CN117126801B - 一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法、产品及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法、产品及应用，并开发可以在体外稳定扩增大量细胞的维持培养基配方，属于细胞生物学和再生医学领域。该方法针对当前临床应用中自体纤维软骨细胞增殖有限、修复效果差、取材造成创伤、安全性相对较差等问题，发明了一种通过操纵转化因子TGFβ3、Shh(Sonic hedgehog)和视黄酸RA信号通路，建立了从hiPSCs高效地衍生高再生能力的纤维软骨细胞的方法。由于该方法实验操作相对简单，产生的纤维软骨细胞在维持培养基条件下大量扩增和长期维持软骨特性，在未来应用于致密结缔组织(包括肌腱、韧带、半月板和纤维环)再生修复的潜在疗法。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学和再生医学领域，涉及一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法、产品及应用。
背景技术
纤维软骨是一种介于透明软骨与致密结缔组织之间的一种过渡形式的组织，主要分布于椎间盘、关节软骨盘、耻骨联合和肌腱关节囊韧带附着部分。纤维软骨由软骨细胞、成纤维细胞和软骨基质(蛋白聚糖和胶原纤维)构成，在体内主要起对抗压力和应力的功能。然而，由于纤维软骨组织缺乏血管，组织受损后难以修复。
纤维软骨细胞因其能够形成软骨组织以及合成和分泌软骨基质成分(如胶原蛋白和硫酸软骨素)等特性而成为修复膝关节半月板候选细胞类型。自体纤维软骨组织(或细胞)移植、手术修复是当前治疗成人致密结缔组织(包括肌腱、韧带、半月板和纤维环)损伤的主要方法。大量临床研究证实，这些致密结缔组织损伤后的愈合效果很不理想，主要是由于自体纤维软骨细胞在体外增殖和再生能力较弱，ECM合成和分泌较少，难以实现快速有效的修复。此外，自体取材也会造成自身机体创伤和感染，而同种异位软骨的移植则无法发挥有效的对抗压力和应力的功能。因此，需要开发新的方法来大量获取高再生能力的纤维软骨细胞，用于开发这些致密结缔组织再生修复的潜在疗法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了以下实施方案：
本发明提供了一种产品，所述产品用于制备高再生传代能力的纤维软骨细胞；所述产品包括培养基1、培养基2、培养基3和/或培养基4；其中，所述培养基1是含有Rocki的E8完全培养基，所述培养基2是含有LDN193189的E8完全培养基，所述培养基3是含有LDN193189、CHIR-99021和AGN193109的E8完全培养基，所述培养基4是含有ITS-G、PUNO1-TGF-β3、SAG、FGF-2和AGN193109的DMEM/F12营养液。
进一步，所述培养基1中的组分Rocki的浓度为10μM。
进一步，所述培养基2中的组分LDN193189的浓度为250nM。
进一步，所述培养基3中的组分LDN193189的浓度为250nM。
进一步，所述培养基3中的组分CHIR-99021的浓度为5μM。
进一步，所述培养基3中的组分AGN193109的浓度为100nM。
进一步，所述培养基4中的组分ITS-G的质量百分比为1％。
进一步，所述培养基4中的组分PUNO1-TGF-β3的浓度为10ng/ml。
进一步，所述培养基4中的组分SAG的浓度为300nM。
进一步，所述培养基4中的组分FGF-2的浓度为20ng/ml。
进一步，所述培养基4中的组分AGN193109的浓度为100nM。
术语“培养物”是指细胞、生物体、多细胞实体或组织在培养基中的生长。术语“培养”是指实现此类生长的任何方法，并且可包括多个步骤。术语“进一步培养”是指将细胞、生物体、多细胞实体或组织培养至某一生长阶段，然后使用另一种培养方法使所述细胞、生物体、多细胞实体或组织达到另一生长阶段。“细胞培养物”是指细胞在体外的生长。在这样的培养中，细胞增殖，但它们本身不组织成组织。“组织培养物”是指组织的维持或生长，例如器官原基或成体器官的体外外植体，以便保持其结构和功能。“单层培养物”是指这样的培养物，其中细胞在合适的培养基中繁殖，且大部分彼此连接并粘附到基底上。此外，“悬浮培养物”是指这样的培养物，其中细胞在合适的培养基中繁殖，且悬浮于该合适的培养基中。
