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CN117004575A - 一种用于兔出血症病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用 - Google Patents

一种用于兔出血症病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用 Download PDF

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CN117004575A
CN117004575A CN202310393739.2A CN202310393739A CN117004575A CN 117004575 A CN117004575 A CN 117004575A CN 202310393739 A CN202310393739 A CN 202310393739A CN 117004575 A CN117004575 A CN 117004575A
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CN
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antibody
hybridoma cell
rabbit hemorrhagic
rhdv2
rhdv1
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Application number
CN202310393739.2A
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王芳
魏后军
胡波
陈兴继
范志宇
宋艳华
仇汝龙
陈萌萌
葛雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Original Assignee
Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于兔出血症病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用。本发明提供的杂交瘤细胞株能产生特异性结合兔出血症病毒的单克隆抗体，其中杂交瘤细胞株2A11产生的单克隆抗体具有抗RHDV广谱性，能够结合RHDV1和RHDV2，无需使用复杂的仪器，特异性强，灵敏度高；并且所述杂交瘤细胞株2A11与杂交瘤细胞株6B3产生的单克隆抗体能够特异性检测RHDV2，与杂交瘤细胞株1D4产生的单克隆抗体能够特异性检测RHDV1，将三个杂交瘤细胞株组合使用，能够在特异性检测兔出血症病毒的同时，进一步实现鉴别检测RHDV1和RHDV2的目的。

Description

一种用于兔出血症病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于兔出血症病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用。
背景技术
兔出血症(Rabbithaemorrhagic disease，RHD)又称“兔瘟”，是由兔出血症病毒(Rabbithaemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种以急性、高度传染性、大面积死亡为特征的兔传染病。目前，RHDV分为2种基因型：RHDV1(基因型GI.1)和RHDV2(基因型GI.2)。RHDV2与RHDV1的不同之处在于：自然条件下RHDV2能感染不同年龄阶段的兔群；感染范围更广，家兔和野兔均易感。RHDV1与RHDV2感染引起的家兔临床症状极为相似，常于感染后24～72h死亡，最常见的病变见于肝脏(肝坏死)、脾脏(脾肿大)、肺和气管(充血和出血)；通过临床症状难以进行鉴别诊断，需要分子生物学检测手段进行诊断。目前，针对兔出血症的临床诊断方法主要分为两类：一类是针对病毒核酸的检测，例如中国专利CN202210707494.1公开了基于双重荧光RT-PCR的鉴别方法，该方法检测率高，敏感度高，但因试剂、仪器和操作技术要求更适合于实验室操作，在一定程度上限制了基层和大量临床样本检测工作的开展；还如中国专利CN202011154052.6公开了一种高效二联检测兔瘟1型和兔瘟2型的引物以及试剂盒，但是该试剂盒是采用LAMP与微流控芯片技术，需要使用专用的恒温扩增仪。另一类是抗原检测，例如传统的红细胞凝集试验，需要使用新鲜人红细胞，而且敏感度低；还如中国专利CN200910029628.3公开了兔出血症检测试纸条，中国专利CN201510703451.6公开了兔出血症病毒双抗夹心ELISA检测试剂盒及使用方法，是基于RHDV1抗原制备的抗体建立的方法；以上现有技术并不适用于RHDV1和RHDV2的鉴别检测。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种用于兔出血症病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用，检测兔出血症病毒，提高检测的特异性和敏感度，鉴别检测RHDV1和RHDV2。
为了实现上述目的，本发明提供了一种产生兔出血症病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株2A11；
所述杂交瘤细胞株2A11的保藏号为CCTCC NO:C202323，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月23日。
本发明还提供了一种兔出血症病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括兔出血症病毒抗体2A11；
所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体。
本发明还提供了一种产生兔出血症病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株组合，所述杂交瘤细胞株组合包括上述技术方案所述的杂交瘤细胞株、产生捕获抗体的杂交瘤细胞株和产生检测抗体的杂交瘤细胞株；
所述产生捕获抗体的杂交瘤细胞株为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11；
所述产生检测抗体的杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株1D4和/或杂交瘤细胞株6B3；
所述杂交瘤细胞株1D4的保藏号为CCTCC NO:C202324，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月23日；
所述杂交瘤细胞株6B3的保藏号为CCTCC NO:C202315，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年1月12日。
本发明还提供了一种兔出血症病毒的单克隆抗体组合，所述单克隆抗体组合包括捕获抗体和检测抗体；
所述捕获抗体为上述技术方案所述的兔出血症病毒抗体2A11；
所述检测抗体包括兔出血症病毒抗体1D4和/或兔出血症病毒抗体6B3；
所述兔出血症病毒抗体1D4为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体；
所述兔出血症病毒抗体6B3为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
