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CN117106722A - 一种用于原位肿瘤建模的多层组构及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于原位肿瘤建模的多层组构及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117106722A
CN117106722A CN202311155887.7A CN202311155887A CN117106722A CN 117106722 A CN117106722 A CN 117106722A CN 202311155887 A CN202311155887 A CN 202311155887A CN 117106722 A CN117106722 A CN 117106722A
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CN
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optionally
film
tissue
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layer film
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CN202311155887.7A
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杨鹏
李科
刘永春
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Xi'an Qingxiu Ecological Technology Co ltd
Shaanxi Normal University
Original Assignee
Xi'an Qingxiu Ecological Technology Co ltd
Shaanxi Normal University
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Abstract

本发明提供了一种用于原位肿瘤建模的多层组构及其制备方法和应用，包括粘附层和封护层，及封装在粘附层与封护层之间的肿瘤细胞和/或肿瘤块；所述粘附层和封护层的边缘粘合用于防止肿瘤细胞从侧边或封护层透出；所述粘附层用于依靠膜自身粘性能或通过医用粘合剂与靶器官组织粘合。本发明的多层组构可以使动物多器官/组织上原位/转移肿瘤模型的构建过程成为制式化流程，突破了小型动物薄壁器官组织建模的障碍，过程简单高效、成本低廉、重复性强、成模率高，具有良好的应用前景。

Description

一种用于原位肿瘤建模的多层组构及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种用于原位肿瘤建模的多层组构及其制备方法和应用。
背景技术
将肿瘤细胞(组织)移植到动物体内并以此为模型进行肿瘤发生机制和治疗的研究已经是当前肿瘤研究的常规手段。目前肿瘤治疗所应用的大多数方法，都需要经动物肿瘤模型试验。最简单的肿瘤模型是皮下肿瘤模型，将人类肿瘤(异种移植模型)或小鼠肿瘤(同系移植模型)的细胞(cell derived xenograft,CDX)或组织(tissue derivedxenograft,TDX)接种到小鼠皮下，可直观监测肿瘤生长。然而，皮下肿瘤模型无法反映出肿瘤及其原生组织环境中的复杂性，存在巨大的不足。原位肿瘤模型则是在皮下肿瘤模型的基础上进一步发展，其是将肿瘤细胞或组织块原位移植到建模动物的对应组织器官内，使之产生肿瘤并形成自发性转移灶。原位移植模型能更好的模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境，模拟肿瘤生长甚至转移的过程。近年来，人源肿瘤组织来源移植模型(patient derivedxenograft)引起了人们的巨大兴趣，这种模型是病人新鲜的瘤组织直接移植到小鼠体内而建立的肿瘤模型，与CDX及TDX相比，PDX移植所用标本直接来源于人体肿瘤组织，稳定地保留了肿瘤的遗传特性、组织学和表型特征，即肿瘤异质性，肿瘤的生长微环境更接近人体实际情况，筛药试验结果也具有较好的临床预见性，但存在肿瘤组织活性要求高、样品准备时间短、成瘤率等缺陷。目前PDX主要以皮下种植为主，少量进行原位接种，可以肯定的是原位接种的临床意义会高于皮下接种。
目前，原位肿瘤模型的构建存在诸多障碍。核心是成模效率，这其中涉及到肿瘤细胞及组织活力，以及实验中的各方面条件，尤其是目前大部分原位建模方法都是通过穿刺法将细胞悬液，肿瘤组织匀浆液或者瘤块直接种植于对应脏器或者组织内，这对前期样本准备和种植过程提出了非常高的要求，有不少技术针对于此，如发明专利CN202111119755、CN202111123981。但是，直接接种难免会发生细胞液或者组织碎片外漏，这就造成了非必要的被动转移，这个问题直接接种法是难以避免的。为了提高成功率并减少外泄有研究人员通过将细胞或者组织固定生物材料内部提高样本稳定性和存活率，目前用到的多为3D打印预制法和生物材料支架立体培养法，如发明专利CN202010094635、CN202111661435，这一类方法难度大，设备要求高，尤其是在PDX原位模型构建中难以有效应用。此外还带来了另一个问题，即含有细胞或组织的材料在目标组织上固定的难题，大部分生物材料对于湿润的组织表面都不具备足够的粘性或需要通过其他粘合剂实现组织固定，否则就会出现脱落，依旧会导致建模失败或者非必要转移的问题。另外一个问题就在于目前所涉及的多种方法尤其是穿刺法都会对动物器官或组织产生严重的二次伤害，虽然有很多发明力图减少伤害例如，CN202120096586、CN202022527066，但是在原位建模操作中二次伤害依旧无法避免；此外，在胃肠及膀胱等薄壁器官以及小器官上穿刺法建模几乎难以有效完成，极易造成穿孔等危害动物生命的问题。
所以需要通过合适的材料和可靠的构型来克服原位肿瘤模型建立过程中的各种问题，使原位肿瘤建模过程可以最大化的减少环境和条件带了的影响。二维材料中已有不少专利产品用于生物医药领域，如CN201310241402、CN202210705366。然而，现有技术中还未有将多层级结构二维材料用于肿瘤细胞和组织维持以构建动物肿瘤模型的专利技术公开。
发明内容
发明目的
为克服上述不足，本发明的目的在于提供一种用于原位肿瘤建模的多层组构及其制备方法和应用。
本发明的多层组构可以使动物原位/转移肿瘤模型的构建过程成为制式化流程，突破了小型动物薄壁器官组织建模的障碍，过程简单高效、成本低廉、重复性强、成模率高，具有良好的应用前景。
解决方案
为实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种用于原位肿瘤建模的多层组构，将所述肿瘤细胞和肿瘤块封装在粘附层与封护层之间，边缘完整粘合并将封护层表面进行交联处理以防止肿瘤细胞从侧边和封护层透出，所述粘附层依靠膜自身粘性能或通过医用粘合剂与靶器官组织粘合，贴敷过程中封护层处理面一侧可选择覆盖一层保护层。
进一步地，膜的层数由2到6层。
进一步地，所述封护层膜的厚度为5nm～2mm，可选地为50nm～2mm，可选地为50nm～1mm，可选地为40nm～1.5μm，可选地为90nm～2μm，可选地为90nm～200nm，可选地为500nm～20μm，可选地为500nm～1mm，可选地为10μm～500μm，可选地为100μm～1mm。
一般情况下，封护层的厚度根据膜的材料有关，例如，蛋白膜的厚度可以较薄，可以是nm级，在针对大型动物时也可以通过蛋白浓度控制增加蛋白膜的厚度；因静电纺丝工艺限制，静电纺丝的膜厚度较厚，可以为500nm～1mm。