术语“培养基”或“培养液”是本领域公认的，并且通常是指用于培养活细胞的任何物质或制备物。如在提及细胞培养中所使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气体或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原基质。术语“培养基”还指意图用于细胞培养的材料，即使其尚未与细胞接触。换言之，准备用于细菌培养的营养丰富的液体是培养基。
在某些具体的实施方案中，所述制备高再生传代能力的纤维软骨细胞的产品包括培养基1，其组分为10μM Rocki的E8完全培养基。在某些具体的实施方案中，所述制备高再生传代能力的纤维软骨细胞的产品包括培养基2，其组分为250nM的LDN193189的E8完全培养基。在某些具体的实施方案中，所述制备高再生传代能力的纤维软骨细胞的产品包括培养基3，其组分为250nM LDN193189、5μM CHIR-99021、100nMAGN193109的E8完全培养基。在某些具体的实施方案中，所述制备高再生传代能力的纤维软骨细胞的产品包括培养基4，其组分为1％ITS-G、10ng/ml PUNO1-TGF-β3、300nM SAG、20ng/ml FGF-2、100nMAGN193109的DMEM/F12营养液。
本发明提供了一种高再生传代能力的纤维软骨细胞的分化方法，所述分化方法包括如下步骤：
1)将iPS细胞消化成单细胞，离心并使用前面所述的培养基1重悬，接种到低吸附培养皿上过夜形成EB球；
2)更换前面所述的培养基2诱导培养2天；
3)接种于基质胶包被板中，更换前面所述的培养基3培养4天；
4)更换前面所述的培养基4，培养6天，分化结束。
进一步，所述步骤1)中iPS细胞为hiPSCs。
进一步，所述分化方法步骤1)中iPS细胞消化使用的试剂为Tryp.LE。
进一步，所述步骤1)消化成的单细胞的浓度为1.5×106cells/mL。
进一步，所述步骤1)接种的培养皿为低吸附孔板。
进一步，所述步骤3)接种基质胶包被板为Matrigel-coated的12孔板。
如本文所用，术语“溶液”包括使本发明中所用的纤维软骨细胞保持存活的药学上可接受的载体或稀释剂。对于纤维软骨细胞群，术语“基本上纯的”是指这样的细胞群，其中按数量计至少约75％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的细胞是MSC。换言之，对于MSC群，术语“基本上纯的”是指这样的细胞群，其包含按数量计小于约20％、小于约10％或小于约5％的谱系定型细胞。
在某些具体的实施方案中，所述高再生传代能力的纤维软骨细胞的分化方法包括如下步骤：1)iPS细胞用Tryp.LE消化成单细胞1.5×106cells/mL，离心并用前面所述的培养基1重悬，接种于低吸附6孔板悬浮培养过夜后形成EB球；2)更换前面所述的培养基2诱导培养2天；3)EB球接种于Matrigel-coated的12孔板，更换前面所述的培养基3处理4天；4)更换前面所述的培养基4，培养5天，分化结束，得到高再生传代能力的纤维软骨细胞。
术语“包含”和“包括”是以包括性的、开放的含义使用，这意味着可以包括另外的元件。
本发明提供了一种纤维软骨细胞，所述纤维软骨细胞由前面所述的分化方法制备得到。
本发明提供了一种10％TY扩增培养基，所述10％TY扩增培养基能够大量扩增并维持纤维软骨细胞特性；所述10％TY扩增培养基包括组分为ITS-G、FBS、PUNO1-TGFβ3、SAG、FGF-2、PDGF-BB、Dexamethasone、GlutaMAX、NEAA、Penicilin-Streptomycin的DMEM/F12培养基。
进一步，所述ITS-G的质量百分比为1％。
进一步，所述FBS的质量百分比为10％。
进一步，所述PUNO1-TGFβ3的浓度为10ng/ml。
进一步，所述SAG的浓度为100nM。
进一步，所述FGF-2的浓度为20ng/ml。
进一步，所述PDGF-BB的浓度为2ng/ml。
进一步，所述Dexamethasone的浓度为100nM。
进一步，所述GlutaMAX的质量百分比为1％。
进一步，所述NEAA的质量百分比为1％。
