和J900V5-15菌株接种于50mL补充1％(w/v)半乳糖的YPD培养基中，30℃培养，3d后，8000rpm离心10min收集菌体，菌体经10mL萃取剂正己烷萃取后制样送GC-MS检测。J900A19菌株检测到特异性倍半萜产物，如图3所示，将该化合物暂时命名为A19。J900V5-15菌株检测到相同特异性倍半萜产物，如图4所示。

JA191～JA197菌株采用类似的方法，添加10％(w/)肉豆蔻酸异丙酯(IPM)覆盖后发酵72h，离心后取油相进行GC-MS检测。菌株JA191、JA192、JA193、JA194、JA196、JA197的倍半萜A19产物(最后鉴定为(+)-intermedeol(艾蒿醇))的产量分别为18.97mg/L、37.7mg/L、60.8mg/L、70.65mg/L、88.6mg/L、167mg/L、186mg/L。

实施例4发酵罐发酵

参照文献(van Hoek,P.；de Hulster,E.；van Di jken,J.P.；Pronk,J.T.Fermentative capacity in high-cell-density fed-batch cultures of baker’syeast.Biotechnol.Bioeng.2000,68,517-523.)中所记载的发酵培养基，对所构建的菌株JA197进行分批补料发酵，在发酵过程中添加覆盖剂以实现原位萃取，覆盖剂分别为正十二烷或肉豆蔻酸异丙酯。发酵过程控制溶氧在20％以上，pH为5，葡萄糖浓度为1～2g/L，乙醇浓度为5g/L以下。最终在发酵罐(15L钢罐)上，倍半萜产物(最后鉴定为(+)-intermedeol(艾蒿醇))产量分别达到了12g/L(覆盖剂为正十二烷)和9.5g/L(覆盖剂为肉豆蔻酸异丙酯)。

实施例5产物鉴定

为了确定倍半萜产物的结构，在不覆盖有机溶剂IPM的发酵条件下对菌JA197发酵，发酵控制和覆盖时相同，区别仅为不加覆盖剂。待发酵结束后，使用甲醇等体积萃取菌液，随后再用正己烷萃取，静止分离，获得上层有机相进行减压浓缩，减压浓缩后使用半制备HPLC进一步纯化，纯化的产物经过¹H和^13CNMR核磁鉴定，COSY，ROESY和X-RAY鉴定结果分别如图4～9所示，确定该倍半萜的化学结构为其命名为(+)-intermedeol(艾蒿醇)。

对比例真菌Termitomyces来源、葡萄Vitis vinifera来源已知艾蒿醇合成酶的表达

已有报道的intermedol合酶有两个，分别是来源于Termitomyces和Vitisvinifera

真菌Termitomyces来源V5-15的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MVQFRIPDLLSCLPACIKATNADNDILQAGLVEVIDQCHLTDHYKKDLKRAEIPHLAIRAFPESDLKYLRICVEYLIAAFLLDRLTDKPATAAQAQEWADIYKQEFRKTLQGTKGPARINQYLTKKCDIYPQAFSKTFEKTKGPAEIIKYLTSHMSNTIKDPYWSCLVENNILLADGMAKEAVDRENPGTEMDLETYIKVRRDTIGARQLFDLGRWIHELNITPETLTHPDIVRMEEQFIDLISLANDLYSYKKEYLAKDAKHNYLTIALRDPTVDLHENDLQGAINYTYDKFCRVLADLEHQKKVLPRFRKSEEAKVDKYFWLMMNVVIGTIQWSLECERYGHFVDADGPNQGDVVFNL。

