CN117126750B - 一种非致病尖孢镰刀菌j2菌株及其在三七生物防治以及促生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非致病尖孢镰刀菌J2菌株及其应用，属于微生物技术领域。所述尖孢镰刀菌J2菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年6月28日，保藏编号为CGMCC No.40712。所述尖孢镰刀菌J2菌株可以防治三七根腐病、三七黑斑病，有效减少上述病害对三七的危害，并且该菌还能促进三七生长以及缓解三七连作障碍，可显著提高三七的出苗率和存苗率，并且显著提高三七植株单株鲜重以及干重。

Description

一种非致病尖孢镰刀菌J2菌株及其在三七生物防治以及促生 长中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种非致病尖孢镰刀菌J2菌株及其在三七生物防治以及促生长中的应用。

背景技术

云南是三七的原产地和主产区，三七性喜温暖阴湿，其独特的生长环境容易诱发多种土传病害。由于三七神奇的药用功效，全球对三七及其相关产品的需求日益增加，由于三七具有严重的连作障碍，导致可供种植三七的土地越来越少。随着三七种植年限的增加，土传病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加，严重损害三七的产量和质量，其中最主要的病害为根腐病。

根腐病是由于土壤中微生物失调，大量病原真菌侵染三七植株根部导致的，土壤中微生物失调是导致三七连作障碍的一个重要因素，目前常用的治理方法主要是施用杀菌剂，但是效果越来越不理想，而采用高效熏蒸剂进行土壤灭生处理，然后再补充益生菌剂调整微生物区系使土壤活化和健化的方法则成本较高，效果也不理想。

镰刀菌属广泛存在于土壤和植物中，其中尖孢镰刀菌是一种重要的土壤习居菌。根据致病性的不同，尖孢镰刀菌可以分为致病性与非致病性两大类。致病性尖孢镰刀菌是引起根腐病和黄萎病的重要病原菌，它能危害蔬菜作物、经济作物和粮食作物等多种农作物，并带来严重的经济损失。而非致病镰刀菌虽能入侵植株根系，但多数定殖于植物外皮层而不会入侵到维管束系统中，不仅不会造成植物发生病害，还在茄科和葫芦科作物的生物防治中应用广泛。根际有益微生物不仅能够促进植物生长并且能提高植物的抗性水平，促生作用的机制主要是使植物获得水分、无机盐、营养物质的能力提高。微生物能分泌植物激素类物质，产生抗生促进作用、重寄生作用，并诱导植物抗性产生。有益微生物在植物病害预防和菌肥生产方面也有着巨大发展潜力。但是目前鲜有非致病尖孢镰刀菌对于三七生防应用的报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种非致病尖孢镰刀菌J2菌株及其应用，利用该菌可以防治三七根腐病、三七黑斑病，有效减少该病害对于三七的危害，并且该菌还能促进三七生长以及缓解三七连作障碍，可显著提高三七的出苗率和存苗率，并且显著提高三七植株单株鲜重以及干重。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种非致病尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)J2菌株，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2023年6月28日；保藏编号为CGMCCNo.40712。

在第二个方面中，本发明提供了所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在防治三七根腐病、三七黑斑病中的应用。

在第三个方面中，本发明提供了所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在制备防治三七根腐病、三七黑斑病的微生物制剂中的应用。

在第四个方面中，本发明提供了所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在促进三七生长中的应用。

在第五个方面中，本发明提供了所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在制备三七生长促进剂中的应用。

在第六个方面中，本发明提供了所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在缓解三七连作障碍中的应用。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明提供的非致病尖孢镰刀菌J2菌株能显著抑制三七根腐病主要病原菌的生长，可以防治三七根腐病、三七黑斑病，有效减少上述病害对三七的危害；并且该菌还能促进三七生长以及缓解三七连作障碍，可显著提高三七的出苗率和存苗率，并且显著提高三七植株单株鲜重以及干重。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中，*表示经t检验法检验与对照相比在P<0.05水平差异显著：

