CN117051039B - 两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用，该质粒的构建方法包括：S1：在GFP表达元件两侧设计两个不同类型的同向LoxP位点；S2：将两个不同LoxP位点分别连入正反向引物，以pEGFP‑N3质粒为模板，扩增GFP基因的表达元件，包括启动子、编码区和5′UTR区；S3：连接至pMD18‑T载体，阳性检测正确后，从插入序列外侧设计正反向引物，扩增出两端包括LoxP位点的GFP基因表达元件组合；S4：将此元件组合连入pTol2‑MCS质粒多克隆位点处，构建完成pTol2‑GFP质粒。本发明质粒转入鳜受精卵后，获得发绿色荧光的鳜转基因底盘家系，从而获得宿主基因组的定点编辑位点，适用于后续不同转基因目标家系的同塘高效筛选和构建，为鱼类基因工程育种提供帮助，极大提高鱼类遗传育种效率。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用。
背景技术
Cre-loxP介导的重组系统可在loxP位点产生高效、专一性重组，不影响其它基因的表达调控，因此在转基因研究中得到广泛应用。Cre重组酶是由来源于P1噬菌体的Cre基因所编码的一类酶，属于Int家族，识别特异靶位点(loxP位点)并催化在该位点断裂和重组。Cre重组酶介导的两个loxP序列间的特异性重组根据序列位置和方向的不同分为三种情况：当两个相同loxP序列位于同一条DNA链且方向相同时，Cre重组酶能够敲除两个loxP序列间的DNA片段；当两个相同loxP序列位于同一条DNA链且方向相反时，Cre重组酶能够倒转两个loxP序列间的DNA片段；当两个相同loxP序列位于不同DNA链上时，Cre重组酶能够介导loxP序列间DNA链的交换或染色体易位。在实验设计中实验者可以根据不同的研究需要选择相应的序列构建方式，来达到相应的目的。
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。在细胞生物学与分子生物学中，绿色荧光蛋白(GFP)基因常用做报告基因(reporter gene)。通过基因工程技术，绿色荧光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色荧光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼(例如斑马鱼)，植物，苍蝇，甚至人等哺乳动物的细胞。
鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水名特优养殖鱼类，属鲈形目、脂科、鳜属。鳜属包括翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜、波纹鳜、暗鳜、高体鳜和柳州鳜7个种。目前用于池塘养殖的鳜主要是翘嘴鳜、大眼鳜和斑鳜，其中以翘嘴鳜的生长速度最快，经济价值最高。随着近年鳜养殖业的快速发展，养殖密度不断增加，养殖病害频繁暴发，严重阻碍了鳜养殖业的健康发展。抗病养殖新品种是鳜养殖业健康发展的基础保障。
鳜抗病相关基因工程育种研究是鳜抗病养殖品种培育的有效途径之一。由于鳜以活饵为食，针对较多候选抗病或易感基因的基因编辑、鱼苗开口、群体培育和编辑位点鉴定等，要求群体数量大且需分塘养殖和多代筛选，这就为池塘养殖管理带来较大困难。为了提前筛选基因组中合适高效的基因编辑位点，并方便同塘养殖和后续鉴别，亟待开发一种表达GFP蛋白且能进行后续定点置换的质粒，用此来构建鳜转GFP基因底盘家系。
发明内容
本发明提供了两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用。对本发明方法构建质粒的转基因家系的鉴定获得了宿主基因组的高效定点编辑位点，适用于后续不同转基因目的家系的同塘高效筛选和构建。利用本发明方法构建的质粒开发鳜转GFP基因底盘家系，在基因组上整合了多个GFP基因拷贝。通过红色荧光蛋白(Redfluorescent protein，简称RFP)对GFP定点置换的应用，说明该家系可作为后续鳜转基因育种研究的可视化标记底盘家系，可作为鳜基因工程育种中有效整合抗病基因家系的高效可视化筛选工具，同时也可为其它鱼类的基因工程育种提供帮助，极大地提高了鱼类遗传育种的效率。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒的构建方法，包括以下步骤：
S1：在GFP表达元件两侧设计两个不同类型的同向LoxP位点；
S2：将两个不同LoxP位点分别连入正反向引物，以pEGFP-N3质粒为模板，扩增GFP基因的表达元件，包括启动子、编码区和5′UTR区；
S3：连接至pMD18-T载体，阳性检测正确后，从插入序列外侧设计正反向引物，扩增出两端包括LoxP位点的GFP基因表达元件组合；
S4：将此元件组合连入pTol2-MCS质粒多克隆位点处，构建完成pTol2-GFP质粒，即为所述两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒。
在以上技术方案中，S1中：上游为Lox66具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游为Lox71具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
在以上技术方案中，S2中：所述启动子具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述编码区具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，所述5′UTR区具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