进一步，所述Penicilin-Streptomycin的质量百分比为1％。
在某些具体的实施方案中，所述培养扩增纤维软骨细胞并能维持纤维软骨细胞特性的10％TY扩增培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，并向其中添加如下组分：1％ITS-G、10％FBS、10ng/ml PUNO1-TGFβ3、100nM SAG、20ng/ml FGF-2、2ng/ml PDGF-BB、100nMDexamethasone、1％GlutaMAX、1％NEAA、1％Penicilin-Streptomycin。在培养基的组分中以％为单位的组分其单位意为质量百分比。
术语“基础培养基”是指促进不需要任何特殊营养补充剂的许多类型的微生物生长的培养基。大多数基础培养基通常包含四种基本化学基团：氨基酸、碳水化合物、无机盐和维生素。基础培养基通常用作更复杂的培养基的基础，向该基础培养基中加入补充剂如血清、缓冲液、生长因子、脂质等。基础培养基的实例包括但不限于伊格尔(Eagles)基础培养基、最小必需培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基、培养基199、营养混合物Ham's F-10和Ham's F 12、McCoy's 5A、达尔伯克MEM/F-I 2、RPMI 1640和伊斯科夫改良达尔伯克培养基(IMDM)。
本发明提供了一种纤维软骨细胞的高扩增传代的方法，所述方法将前面所述的纤维软骨细胞汇合，清洗，Trypsin-EDTA消化，终止消化，离心收集细胞沉淀，按比例传代，使用前面所述的10％TY扩增培养基重悬细胞，接种于预先涂覆gelatin的培养皿中。
进一步，所述纤维软骨细胞汇合的汇合度为90％-95％。
进一步，所述纤维软骨细胞汇合后使用DPBS清洗。
进一步，所述消化使用的Trypsin-EDTA的质量百分比为0.25％。
进一步，所述消化的时间为3min。
进一步，所述消化的环境为37℃，5％CO2的培养箱。
进一步，所述终止消化使用的培养基为含FBS的培养基。
进一步，所述按比例传代的比例为1：6或1：12。
进一步，所述预先涂覆gelatin的质量百分比为0.2％。
在某些的具体的实施方案中，所述纤维软骨细胞的高扩增高传代的方法包括如下步骤：将具备纤维软骨细胞增殖特性的纤维软骨细胞进行汇合，待纤维软骨细胞汇合度达到90-95％时，使用DPBS清洗，然后添加0.25％Trypsin-EDTA在37℃，5％CO2培养箱消化3min，然后使用含FBS的培养基终止消化，随后1200rpm 3min离心收集细胞沉淀，再按照1：6或1：12比例传代，使用前面所述的10％TY扩增培养基重悬细胞，接种于0.2％gelatin预先涂覆的培养皿中。
本发明提供了ITS-G、FBS、PUNO1-TGFβ3、SAG、FGF-2、PDGF-BB、Dexamethasone、GlutaMAX、NEAA、Penicilin-Streptomycin、DMEM/F12培养液的组合在制备能够持续扩增并维持纤维软骨细胞特性的纤维软骨细胞的产品中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明解决分化的纤维软骨细胞增殖能力差、无法传代的难题，本发明通过调控PUNO1-TGFβ3、SHH、视黄酸RA信号通路，历经近轴中胚层PM-TSPCs肌腱祖细胞过渡，建立并优化了从hiPSCs高效地衍生高再生能力的纤维软骨细胞的方法。同时，我们也优化了一种体外可大量扩增并维持纤维软骨细胞特性的培养基10％TY。未来将进一步测试这些纤维软骨细胞的力学功能，并开发致密结缔组织再生修复的潜在疗法。
附图说明
图1是不同TGF-β因子诱导分化纤维软骨细胞阿利新蓝染色和传代后细胞生长图；
图2是分化第12天纤维软骨细胞活死细胞染色图；
图3是AGN1纤维软骨细胞甲苯胺蓝和阿利新蓝染色图；
图4是纤维软骨细胞增殖曲线和倍增时间统计结果图；
图5是qPCR检测传代过程中纤维软骨标志物的基因表达水平图；
图6是纤维软骨细胞在裸鼠皮下形成的纤维软骨组织图。
具体实施方式
实施例1从hiPSCs分化纤维软骨细胞的方法
1、实验材料