对这个酶的编码基因按照酿酒酵母密码子优化后合成，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示：

ATGGTCCAGTTCAGAATACCAGACTTGTTGTCTTGCTTGCCAGCTTGTATCAAGGCTACCAACGCCGATAACGACATCTTGCAAGCAGGTTTGGTGGAGGTCATCGATCAGTGTCACTTGACCGACCACTACAAGAAGGACTTGAAGAGGGCCGAAATTCCACACTTGGCCATTAGAGCTTTCCCAGAGTCCGACTTGAAGTACTTGAGGATTTGCGTGGAGTACTTGATCGCCGCTTTCCTATTGGACAGATTGACCGACAAGCCAGCTACAGCAGCTCAAGCTCAAGAGTGGGCAGATATCTACAAGCAGGAGTTCAGGAAGACCTTGCAAGGTACTAAGGGTCCAGCTAGGATCAACCAGTACTTGACCAAGAAGTGCGACATCTACCCACAAGCCTTCTCCAAGACCTTCGAAAAGACCAAGGGTCCAGCCGAAATCATCAAGTACTTGACCTCCCACATGTCCAACACCATCAAGGACCCATATTGGTCTTGCTTGGTCGAGAACAACATCTTGTTGGCCGACGGTATGGCAAAGGAAGCCGTTGACAGAGAAAACCCAGGTACAGAGATGGACTTGGAAACTTATATCAAGGTCAGGAGAGATACCATCGGCGCTAGACAATTGTTCGACCTAGGTAGGTGGATTCATGAATTGAACATCACCCCAGAAACTTTGACTCATCCAGACATCGTTAGGATGGAGGAGCAGTTCATCGACTTGATCTCCTTGGCCAACGACTTGTACAGCTACAAGAAGGAGTACTTGGCCAAGGACGCTAAGCACAACTACTTGACCATCGCCTTGAGAGATCCAACCGTTGATTTGCACGAGAACGACTTGCAAGGCGCTATCAACTACACCTACGACAAGTTTTGCAGGGTCTTGGCAGACTTGGAGCATCAGAAGAAGGTCTTGCCAAGGTTCAGGAAGTCCGAAGAAGCTAAGGTCGACAAGTACTTTTGGTTGATGATGAACGTCGTGATCGGTACCATTCAGTGGTCTTTGGAGTGCGAAAGGTACGGTCATTTTGTTGACGCAGACGGTCCAAACCAAGGCGACGTTGTCTTCAACTTGTAA。

以SEQ ID NO.4为模板，设计特异基因引物对P55/P56，利用VAZYME公司的Phanta高保真酶通过PCR扩增获得V5-15基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有该基因的酵母表达载体，命名为p900-V5-15，质粒p900-V5-15构建示意图见图2。

葡萄Vitis vinifera来源VvPNSeInt的氨基酸序列如下所示：

MSVPLSVSVTPILSQRIDPEVARHEATYHPNFWGDRFLHYNPDDDFCGTHACKEQQIQELKEEVRKSLEATAGNTSQLLKLIDSIQRLGLAYHFEREIEEALKAMYQTYTLVDDNDHLTTVSLLFRLLRQEGYHIPSDVFKKFMDEGGNFKESLVGDLPGMLALYEAAHLMVHGEDILDEALGFTTAHLQSMAIDSDNPLTKQVIRALKRPIRKGLPRVEARHYITIYQEDDSHNESLLKLAKLDYNMLQSLHRKELSEITKWWKGLDFATKLPFARDRIVEGYFWILGVYFEPQYYLARRILMKVFGVLSIVDDIYDAYGTFEELKLFTEAIERWDASSIDQLPDYMKVCYQALLDVYEEMEEEMTKQGKLYRVHYAQAALKRQVQAYLLEAKWLKQEYIPRMDEYMSNALVSSACSMLTTTSFVGMGDIVTKEAFDWVFSDPKMIRASNVICRLMDDIVSHEFEQKRGHVASAVECYMKQYGVSKEEAYDEFKKQVESAWKDNNEEFLQPTAVPVPLLTRVLNFSRMMDVLYKDEDEYTLVGPLMKDLVAGMLIDPVPM(SEQ ID NO.15)。