进一步地，所述粘附层的厚度为40nm～10μm，可选地为90nm～1mm，可选地为40nm～200nm，可选地为1μm～10μm。
进一步地，所述封护层膜或粘附层膜中，膜根据不同动物器官组织及肿瘤细胞或组织样本，裁剪至合适大小，膜面积可选地为0.5mm2～9cm2。
进一步地，所述封护层膜或粘附层膜中，粘附层膜的孔径不小于封护层膜，可选的为1nm～2μm。
进一步地，所述封护层膜或粘附层膜中，膜的杨氏模量为1Gpa～12Gpa，可选地为1Gpa～2Gpa，可选地为3Gpa～5Gpa，可选地为6Gpa～12Gpa。
进一步地，所述封护层膜或粘附层膜中，膜的韧性为0.1kJ/m2～8kJ/m2，可选地为0.1kJ/m2～3.4kJ/m2，可选地为4.1kJ/m2～6kJ/m2，可选地为6.1kJ/m2～8kJ/m2。
进一步地，所述封护层膜或粘附层膜中，膜的粘附强度为0.1kPa～300kPa，可选地为0.1kPa～10kPa，可选地为11kPa～100kPa可选地为100kPa～300kPa。
进一步地，所述封护层膜和粘附层膜的边缘通过膜自身粘性或粘合剂进行粘连，再利用氧化剂进行封闭处理(氧化剂可以使封护层膜变致密，防治肿瘤细胞透过)。
进一步地，所述封护层膜和/粘附层膜为蛋白膜，可选地，蛋白质为乳铁蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白、胰岛素、α-乳白蛋白、人血清白蛋白、纤维蛋白原、β-淀粉样蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、辣根过氧化酶、血红蛋白、血蓝蛋白组蛋白、谷蛋白、胶原酶、卵白蛋白、大豆蛋白、转铁蛋白、甲状腺球蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、粘蛋白中的一种或几种；可选地，所述交联剂选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽、二巯基丁二酸、亚硫酸钠、戊二醛、京尼平、谷氨酰胺转氨酶、碳二亚胺中任意一种或几种；可选地，所述蛋白膜中还含有金属纳米粒子，可选地，所述蛋白膜中含有纳米银；可选地，所述蛋白膜自身具有粘性。可选地，蛋白膜为蛋白质水溶液和交联剂水溶液在气液界面上自组装形成的蛋白质薄膜。蛋白膜也可以采用旋涂法或采用静电纺丝法制备。可选地蛋白膜的封护层的厚度为5nm～2mm，可选地为粘附层的90nm～1mm，保护层厚度为10nm～100nm。
和/或，所述封护层膜和/粘附层膜为静电纺丝二维薄膜，可选地，所述静电纺丝二维薄膜的材料选自聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯、聚乙烯、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、明胶中的一种或几种；可选地，静电纺丝薄膜较厚，可选地，封护层的厚度为100μm～1mm，保护层厚度为20nm～100μm。
和/或，所述封护层膜和/粘附层膜为气相沉积法薄膜，可选地，所述气相沉积法薄膜的材料选自碳纳米管膜、石墨烯、二硫化钼等中的一种或几种；可选地，气相沉积法薄膜的封护层的厚度为90nm～200nm。保护层厚度为10nm～100nm。
和/或，所述封护层膜和/粘附层膜为旋涂法薄膜，可选地，所述旋涂法薄膜的材料选自多糖类；可选地选自壳聚糖、羟甲基纤维素、海藻酸钠、透明质酸、卡拉胶可溶性高分子的一种或几种。旋涂法薄膜的封护层的厚度为40nm～1.5μm。保护层厚度为200nm～1.5μm。
和/或，所述封护层膜上还附有保护层，可选地，所述保护层与封护层膜材质相同。
可选地，保护层的厚度为10nm～100μm，可选地为20nm～100μm，可选地为10nm～20μm，可选地为200nm～1.5μm，可选地为10nm～100nm，可选地为500nm～20μm。
进一步地，还包括用于将其置于培养液或维持液中进一步培养或者维持的支撑物；
可选地，所述支撑物为水凝胶，塑料类，金属类中的一种或几种；
可选地，所述水凝胶为小分子、天然高分子和合成高分子中的任意一种或几种；
可选地，所述小分子包括芴基二肽、八肽、寡肽衍生物中的一种或任意几种；
可选地，所述天然高分子包括多糖类、肽类、核酸类；所述多糖类包括淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚糖、k2型角叉菜胶、刺槐豆胶、明胶和琼脂糖中的一种或任意几种，所述多肽类为胶原、血纤蛋白、聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸中的一种或几种；
可选地，所述合成高分子包括聚丙烯酸及其衍生物类、聚醚类、聚酯类中的一种或几种；可选地，所述聚醚类包括聚氧化丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯中的一种或任意几种；可选地，所述聚丙烯酸及其衍生物类包括聚丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇中的一种或几种；可选地，所述聚酯类包括聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚富马酸丙二醇酯、聚己内酯和聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯中的一种或几种；
可选地，所述塑料类包括热塑性塑料、热固性塑料、通用塑料、工程塑料、功能塑料、结晶型塑料、非结晶型塑料中的一种或几种；
可选地，所述塑料类成分包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚甲醛、聚酰胺、聚碳酸酯、丙烯腈－丁二烯－苯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯腈－苯乙烯共聚物、聚酯、酚醛树脂、环氧树脂、氨基树脂、醇酸树脂、烯丙基树脂、脲甲醛树脂、三聚氰胺树脂、不饱和聚酯、硅树脂、聚氨酯中的一种或几种；可选地，聚酯选自PETP聚对苯二甲酸丁二醇酯、PBTP聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种或几种；
可选地，所述金属材料包括不锈钢、金、银、铜中的一种或几种；
可选地，所述培养液/维持液包括BME培养基、MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、PRMI1640培养基、HAM F10/F12培养基、199培养基、CHO培养基、Vero培养基、NS0培养基、PFM培养基、UW组织保存液、HBSS组织保存液、GALA组织保存液、FRS组织保存液、MACS组织保存液、磷酸盐缓冲液、生理盐水、等渗葡萄糖溶液的一种或任意几种；
可选地，培养液含有血清，包括小牛血清、新牛血清、胎牛血清、马血清、人血清一种或任意几种；
可选地，培养/维持温度范围包括2℃-37℃；
可选地，培养环境可以含有0-5％的CO2。
进一步地，所述多层组构用于植入相应动物体内的目标器官或组织上，使之牢固粘附；
可选地，所述目标器官或组织选自脑、心、心包、血管、胸膜、腹膜、肝、胆囊、胆管、胰腺、脾、肺、肾、膀胱、前列腺、尿道、口腔、牙龈、舌、鼻腔、咽喉、耳道、甲状腺、食道、胃、肠道、肛门、卵巢、子宫、阴茎、睾丸、软骨、骨组织、骨髓、神经组织、眼球、眼睑、乳腺、淋巴结、肌肉、肌腱、皮肤、脂肪体等器官或组织的各种肿瘤中一种或任意几种；
可选地，所述动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、黄金地鼠、兔子、犬、猪、猴子、猩猩中一种或任意几种。
