CN117106966B - 一种检测格特隐球菌的引物对、方法以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种检测格特隐球菌的引物对、方法以及试剂盒。其中，该引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。通过本申请提供的引物对能够准确地检测格特隐球菌，帮助临床快速准确地诊断格特隐球菌引发的疾病，减少药物滥用。

Description

一种检测格特隐球菌的引物对、方法以及试剂盒

技术领域

本发明属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种检测格特隐球菌的引物对、方法以及试剂盒。

背景技术

新生隐球菌和格特隐球菌是两种主要的引起人体感染的致病隐球菌。新生隐球菌与格特隐球菌在流行性、致病性、症状及诊断治疗方面均有明显差异。因此，在临床上区分两种隐球菌具有重要的意义。

目前的隐球菌检测方法有墨汁染色法、培养鉴定法、抗原检测法等。其中，墨汁染色法的敏感度较低；培养鉴定法耗时较长，不利于临床快速诊断；抗原检测法可以快速检测隐球菌但并不能进一步区分隐球菌的种类。因此，如何准确地检测并鉴定格特隐球菌是一项亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供了一种检测格特隐球菌的引物对、方法、试剂盒以及该引物对在检测格特隐球菌中的应用，通过针对格特隐球菌的特定基因片段设计对应的引物对，能够准确地检测格特隐球菌，帮助提高格特隐球菌检测的准确性。

第一方面，本申请提供一种检测格特隐球菌的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

在一些实施例中，所述引物对用于识别所述格特隐球菌中如Seq ID No.3所示的核苷酸序列。

第二方面，提供一种检测格特隐球菌的方法，所述方法包括：获取待测样本的模板DNA；对所通过聚合酶链式反应PCR对所述模板DNA进行扩增以获取扩增结果，其中所述PCR的反应物包括第一方面任一实施例中的引物对和荧光染料；根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述格特隐球菌的检测结果为阳性或阴性。

在一些实施例中，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述格特隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：在所述扩增结果中所述待测样本有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，确定所述待测样本中的所述格特隐球菌的检测结果为阳性；或在所述扩增结果中所述待测样本没有荧光对数增长，确定所述待测样本中的所述格特隐球菌的检测结果为阴性；或在所述扩增结果中所述待测样本有荧光对数增长且循环阈值Ct大于30.0的情况下，确定所述待测样本中的所述格特隐球菌的检测结果为阴性。

第三方面，提供一种检测格特隐球菌的试剂盒，所述试剂盒包括本申请任一实施例中的引物对。

在一些实施例中，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷三磷酸dNTP。

第四方面，提供一种本申请任一实施例中的引物对在检测格特隐球菌中的应用。

附图说明

图1为本申请实施例一种格特隐球菌的检测方法的示意性流程图。

图2为本申请实施例一种格特隐球菌的特异性扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请的技术方案作进一步介绍。

本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。在本申请中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。另外，当表述某个参数为≥2的整数，则相当于公开了该参数为例如整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等。

在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

如果没有特别的说明，本申请所提到的“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分，也可以仅包括或包含列出的组分。

如果没有特别的说明，在本申请中，术语“或”是包括性的。举例来说，短语“A或B”表示“A，B，或A和B两者”。更具体地，以下任一条件均满足条件“A或B”：A为真（或存在）并且B为假（或不存在）；A为假（或不存在）而B为真（或存在）；或A和B都为真（或存在）。

如果没有特别的说明，本申请的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

目前隐球菌属的种类较多，在自然界分布广泛，与人类感染最密切的主要有新生隐球菌和格特隐球菌，他们均可导致人类肺部或中枢神经系统隐球菌病，也可致全身播散性感染。格特隐球菌曾引起加拿大温哥华地区及美国西北部地区爆发流行，近年来欧洲和我国也有感染病例报告，在我国，格特隐球菌主要分布在上海、江苏、福建、浙江、广东、海南、河北等省份，新生隐球菌各地均有散发病例。新生隐球菌主要感染免疫缺陷患者，格特隐球菌则主要引起免疫正常人群患病。因此，临床上需要区分两种隐球菌，以避免误诊、减少药物滥用。

目前隐球菌的检测方法主要有墨汁染色法、培养鉴定法、抗原检测法、抗体检测法、核酸检测法等。

其中，基于实时荧光PCR的核酸检测技术经过二十多年的实践，不断改进并完善，逐渐成为临床分子诊断最成熟的核酸检测方法之一，其融汇了PCR技术的核酸高效扩增、基因扩增的灵敏性、分子杂交的特异性和光谱技术的敏感性及精确定量的特点。

但是由于隐球菌种类繁多，种之间、种属之间(与其他属比如念珠菌属、曲霉属等)的核酸序列同源性较高，引物或探针设计难度较大。同时，整个真菌基因组发生变异的几率远大于人类基因组，使得可选择作为靶基因序列进行种属检测的基因序列难度极大。

有鉴于此，本申请提供了一种检测格特隐球菌的引物对，基于该引物对的聚合酶链式反应PCR能够准确、快捷地进行格特隐球菌检测。

首先本申请实施例提供一种检测格特隐球菌的引物对。

其中，该引物对包括正向引物和反向引物。正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

具体来说，发明人通过生物信息学方法，通过对新生隐球菌、格特隐球菌、金色葡萄球菌、克氏肺炎菌、大肠杆菌、白色念珠菌等细菌的全部基因组进行比较，不局限于单一的编码基因，而是在整个基因组层面寻找差异位点，从而设计出了核苷酸序列如Seq IDNo.1和Seq ID No.2所示的引物对。该引物对能够特异性识别只有格特隐球菌才有的如SeqID No.3所示的核苷酸序列。利用该引物对进行格特隐球菌检测能够高效、准确地检测格特隐球菌。