E8 complate medium(Stem Cell,#05990)；Y27632/Rocki(abcam,ab120129)；CHIR-99021(Selleck,S1263)；LDN193189(Selleck,S2618)；TrypLE(Gibco,12604-021)；AGN193109(MCE,HY-U00449)；PUNO1-TGF-β3(invivoGen)；TGFβ3(peprotech,100-36E)；TGF-β1(Cellapybio,CA32002)；SAG(Selleck,S7779)；Matrigel(Corning,354277)；0.25％Trypsin-EDTA(Gibco,2520072)；Fetal Bovine Serum(Cellma,SA211.02)；DMEM/F12 withhepes(Gibco,11320-033)；Penicilin-Streptomycin(HyClone,SV30010)；Beta-Mercaptoethanol(1000×)(Gibco,21985-023)；Dexamethasone(MK-125)(Selleck,S1322)；Insulin-Transferrin-Selenium(ITS-G)(100×)(Gibco,41400045)；FGF-2(peprotech,AF-100-18B)；PDGF-BB(MCE,HY-P7055)；MEM NEAA(Gibco,11140050)；GlutaMax(Gibco,35050061)；Gelatin(Sigma,48722)
2、实验方法
A、分化方法
1)将hiPSCs细胞用Tryp.LE消化成单细胞，调整细胞浓度为1.5×106cells/mL，离心并用含10μM Rocki的E8完全培养基重悬，接种于低吸附6孔板悬浮培养过夜后形成EB球；
2)更换为含有250nM LDN193189的E8完全培养基诱导培养2天；
3)EB球接种于Matrigel-coated的12孔板，更换为含有250nM LDN193189、5μMCHIR-99021、100nMAGN193109的E8完全培养基处理4天；
4)更换为含有1％ITS-G、10ng/ml PUNO1-TGF-β3、300nM SAG、20ng/ml FGF-2、100nMAGN193109的DMEM/F12培养基，培养6天，分化结束。
B、扩增传代方法
将分化得到的纤维软骨细胞收集，待纤维软骨细胞汇合度达到90-95％时，DPBS清洗，0.25％Trypsin-EDTA于37℃5％CO2培养箱消化3min，使用含FBS的培养基终止消化，1200rpm 3min离心收集细胞沉淀，按照1：6或1：12比例传代，10％TY扩增培养基重悬细胞，接种于0.2％gelatin预先涂覆的培养皿中。
扩增培养基10％TY的组分包括1％ITS-G、10％FBS、10ng/ml PUNO1-TGFβ3、100nMSAG、20ng/ml FGF-2、2ng/ml PDGF-BB、100nM Dexamethasone、1％GlutaMAX、1％NEAA、1％Penicilin-Streptomycin。
实施例2纤维软骨细胞鉴定
1、实验材料
PBS缓冲液(索莱宝，P1003)；甲苯胺蓝染液(索莱宝，G2543)；阿利新蓝染色试剂盒PH2.5(索莱宝，G2542)；无菌去离子水。
2、实验方法
按照实施例1中所述hiPSCs分化纤维软骨细胞的方法，纤维软骨细胞经4次传代(P4)，调整细胞浓度为2×104cells/孔接种于0.2％gelatin预先涂覆的12孔板，待细胞生长汇合度达80-90％时，其培养液并用DPBS洗一遍，4％PFA室温固定30min。依据试剂供应商提供的使用说明书进行甲苯胺蓝和阿利新蓝染色，fibriblasts为对照组。
甲苯胺蓝染色：将固定好的纤维软骨细胞用无菌去离子水洗2min；然后，甲苯胺蓝染色液浸染30min，无菌去离子水洗2min去掉残余的染色液，纤维软骨细胞呈现清晰的蓝紫色。电子显微镜(CKX53PH,olympus)明场采集照片。
阿利新蓝染色：将固定好的纤维软骨细胞用无菌去离子水洗2min；入Alcian酸化液浸泡3min；然后，入Alcian染色液(PH2.5)浸染30min；无菌去离子水洗2min去掉残余的染色液，纤维软骨细胞呈现蓝色。电子显微镜(CKX53PH,olympus)明场采集照片。