对这个酶的编码基因按照酿酒酵母密码子优化后合成，其核苷酸序列如下所示：

ATGAGTGTCCCTTTATCTGTCTCTGTTACTCCAATCTTGTCCCAAAGAATCGACCCAGAAGTTGCCAGACACGAAGCTACTTACCATCCAAACTTCTGGGGTGACCGTTTCTTACACTACAATCCAGATGACGATTTCTGTGGTACCCACGCTTGTAAGGAACAACAAATCCAAGAATTAAAAGAAGAAGTCAGAAAGTCTTTGGAAGCCACTGCTGGTAACACTTCTCAATTGTTGAAATTGATCGATTCTATTCAAAGATTGGGTTTAGCCTACCACTTCGAAAGAGAAATCGAAGAAGCCTTGAAGGCTATGTACCAAACCTACACCTTGGTTGACGACAATGACCATTTAACTACCGTCTCACTCTTGTTCAGATTGTTGAGACAAGAAGGCTACCACATCCCATCTGATGTTTTCAAGAAGTTCATGGACGAAGGTGGTAACTTCAAGGAATCTCTAGTTGGTGACTTGCCAGGTATGCTAGCTTTGTACGAAGCTGCTCACTTGATGGTTCACGGTGAAGACATTTTGGACGAAGCTTTGGGTTTCACCACTGCCCACTTGCAATCCATGGCTATCGATTCCGATAACCCATTGACAAAGCAAGTCATCAGAGCTTTGAAGCGTCCAATTAGAAAGGGTTTGCCAAGAGTCGAAGCCAGACATTACATCACTATCTACCAAGAAGACGACTCTCACAACGAATCGTTGCTGAAGTTGGCTAAGTTGGACTACAACATGTTGCAATCCTTGCACAGAAAGGAATTATCTGAAATTACCAAGTGGTGGAAGGGTTTGGATTTTGCTACCAAGCTTCCATTCGCTAGAGACAGAATTGTTGAAGGTTACTTTTGGATTTTAGGTGTTTACTTTGAACCACAATACTACTTGGCTAGAAGAATCTTAATGAAGGTCTTCGGTGTCCTGTCCATCGTCGATGATATATACGATGCTTACGGTACTTTCGAAGAGTTGAAGTTGTTCACTGAAGCCATCGAAAGATGGGACGCTTCTTCTATTGACCAATTGCCAGACTACATGAAGGTTTGTTACCAAGCTTTGTTGGATGTCTACGAAGAAATGGAAGAAGAAATGACTAAACAAGGTAAGCTTTATCGCGTTCATTACGCTCAAGCTGCCTTGAAAAGACAAGTTCAAGCTTATTTGTTGGAAGCTAAATGGTTGAAGCAAGAATACATTCCAAGAATGGACGAATATATGTCCAACGCTTTAGTTTCTTCCGCTTGCTCCATGTTGACCACTACTTCTTTCGTGGGTATGGGTGATATTGTCACCAAGGAAGCTTTCGACTGGGTTTTCTCTGACCCAAAGATGATTAGAGCCTCTAACGTTATCTGTCGTTTGATGGATGATATTGTTTCCCACGAATTTGAACAAAAGAGAGGTCACGTTGCTTCCGCTGTTGAATGTTACATGAAACAATACGGTGTCTCCAAGGAAGAAGCTTACGACGAATTCAAGAAGCAAGTTGAATCTGCTTGGAAGGACAACAACGAAGAATTCTTGCAACCAACCGCTGTCCCAGTCCCATTGTTGACCAGAGTTTTGAACTTCAGCCGTATGATGGACGTATTGTACAAGGATGAAGATGAATACACTTTGGTTGGTCCACTGATGAAGGATTTAGTCGCCGGTATGTTGATTGATCCTGTTCCAATGTAA(SEQ ID NO.16)。

以以上序列为模板，设计特异基因引物对P71/P72，利用VAZYME公司的Phanta高保真酶通过PCR扩增获得基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有该基因的酵母表达载体，命名为p900-VvPNSeInt，质粒p900-VvPNSeInt构建示意图见图2。

使用限制性内切酶MssI将质粒p900-V5-15线性化，回收含有法尼基焦磷酸合酶基因以及V5-15基因的片段，通过PEG/LiAC方法将该片段导入到酵母菌株JCR27感受态中，进行酵母菌落PCR验证后，将阳性菌命名为JV151。