进一步地，所述多层组构通过自身粘附力或粘合剂与组织粘附；可选地，粘合剂选自氰基丙烯酸酯类、水凝胶类、黑色素类、类黑色素类、纤维素类、蛋白质类、医用树脂类、糖类、核酸类中一种或任意几种。
第二方面，提供一种多器官组织肿瘤原位/转移瘤动物模型的构建方法，包括如下步骤：
1)制备封护层膜，可选地，所述封护层膜选自蛋白膜、纤维膜、合成大分子膜、金属膜、无机基材膜中的一种或几种；
2)在封护层膜上植入肿瘤细胞或肿瘤组织；
3)制备粘附层，使其覆盖在含有肿瘤细胞或肿瘤组织的封护层膜表面，边缘粘合封边制成多层组构；
4)将多层组构通过手术利用自身粘性或粘合剂，相应的动物器官或组织上，制备相应的动物模型。
进一步地，步骤4)中的多层组构采用第一方面所述的多层组构。
可选地，步骤3)中，还将多层组构放置于用于支撑或方便贴到器官组织的支撑物上，接触面为非粘附层与支撑物接触；可选地，将其置于培养液或维持液中进培养或者维持；可选地，在步骤4)中将多层组构粘附在相应的动物器官或组织上后取出支撑物。支撑物的目的是为了方便制备多层组构，及方便后续贴到相应的动物器官或组织上。
第三方面，提供一种所述的制备方法制备的多器官组织肿瘤原位/转移瘤动物模型。
第四方面，提供一种第一方面所述的多层组构在制备多器官组织肿瘤原位/转移瘤动物模型中的应用。
本发明公开了多器官组织肿瘤原位/转移瘤动物模型的构建方法，首先利用体内可使用的具有通透性、降解性、韧性和粘性的膜形态材料建立一种可进行肿瘤细胞和组织包封培养或维持的多层组构，将肿瘤细胞或组织封装在多层组构内，再对组构边缘进行封闭以防止外泄，可通过培养液对内部细胞或组织进一步培养，也可以使用维持液维持内部细胞或组织，使其保持活性，最后通过湿性粘附方法将多层组构牢固贴敷于建模动物的目标器官或组织上，使细胞和组织浸润至正常组织，实现动物肿瘤原位/转移瘤模型低成本，大规模，高效率的构建。克服了目前建模方法存在的问题，实现广谱肿瘤模型全面化构建。
有益效果
(1)在本发明通过建立一种既可进行肿瘤细胞/组织培养或维持又能实现动物器官组织牢固粘附的多层组构，实现动物原位/转移肿瘤模型的大规模构建。
(2)本发明建立的方法首先突破了薄壁器官组织难以进行建模的技术障碍，使食管、胃、肠、膀胱等区域的原位模型可以大规模构建。且建模重复性强，成膜率高。
(3)本发明建立的方法降低了微小器官组织建模难度和成本，使前列腺、卵巢、淋巴、耳鼻喉区域、眼睛等区域肿瘤建模更加有效，成瘤率更高。
(4)本发明建立的方法减轻了其他器官组织原位/转移肿瘤模型建模过程中的二次伤害，增加了动物成活率，进一步提高了成模率。
(5)本发明建立的方法还大大降低了非必要被动转移，防治植入的细胞或组织再目标组织外的地方定植生长。
(6)本发明建立的方法可提高临床PDX模型的建模效率，有效保证人源样本的成活率。
(7)本发明建立的方法可以使动物原位/转移肿瘤模型的构建过程成为制式化流程，过程简单高效、成本低廉、重复性强、成模率高，具有良好的应用前景。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为本发明的多层组构组装过程示意图。
图2为本发明的实施例1的多层组构照片。
图3为本发明的实施例1的多层组构SEM照片。
图4为本发明的实施例1的多层组构体外组织贴敷照片。
图5为本发明的实施例1的负载细胞多层组构照片。
图6为本发明的实施例1的负载细胞多层组构培养后活死细胞染色荧光照片。
图7为本发明的实施例的多层结构动物体内主要器官组织贴敷结果照片。
图8为本发明的实施例1的负载细胞多层组构用于小鼠肝原位肿瘤模型构建结果照。
图9为本发明的实施例2的负载细胞多层组构用于小鼠胃壁原位肿瘤模型病理结果。
图10为本发明的实施例3的负载组织多层组构用于小鼠子宫原位肿瘤模型构建结果照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，所提及的“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中，涉及了大量实验和操作技术均为生物和医学研究中常用方法。应理解，主旨保护的是该方法的内容和精神，而不是针对通用实验方法。
以下实施例中，检测方法为:
杨氏模量的与韧性的检测方法：将膜材料，裁剪成1cm×4cm的长条形，然后使用万能拉力试验机，记录器应力(σ)-应变(ε)曲线。
杨氏模量(E)可通过下面的公式计算：
E＝σ/ε
其中ε的取值不超过1％。
韧性(T)的计算公式如下：
T＝F/A×L
其中，F为断裂强度，A为断裂处的断面，L为断裂处的物理长度。
粘附强度的检测方法为拉拔法：使用环氧粘合剂(DP420，3M)，将直径为20mm的锭子粘附到膜材料上。去除多余的粘合剂后，将粘合剂在60℃下固化5小时。然后将锭子从基底上拔下，并记录将涂层与基底分离所需的力。
实施例1
1)蛋白膜制备：以4-羟乙基哌嗪乙磺酸为交联剂，溶菌酶为材料，溶菌酶的浓度分别为2、4、8mg/ml，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的用量为15mg/ml，两者按体积1:1混合均匀，静置后通过气相界面法制备具有粘附性的二维蛋白质薄膜，厚度分别为10nm、80nm、150nm。
将厚度10nm、80nm、150nm的蛋白膜(蛋白膜的厚度可以通过蛋白浓度控制，也可以通过再生长的方式增加膜厚度)分别裁剪，膜的面积约为0.5cm2，液相界面为非粘附面，气相界面为粘附界面；杨氏模量1Gpa-3 Gpa之间；韧性范围0.1-1.4kJ/m2；粘附面的粘附强度120-300kPa；
2)封护层的制备：使用浓度为1％的甲醛(氧化剂)对上述步骤1)的厚度150nm蛋白膜进行固定化处理使之成为封护层膜，再将上述步骤1)的厚度10nm的蛋白膜通过自身粘性贴敷于经固化处理的厚度150nm的封护层膜的非粘性层上作为保护层膜，获得双层膜，并将该双层膜放置于琼脂糖凝胶块上，其中厚度10nm的保护层膜直接接触琼脂，即厚度10nm的保护膜层在下、厚度150nm的封护层膜在上，之后在150nm封护层膜表面中央加入人肝癌细胞系BEL-7402细胞(源自ATCC)悬液，沉积后吸干培养液；
3)粘附层的制备：利用膜自身粘附性将步骤1)的厚度80nm的蛋白膜覆盖在沉积有BEL-7402细胞的上述步骤2)的150nm封护层膜表面，利用自身粘性完成边缘粘合，并通过0.5％过氧乙酸对边缘进行处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得3层膜的多层组构(参见图1)。
4)将上述步骤3)的载有BEL-7402细胞多层组构的琼脂凝胶块置于3.5cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基浸润但不没过多层组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞稳定存活并贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取6周龄BALB/c-nu/nu裸小鼠(购自北京华阜康公司)，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，使用碘伏对小鼠的腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在小鼠胸骨剑突下依照皮纹切开皮和腹膜，小心翻出肝脏，分出完整肝叶，用无菌棉签吸干肝脏表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的肝脏表面，依靠膜自身粘性完成肝脏表面粘合，小心收起肝脏，消毒后用6-0可吸收缝合线缝合腹膜，用4-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例所构建的多层组构如图2和图3所示，可见到肉眼及超微结构，其自身可牢固粘附在组织上(结果见图4)，负载的细胞能有效在组构内生长并保持较高活性(测试结果见图5和图6)，多组织通用性贴敷测试结果见图7的肝脏照片。本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于小鼠肝脏表面后，约一星期即可形成肝癌原位肿瘤，结果见图8。本实施例中所述方法多次操作均可使小鼠肝原位成模率超过95％，非必要被动转移率控制在10％以下。