图1为非致病尖孢镰刀菌J-2菌株在PDA培养基上的形态学特征图，其中a和b为菌落形态图，c为菌丝形态图，d为大型分生孢子和小型分生孢子形态图。

图2为非致病尖孢镰刀菌J-2菌株与三七根腐病主要病原菌对峙培养5天后的平板图及对照图。

图3为非致病尖孢镰刀菌J2菌株增强三七植株对黑斑病的抗性示意图。

图4为非致病尖孢镰刀菌J2菌株对三七出苗率、存苗率及生物量的影响示意图。

图5为非致病尖孢镰刀菌J2菌株对连作土种植三七出苗率、存苗率及生物量的影响示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1：非致病尖孢镰刀菌J2菌株的分离及鉴定

(1)菌株的分离与纯化

称取三七根际土10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中，25℃摇床振荡培养30min，然后进行10倍梯度稀释至10^-1、10^-2。吸取稀释液0.1mL放入添加有硫酸链霉素(100ppm)的PDA平板上均匀涂布，在28℃恒温培养箱中倒置培养1-3d，定期观察；待培养皿中长出疑似菌落后，立即进行挑取并转移到新鲜的PDA平板上进行编号保存；从菌落边缘挑取菌丝进行纯化，得到如图1所示的纯培养物。所述PDA平板组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。

(2)菌株的鉴定

提取分离纯化后菌株的基因组DNA，采用以下3对引物进行PCR扩增：

①上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3’，和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

将上述扩增序列在NCBI数据库中进行比对，用BLAST比对后与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum相似度最高，结合形态学鉴定，确定分类命名为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，菌株命名为J2。

所述尖孢镰刀菌J2菌株在葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养5d，如图1所示，该菌株可长满直径为9cm的培养皿，菌落边缘整齐，菌落中心为浅紫色，边缘为白色，菌丝发达致密，分生孢子梗分枝，有隔，分生孢子有两种类型，大型分生孢子呈镰刀型或弯月型，两端稍尖，中间略弯曲，具有2-3个分隔；而小型分生孢子则呈卵圆形，未观察到明显分隔。

实施例2：非致病尖孢镰刀菌J2菌株对三七根腐病主要病原菌生长的抑制率测定

采用平板对峙法将尖孢镰刀菌J2菌株与三七根腐病主要病原菌进行共培养。供试三七根腐病病原菌株有：恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)D-1、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)RS6、RS8和CD-9、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)F3、雪腐镰刀菌(Monographella cucumerina)M共6株。将直径为5mm的尖孢镰刀菌J2菌株和供试三七根腐病病原菌菌饼接种在PDA培养基上，彼此之间的距离约为3cm。每处理6次重复，对照为只接种病原菌，于28℃恒温培养箱培养，待同一皿中的两株菌落边界开始有交集时，测量供试根腐病菌的菌落半径，计算抑制率。

抑制率(％)＝(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径×100

结果如图2和表1所示，尖孢镰刀菌J2菌株能显著抑制三七根腐病主要病原菌的生长，与对照相比，供试6个三七根腐病病原菌的生长被显著抑制，其中对恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)D-1生长的抑制率达62.16％。

表1：非致病尖孢镰刀菌J2菌株对三七根腐病主要病原菌生长的抑制率

实施例3：非致病尖孢镰刀菌J2菌株在诱导植株抗性防治三七黑斑病中的应用

制备尖孢镰刀菌J2菌株分生孢子悬浮液，制备方法包括以下步骤：

(1)将尖孢镰刀菌J2菌株接种于PDA培养基上培养，得到尖孢镰刀菌J2菌株菌落；

(2)在步骤(1)的培养皿中加入10mL无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到尖孢镰刀菌J2分生孢子悬浮液。调节悬浮液的浓度为1×10⁶CFU/mL。

通过使用尖孢镰刀菌J2菌株50mL分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理72h后，用保鲜膜包住花盆，使用1％次氯酸钠对三七叶片表面进行消毒，然后喷施无菌水简单清洗，每株接种2叶，每叶接种一个直径为5mm的三七黑斑病病原菌Alternariapanax菌饼，设置6个重复，将接种完的盆栽置于白色透明整理箱中，在光照强度2000lux，温度24℃，12h光暗交替的生长间中保湿培养5d后，收集被接种叶片，利用扫描仪扫描病斑，并用AdobePhotoshop CS6计算病斑面积。结果如图3所示，可以看出，三七病斑面积显著降低。