菌株JV151相较CEN.PK2-1D菌株，加强了MVA途径，过表达整个MVA途径，在此基础上，又过表达了法尼基焦磷酸合酶基因以及V5-15基因，菌株JV151中各基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20、V5-15＝2、2、2、2、2、2、2、2、1。

使用限制性内切酶MssI将质粒p900-VvPNSeInt线性化，回收含有法尼基焦磷酸合酶基因以及VvPNSeInt基因的片段，通过PEG/LiAC方法将该片段导入到酵母菌株JCR27感受态中，进行酵母菌落PCR验证后，将阳性菌命名为JVVvPNSeInt。

菌株JVVvPNSeInt相较CEN.PK2-1D菌株，加强了MVA途径，过表达整个MVA途径，在此基础上，又过表达了法尼基焦磷酸合酶基因以及VvPNSeInt基因，菌株JVVvPNSeInt中各基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20、VvPNSeInt＝2、2、2、2、2、2、2、2、1。

按照和菌株JA191一样的摇瓶发酵条件对菌株JV151、JVVvPNSeInt进行摇瓶发酵，发酵结束检测intermedeol产量，分别为0.35mg/L和0.04mg/L，与菌株JV191相比低很多，可见AaTPS19优于现有报道的intermedeol合酶。

实施例6A19杀虫效果监测

(1)使用hand-in-cage测试评价A19((+)-intermedeol)趋避埃及伊蚊的效果

hand-in-cage实验装置包括一个30cm×30cm×30cm的蚊笼，其中放置一只经过改造的手套。在笼子的顶部安装了一台用于录像的数码相机。为了创建一个测试窗口，在丁腈橡胶手套背面剪下一个方块，并粘上一个稍大于窗口尺寸的磁性框架，作为堆积额外的磁性窗框架的基础。将一块经过测试化合物处理的纱布网放置在固定的磁性框架上，距离手套约3.0mm。第二块未经处理的纱布网用另一个磁性框架放置在处理网上方约8.0mm处。堆叠的磁性框架用粘合夹固定，确保处理过的和未处理的网之间有足够的空间，以防止蚊子接触处理过的网或刺穿手套中的手的皮肤。

该实验是在一个相对湿度约为50％、温度范围为28℃到30℃的房间中进行的。将未吸血的以2％的葡萄糖为食的蚊子转移到蚊笼中，大约10到20日龄(约50～70只)。在测试前8小时，将葡萄糖移除，每次测试都在16：00到21：00之间进行。在实验前，一名研究人员从2mL的EP管取出800μl溶解在丙酮中的A19处理一块纱布网，以丙酮作为对照。在让丙酮挥发大约7分钟后，研究人员组装并佩戴了改造过的手套。同时，一名实验室助理将准备好的笼子从培养箱转移到实验室的一个长凳上。

实验开始，研究人员将戴着改造手套的手伸入笼子，数码相机记录了蚊子10分钟内停落在测试窗口的情况，随后统计并记录了蚊子停落的次数。对于每个笼子，先测试两次溶剂(丙酮)对照组，然后进行测试化合物处理。两次试验之间至少间隔0.5小时，以让蚊子完全恢复，并将之前实验中的任何残留蒸汽通风出房间。对照组的数据也纳入统计以建立蚊子对溶剂反应的基线活性，并排除了对照组试验中低停落数的笼子的任何数据。每个笼的驱避率采用以下公式确定：驱避率＝[1-(蚊子的给药窗口停落数量/蚊子的溶剂窗口停落数量)]×100。每个笼子都由至少两名不同的测试人员进行测试，包括男生和女生。此外，每个笼子每天只测试一次。实验完成后，将笼子立即放回培养箱。每次实验都会更换新的改造后的手套及其磁性框架。本实验测试了两个浓度梯度的(+)-intermedeol,分别是500ppm和5000ppm。测试结果如图10所示，可见两个浓度下，A19对蚊子都有很好的趋避效果，有潜力用作驱蚊剂。