实施例2
1)蛋白膜制备：以β-巯基乙醇为交联剂，BSA为材料，BSA的浓度为2、4、10mg/ml，β-巯基乙醇水溶液的浓度为50mmol/l，两者以1：1的体积比混合后，通过气相界面法制备具有粘附性的二维蛋白质薄膜，厚度分别为20nm、60nm、180nm。
将厚度20nm、60nm、180nm的蛋白膜(蛋白膜的厚度可以通过蛋白浓度控制，也可以通过再生长的方式增加膜厚度)分别裁剪，膜的面积约为0.2cm2，液相界面为非粘附面，气相界面为粘附界面；杨氏模量1Gpa-3 Gpa之间；韧性范围0.1-1.9kJ/m2；粘附面的粘附强度为100-300kPa；
2)封护层的制备：使用2％戊二醛(氧化剂)对步骤1)的厚度180nm蛋白膜进行固定化处理使之成为封护层膜，再将步骤1)的膜层厚度为20nm的蛋白膜通过自身粘性贴敷于经固化处理的180nm封护层膜的非粘性层上作为保护层膜，获得双层膜，并将该双层膜放置于琼脂糖凝胶块上，其中膜层厚度为20nm的保护层膜接触琼脂，即厚度20nm的保护膜层在下、厚度180nm的封护层膜在上，之后在180nm封护层膜表面中央加入人胃癌细胞系BGC-823细胞(源自ATCC)悬液，沉积后吸干培养液；
3)粘附层的制备：利用膜自身粘附性将步骤1)的厚度60nm的蛋白膜覆盖在沉有BGC-823细胞的上述步骤2)的180nm封护层膜表面，利用自身粘性完成边缘粘合，并通过3％过氧化氢对边缘进行处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得3层膜的多层组构(参见图1)。
4)将上述步骤3)的含细胞多层组构的琼脂凝胶块置于3.5cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基浸润但不没过多层组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞稳定存活并贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取6周龄BALB/c-nu/nu裸小鼠(购自北京华阜康公司)，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，使用碘伏对小鼠的腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在小鼠胸骨剑突下依照皮纹切开皮和腹膜，小心暴露胃囊，用无菌棉签吸干胃壁表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的胃壁上，依靠膜自身粘性完成胃壁表面粘合，小心收起胃囊，消毒后用6-0可吸收缝合线缝合腹膜，用4-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于小鼠胃壁上后，多组织通用性贴敷测试结果见图7的胃照片，约十天左右即可形成胃癌原位肿瘤，结果见图9。本实施例的方法可使小鼠胃原位肿瘤模型成模率提高至90％以上，非必要被动转移率控制在10％以下。
实施例3
1)蛋白膜制备：以二巯基丁二酸为交联剂，乳铁蛋白为材料，乳铁蛋白的浓度分别为1、2、7mg/ml，二巯基丁二酸的用量为13mg/ml，两者按体积比1:1进行混合，通过气相界面法制备具有粘附性的二维蛋白质薄膜，厚度分别为10nm、40nm、120nm。
将厚度10nm、40nm、120nm的蛋白膜(蛋白膜的厚度可以通过蛋白浓度控制，也可以通过再生长的方式增加膜厚度)，膜的面积约为40mm2，液相界面为非粘附面，气相界面为粘附界面；杨氏模量1Gpa-2 Gpa之间；韧性范围0.1-1.2kJ/m2；粘附面的粘附强度为20-100kPa；
2)封护层的制备：使用浓度为6mg/ml的三(2-羧乙基)膦盐酸盐对步骤1)的厚度120nm蛋白膜进行固定化处理使之成为封护层膜，再将步骤1)的膜层厚度为10nm的蛋白膜通过自身粘性贴敷于经固化处理的120nm封护层膜的非粘性层上作为保护层膜，获得双层膜并将双层膜放置于壳聚糖凝胶块上，其中膜层厚度为10nm的保护层膜接触琼脂，即厚度10nm的保护膜层在下、厚度120nm的封护层膜在上，之后在120nm封护层膜表面中央加入人宫颈癌细胞系Hela细胞悬液(源自ATCC)，沉积后吸干培养液；
3)粘附层的制备：利用膜自身粘附性将步骤1)的厚度40nm的蛋白膜覆盖在沉有Hela细胞的上述步骤2)的120nm封护层膜表面，利用自身粘性完成边缘粘合，并通过1％稀草酸水溶液对边缘进行快速处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得3层膜的多层组构(参见图1)。
4)将上述步骤3)的含细胞多层组构的琼脂凝胶块置于3.5cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基浸润但不没过多层组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞稳定存活并贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取6周龄BALB/c-nu/nu裸小鼠，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，使用碘伏对小鼠的腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在小鼠生殖道口上方0.5cm处依照皮纹切开皮和腹膜，小心暴露膀胱，沿膀胱下寻找并暴露Y型子宫，用无菌棉签吸干子宫外表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的子宫上，依靠膜自身粘性完成子宫表面粘合，小心收起子宫和膀胱，消毒后用6-0可吸收缝合线缝合腹膜，用4-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于小鼠子宫上后，多组织通用性贴敷测试结果见图7的子宫照片，约一周左右即可形成小鼠子宫癌原位肿瘤，结果见图10。本实施例的方法可使小鼠子宫原位肿瘤模型成模率达到90％以上，非必要被动转移率控制在10％以下。
实施例4
1)以聚乙烯吡咯烷酮K30为材料，溶剂为无水乙醇，浓度为100mg/mL，通过静电纺丝技术制备二维薄膜，设定速度为50μL/h，电压为10kV。
分别制备膜厚度为40μm、80μm、200μm的二维薄膜(通过调整静电纺丝参数调整膜厚度)，膜的面积约为4cm2；杨氏模量2Gpa-8 Gpa之间；韧性范围2.4-4.5kJ/m2；粘附强度为0.1-10kPa；
2)封护层的制备：将步骤1)的厚度40μm的二维薄膜通过氰基丙烯酸酯粘合剂贴敷于步骤1)的厚度200μm的二维薄膜上，稀盐酸固定双层膜成为封护层膜，并放置于PE塑料材质的基座上，其中膜层厚度为40μm膜二维薄直接接触PE塑料基座，即厚度40μm的二维薄膜在下、厚度200μm的二维薄膜在上，之后向厚度200μm封护层膜表面中央加入大鼠胰腺癌细胞系DSL-6A/C1细胞悬液，沉积后吸干培养液；
3)粘附层的制备：利用黏蛋白将步骤1)的厚度40μm二维薄膜贴敷于步骤1)的80μm膜上形成粘附层，再将其覆盖在沉有DSL-6A/C1细胞的步骤2)的的封护层膜表面，利用氰基丙烯酸酯粘合剂将两层膜的边缘完全粘合，并通过1％稀盐酸对膜的边缘进一步处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得多层组构。