在以上技术方案中，S2中：所述正反向引物分别为F1具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，R1具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
在以上技术方案中，S3中：所述正反向引物分别为F2具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，R2具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
本发明提供了两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒，所述质粒采用上述构建方法构建而成。
本发明还提供了上述质粒在基因工程育种上的应用。
作为其中一种实施例，所述质粒应用于鱼类转GFP基因底盘家系构建。
作为其中一种实施例，所述质粒应用于鳜转GFP基因底盘家系构建，其构建方法包括以下步骤：
S1：体外转录出Tol2 mRNA，将Tol2 mRNA和pTol2-GFP一起显微注射入鳜胚胎，构建P0代转基因群体；
S2：P0代性成熟后，与野生型亲鱼测交，筛选发绿色荧光的胚胎，即为稳定的所述鳜转GFP基因底盘家系。
在以上技术方案中，P0代性成熟的过程为：P0代转基因群体发育至12h-36h时，将显微注射的胚胎置于倒置荧光显微镜下观察，挑选发光信号强的胚胎进行孵育，同时进行团头鲂饵料鱼的繁殖，待鳜转基因群体平游后，用饵料鱼开口培育，一月龄后发塘养殖培育至性成熟。
本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明首次将Cre-LoxP重组酶系统的优势用于鱼类转基因家系的构建，基本步骤包括常规质粒构建、显微注射、荧光观察和家系传代等，整体过程简单易行，可达到后续高效构建转目标基因家系的目的。本发明提供的鳜转基因底盘家系可直接用于鳜基因工程育种研究，简化鳜养殖设施和养殖周期，极大地提高鳜遗传育种的效率。
(1)质粒构建上与常规质粒构建难度没有区别，简单易行。所用试剂材料，均易于购买，且操作人员不需要经过复杂的科研培训即可操作，适用性强；
(2)检测外源GFP基因的表达情况更为直观，仅需观察荧光亮度即可判断转植基因的表达效果，筛选方便。常规检测外源基因的表达情况，需要进行整合位点的检测，且在整合入基因组的基础上并不能判断基因表达效率的高低。本发明通过两代胚胎样本的荧光观察，在胚胎发育期即可筛选出稳定整合且高效表达的转基因底盘家系，极大地降低了检测难度；
(3)底盘家系构建完成后，后续正式多类转基因家系的构建仅需在此基础上进行替换即可。常规转基因家系的构建需要进行大量多个世代家系构建、分塘养殖、样本收集和外源目的基因的检测等，本发明通过后续一代转基因胚胎的荧光替换情况观察即可判断外源目的基因的整合位点和表达效率，极大地减少了大量经济鱼类家系构建、养殖培育和人工管理所导致的昂贵成本。
附图说明
图1为筛选出的3个发绿色荧光的F1底盘家系以及不发光的对照家系的图像。
图2.为在鳜底盘家系转入红色荧光蛋白后不同时间点的红色荧光观察图像。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
本发明提供了两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用，两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒构建如下：
为避免后续LoxP位点的分子内重组事件发生，在GFP表达元件两侧设计两个不同类型的LoxP位点。做法是将两个不同LoxP位点分别连入正反向引物，以pEGFP-N3质粒为模板，扩增GFP基因的表达元件，包括启动子、编码区和5′UTR区。然后连接至pMD18-T载体，阳性检测正确后，从插入序列外侧(pMD18-T载体上)设计引物，扩增出两端包括LoxP位点的GFP基因表达元件组合。将此元件组合连入pTol2-MCS质粒多克隆位点处，构建完成pTol2-GFP质粒。
包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒在转基因底盘家系构建中的应用，利用此质粒构建转基因底盘家系的具体步骤如下：
体外转录出Tol2 mRNA，将Tol2 mRNA和pTol2-GFP一起显微注释鳜胚胎，构建P0代转基因底盘家系。P0代性成熟后，与野生型亲鱼测交，筛选发绿色荧光的胚胎，即为稳定转LoxP-GFP基因的底盘家系。
作为其中一种实施例，本发明提供一种两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒构建方法，具体步骤如下：
1)在GFP表达元件两侧设计两个不同类型的同向LoxP位点(上游为Lox66:ATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAACGGTA；下游为Lox71:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。)。
2)将两个LoxP位点分别连入正反向引物(F1:ATAACTTCGT ATAGTATACATTATACGAACGGTATAGTTATTAATAGTAATCAATT ACGGG；R1:ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTAACAAACCACAACTAGAATGCAGTG)，以pEGFP-N3质粒(购买于Clontech公司)为模板，扩增GFP基因的表达元件，包括启动子、编码区和5′UTR区。
启动子的核苷酸序列为：TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG GGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC(SEQ ID NO.7)；