本发明还提供了上述技术方案所述的杂交瘤细胞株或单克隆抗体或杂交瘤细胞株组合或单克隆抗体组合在制备兔出血症病毒检测试剂盒中的应用。
优选的，所述兔出血症病毒包括RHDV1和RHDV2中的一种或两种组合；
所述试剂盒包括双抗体夹心ELISA试剂盒。
本发明还提供了上述技术方案所述的杂交瘤细胞株组合或所述的单克隆抗体组合在制备鉴别RHDV1和RHDV2的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测RHDV1的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体和HRP标记的检测抗体；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体为兔出血症病毒抗体1D4；所述兔出血症病毒抗体1D4为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体。
本发明还提供了一种检测RHDV2的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体和HRP标记的检测抗体；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体为兔出血症病毒抗体6B3；所述兔出血症病毒抗体6B3为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
本发明还提供了一种鉴别RHDV1和RHDV2的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体、HRP标记的检测抗体1和HRP标记的检测抗体2；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体1为兔出血症病毒抗体1D4；所述兔出血症病毒抗体1D4为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体；
所述检测抗体2为兔出血症病毒抗体6B3；所述兔出血症病毒抗体6B3为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
有益效果：
本发明提供的杂交瘤细胞株能产生特异性结合兔出血症病毒的单克隆抗体，其中杂交瘤细胞株2A11产生的单克隆抗体具有广谱性，能够结合RHDV1和RHDV2。并且将上述杂交瘤细胞株2A11和杂交瘤细胞株1D4和6B3中的任意一种或两种组合，所述杂交瘤细胞株2A11与杂交瘤细胞株1D4产生的单克隆抗体能够特异性检测RHDV1，与杂交瘤细胞株6B3产生的单克隆抗体能够特异性检测RHDV2，将三个杂交瘤细胞株组合使用，能够在特异性检测兔出血症病毒的同时，进一步实现鉴别检测RHDV1和RHDV2的目的。利用本发明提供的杂交瘤细胞株，无需使用复杂的仪器，特异性强，灵敏度高。
生物保藏信息
杂交瘤细胞株2A11，于2023年2月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO:C202323；
杂交瘤细胞株1D4，于2023年2月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO:C202324；
杂交瘤细胞株6B3，于2023年1月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO:C202315。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为RHDV1敏感性试验结果；
图2为RHDV2敏感性试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种产生兔出血症病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株2A11；
所述杂交瘤细胞株2A11的保藏号为CCTCC NO:C202323，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月23日。
本发明提供的杂交瘤细胞株2A11能够产生抗RHDV广谱单克隆抗体2A11，能够特异性捕获兔出血症病毒，包括RHDV1和RHDV2，检测兔出血症病毒。本发明所述杂交瘤细胞株2A11产生的单克隆抗体2A11可以作为捕获抗体，与抗RHDV1或RHDV2的特异性单克隆抗体配对，特异性检测RHDV1样品或RHDV2样品，并未无交叉反应，进一步提高RHDV1或RHDV2检测的灵敏性。
鉴于本发明提供的杂交瘤细胞株的作用，上述杂交瘤细胞株产生的抗体同样属于本发明的保护范围。本发明所述杂交瘤细胞株抗体具体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体。
本发明还提供了一种产生兔出血症病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株组合，所述杂交瘤细胞株组合包括上述技术方案所述的杂交瘤细胞株、产生捕获抗体的杂交瘤细胞株和产生检测抗体的杂交瘤细胞株；所述产生捕获抗体的杂交瘤细胞株为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11；所述产生检测抗体的杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株1D4和/或杂交瘤细胞株6B3。本发明所述杂交瘤细胞株组合具体有杂交瘤细胞株2A11和杂交瘤细胞株1D4的组合，杂交瘤细胞株2A11和杂交瘤细胞株6B3的组合，以及杂交瘤细胞株2A11、杂交瘤细胞株1D4和杂交瘤细胞株6B3的组合。所述杂交瘤细胞株1D4的保藏号为CCTCC NO:C202324，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月23日；所述杂交瘤细胞株6B3的保藏号为CCTCC NO:C202315，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年1月12日。
在本发明中，所述杂交瘤细胞株6B3能够产生抗RHDV2的特异性单克隆抗体6B3，检测RHDV2。本发明将杂交瘤细胞株6B3和上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11和1D4中的任意一种或多种组合使用，杂交瘤细胞株2A11产生的抗RHDV广谱单克隆抗体2A11与杂交瘤细胞株1D4产生的抗RHDV1特异性单克隆抗体1D4配对，能特异性检测RHDV1样品，而且不与RHDV2样品反应；杂交瘤细胞株2A11产生的抗RHDV广谱单克隆抗体2A11与杂交瘤细胞株6B3产生的抗RHDV2特异性单克隆抗体6B3配对，能特异性检测RHDV2样品，而且不与RHDV1样品反应。本发明提供的杂交瘤细胞株组合能够同时检测RHDV1和RHDV2，并且在检测的同时区分RHDV1和RHDV2。
鉴于本发明提供的杂交瘤细胞株组合的作用，上述杂交瘤细胞株组合产生的抗体组合同样属于本发明的保护范围。本发明所述杂交瘤细胞株组合具体为兔出血症病毒抗体2A11和兔出血症病毒抗体1D4的组合，或者兔出血症病毒抗体2A11和兔出血症病毒抗体6B3的组合，或者兔出血症病毒抗体2A11、兔出血症病毒抗体1D4和兔出血症病毒抗体6B3的组合。
本发明还提供了上述技术方案所述的杂交瘤细胞株或单克隆抗体或杂交瘤细胞株组合或单克隆抗体组合在制备兔出血症病毒检测试剂盒中的应用。
在本发明中，所述兔出血症病毒优选包括RHDV1和RHDV2中的一种或两种组合；所述试剂盒优选包括双抗体夹心ELISA试剂盒。