4)将上述步骤3)的含细胞多层组构的PE塑料块置于10cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基浸润但不没过多层组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞稳定存活并贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取体重200g左右雄性SD大鼠(购自北京华阜康公司)，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，首先对大鼠腹部进行剃毛备皮，使用碘伏对大鼠的腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在大鼠上腹部左侧处依照皮纹切开皮和腹膜，寻找脾脏，小心翻出暴露胰腺，用无菌棉签吸干胰腺外表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的胰腺上，依靠氰基丙烯酸酯粘合剂完成组织表面粘合，小心复位胰腺和脾脏，消毒后用4-0可吸收缝合线缝合腹膜，用2-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于大鼠胰腺上后，多组织通用性贴敷测试结果见图7的胰腺照片，约一周左右即可形成大鼠胰腺癌原位肿瘤。
实施例5
1)以聚氧化乙烯为材料，通过静电纺丝技术制备二维薄膜，溶剂为甲醇，浓度为100mg/mL，通过静电纺丝技术制备二维薄膜，设定速度为50μL/h，电压为10kV。
分别制备膜厚度为膜厚度包括20μm、100μm、1mm的二维薄膜(通过调整静电纺丝参数调整膜厚度)，膜的面积约为0.5cm2；杨氏模量1Gpa-8 Gpa之间；韧性范围0.4-6.9kJ/m2；粘附强度2-6.1kPa；
2)封护层的制备：将步骤1)的厚度1mm的二维薄膜的其中一个面通过稀铬酸氧化，滴到膜面上处理20秒后，快速清洗干净。成为封护层膜，并放置于PP塑料材质的基座上，氧化处理的封护层膜膜面与PP塑料基座直接接触，即氧化处理的膜面向下，未进行氧化处理的膜表面向上，向未进行氧化处理的膜表面加入大鼠癌细胞系CBRH-7919细胞悬液，沉积后吸干培养液；
3)粘附层的制备：利用聚多巴胺凝胶将步骤1)的厚度20μm二维薄膜贴敷于厚100μm二维薄膜上形成粘附层，再将其覆盖在步骤2)的沉有细胞封护层膜表面，利用葡萄糖-柠檬酸粘合剂将两层膜的边缘完全粘合，并通过1％稀铬酸对边缘进行处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得多层组构。
4)将上述步骤3)的含细胞多层组构的PP塑料块置于3.5cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基浸润但不没过组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞稳定存活并贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取体重200g左右雄性SD大鼠(购自北京华阜康公司)，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，首先对大鼠腹部进行剃毛备皮，使用碘伏对大鼠的腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在大鼠中腹部侧位处依照皮纹切开皮和腹膜，小心暴露肾脏，用无菌棉签吸干肾脏外表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的肾脏上，依靠外科胶完成肾脏表面粘合，小心复位肾脏，消毒后用4-0可吸收缝合线缝合腹膜，用2-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入普鲁卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于大鼠肾脏上后，多组织通用性贴敷测试结果见图7的肾脏照片，约八天左右即可形成大鼠肾癌原位肿瘤。
实施例6
1)以壳聚糖为材料，通过旋涂法制备二维薄膜。壳聚糖的浓度为5mg/ml，以3％的醋酸水溶液为溶剂，超声分散后，在不锈钢光滑面上滴加1至2滴，以600rpm为启动速度，以2200rpm为恒定速度，分别转动8s和20s重复3～5次，37℃干燥12h，制备二维薄膜。
分别制备膜厚度为100nm、200nm的二维薄膜(通过涂抹次数控制膜厚度)，裁剪膜的面积约为0.4cm2；杨氏模量5Gpa-8 Gpa之间；韧性范围1.8-7.4kJ/m2；粘附强度10-54kPa；
2)封护层的制备：将步骤1)的厚度200nm的二维薄膜的其中一个面通过过碳酸钠氧化，滴上后处理1分钟，快速清洗，成为封护层和保护层，并放置于不锈钢材质的基座上，氧化处理的膜面与基座直接接触，即氧化处理的膜面向下，向未进行氧化处理的膜表面加入大鼠癌细胞系MADB106细胞悬液，沉积后吸干培养液；
3)利用贻贝蛋白将两张步骤1)的厚度100nm二维薄膜贴附形成粘附层，再将其覆盖在步骤2)的沉有细胞的封护层膜表面，利用高糖粘合剂将膜的边缘完全粘合，并通过0.5％稀硝酸对边缘进行处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得多层组构。
4)将上述步骤3)的含细胞多层组构的不锈钢基座块置于3.5cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的MEM高糖培养基，培养基浸润但不没过组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞稳定存活并贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取体重200g左右雄性SD大鼠(购自北京华阜康公司)，通过5％水合氯醛溶液腹腔注射进行麻醉，在麻醉状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，首先对大鼠腹部进行剃毛备皮，使用碘伏对大鼠的上腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在大鼠剑突下缘处依照皮纹切开皮和腹膜，小心寻找胃囊，向上探索食管，取支撑器将食管固定，用无菌棉签吸干食管外表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的食管上，依靠外科胶完成食管表面粘合，小心复位并确定食管贯通，消毒后用4-0可吸收缝合线缝合腹膜，用2-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入普鲁卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于大鼠食管上后，多组织通用性贴敷测试结果见图7的食管照片，约一周左右即可形成大鼠食管癌原位肿瘤。
实施例7
1)以甲烷为材料，在65-85℃条件下将二茂铁和硫粉为助剂，在600℃条件下通过气相沉积法制备碳纳米管二维薄膜。
分别制备膜厚度为20nm、120nm、160nm的二维薄膜(通过反应时间控制厚度)，膜的面积约为0.6cm2；杨氏模量10Gpa-12 Gpa之间；韧性范围0.1-0.7kJ/m2；粘附强度为0.1-0.2kPa；
2)封护层的制备：利用羧甲基纤维素粘合剂将步骤1)的厚度160nm和厚度20nm的二维薄膜粘合，再通过重铬酸钠氧化厚度160nm二维薄膜成为封护层，以厚度20nm二维薄膜为保护层，并放置于不锈钢材质的基座上，其中厚度20nm二维薄膜直接接触基座，即厚度20nm二维薄膜向下、厚度160nm的二维薄膜在上，向160nm膜表面加入大鼠癌细胞系CBRH-7919细胞悬液，沉积后吸干培养液；