3、实验结果
本分化方法对比现有技术的分化方法，得到结果如图1所示，结果表明，本分化方法中PUNO1-TGFβ3促软骨细胞增殖和分化，分化获得高再生能力的纤维软骨细胞，所获得的纤维软骨细胞经首次传代后培养72h细胞生长形态可知，对照使用TGF-β1分化的细胞不增殖且逐渐凋亡。图1结果显示，与TGF-β1组相比，TGF-β3诱导hiPSCs分化纤维软骨细胞比例更高，表现为阿利新蓝阳性面积更高，且细胞增殖速度更快，PUNO1-TGFβ3实验例的纤维软骨细胞生长活性较高。
对照试验到12天时出现了大量细胞凋亡，结果如图2所示，而在图2结果中本发明使用的分化方法不存在细胞死亡的情况，效果优异。以fibroblasts作为对照，hiPSCs分化获得的纤维软骨细胞AGN1经过4次传代培养，依然能够被甲苯胺蓝和阿利新蓝着色，证明这些细胞是纤维软骨细胞，结果如图3所示。实施例3纤维软骨细胞增殖能力测试和软骨特性维持
1、实验材料
Hoechest33342(Beyotime,C1028)；DPBS(Hyclone,SH30028.02)；cck8(YEASEN,40203ES76)。
2、实验方法
按照实施例1中所述hiPSCs分化纤维软骨细胞的方法，纤维软骨细胞传代至P5(第5代)和P11(第11代)，准备测试增殖曲线和倍增时间。
cck8测试细胞增殖：在第0天时，96孔板接种AGN1细胞2000个/孔，做10个平行孔，共计5块板；次日，弃掉培养基，加入体积比培养基：cck8＝10:1并混匀，每孔加入100μL于37℃5％CO2培养箱孵育2h，留出3个cck8无细胞孔(本底)，thermo酶标仪450nm测吸光度OD值。
倍增时间统计(P6和P12)：接种细胞数目(24孔板，20000个/孔)，3-4个平行孔和计时，细胞汇合度达到90-95％时，0.25％Trypsin-EDTA消化细胞进行计数。根据公式计算倍增时间：PDT＝t×[log2/(logNt-logN0)]，其中，t为细胞培养的总时间(h)，Nt是培养t时间后细胞的数量，N0是初始接种的细胞数量。
qPCR检测传代过程中纤维软骨标志物的基因表达水平：取传代过程中(P3、P6和P12)不同代数的纤维软骨细胞，trizol裂解细胞，提取RNA和反转录。使用实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480II,Roche)进行qPCR检测Sox9、ACAN、Col 1A1、Col 2A1、Col 1A2、FSP1、a-SMA、Oct4的基因表达水平。
3、实验结果
cck8增殖曲线与倍增时间统计结果如图4所示，cck8增殖曲线结果表明，纤维软骨细胞AGN1可以在体外大量增殖，代数(P12)越高增殖相对更慢。倍增时间统计结果也表明，随着细胞代数增加AGN1细胞的群体倍增时间也随之增加。
以hiPSCs为对照，检测纤维软骨细胞传代过程中(P3，P6和P12)基因标志物的表达水平，结果如图5所示。结果显示，AGN1纤维软骨细胞均高表达软骨细胞(Sox9/ACAN/COL2A1)和成纤维细胞(FSP1和a-SMA)标志物，表明AGN1纤维软骨细胞可以在体外扩增并维持纤维软骨特性。
实施例4体内形成永生化纤维软骨细胞
1、实验材料
6-8周龄NOD SCID雌性小鼠；1mL注射器(KDL)；基质胶Matrigel(Corning,354277)；collagen type I rat tail(Corning,354236)。
2、实验方法
按照实施例1中所述hiPSCs分化纤维软骨细胞的方法，将纤维软骨细胞传代至P6，待细胞生长汇合度达90％时，0.25％Typsin-EDTA于37℃，5％CO2培养箱消化3min，然后使用含FBS的培养基终止消化，1200rpm 3min离心收集细胞沉淀。细胞计数，取1.5×107AGN1纤维软骨细胞混合50％体积的Matrigel+collagen type I+DMEM/F12(100uL Matrigel+0.4mg collagen type I+50uL DMEM/F12)，裸鼠腹股沟处单点皮下注射，6-8周后取材。
3、实验结果