本发明还提供了上述技术方案所述的杂交瘤细胞株组合或所述的单克隆抗体组合在制备鉴别RHDV1和RHDV2的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测RHDV1的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体和HRP标记的检测抗体；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体为兔出血症病毒抗体1D4；所述兔出血症病毒抗体1D4为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体。
在本发明中，所述捕获抗体的浓度优选为4μg/mL；所述HRP标记的检测抗体的浓度优选为0.5μg/mL。
在本发明中，所述双抗体夹心ELISA试剂盒优选还包括封闭剂、显色液、终止液和洗涤液中的一种或多种。本发明所述封闭剂优选包括5％脱脂乳、1％BSA、2％明胶和1％干酪素钠中的任意一种，进一步优选为5％脱脂乳；所述洗涤液优选包括PBST。
本发明还提供了一种检测RHDV2的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体和HRP标记的检测抗体；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体为兔出血症病毒抗体6B3；所述兔出血症病毒抗体6B3为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
在本发明中，所述捕获抗体的浓度优选为4μg/mL；所述HRP标记的检测抗体的浓度优选为0.5μg/mL。
在本发明中，所述双抗体夹心ELISA试剂盒优选还包括封闭剂、显色液、终止液和洗涤液中的一种或多种。本发明所述封闭剂优选包括5％脱脂乳、1％BSA、2％明胶和1％干酪素钠中的任意一种，进一步优选为5％脱脂乳；所述洗涤液优选包括PBST。
本发明还提供了一种鉴别RHDV1和RHDV2的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体、HRP标记的检测抗体1和HRP标记的检测抗体2；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体1为兔出血症病毒抗体1D4；所述兔出血症病毒抗体1D4为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体；
所述检测抗体2为兔出血症病毒抗体6B3；所述兔出血症病毒抗体6B3为上述技术方案所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
在本发明中，所述捕获抗体的浓度优选为4μg/mL；所述HRP标记的检测抗体1、检测抗体2的浓度均优选为0.5μg/mL。
在本发明中，所述双抗体夹心ELISA试剂盒优选还包括封闭剂、显色液、终止液、和洗涤液中的一种或多种。本发明所述封闭剂优选包括5％脱脂乳、1％BSA、2％明胶和1％干酪素钠中的任意一种，进一步优选为5％脱脂乳；所述洗涤液优选包括PBST。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于兔出血症病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株2A11、6B3、4F1的建立：
1、实验材料
RHDV1(WF/2007株，GenBank登录号FJ794180)；
RHDV2(SC2020/04株，GenBank登录号MT383749)；
重组RHDV1 VP60蛋白(制备方法见：王芳，胡波，任雪枫等.兔出血症病毒衣壳蛋臼在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[J].畜牧兽医学报.2008；39(10):1382—1387.)；
重组RHDV2 VP60蛋白(制备方法见：CN202010608699.5《一种兔出血症病毒2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒、疫苗及其制备方法和应用》)
2、抗原的制备
按照醛化红细胞吸附释放纯化方法进行分别对步骤1.1的试验材料进行提纯，操作如下：将人“O”型红细胞用PBS洗涤3次后，配制成10％悬液，将等体积1.25％戊二醛缓慢加入到10％红细胞悬浮液中，37℃水浴1h。醛化后的红细胞再用PBS洗涤3次，最后配成50％红细胞悬液待用。将10mL 50％红细胞悬液加入到各100mL离心后的RHDV1、RHDV2、重组RHDV1 VP60蛋白和重组RHDV2 VP60蛋白中，置4℃摇床中振摇2h；将混悬液4℃8000r/min离心5min，弃上清，沉淀用预冷的PBS洗涤3次，加入2mL PBS，振荡混匀，37℃水浴1h，37℃8000r/min离心10min，上清即为纯化的抗原。
3、动物免疫
利用甲醛分别灭活纯化后的RHDV1和RHDV2，作为免疫抗原免疫小鼠：取6～8周龄的BALB/c纯系小鼠6只，将抗原与弗氏完全佐剂1：1混匀，乳化后进行腹腔注射，注射总剂量为200μL，抗原量100μg/只。阴性对照小鼠用PBS与弗氏完全佐剂1：1混匀进行腹腔注射，剂量与免疫小鼠相同。每隔两周后进行二免和三免，佐剂为弗氏不完全佐剂，剂量与首免相同。第5周进行尾静脉采血，收集血清，ELISA检测小鼠血清效价。第6周选定效价合格的小鼠腹腔注射免疫抗原40μg，加强免疫3d后进行细胞融合。
4、饲养细胞的制备
取一只空白的BALB/c纯系小鼠，拉颈脱臼处死，用75％的酒精浸泡10min；随后将其放入无菌超净台中，用镊子提起小鼠腹部皮毛，用剪刀将其剪开，露出腹膜，用注射器将5mL DMEM培养基注入小鼠腹腔，再用注射器回收腹腔内培养基转移至50mL离心管内，并加入40mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，混匀后将其加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃，5％CO2的培养箱中
5、细胞融合
将步骤3加强免疫后的小鼠进行眼球采血，血液8000r/min离心10min，取血清做为阳性对照。小鼠颈椎脱臼处死后取脾脏制成脾细胞悬液，与处于对数生长期的SP2/0细胞以5：1的比例混匀。在PEG1450的作用下进行融合。将融合后的细胞加入到提前一天铺有饲养细胞的96孔板中，每孔100μL，置孵箱中培养。融合后第7d，将培养液换成200μL新鲜的HT培养基，置孵箱中培养。换液2d后，将板孔中的上清每孔吸出100μL，并作相应的编号，利用间接ELISA检测分泌RHDV2 VP60蛋白特异性抗体的细胞株。2d后进行复检，复检结果为阳性的孔进行3次亚克隆直至抗体阳性率为100％，将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存于液氮保存。获得一株能够稳定分泌针对RHDV1 VP60蛋白和RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为2A11；获得两株能够稳定分泌针对RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为6B3、4F1。间接ELISA方法如下。