3)利用普鲁兰多糖粘合剂步骤1)的厚度20nm的二维薄膜和步骤1)的厚度100nm的二维薄膜贴附形成粘附层，再将厚度100nm二维薄膜的一面覆盖在沉有细胞的封护层膜表面，利用浓度为1.5％的普鲁兰多糖粘合剂将膜的边缘完全粘合封闭，并通过2％重铬酸钠溶液对边缘进行处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得多层组构。
4)将上述步骤3)的含细胞多层组构的不锈钢基座块置于3.5cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的1640培养基，培养基浸润但不没过组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞稳定存活并贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取体重200g左右雄性SD大鼠(购自北京华阜康公司)，通过戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，在麻醉状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，首先对大鼠腹部进行剃毛备皮，使用碘伏对大鼠的下腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在大鼠生殖道口上1cm处依照皮纹切开皮和腹膜，小心寻找结肠，取支撑器将其固定，用无菌棉签吸干结肠外表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的结肠上，依靠外科胶完成结肠表面粘合，小心复位并确定结肠贯通，消毒后用4-0可吸收缝合线缝合腹膜，用2-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入普鲁卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于大鼠结肠上后，多组织通用性贴敷测试结果见图7的结肠照片，约十二天左右即可形成大鼠结肠癌原位肿瘤。
实施例8
1)以羟甲基纤维素为材料，通过旋涂法制备二维薄膜，浓度为5mg/ml，超声分散至30％乙醇水溶液中后，在不锈钢光滑面上滴加1至2滴，以800rpm为启动速度，以2800rpm为恒定速度，分别转动5s和30s重复3至5次，37℃干燥24h。
通过滴加次数控制厚度，分别制备厚度为40nm、200nm、1.5μm的膜，膜的面积约为4cm2；杨氏模量2Gpa-4 Gpa之间；韧性范围1.4-4.8kJ/m2；粘附强度10-19kPa；
2)封护层的制备：利用蛋白质胶黏剂将步骤1)的厚度40nm和步骤1)的厚度1.5μm的二维薄膜粘合，再通过稀硫酸氧化厚度1.5μm二维薄膜成为封护层，厚度40nm为保护层，并放置于不锈钢材质的基座上，厚度40nm二维薄膜面与基座直接接触，即厚度40nm二维薄膜向下、厚度1.5μm的二维薄膜在上，向1.5μm的二维薄膜表面加入兔癌细胞系VX2细胞悬液，沉积后吸干培养液；
3)利用蛋白质胶黏剂将步骤1)的厚度40nm膜和步骤1)的厚度200nm的二维薄膜贴附形成粘附层，再将其覆盖在沉有细胞的封护层膜表面，其中厚度200nm的二维薄膜与沉积有细胞的步骤2)的厚度1.5μm的膜直接接触，利用蛋白质胶黏剂对膜边缘进行完全粘合，并通过2％稀硫酸对边缘进行处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得多层组构。
4)将上述步骤3)的含细胞多层组构的不锈钢基座块置于10cm培养皿中，加入含10％胎牛血清的HAM F10/F12培养基，培养基浸润但不没过组构，在37℃、5％CO2环境下，培养18-24h，待细胞贴敷于膜上后用于体内建模。
5)取体重3000g左右雄性大耳白兔(购自重庆腾鑫生物科技有限公司)，通过异氟烷吸入法进行麻醉，在气体维持麻醉状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，首先对兔子下腹部进行剃毛备皮，使用碘伏对下腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在兔子生殖道口上2cm处依照皮纹切开皮和腹膜，暴露膀胱，取支撑器将其固定，用无菌棉签吸干膀胱外表面水分。
6)将培养好的步骤4)中的含细胞多层组构的粘附层贴敷在步骤5)的干燥的膀胱上，依靠外科胶完成膀胱表面粘合，消毒后用2-0可吸收缝合线缝合腹膜，用1-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入普鲁卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于白兔膀胱上后，多组织通用性贴敷测试结果见图7的膀胱照片，约两周左右即可形成兔膀胱癌原位肿瘤。
实施例9
1)以4-羟乙基哌嗪乙磺酸为交联剂，乳铁蛋白为材料。乳铁蛋白的浓度为1、2、7mg/ml，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的用量为13mg/ml，两者按体积比1:1进行混合，通过气相界面法制备具有粘附性的二维蛋白质薄膜，厚度分别为10nm、50nm、200nm。
将厚度10nm、50nm、200nm的蛋白质薄薄膜分别裁剪，膜的面积约为0.5cm2，液相界面为非粘附面，气相界面为粘附界面；杨氏模量1Gpa-2 Gpa之间；韧性范围0.1-1.2kJ/m2；粘附面的粘附强度为20-100kPa；
2)封护层的制备：使用β-巯基乙醇对步骤1)的厚度200nm蛋白质薄膜进行固定化处理使之成为封护层，再将厚度10nm的蛋白质薄膜通过自身粘性贴敷于厚度200nm蛋白质薄膜的非粘性层上用于保护层，并将双层膜放置于琼脂糖凝胶块上，其中厚度10nm蛋白质薄膜接触琼脂在下、厚度200nm蛋白质薄膜在上，之后向厚度200nm蛋白质薄膜表面中央加入小鼠乳腺癌细胞系4T1培养瘤块，瘤块组织保存在8℃的UW组织保存液；
3)利用膜自身粘附性将步骤1)的厚度10nm的蛋白质薄膜贴敷于步骤1)的厚度50nm蛋白质薄膜亲水面形成粘附层，再将其覆盖在载有瘤块组织的膜的封护层膜表面，利用自身粘性完成边缘粘合，并通过1％稀草酸对边缘进行处理(可以采用滴加并涂抹的方式处理)，完成封边，制备获得负载瘤块组织的多层组构(结构见图1)，多层组构至于磷酸盐缓冲液保存，液面不能没过多层组织粘性层。
4)取6周龄雌性BALB/c小鼠(购自北京华阜康公司)，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，使用碘伏对小鼠的腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在小鼠胸骨剑突下依照皮纹切开皮和腹膜，小心翻出肝脏，分出完整肝叶，用无菌棉签吸干肝脏表面水分。
5)将上述步骤3)的载有肿瘤组织的多层组构的粘附层贴敷在干燥的肝脏表面，依靠膜自身粘性完成肝脏表面粘合，小心收起肝脏，消毒后用6-0可吸收缝合线缝合腹膜，用4-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于小鼠肝脏上后，约五天左右即可形成肝脏原位肿瘤。
实施例10
1)以纳米银和胶原蛋白为材料，以4-羟乙基哌嗪乙磺酸为交联剂。纳米银的浓度为15mg/mL，胶原蛋白的浓度为2、4、7mg/ml，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的用量为13mg/ml，三者按体积比1:1:1进行混合，通过气相界面法制备具有粘附性的二维金属杂化薄膜，厚度分别为25nm、40nm、90nm。