编码区的核苷酸序列为：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG TTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ IDNO.8)；
5′UTR区的核苷酸序列为：AGCGGCCGCGACTCTAGATCAT AATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGT(SEQ ID NO.9)。
3)连接至pMD18-T载体(购买于Takara公司)，阳性检测正确后，从插入片段外侧(位于pMD18-T载体上)设计引物(F2:GC CTCTTCGCTATTACGCCAGC；R2:CCAATACGCAAACCGCCTCT CC)，扩增出两端包括LoxP位点的GFP基因表达元件组合。将此元件组合连入pTol2-MCS质粒多克隆位点处，构建完成pTol2-GFP质粒。
作为其中一种实施例，本发明提供一种鳜转GFP基因底盘家系的构建方法，具体步骤如下：
1)将从国家斑马鱼资源中心购买的CZP13质粒作为模板，利用sp6体外转录试剂盒(购买于Thermo Fisher Scientific公司)，转录出Tol2 mRNA，将Tol2 mRNA(100ng/ul)和pTol2-GFP(20ng/ul)一起显微注释鳜胚胎，构建P0代转基因群体。
2)发育至12h-36h时，将显微注射的胚胎置于荧光倒置显微镜下观察，挑选发光信号强的胚胎在孵化桶中孵育。同时进行团头鲂饵料鱼的繁殖，待鳜转基因群体平游后，用饵料鱼开口培育。一月龄后发塘养殖培育至性成熟。
3)一月龄转基因P0代性成熟后，繁殖季节与野生型亲鱼测交，受精卵发育至12h-36h时在荧光倒置显微镜下观察筛选发绿色荧光的胚胎，即为稳定转LoxP-GFP基因的底盘家系。
4)挑选荧光较强的3个家系作为保种的底盘家系，待平游后，用饵料鱼开口培育。一月龄后发塘养殖培育至性成熟，即为构建完成的转基因底盘家系(图1)。
实验例
转基因底盘家系靶点基因替换的验证实验：
1)从山东维真生物科技有限公司购买腺相关病毒质粒pAV-4in1shRNA-CMV-RFP，插入两个LoxP位点，改造为pAV-lox66-4in1shR NA-CMV-RFP-polyA-lox71质粒。
2)转基因底盘家系性成熟后，繁殖季节将F6家系(绿色荧光亮度最强)内雄性和雄性亲鱼自交，获得转基因用底盘胚胎，将Cre酶(100ng/ul)和pAV-lox66-4in1shRNA-CMV-RFP-polyA-lox71(20ng/ul)一起显微注释鳜胚胎，构建转RFP(由GFP基因替换为RFP)基因的家系。
3)发育至24h-96h时，将显微注射的胚胎置于荧光倒置显微镜下观察，结果发现10％的胚胎仅发红色荧光(图2)，其余发绿色荧光，说明10％的胚胎成功产生了荧光蛋白的置换(绿变红)，也验证了本发明基于Cre-LoxP重组酶系统设计和构建的鳜转GFP基因底盘家系是成功的。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (4)
1.两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒在基因工程育种上的应用，其特征在于，所述质粒应用于鳜转GFP基因底盘家系构建，其构建方法包括以下步骤：
S1：体外转录出Tol2 mRNA，将Tol2 mRNA和pTol2-GFP一起显微注射入鳜胚胎，构建P0代转基因群体；
S2：P0代性成熟后，与野生型亲鱼测交，筛选发绿色荧光的胚胎，即为稳定的所述鳜转GFP基因底盘家系；
其中，pTol2-GFP构建方法包括以下步骤：
S11：在GFP表达元件两侧设计两个不同类型的同向LoxP位点，其中，上游LoxP位点为Lox66，所述Lox66的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游LoxP位点为Lox71，所述Lox71的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
S12：将两个不同LoxP位点分别连入正反向引物，以pEGFP-N3质粒为模板，扩增GFP基因的表达元件，包括启动子、编码区和5′UTR区；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述5′UTR区的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
S13：连接至pMD18-T载体，阳性检测正确后，从插入序列外侧设计正反向引物，扩增出两端包括LoxP位点的GFP基因表达元件组合；
S14：将此元件组合连入pTol2-MCS质粒多克隆位点处，构建完成pTol2-GFP质粒，即为所述两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，S12中：所述正反向引物分别为F1和R1，F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，S13中：所述正反向引物分别为F2和R2，F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，P0代性成熟的过程为：P0代转基因群体发育至12h-36h时，将显微注射的胚胎置于倒置荧光显微镜下观察，挑选发光信号强的胚胎进行孵育，同时进行团头鲂饵料鱼的繁殖，待鳜转基因群体平游后，用饵料鱼开口培育，一月龄后发塘养殖培育至性成熟。
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