以纯化的RHDV1、RHDV2、重组RHDV1 VP60蛋白和重组RHDV2 VP60蛋白为抗原，利用包被液稀释并分别包被96孔酶标板，抗原包被浓度为1μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。用PBST洗涤3次，300μL/孔。每孔加入200μL封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃放置1.5h，洗涤同上。将杂交瘤细胞上清作为一抗，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤同上；HRP-羊抗鼠IgG(1:10000)为二抗孵育1h，每孔100μL，洗涤同上。每孔加入100μL TMB底物显色液，37℃放置15min后每孔加入2mol/L H2SO4终止液50μL。用酶标仪测定每孔OD450值，待检样品OD450/阴性样品OD450＞2.1判定为阳性。
(二)单克隆抗体制备、纯化和辣根过氧化物酶标记。
1、腹水制备
利用杂交瘤细胞株2A11、1B8、1D4、5F3、6B3、4F1制备小鼠腹水，其中1B8、1D4、5F3来源见“宋艳华,胡波,范志宇,等.RHDVVLPs单克隆抗体的制备及其识别表位的初步定位[J].华北农学报,2015,30(5):65-70.”。取12周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂进行致敏，7d后腹腔注射2×105个杂交瘤细胞株，观察小鼠，2周后小鼠腹部膨大，触之有波动感，进行腹水收集，4000r/min离心5min，取中间层液体，于-80℃保存备用；
2、抗体纯化
取步骤1腹水12000r/min离心4min取上清，按照1：5的体积比加入PBS稀释，使用Protein G亲和层析柱纯化，将纯化的抗体用PBS 4℃透析过夜后，用BCA蛋白测定试剂盒测定抗体浓度。
3、辣根过氧化物酶标记单克隆抗体1D4、5F3、6B3、4F1
(1)称取5mg HRP溶解于1mL纯水中，加入0.2mL新配的0.1mol/mLNaIO4溶液，室温反应30min；
(2)将5mg步骤2纯化的单克隆抗体用偶联缓冲液透析过夜(pH 9.50.01mol/mL的碳酸盐缓冲液)透析过夜；
(3)将步骤(1)和步骤(2)的溶液混合，室温反应2h；
(4)加入0.1ml 4mg/ml NaBH4液，混匀后置4℃2h。
(5)将上述液装入透析袋中，利用0.15M pH7.4 PBS 4℃透析过夜。
4、单克隆抗体的间接ELISA鉴定
按步骤(一)中记载的间接ELISA方法对纯化的单克隆抗体和酶标的单克隆抗体(不加HRP-羊抗鼠IgG)进行鉴定，结果如表1所示。
表1单克隆抗体的间接ELISA鉴定结果
注：表中数值表示OD450。
根据表1可以看出，杂交瘤细胞株2A11和1B8产生的单克隆抗体均能与RHDV1、RHDV2及重组RHDV1 VP60蛋白、重组RHDV2 VP60蛋白反应，为抗RHDV广谱单克隆抗体；杂交瘤细胞株1D4和5F3产生的单克隆抗体1D4和5F3仅能与RHDV1及重组RHDV1 VP60蛋白反应，为抗RHDV1特异性单克隆抗体；杂交瘤细胞株6B3和4F1产生的单克隆抗体6B3和4F1仅能与RHDV2及重组RHDV2VP60蛋白反应，为抗RHDV2特异性单克隆抗体。
实施例2
抗体配对实验
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11和1B8分别作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至8μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min；
(2)步骤(1)洗涤结束后，随机分为实验1组、实验2组和对照组，实验1组每孔加入100μL兔出血症病毒1型(RHDV1)肝脏研磨液，实验2组每孔加入100μL兔出血症病毒2型(RHDV2)肝脏研磨液，对照组每孔加入100μL阴性肝脏研磨液；加入肝脏研磨液后37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min；
其中，肝脏研磨液的制备方法为：用0.01mol/LpH7.4的PBS，按1g：10mL的质量体积比将PBS和兔肝脏混合，进行充分研磨，8000rpm离心15min后取上清，即得肝脏研磨液；
通过红细胞凝集试验(HA，具体参照中华人民共和国农业行业标准《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法》(NY/T572-2016))分别检测兔出血症病毒1型(RHDV1)肝脏研磨液和兔出血症病毒2型(RHDV2)肝脏研磨液的HA效价，具体的，兔出血症病毒1型(RHDV1)肝脏研磨液的HA效价为1：2560；兔出血症病毒2型(RHDV2)肝脏研磨液的HA效价为1:2560。
(3)步骤(2)洗涤结束后，实验1组、实验2组和对照组分别4个子处理组，第1子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-1D4；第2子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-5F3；第3子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-6B3；第4子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-4F1；
37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
(4)步骤(3)洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液(购自湖州英创生物科技有限公司)并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算P(RHDV1)/N值、P(RHDV1)/P(RHDV2)值、P(RHDV2)/N值和P(RHDV2)/P(RHDV1)值，其中P(RHDV1)为实验1组，即以RHDV1为抗原的OD450检测结果；P(RHDV2)为实验2组，即以RHDV2为抗原的OD450检测结果；N为对照组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果，结果如表2所示。
表2不同抗体配对方式检测结果
注：表中“-”表示未计算。
根据表2可以看出，单克隆抗体2A11作为捕获抗体，HRP-1D4作为RHDV1检测抗体，P(RHDV1)/N值及P(RHDV1)/P(RHDV2)值最大，单克隆抗体2A11和单克隆抗体1D4为检测RHDV1的最佳抗体组合；单克隆抗体2A11作为捕获抗体，HRP-6B3作为RHDV2检测抗体，P(RHDV2)/N值及P(RHDV1)/P(RHDV1)值最大，单克隆抗体2A11和单克隆抗体6B3为检测RHDV2的最佳抗体组合。
实施例3
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至8μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min；
(2)步骤(1)洗涤结束后，随机分为实验1组、实验2组、对照1组和对照2组，实验1组、实验2组、对照1组和对照2组分别分为4个子处理组；
按照实施例2步骤(2)的方式制备RHDV1肝脏研磨液、RHDV2研磨液和阴性肝脏研磨液，分别按1:10、1:20、1:40、1:80进行稀释；
实验1组的第1子处理组每孔加入100μL RHDV1肝脏研磨液按照1:10进行稀释后的稀释液，第2子处理组每孔加入100μL RHDV1肝脏研磨液按照1:20进行稀释后的稀释液，第3子处理组每孔加入100μL RHDV1肝脏研磨液按照1:40进行稀释后的稀释液，第4子处理组每孔加入100μL RHDV1肝脏研磨液按照1:80进行稀释后的稀释液；