将厚度为25nm、40nm、90nm的薄膜(蛋白膜的厚度可以通过蛋白浓度控制，也可以通过再生长的方式增加膜厚度)分别裁剪，膜的面积约为0.5cm2；杨氏模量4Gpa-8 Gpa之间；韧性范围0.1-1.0kJ/m2；粘附面的粘附强度为1-23kPa；
2)封护层的制备：将步骤1)的厚度20nm的薄膜作为保护层通过自身粘性贴敷于步骤1)的厚度90nm的薄膜上，稀硝酸固定步骤1)的厚度90nm薄膜的亲水面成为封护层，并放置于琼脂糖凝胶块上，其中20nm膜接触琼脂在下90nm膜在上，向90nm膜表面中央加入人源胃癌瘤块，瘤块组织一直保存在GALA组织保存液中；
3)粘附层的制备：利用膜自身粘附性将步骤1)的厚度90nm膜贴敷于40nm薄膜外侧形成粘附层，再将其覆盖在沉有细胞的封护层膜表面，利用自身粘性完成边缘粘合，并通过稀盐酸对边缘进行处理，完成封边，制备获得多层组构，浸泡于4℃的MACS组织保存液中用于后续体内建模，浸泡过程中液体切勿没过组构粘附层。
4)取6周龄BALB/c-nu/nu裸小鼠，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，使用碘伏对小鼠的腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在小鼠胸骨剑突下依照皮纹切开皮和腹膜，小心暴露胃囊，用无菌棉签吸干胃囊表面水分。
5)将载有肿瘤组织的多层组构的粘附层贴敷在干燥的胃壁表面，依靠膜自身粘性完成胃壁表面粘合，小心收起，消毒后用6-0可吸收缝合线缝合腹膜，用4-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于小鼠胃壁上后，约八天左右即可形成胃癌原位肿瘤。
实施例11
1)以纳米金和溶菌酶为材料，以4-羟乙基哌嗪乙磺酸为交联剂，纳米金的浓度为15mg/mL，溶菌酶的浓度为2、3、7mg/ml，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的用量为13mg/ml，三者按体积比1:1:1进行混合，通过气相界面法制备具有粘附性的二维金属杂化薄膜，厚度分别为15nm、60nm、130nm。
将厚度15nm、60nm、130nm的蛋白膜(蛋白膜的厚度可以通过蛋白浓度控制，也可以通过再生长的方式增加膜厚度)分别裁剪，膜的面积约为0.3cm2；杨氏模量1Gpa-7 Gpa之间；韧性范围0.1-1.6kJ/m2；粘附面的粘附强度0.1-43kPa；
2)封护层的制备：将步骤1)的厚度15nm的膜作为保护层通过自身粘性贴敷于步骤1)的厚度130nm的膜上，稀铬酸固定步骤1)的厚度130nm膜的亲水面成为封护层，并放置于明胶凝胶块上，其中厚度15nm膜接触琼脂在下、厚度130nm膜在上，向膜外表面加入人源前列腺瘤块，瘤块始终保存在2℃的HBSS组织保存液中；
3)利用膜自身粘附性将步骤1)的厚度60nm膜覆盖在载有瘤块组织的封护层130nm膜表面，利用自身粘性完成边缘粘合，并通过稀铬酸对边缘进行处理，完成封边，制备获得多层组构，浸泡于GALA组织保存液中用于后续体内建模，浸泡过程中液体切勿没过组构粘附层。
4)取6周龄雄性BALB/c-nu/nu裸小鼠，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，使用碘伏对小鼠的下腹部进行大面积消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在小鼠生殖道口上0.5cm处依照皮纹切开皮和腹膜，小心暴露膀胱及凝固腺，再在其中寻找前列腺，用无菌棉签挑出并吸干表面水分。
5)将载有肿瘤组织的多层组构的粘附层贴敷在干燥的前列腺表面，依靠膜自身粘性完成表面粘合，小心收起，消毒后用6-0可吸收缝合线缝合腹膜，用4-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的含细胞多层组构贴敷于小鼠前列腺上后，约一周左右即可形成前列腺原位肿瘤。
实施例12
1)以离子溅射法制备二维金纳米蛋白复合膜，将实施例1所得的10nm蛋白薄膜，放到离子溅射仪中，真空度为2×10-3Pa,电压为500V，喷金时间为3分钟。
通过控制喷涂时间分别制备膜厚度为500nm、10μm、100μm的膜，膜的面积约为4cm2；杨氏模量10Gpa-12 Gpa之间；韧性范围0.4-3.8kJ/m2；粘附强度为0.1-0.6kPa；
2)封护层的制备：将步骤1)的厚度100μm和步骤1)的厚度10μm的膜通过铬酸固定，之后用医用树脂粘合剂粘合成为封护层，并放置于PF塑料基质块上，10μm膜接触基质块在下，100μm膜在上，向100μm膜表面中央加入犬结肠癌瘤块，瘤块组织一直保存在FRS组织保存液中；
3)利用医用树脂粘合剂将步骤1)的厚度500nm膜贴敷于步骤1)的厚度100μm膜载有瘤块组织的一面形成粘附层，并通过铬酸对边缘进行处理，完成封边，制备获得多层组构，浸泡于4℃的FRS组织保存液中用于后续体内建模。
4)取雌性比格犬一只(购自重庆腾鑫生物技术有限公司)，通过异氟烷吸入式法进行麻醉，在麻醉气维持状态下仰卧固定于消毒后的小动物手术台上，使用碘伏对犬下腹部进行大面积备皮消毒，覆盖无菌手术洞巾，10号手术刀片在生殖道一侧下依照皮纹切开皮和腹膜，小心暴露结肠，用无菌棉签吸干结肠表面水分。
5)将载有结肠癌组织的多层组构的粘附层贴敷在干燥的结肠表面，通过医用外科胶完成组构与结肠表面的粘合，小心收起，消毒后用2-0可吸收缝合线缝合腹膜，用2-0缝合线缝合外皮，并对伤口进行消毒，点入利多卡因镇痛剂后，使用医用外科胶封闭伤口。
本实施例中所制备的载肿瘤组织多层组构贴敷于犬结肠上后，约三周左右即可形成结肠癌原位肿瘤。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于原位肿瘤建模的多层组构，其特征在于，包括粘附层和封护层，及封装在粘附层与封护层之间的肿瘤细胞和/或肿瘤块；
所述粘附层和封护层的边缘粘合用于防止肿瘤细胞从侧边或封护层透出；
所述粘附层用于依靠膜自身粘性能或通过医用粘合剂与靶器官组织粘合。
2.根据权利要求1所述的多层组构，其特征在于，所述封护层膜的厚度为5nm～2mm，可选地为50nm～2mm，可选地为50nm～1mm，可选地为40nm～1.5μm，可选地为90nm～2μm，可选地为90nm～200nm，可选地为500nm～20μm，可选地为500nm～1mm，可选地为10μm～500μm，可选地为100μm～1mm；
和/或，所述粘附层的厚度为40nm～10μm，可选地为90nm～1mm，可选地为40nm～200nm，可选地为1μm～10μm；
和/或，所述封护层膜或粘附层膜中，膜根据不同动物器官组织及肿瘤细胞或组织样本，裁剪至合适大小，膜面积可选地为0.5mm2～9cm2；
和/或，所述封护层膜或粘附层膜中，粘附层膜的孔径不小于封护层膜，可选的孔径为1nm～2μm；
和/或，所述封护层膜或粘附层膜中，膜的杨氏模量为1Gpa～12Gpa，可选地为1Gpa～2Gpa，可选地为3Gpa～5Gpa，可选地为6Gpa～12Gpa；
和/或，所述封护层膜或粘附层膜中，膜的韧性为0.1kJ/m2～8kJ/m2，可选地为0.1kJ/m2～3.4kJ/m2，可选地为4.1kJ/m2～6kJ/m2，可选地为6.1kJ/m2～8kJ/m2；
和/或，所述封护层膜或粘附层膜中，膜的粘附强度为0.1kPa～300kPa，可选地为0.1kPa～10kPa，可选地为11kPa～100kPa，可选地为100kPa～300kPa。
3.根据权利要求1或2所述的多层组构，其特征在于，所述封护层膜和粘附层膜的边缘通过膜自身粘性或粘合剂进行粘连，再利用氧化剂进行封闭处理；