纤维软骨细胞AGN1 P6(第6代)注射裸鼠皮下，6周后取材观察形成0.5×0.4×0.4cm非透明的纤维软骨组织，形成的纤维软骨组织的结果如图6所示，结果表明，注入裸鼠皮下的AGN1纤维软骨细胞形成永生化的纤维软骨组织，其纤维软骨细胞的特性没有丢失，表现优异。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (18)
1.一种产品，其特征在于，所述产品用于制备高再生传代能力的纤维软骨细胞；所述产品包括培养基1、培养基2、培养基3和培养基4；其中，所述培养基1是含有Rocki的E8完全培养基，所述培养基2是含有LDN193189的E8完全培养基，所述培养基3是含有LDN193189、CHIR-99021和AGN193109的E8完全培养基，所述培养基4是含有ITS-G、PUNO1-TGF-β3、SAG、FGF-2和AGN193109的DMEM/F12营养液，所述PUNO1-TGF-β3来源于invivoGen公司；
所述培养基1中的组分Rocki的浓度为10 μM；
所述培养基2中的组分LDN193189的浓度为250 nM；
所述培养基3中的组分LDN193189的浓度为250 nM；
所述培养基3中的组分CHIR-99021的浓度为5 μM；
所述培养基3中的组分AGN193109的浓度为100 nM；
所述培养基4中的组分ITS-G的质量百分比为1%；
所述培养基4中的组分PUNO1-TGF-β3的浓度为10 ng/ml；
所述培养基4中的组分SAG的浓度为300 nM；
所述培养基4中的组分FGF-2的浓度为20 ng/ml；
所述培养基4中的组分AGN193109的浓度为100 nM。
2.一种高再生传代能力的纤维软骨细胞的分化方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1）将iPS细胞消化成单细胞，离心并使用权利要求1所述的培养基1重悬，接种到低吸附培养皿上过夜形成EB球；
2）更换权利要求1所述的培养基2诱导培养2天；
3）接种于基质胶包被板中，更换权利要求1所述的培养基3培养4天；
4）更换权利要求1所述的培养基4，培养6天，分化结束。
3.根据权利要求2所述的分化方法，其特征在于，所述分化方法步骤1）中iPS细胞消化使用的试剂为TrypLE。
4.根据权利要求2所述的分化方法，所述iPS细胞为hiPSCs。
5.根据权利要求2所述的分化方法，所述步骤1）消化成的单细胞的浓度为1.5×106 cells/mL。
6.根据权利要求2所述的分化方法，所述步骤1）接种的培养皿为低吸附孔板。
7.根据权利要求2所述的分化方法，所述步骤3）接种基质胶包被板为Matrigel-coated的12孔板。
8.一种10% TY扩增培养基，其特征在于，所述10% TY扩增培养基能够大量扩增并维持纤维软骨细胞特性；所述10% TY扩增培养基是包括ITS-G、FBS、PUNO1-TGF-β3、SAG、FGF-2、PDGF-BB、Dexamethasone、GlutaMAX、NEAA、Penicilin-Streptomycin的DMEM/F12培养基，所述PUNO1-TGF-β3来源于invivoGen公司；
所述ITS-G的质量百分比为1%；
所述FBS的质量百分比为10%；
所述PUNO1-TGF-β3的浓度为10 ng/ml；
所述SAG的浓度为100 nM；
所述FGF-2的浓度为20 ng/ml；
所述PDGF-BB的浓度为2 ng/ml；
所述Dexamethasone的浓度为100 nM；
所述GlutaMAX的质量百分比为1%；
所述NEAA的质量百分比为1%；
所述Penicilin-Streptomycin的质量百分比为1%。
9.一种纤维软骨细胞的高扩增传代的方法，其特征在于，所述方法将权利要求2-7任一项所述的方法制备得到的纤维软骨细胞汇合，清洗，Trypsin-EDTA消化，终止消化，离心收集细胞沉淀，按比例传代，使用权利要求8所述的10%TY扩增培养基重悬细胞，接种于预先涂覆gelatin的培养皿中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述纤维软骨细胞汇合的汇合度为90%-95%。
11.根据权利要求9所述的方法，所述纤维软骨细胞汇合后使用DPBS清洗。
12.根据权利要求9所述的方法，所述消化使用的Trypsin-EDTA的质量百分比为0.25%。
13.根据权利要求9所述的方法，所述消化的时间为3 min。