实验2组的第1～4子处理组，每孔加入100μL RHDV2肝脏研磨液，各子处理加入的肝脏研磨液的稀释倍数与实验1组的各子处理组对应；
对照1组用于下步添加检测抗体HRP-1D4；对照1组的第1～4子处理组，每孔加入100μL阴性肝脏研磨液，各子处理加入的肝脏研磨液的稀释倍数与实验1组的各子处理组对应；
对照2组用于下步添加检测抗体HRP-6B3；对照2组的第1～4子处理组，每孔加入100μL阴性肝脏研磨液，各子处理加入的肝脏研磨液的稀释倍数与实验1组的各子处理组对应；
加入肝脏研磨液的稀释液后37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min。
(3)步骤(2)洗涤结束后，实验1组的各子处理组，每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-1D4；
实验2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-6B3；
对照1组的各子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-1D4；
对照2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-6B3；
37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
(4)步骤(3)洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算P(RHDV1)/N1值、P(RHDV1)/P(RHDV2)值、P(RHDV2)/N2值和P(RHDV2)/P(RHDV1)值，其中P(RHDV1)为实验1组，即以RHDV1为抗原的OD450检测结果；P(RHDV2)为实验2组，即以RHDV2为抗原的OD450检测结果；N1为对照1组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果；N2为对照2组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果，结果如表3所示。
表3不同稀释倍数检测结果
根据表3可以看出，以单克隆抗体2A11为捕获抗体，HRP-1D4为RHDV1检测抗体HRP-1D4，HRP-6B3为RHDV2检测抗体，对1:10、1:20、1:40、1:80稀释RHDV1、RHDV2阳性肝脏和阴性肝脏进行检测。用RHDV1检测抗体HRP-1D4检测1:40稀释的肝脏样品时，P(RHDV1)/N1值及P(RHDV1)/P(RHDV2)值最大；用RHDV2检测抗体HRP-6B3检测1:40稀释的肝脏样品时，P(RHDV2)/N2值及P(RHDV2)/P(RHDV1)值最大。因此，确定肝脏样品最佳稀释倍数为1：40。
实施例4
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至12、8、4、2μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min；
(2)步骤(1)洗涤结束后，每个单克隆抗体2A11稀释浓度下均随机分为实验1组、实验2组、对照1组和对照2组；
按照实施例2步骤(2)的方式制备RHDV1肝脏研磨液、RHDV2研磨液和阴性肝脏研磨液，按1:40的比例进行稀释；
每个克隆抗体2A11稀释浓度下的实验1组每孔均加入100μL RHDV1肝脏研磨液的稀释液；
每个克隆抗体2A11稀释浓度下的实验2组每孔均加入100μL RHDV2肝脏研磨液的稀释液；
对照1组用于下步添加检测抗体HRP-1D4；每个克隆抗体2A11稀释浓度下的对照1组每孔均加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
对照2组用于下步添加检测抗体HRP-6B3；每个克隆抗体2A11稀释浓度下的对照2组每孔均加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
加入肝脏研磨液的稀释液后37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min。
(3)步骤(2)洗涤结束后，每个克隆抗体2A11稀释浓度下的实验1组、实验2组、对照1组和对照2组分别分为4个子处理组：
每个克隆抗体2A11稀释浓度下的实验1组和对照1组的第1子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-1D4，第2子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4，第3子处理组每孔加入100μL浓度为0.25μg/mL的HRP-1D4，第4子处理组每孔加入100μL浓度为0.125μg/mL的HRP-1D4；
每个克隆抗体2A11稀释浓度下的实验2组和对照2组的第1子处理组每孔加入100μL浓度为1μg/mL的HRP-6B3，第2子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3，第3子处理组每孔加入100μL浓度为0.25μg/mL的HRP-6B3，第4子处理组每孔加入100μL浓度为0.125μg/mL的HRP-6B3；
37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
(4)步骤(3)洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算P(RHDV1)/N1值、P(RHDV1)/P(RHDV2)值、P(RHDV2)/N2值和P(RHDV2)/P(RHDV1)值，其中P(RHDV1)为实验1组，即以RHDV1为抗原的OD450检测结果；P(RHDV2)为实验2组，即以RHDV2为抗原的OD450检测结果；N1为对照1组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果；N2为对照2组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果。结果如表4所示。
表4不同捕获抗体和检测抗体浓度的检测结果
根据表4可以看出，捕获抗体2A11浓度为8或4μg/mL，RHDV1检测抗体HRP-1D4浓度为0.5μg/mL时，P(RHDV1)/N1值及P(RHDV1)/P(RHDV2)值较大；捕获抗体2A11浓度为4μg/mL，RHDV2检测抗体HRP-6B3浓度为0.5μg/mL时，P(RHDV2)/N2值及P(RHDV2)/P(RHDV1)值最大。综合考虑确定捕获抗体2A11浓度为4μg/mL，检测抗体HRP-1D4、HRP-6B3浓度均为0.5μg/mL效果最佳。
实施例5
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，随机分为实验1组、实验2组、对照1组和对照2组，实验1组、实验2组、对照1组和对照2组分别分为4个子处理组；
实验1组的第1～4子处理组，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后第1子处理组按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min；第2子处理组按200μL/孔加入1％BSA，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min；第3子处理组按200μL/孔加入2％明胶，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min；第4子处理组按200μL/孔加入1％干酪素钠，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min；