可选地，封边处理的氧化剂包括过氧化氢、甲醛、过氧乙酸、硫酸、盐酸、硝酸、草酸、重铬酸钠、铬酸、高锰酸钾、过硫酸铵、次氯酸钠、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾、溴、碘中的一种或几种；
和/或，所述封护层膜和/粘附层膜为蛋白膜，可选地，蛋白质为乳铁蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白、胰岛素、α-乳白蛋白、人血清白蛋白、纤维蛋白原、β-淀粉样蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、辣根过氧化酶、血红蛋白、血蓝蛋白组蛋白、谷蛋白、胶原酶、卵白蛋白、大豆蛋白、转铁蛋白、甲状腺球蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、粘蛋白中的一种或几种；可选地，所述交联剂选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽、二巯基丁二酸、亚硫酸钠、戊二醛、京尼平、谷氨酰胺转氨酶、碳二亚胺、环氧氯丙烷中任意一种或几种；可选地，所述蛋白膜自身具有粘性；可选地，蛋白膜为蛋白质水溶液和交联剂水溶液在气液界面上自组装形成的蛋白质薄膜；
和/或，所述封护层膜和/粘附层膜为静电纺丝二维薄膜，可选地，所述静电纺丝二维薄膜的材料选自聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯、聚乙烯、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、明胶中的一种或几种；
和/或，所述封护层膜和/粘附层膜为气相沉积法薄膜，可选地，所述气相沉积法薄膜的材料选自碳纳米管膜、石墨烯、二硫化钼等中的一种或几种；
和/或，所述封护层膜和/粘附层膜为旋涂法薄膜，可选地，所述旋涂法薄膜的材料选自多糖类，可选地选自壳聚糖、羟甲基纤维素、海藻酸钠、透明质酸、卡拉胶可溶性高分子的一种或几种；
和/或，所述封护层膜上还附有保护层，可选地，所述保护层与封护层膜材质相同，可选地，保护层的厚度为10nm～100μm，可选地为20nm～100μm，可选地为10nm～20μm，可选地为200nm～1.5μm，可选地为10nm～100nm，可选地为500nm～20μm。
4.根据权利要求1至3任一所述的多层组构，其特征在于，还包括用于将其置于培养液或维持液中进一步培养或者维持的支撑物；
可选地，所述支撑物为水凝胶，塑料类，金属类中的一种或几种；
可选地，所述水凝胶为小分子、天然高分子和合成高分子中的任意一种或几种；
可选地，所述小分子包括芴基二肽、八肽、寡肽衍生物中的一种或任意几种；
可选地，所述天然高分子包括多糖类、肽类、核酸类；所述多糖类包括淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚糖、k2型角叉菜胶、刺槐豆胶、明胶和琼脂糖中的一种或任意几种，所述多肽类为胶原、血纤蛋白、聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸中的一种或几种；
可选地，所述合成高分子包括聚丙烯酸及其衍生物类、聚醚类、聚酯类中的一种或几种；可选地，所述聚醚类包括聚氧化丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯中的一种或任意几种；可选地，所述聚丙烯酸及其衍生物类包括聚丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇中的一种或几种；可选地，所述聚酯类包括聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚富马酸丙二醇酯、聚己内酯和聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯中的一种或几种；
可选地，所述塑料类包括热塑性塑料、热固性塑料、通用塑料、工程塑料、功能塑料、结晶型塑料、非结晶型塑料中的一种或几种；
可选地，所述塑料类成分包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚甲醛、聚酰胺、聚碳酸酯、丙烯腈－丁二烯－苯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯腈－苯乙烯共聚物、聚酯、酚醛树脂、环氧树脂、氨基树脂、醇酸树脂、烯丙基树脂、脲甲醛树脂、三聚氰胺树脂、不饱和聚酯、硅树脂、聚氨酯中的一种或几种；可选地，聚酯选自PETP聚对苯二甲酸丁二醇酯、PBTP聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种或几种；
可选地，所述金属材料包括不锈钢、金、银、铜中的一种或几种；
可选地，所述培养液/维持液包括BME培养基、MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、PRMI1640培养基、HAM F10/F12培养基、199培养基、CHO培养基、Vero培养基、NS0培养基、PFM培养基、UW组织保存液、HBSS组织保存液、GALA组织保存液、FRS组织保存液、MACS组织保存液、磷酸盐缓冲液、生理盐水、等渗葡萄糖溶液的一种或任意几种；
可选地，培养液含有血清，包括小牛血清、新牛血清、胎牛血清、马血清、人血清一种或任意几种；
可选地，培养/维持温度范围包括2℃-37℃；
可选地，培养环境可以含有0-5％的CO2。
5.根据权利要求1至4任一所述的多层组构，其特征在于，所述多层组构用于植入相应动物体内的目标器官或组织上，使之牢固粘附；
可选地，所述目标器官或组织选自脑、心、心包、血管、胸膜、腹膜、肝、胆囊、胆管、胰腺、脾、肺、肾、膀胱、前列腺、尿道、口腔、牙龈、舌、鼻腔、咽喉、耳道、甲状腺、食道、胃、肠道、肛门、卵巢、子宫、阴茎、睾丸、软骨、骨组织、骨髓、神经组织、眼球、眼睑、乳腺、淋巴结、肌肉、肌腱、皮肤、脂肪体等器官或组织的各种肿瘤中一种或任意几种；
可选地，所述动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、黄金地鼠、兔子、犬、猪、猴子、猩猩中一种或任意几种。
6.根据权利要求5所述的多层组构，其特征在于，所述多层组构通过自身粘附力或粘合剂与组织粘附；可选地，粘合剂选自氰基丙烯酸酯类、水凝胶类、黑色素类、类黑色素类、纤维素类、蛋白质类、医用树脂类、糖类、核酸类中一种或任意几种。
7.一种多器官组织肿瘤原位/转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备封护层膜，可选地，所述封护层膜选自蛋白膜、纤维膜、合成大分子膜、金属膜、无机基材膜中的一种或几种；
2)在封护层膜上放置肿瘤细胞或肿瘤组织；
3)制备粘附层，使其覆盖在含有肿瘤细胞或肿瘤组织的封护层膜表面，边缘粘合封边制成多层组构；
4)将多层组构通过手术利用自身粘性或粘合剂，粘附在相应的动物器官或组织上，制备相应的动物模型。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤4)中的多层组构采用权利要求1至6任一所述的多层组构；
可选地，步骤3)中，还将多层组构放置于用于支撑或方便贴到器官组织的支撑物上，接触面为非粘附层与支撑物接触；可选地，将其置于培养液或维持液中进培养或者维持；可选地，在步骤4)中将多层组构粘附在相应的动物器官或组织上后取出支撑物。
9.一种权利要求7或8所述的制备方法制备的多器官组织肿瘤原位/转移瘤动物模型。
10.一种权利要求1至6任一所述的多层组构在制备多器官组织肿瘤原位/转移瘤动物模型中的应用。
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