实施例4：非致病尖孢镰刀菌J2菌株在促进三七生长中的应用

制备尖孢镰刀菌J2菌株分生孢子悬浮液，包括以下步骤：

(1)将尖孢镰刀菌J2菌株接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养5d，得到尖孢镰刀菌J2菌株菌落。所述葡萄糖马铃薯琼脂培养基组成为：200g/L的马铃薯、20g/L葡萄糖、15g/L琼脂。

(2)在步骤(1)的培养皿中加入10mL无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到尖孢镰刀菌J2菌株分生孢子悬浮液。调整悬浮液的浓度为1×10⁶CFU/mL。

(3)将自然土装入花盆中，将浓度为1×10⁶CFU/mL的尖孢镰刀菌J2分生孢子悬浮液均匀浇灌于花盆中，每盆50mL，每隔7天用制备的分生孢子悬浮液浇灌一次，以浇灌相同体积的灭菌水作为对照，每个处理12盆，共浇灌4次，最后一次浇灌后7天收集花盆中的处理土，过60目土壤筛，混匀后称取200g装入洁净的组培瓶中，播种健康饱满的三七种子，每瓶10颗，每个处理12瓶，自然条件下培养3个月，待出苗后统计出苗率，随后每隔14天统计一次存苗率，培养60天待最后一次统计存苗率后，将三七根系洗净擦干表面水分，称重记录植株单株鲜重以及烘干后的植株干重。

结果如图4所示，通过使用浓度为1×10⁶CFU/mL的尖孢镰刀菌J2分生孢子悬浮液对自然土进行播种前处理，可提高三七的出苗率和存苗率，使存苗率达到70％以上，并且显著提高三七植株单株鲜重以及干重。

实施例5：非致病尖孢镰刀菌J2菌株在缓解三七连作障碍中的应用

制备尖孢镰刀菌J2菌株分生孢子悬浮液，包括以下步骤：

(1)将尖孢镰刀菌J2菌株接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养5d，得到尖孢镰刀菌J2菌株菌落。所述葡萄糖马铃薯琼脂培养基组成为：200g/L的马铃薯、20g/L葡萄糖、15g/L琼脂。

(2)在步骤(1)的培养皿中加入10mL无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到尖孢镰刀菌J2菌株分生孢子悬浮液。调整悬浮液的浓度为1×10⁶CFU/mL。

(3)将连续种植三七一年的连作土装入花盆中，将浓度为1×10⁶CFU/mL的尖孢镰刀菌J2分生孢子悬浮液均匀浇灌于花盆中，每盆50mL，每隔7天用制备的分生孢子悬浮液浇灌一次，以浇灌相同体积的灭菌水作为对照，每个处理12盆，共浇灌4次，最后一次浇灌后7天收集花盆中的处理土，过60目土壤筛，混匀后称取200g装入洁净的组培瓶中，播种健康饱满的三七种子，每瓶10颗，每个处理12瓶，自然条件下培养3个月，待出苗后统计出苗率，随后每隔14天统计一次存苗率，培养60天待最后一次统计存苗率后，将三七根系洗净擦干表面水分，称重记录植株单株鲜重以及烘干后的植株干重。

结果如图5所示，通过使用浓度为1×10⁶CFU/mL的尖孢镰刀菌J2分生孢子悬浮液对连作土进行播种前处理，可显著提高三七的出苗率和存苗率，使出苗率达到80％以上，存苗率达到70％以上，并且显著提高三七植株单株鲜重以及干重。

显然，上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种非致病尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)J2菌株，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2023年6月28日；保藏编号为CGMCC No.40712。

2.权利要求1所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在防治三七根腐病、三七黑斑病中的应用。

3.权利要求1所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在制备防治三七根腐病、三七黑斑病的微生物制剂中的应用。

4.权利要求1所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在促进三七生长中的应用。

5.权利要求1所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在制备三七生长促进剂中的应用。

6.权利要求1所述的非致病尖孢镰刀菌J2菌株或其孢子悬浮液在缓解三七连作障碍中的应用。