实验2组的第1～4子处理组、对照1组的第1～4子处理组合对照2组的第1～4子处理组的处理方式分别与实验1组的第1～4子处理组的处理方式相同。
(2)步骤(1)洗涤结束后，按照实施例2步骤(2)的方式制备RHDV1肝脏研磨液、RHDV2研磨液和阴性肝脏研磨液，按1:40的比例进行稀释；
实验1组的各子处理组每孔加入100μL RHDV1肝脏研磨液的稀释液；
实验2组的各子处理组每孔加入100μL RHDV2肝脏研磨液的稀释液；
对照1组用于下步添加检测抗体HRP-1D4；对照1组的各子处理组每孔加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
对照2组用于下步添加检测抗体HRP-6B3；对照2组的各子处理组每孔加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
加入肝脏研磨液的稀释液后37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min；
(3)步骤(2)洗涤结束后，实验1组的各子处理组，每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4；
实验2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3；
对照1组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4；
对照2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3；
37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
(4)步骤(3)洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算P(RHDV1)/N1值、P(RHDV1)/P(RHDV2)值、P(RHDV2)/N2值和P(RHDV2)/P(RHDV1)值，其中P(RHDV1)为实验1组，即以RHDV1为抗原的OD450检测结果；P(RHDV2)为实验2组，即以RHDV2为抗原的OD450检测结果；N1为对照1组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果；N2为对照2组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果，结果如表5所示。
表5不同封闭剂检测结果
根据表5可以看出，用5％脱脂乳作为封闭剂，以RHDV1检测抗体HRP-1D4检测样品时，P(RHDV1)/N1值及P(RHDV1)/P(RHDV2)值最大；同时用5％脱脂乳作为封闭剂，以RHDV2检测抗体HRP-6B3检测样品时P(RHDV2)/N2值及P(RHDV2)/P(RHDV1)值最大。因此，确定最佳封闭剂为5％脱脂乳。
实施例6
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
(2)步骤(1)洗涤结束后，随机分为实验1组、实验2组、对照1组和对照2组，实验1组、实验2组、对照1组和对照2组分别分为4个子处理组；
按照实施例2步骤(2)的方式制备RHDV1肝脏研磨液、RHDV2研磨液和阴性肝脏研磨液，按1:40的比例进行稀释；
实验1组的各子处理组每孔加入100μL RHDV1肝脏研磨液的稀释液；
实验2组的各子处理组每孔加入100μL RHDV2肝脏研磨液的稀释液；
对照1组用于下步添加检测抗体HRP-1D4；对照1组的各子处理组每孔加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
对照2组用于下步添加检测抗体HRP-6B3；对照2组的各子处理组每孔加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
加入稀释液后，各处理组的第1子处理组37℃孵育40min，PBST洗3次，每次5min；各处理组的第2子处理组37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；；各处理组的第3子处理组37℃孵育1.5h，PBST洗3次，每次5min；各处理组的第4子处理组37℃孵育2h，PBST洗3次，每次5min；
(3)步骤(2)洗涤结束后，实验1组的各子处理组，每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4；
实验2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3；
对照1组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4；
对照2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3；
加入检测抗体后，PBST洗3次，每次5min；
(4)步骤(3)洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算P(RHDV1)/N1值、P(RHDV1)/P(RHDV2)值、P(RHDV2)/N2值和P(RHDV2)/P(RHDV1)值，其中P(RHDV1)为实验1组，即以RHDV1为抗原的OD450检测结果；P(RHDV2)为实验2组，即以RHDV2为抗原的OD450检测结果；N1为对照1组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果；N2为对照2组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果，结果如表6所示。
表6抗原不同孵育时间检测结果
根据表6可以看出，以RHDV1检测抗体HRP-1D4进行试验，抗原孵育1h时，P(RHDV1)/N值及P(RHDV1)/P(RHDV2)值最大；以RHDV2检测抗体HRP-6B3进行试验，抗原孵育1h或1.5h时，P(RHDV2)/N值及P(RHDV2)/P(RHDV1)值较大。因此，最适检测抗体孵育时间为1h。
实施例7
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
(2)步骤(1)洗涤结束后，随机分为实验1组、实验2组、对照1组和对照2组，实验1组、实验2组、对照1组和对照2组分别分为4个子处理组；
按照实施例2步骤(2)的方式制备RHDV1肝脏研磨液、RHDV2研磨液和阴性肝脏研磨液，按1:40的比例进行稀释；
实验1组的各子处理组每孔加入100μL RHDV1肝脏研磨液的稀释液；
实验2组的各子处理组每孔加入100μL RHDV2肝脏研磨液的稀释液；
对照1组用于下步添加检测抗体HRP-1D4；对照1组的各子处理组每孔加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
对照2组用于下步添加检测抗体HRP-6B3；对照2组的各子处理组每孔加入100μL阴性肝脏研磨液的稀释液；
加入肝脏研磨液的稀释液后37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min；
(3)步骤(2)洗涤结束后，实验1组的各子处理组，每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4；