正向引物的核苷酸序列具体为：

CGTATCACCAAGCCCTGCTC。

反向引物的核苷酸序列具体为：

GGACGAGGACGATGAATCAGA。

该引物对用于识别格特隐球菌中如Seq ID No.3所示的核苷酸序列。换言之，针对格特隐球菌设计的引物对能够特异性识别格特隐球菌中如Seq ID No.3所示的核苷酸序列。

上述引物对在检测和鉴定格特隐球菌时具有敏感性高、特异性强的明显优势。

本申请实施例还提供一种检测格特隐球菌的方法100。

图1为本申请实施例检测格特隐球菌的方法100的示意性流程图。如图1所示，方法100包括：

S101，获取待测样本的模板DNA。

S102，通过聚合酶链式反应PCR对模板DNA进行扩增以获取扩增结果。其中，PCR的反应物包括本申请任一实施例中的引物对和荧光染料。

S103，根据扩增结果判断待测样本中格特隐球菌的检测结果为阳性或阴性。

具体来说，S102中的荧光染料能够对DNA进行染色而不与DNA单链进行结合，其在游离状态下不发光，只有掺入DNA双链中才发光。示例性地，SYBR Green染料。在PCR扩增反应中，能够随着PCR特异性产物的指数扩增而使得荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。由此，本申请提供的上述引物探针组合通过荧光定量PCR能够有效检测待测样本中是否存在格特隐球菌。

可选地，待测样本包括血液、体液、和/或肺部组织。

可选地，在S103中，根据扩增结果判断待测样本中格特隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：

在荧光对数有增长且Ct小于或等于30.0的情况下，判断待测样本中格特隐球菌为阳性；或

在荧光对数没有增长的情况下，判断待测样本中格特隐球菌为阴性；或

在荧光对数有增长且Ct大于30.0的情况下，判断待测样本中格特隐球菌为阴性。

本申请实施例还提供一种检测格特隐球菌的试剂盒，该试剂盒包括本申请任一实施例中的引物对。

可选地，该试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷酸三磷酸dNTP。

可选地，该试剂盒还包括MgCl₂。

使用本申请实施例提供的试剂盒，能够准确、快速地检测格特隐球菌，并且具有操作简单、检测时间短、适应性强的优势，能够满足临床快速诊断的需求，为治疗方案的指定提供可靠的依据，为疾病的治疗节省宝贵的时间。

另外，本申请实施例还提供一种如上述任一实施例中的引物对在检测格特隐球菌中的应用。

接下来，对本申请提供的检测方法100的具体步骤做进一步介绍。应理解，下述实施例仅为了说明本申请的鉴定方法的实施方式，其中具体试剂用量或仪器的使用可根据需要调整，不构成对本申请实施例的限定。

实施例1：基因组DNA的提取

一、试验材料：待测样本

本申请所述的待测样本包括但不限于血液、体液或肺部组织。

二、主要试剂与仪器

DNA提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；Quanti Fast SYBR® Green PCR Kit购自Qiagen公司；荧光定量PCR仪购于Roche公司。

三、实验方法

按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，使用分光光度计，测定样品中DNA含量，测定OD260/OD280比值。本实施例中提供的待测样本中含有新生隐球菌和格特隐球菌。

实施例2：PCR扩增反应

2.1 隐球菌的PCR检测

一、试验材料

基因组DNA。具体的PCR反应体系详见表1。

二、主要试剂与仪器

表1：实时荧光PCR反应体系 (25 μL)

三、实验方法

本实施例采用Qiagen公司的Quanti Fast SYBR® Green PCR Kit的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增反应，PCR扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书。

本实施例中，正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

本实施例中，PCR反应的扩增条件为：95^oC预变性5min；95^oC 10s，68^oC 60s，45个循环，获得扩增结果。

四、分析判断扩增结果

图2为本申请实施例通过上述操作得到的格特隐球菌的扩增曲线。图2的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位(Relative fluorescence unit, RFU)，横坐标为扩增的循环数目(cycle)。

如图2所示，在对待测样本的检测结果中，格特隐球菌被特异性扩增，具有荧光对数增长以及相应的扩增曲线，且Ct≤30.0。而平行实验的新生隐球菌无特异性扩增曲线。说明该引物对对格特隐球菌具有良好的特异性，能够特异性识别格特隐球菌中如Seq IDNo.3所示的核苷酸序列，即能够准确识别待测样本中的格特隐球菌，且不会导致新生隐球菌的非特异性扩增。并且格特隐球菌的3条扩增曲线均具有几乎一致的荧光对数增长，说明通过该引物对检测格特隐球菌的方法具有良好的重复性。另外，图2中的模板DNA浓度为0.1ng/μL，经过荧光PCR仍能有良好的荧光对数响应，说明通过该引物对检测格特隐球菌的方法具有优异的敏感性。

由此，本申请提供的引物对能够准确、高效地进行格特隐球菌检测。

综上所述，本申请提供的引物对对格特隐球菌具有良好的特异性，使用该引物对检测格特隐球菌的方法具有良好的重复性以及敏感性。通过本申请提供的含有该引物对的检测试剂盒对格特隐球菌进行检测，操作简单且结果可靠准确，能够帮助医师对隐球菌感染的疾病进行快速地诊断，有利于制定合适的治疗方法，减少药物滥用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一种实现方式”、“一些实施例”、“示意性实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种检测格特隐球菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如Seq IDNo.2所示。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对用于识别所述格特隐球菌中如Seq ID No.3所示的核苷酸序列。

3.一种检测格特隐球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷三磷酸dNTP。

5.一种如权利要求1或2所述的引物对在制备检测格特隐球菌的试剂盒中的应用。