(2)使用H管实验评价A19对褐飞虱的趋避效果

使用H管嗅觉计测试A19化合物对褐飞虱的吸引力，方法由Lou和Cheng描述的方法改进而来(Lou,Y.-G.and J.-A.Cheng(2003)."Role of rice volatiles in theforaging behaviour of the predator Cyrtorhinus lividipennis for the ricebrown planthopper Nilaparvata lugens."Biocontrol 48:73-86.)。H管的设置如下：两个圆柱形玻璃管臂(直径3cm，高15cm)，每个都在顶部开口，在离底部4.5厘米处有一个孔(直径3cm)。另一个圆柱形的“连接器”玻璃管(直径3cm，长17cm)通过距离底部4.5厘米的孔连接两个“管臂”。在连接器的中心，有一个直径为1厘米的孔，用于释放测试昆虫。实验在09：00到17：00之间进行，在此期间褐飞虱非常活跃。A19化合物的最终用丙酮配置浓度为500ppm。将三叶期水稻幼苗彻底浸泡在A19溶液中浸泡20秒，挥发7min。丙酮作为对照。在玻璃臂的顶部放置双层纱布，用橡皮筋密封。饥饿处理0.5h的褐飞虱通过释放孔引入H管，然后棉花塞住释放孔。将该装置置于26±2℃和70±5％ RH的培养箱中。1h后，记录对照组和处理组的褐飞虱数量。如果从释放孔到昆虫休息的区域的距离不超过3厘米，则认为这是“没有选择”。否则，即被认为是“选择”。每次重复检测17-20个个体，每个处理重复7次以上。检测结果如图11所示，可见，A19对水稻害虫褐飞虱有很好的趋避效果，有潜力用作农药。

(3)使用H管实验评价A19对中黑盲蝽的趋避效果

对于中黑盲蝽，H管的设置如上所述。实验在15：00到18：00之间进行，因为在这期间中黑盲蝽非常活跃。将5cm长的豆角置于H管的两臂中，用于引诱饥饿处理1h的中黑盲蝽。同时，将150μl的A19(500ppm)和丙酮分别加入到两张4cm×2cm的滤纸中。滤纸挥发2min，然后将它们与豆角一起放入H管臂。将该装置置于26±2℃和70±5％ RH的培养箱中。在接下来的1.5h～2.5h，中黑盲蝽对处理组和对照组进行选择。每次重复检测15个个体，每个处理进行5次以上重复。检测结果如图12所示，可见，A19对棉花害虫盲蝽有很好的趋避效果，有潜力用作农药。

实施例7 A19的抗菌效果检测

使用抑菌圈实验评价A19对立枯丝核菌的抑制效果

为了确定A19对立枯丝核菌(植物病原真菌，在全世界范围内对各种重要的经济作物造成破坏性的病害)的抑制作用，从3日龄菌落边缘切割7mm的菌丝塞转移到含有特定浓度试验化合物的PDA培养基中(20％马铃薯，2％葡萄糖和2％琼脂)，A19溶解在DMSO中，浓度分别为10ppm、25ppm、50ppm和100ppm，并以DMSO作为一个对照组。在28℃下孵育24h后，用前期研究Liu,K.,et al.(2022)."Biological and molecular characterizations offluxapyroxad-resistant isolates of Botrytis cinerea."Phytopathology Research4(1):2.所述的杂交法测量菌落直径，并从测量数据中减去原菌丝塞直径(7mm)。每个实验至少检测3个重复，检测结果如图13所示，可见，A19对立枯丝核菌有很好的抑制效果，有潜力用作农药。