实验2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3；
对照1组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4；
对照2组的各子处理组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3；
加入检测抗体后，各处理组的第1子处理组37℃孵育40min，PBST洗3次，每次5min；各处理组的第2子处理组37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；；各处理组的第3子处理组37℃孵育1.5h，PBST洗3次，每次5min；各处理组的第4子处理组37℃孵育2h，PBST洗3次，每次5min；
(4)步骤(3)洗涤结束后，按100μL/孔加入底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算P(RHDV1)/N1值、P(RHDV1)/P(RHDV2)值、P(RHDV2)/N2值和P(RHDV2)/P(RHDV1)值，其中P(RHDV1)为实验1组，即以RHDV1为抗原的OD450检测结果；P(RHDV2)为实验2组，即以RHDV2为抗原的OD450检测结果；N1为对照1组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果；N2为对照2组，即以阴性肝脏样品为抗原的OD450检测结果，结果如表7所示。
表7检测抗体不同孵育时间检测结果
根据表7可以看出，RHDV1检测抗体HRP-1D4孵育60或90min时，P(RHDV1)/N值及P(RHDV1)/P(RHDV2)值较大；RHDV2检测抗体HRP-6B3孵育60min时，P(RHDV2)/N值及P(RHDV2)/P(RHDV1)值最大。因此，最适检测抗体孵育时间为1h。
实施例7
阴阳性临界值的确定
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
(2)步骤(1)洗涤结束后，取30份RHDV阴性的健康兔肝脏，分别按照实施例2步骤(2)的方式制备阴性肝脏研磨液，按1:40的比例进行稀释，得到稀释液；分别以每份RHDV阴性的健康兔肝脏制备得到的阴性肝脏研磨液的稀释液为抗原，进行实验，其中，每份稀释液处理组分为实验1组和实验2组，实验1组和实验2组按照100μL/孔的添加量添加稀释液，37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min；
洗涤结束后，实验1组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；实验2组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
(3)步骤(2)洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算30份RHDV阴性的健康兔肝脏检测结果的平均值和标准差(SD)，OD450值≥判为阳性，OD450值＜判为阴性，结果如下：
检测30份RHDV阴性的健康兔肝脏，检测抗体HRP-1D4检测样品平均值为0.113，标准偏差(s)为0.027，阴阳性临界值为0.195，即OD450值≥0.195判为RHDV1阳性，OD450值＜0.195判为RHDV1阴性；
检测抗体HRP-6B3检测样品平均值为0.093，标准偏差(s)为0.024，阴阳性临界值为0.166，即待检样品OD450值≥0.166判为RHDV2阳性，OD450值＜0.166判为RHDV2阴性。
实施例8
特异性试验
1.待检测抗原样品：RHDV1感染死亡的兔肝脏、RHDV2感染死亡的兔肝脏、轮状病毒(RV)感染死亡的兔肝脏、兔支气管败血波氏杆菌(Bb)感染死亡的兔肝脏、兔多杀性巴氏杆菌(Pm)感染死亡的兔肝脏、兔A型产气荚膜梭菌(CpA)感染死亡的兔肝脏和肠炎沙门氏菌(Se)感染死亡的兔肝脏。
2.样品处理：
按照实施例2步骤(2)中肝脏研磨液制备方法分别对各样品研磨，按1:40的比例进行稀释，得到稀释液。
3.将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
4.分别以步骤2得到的样品作为抗原，分为实验1组和实验2组，实验1组和实验2组按照100μL/孔的添加量添加抗原，37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min；
洗涤结束后，实验1组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；实验2组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
5.步骤4洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，根据实施例7得出的阴阳性临界值进行结果判定，具体结果如下表8。
表8对不同病毒样品的检测结果
注“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
根据表8可以看出，检测RHDV1阳性样品为RHDV1阳性、RHDV2阴性，检测RHDV2阳性样品为RHDV2阳性、RHDV1阴性；检测轮状病毒(RV)、兔支气管败血波氏杆菌(Bb)、兔多杀性巴氏杆菌(Pm)、兔A型产气荚膜梭菌(CpA)、肠炎沙门氏菌(Se)感染死亡兔肝脏样品，均为RHDV1及RHDV2阴性，说明本发明提供的方法能够特意检测RHDV1及RHDV2。
实施例9
RHDV1敏感性试验
1.RHDV1阳性样品：RHDV1感染死亡的兔肝脏，按照实施例2步骤(2)中肝脏研磨液制备方法获得1：10的RHDV2阳性样品，利用PBS倍比稀释，直至稀释倍数为1：20480，得到不同浓度的RHDV1阳性样品稀释液。
2.将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
3.分别以步骤1得到的作为稀释液抗原，按照100μL/孔的添加量添加抗原，37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min；
4.洗涤结束后，每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
5.步骤4洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，结果图1和表9所示。
表9 RHDV1敏感性试验结果
注“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
根据图1和表9可以看出，利用本发明提供的方法，RHDV1阳性样品1：10240稀释时，双夹心ELISA检测结果为阳性，此后为阴性；而根据前文记载的内容，利用红细胞凝集试验(HA)检测方法RHDV1阳性样品的HA效价为1：2560。本发明提供的方法相比常规的检测方法具有更高的敏感性。
实施例10
RHDV2敏感性试验
1.RHDV2阳性样品：RHDV2感染死亡的兔肝脏，按照实施例2步骤(2)中肝脏研磨液制备方法获得1：10的RHDV2阳性样品，利用PBS倍比稀释，直至稀释倍数为1：20480，得到不同浓度的RHDV2阳性样品稀释液。
2.将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