14.根据权利要求9所述的方法，所述消化的环境为37℃，5% CO2的培养箱。
15.根据权利要求9所述的方法，所述终止消化使用的培养基为含FBS的培养基。
16.根据权利要求9所述的方法，所述按比例传代的比例为1：6或1：12。
17.根据权利要求9所述的方法，所述预先涂覆gelatin的质量百分比为0.2%。
18.权利要求8所述10% TY扩增培养基在制备能够持续扩增并维持纤维软骨细胞特性的纤维软骨细胞的产品中的应用。
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| WO2009047346A1 (en) * | 2007-10-11 | 2009-04-16 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for preparing porous scaffold for tissue engineering, cell culture and cell delivery |
| WO2014052912A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Scripps Health | Methods of differentiating stem cells into chondrocytes |
| US10787640B2 (en) * | 2015-03-03 | 2020-09-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Producing mesodermal cell types and methods of using the same |
| WO2018135902A1 (ko) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법 |
| RU2690498C1 (ru) * | 2018-05-17 | 2019-06-04 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" | Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека |
| JPWO2020235319A1 (zh) * | 2019-05-20 | 2020-11-26 | ||
| SMT202400473T1 (it) * | 2019-08-14 | 2025-01-14 | Vanarix Sa | Metodo per la produzione in vitro di tessuto cartilagineo ialino |
| WO2021041858A1 (en) * | 2019-08-29 | 2021-03-04 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Differentiated tendon cells derived from pluripotent progenitor cells and methods of use thereof |
| WO2022251477A1 (en) * | 2021-05-28 | 2022-12-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Biodegradable tissue scaffold with secondary matrix to host weakly adherent cells |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118355110A (zh) * | 2021-10-14 | 2024-07-16 | 默多克儿童研究所 | 产生软骨和骨的方法 |
| CN118109397A (zh) * | 2022-11-30 | 2024-05-31 | 北赛泓升(北京)生物科技有限公司 | 人多能干细胞分化来源的软骨微组织的制备方法及用途 |
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