实施例8 A19的除草效果检测

使用拟南芥幼苗抑制实验评价A19开发除草剂的潜力

选择Arabidopsis thaliana ecotype Columbia(Col-0)进行根系测定。先将种子表面消毒后4℃孵育3天进行春化，然后播种在含有半强度MS培养基(pH＝5.7)的方形培养皿中(130mm×130mm)，将培养皿垂直放置在生长室中，光照周期为16小时光照(150μmol m^- ²S^-1)/8小时暗光，昼夜温度为23/21℃。发芽3～5天后，将幼苗转移到含有1/2MS培养基的培养皿(直径为35mm)中，培养基中添加溶解在DMSO中的A19，A19的浓度分别为25ppm、50ppm、100ppm和200ppm，并以DMSO作为对照组。在4～5天后使用ImageJ软件(NIH，USA，http://rsb.info.nih.gov/ij)和校准量表测定了根和叶的长度，每个实验至少检测了10株幼苗，测试结果如图14所示，可见，A19对拟南芥幼苗有很好的抑制效果，有潜力用作农药。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.艾蒿醇合成酶，其特征在于，所述艾蒿醇合成酶来源于艾蒿（Artemisia argyi），所述艾蒿醇合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.核酸分子，其包含编码权利要求1所述艾蒿醇合成酶的核苷酸序列或与其碱基互补的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的原始载体包括pZY900、pYR017、pYR018或pKlURA100。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子，或者，含有权利要求4所述重组表达载体的转化体，所述转化体的宿主细胞为酿酒酵母表达系统。

6.重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母含有权利要求2或3所述的核酸分子，或者含有权利要求4所述的重组表达载体，所述重组酿酒酵母还含有法尼烯焦磷酸合酶基因。

7.根据权利要求6所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母基因组中法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为1~3。

8.根据权利要求6所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母基因组中法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为2。

9.根据权利要求6所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母基因组中至少一种甲羟戊酸途径相关基因的拷贝数在1以上。

10.根据权利要求9所述的重组酿酒酵母，其特征在于，ERG10基因、ERG13基因、tHMG1基因、ERG12基因、ERG8基因、MVD1基因或IDI1基因中的至少一个基因的拷贝数为1~3。

11.根据权利要求10所述的重组酿酒酵母，其中，所述ERG10基因、ERG13基因、tHMG1基因、ERG12基因、ERG8基因、MVD1基因或IDI1基因中的至少一个基因的拷贝数为2或3。

12.根据权利要求6所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母基因组中敲除了抑制因子GAL80基因和/或ERG9启动子上游-175~-220范围内的激活顺式元件。

13.权利要求6~12任一项所述重组酿酒酵母的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：

（a）将权利要求2或3所述的核酸分子或者权利要求4所述的重组表达载体转化进酿酒酵母细胞中；

（b）通过基因编辑增加酿酒酵母基因组中法尼烯焦磷酸合酶基因和/或甲羟戊酸途径相关基因的拷贝数；

所述步骤（a）和步骤（b）的实施顺序不分先后。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为1~3。

15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为2。

16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，ERG10基因、ERG13基因、tHMG1基因、ERG12基因、ERG8基因、MVD1基因或IDI1基因中的至少一个基因的拷贝数为1~3。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，所述ERG10基因、ERG13基因、tHMG1基因、ERG12基因、ERG8基因、MVD1基因或IDI1基因中的至少一个基因的拷贝数为2或3。

18.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，向酿酒酵母细胞中转化抑制因子GAL80基因敲除表达盒和/或ERG9启动子上游激活顺式元件敲除表达盒。

19.艾蒿醇的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，发酵培养权利要求5所述的转化体，或者，发酵培养权利要求6~12任一项所述的重组酿酒酵母，或者发酵培养采用权利要求13~18任一项所述制备方法制备得到的重组酿酒酵母，并从发酵产物中回收艾蒿醇。

20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述回收的方法包括使用油相萃取发酵产物。

21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述油相包括正己烷、正十二烷和/或肉豆蔻酸异丙酯。

22.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述回收的方法为，发酵过程中，添加油相，发酵结束后，收集油相，分离获得富集于油相中的艾蒿醇。

23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述收集油相的方法包括离心。

24.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述分离的方法包括精馏。

25.采用权利要求19~24任一项所述制备方法得到的艾蒿醇在制备抗菌产品或除草产品中的应用，所述抗菌产品能够抑制的微生物为立枯丝核菌，所述除草产品能够抑制的植物为拟南芥。