3.分别以步骤1得到的样品作为稀释液，按照100μL/孔的添加量添加抗原，37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min。
4.洗涤结束后，每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min。
5.步骤4洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，结果图2和表10所示。
表10 RHDV2敏感性试验结果
注“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
根据图2和表10可以看出，利用本发明提供的方法，RHDV2阳性样品1：5120稀释时，双夹心ELISA检测结果为阳性，此后为阴性；而根据前文记载的内容，利用红细胞凝集试验(HA)检测方法RHDV2阳性样品的HA效价为1：2560。本发明提供的方法相比常规的检测方法相比常规的红细胞凝集试验(HA)检测方法，具有更高的敏感性。
实施例11
重复性试验
1.待检测抗原样品：分别随机取RHDV1阳性样品、RHDV2阳性样品和阴性样品各3份，共9份样品；
分别按照实施例2步骤(2)中肝脏研磨液制备方法分别对各样品研磨，按1:40的比例进行稀释，得到稀释液；每份样品做4个重复；
2.将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
3.分别以步骤1得到的稀释液为抗原，分为实验1组和实验2组，实验1组和实验2组按照100μL/孔的添加量添加抗原，37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min。
洗涤结束后，实验1组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；实验2组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min。
5.步骤4洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL2 mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，计算平均值和标准差(SD)，按公式：变异系数(CV)＝标准差(SD)/平均值 计算变异系数，结果如表11所示。
表11重复性试验结果
根据表11可以看出，9份随机选择的样品的变异系数(CV)均小于10％，表明重复性符合试验要求。
实施例12
临床样品检测试验
1.待检测抗原样品：以四川省、山东省、河南省各兔场送检的共60份死亡兔肝脏为待测样品；
1.1分别按照实施例2步骤(2)中肝脏研磨液制备方法分别对各样品研磨，按1:40的比例进行稀释，得到ELISA待检样品稀释液；
1.2用DEPC水，按1g：10mL的质量体积比将DEPC水和(待测样品)兔肝脏分别混合，进行充分研磨，8000rpm离心15min后取上清，即得RT-PCR待检肝脏研磨液；
2.对步骤1得到的样品进行RT-PCR检测和ELISA检测。其中，
RT-PCR检测步骤参照“宋艳华，魏后军，范志宇，等.兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR鉴定[J].江苏农业学报.2016,32(05):1117-1121.”，具体为：
(1)将步骤1.2得到的待检肝脏研磨液，按照Trizol法提取RNA；利用反转录试剂盒获得样品的cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用2×Taq MasterMix进行RHDV VP60基因片段的扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察，RHDV1扩增产物大小应为193bp、RHDV2扩增产物大小应为829bp，扩增用引物和反应条件如表12。
表12引物序列及反应条件
ELISA检测步骤：
(1)将实施例1得到的单克隆抗体2A11作为捕获抗体，利用pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至4μg/mL，按照每孔100μL的添加量添加至96孔酶标反应板，4℃包被过夜，PBST洗3次，每次5min；然后按200μL/孔加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，PBST洗3次，每次5min。
(2)分别以步骤1得到的稀释液为抗原，分为实验1组和实验2组，实验1组和实验2组按照100μL/孔的添加量添加抗原，37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次5min；
洗涤结束后，实验1组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-1D4，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；实验2组每孔加入100μL浓度为0.5μg/mL的HRP-6B3，37℃孵育1h，PBST洗3次，每次5min；
(3)步骤(2)洗涤结束后，按100μL/孔加入TMB底物显色液并置于37℃避光作用10min，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，置于酶标仪上测定OD450值，根据实施例7得出的阴阳性临界值进行结果判定检测结果。
3.并按照下述公式计算符合率，检测结果如表13。
符合率＝两种方法检测结果相同的样品数/总样品数×100％。
表13采用不同方式对临床样品的检测结果
根据表13可以看出，建立的双抗体夹心ELISA方法检测结果显示，RHDV1阳性样品9份，RHDV2阳性样品23份，阴性样品28份；RT-PCR方法检测结果显示，RHDV1阳性样品9份，RHDV2阳性样品19份，阴性样品32份。两种方法检测RHDV1阳性样品的符合率为100％(9/9)，RHDV2阳性样品的符合率为82.61％(19/23)，阴性样品的符合率为87.5％(28/32)，总符合率为93.33％(56/60)，说明本发明提供的方法能够实现RHDV1和RHDV2的检测，检测结果准确。
根据上述内容可以看出，本发明提供的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体能够特异性检测兔出血症病毒，并且区分检测RHDV1与RHDV2，特异性强、敏感度高，并且具有可重复性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种产生兔出血症病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株2A11；
所述杂交瘤细胞株2A11的保藏号为CCTCCNO：C202323，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月23日。
2.一种兔出血症病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括兔出血症病毒抗体2A11；
所述兔出血症病毒抗体2A11为权利要求1所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体。
3.一种产生兔出血症病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株组合，其特征在于，所述杂交瘤细胞株组合包括产生捕获抗体的杂交瘤细胞株和产生检测抗体的杂交瘤细胞株；
所述产生捕获抗体的杂交瘤细胞株为权利要求1所述的杂交瘤细胞株2A11；
所述产生检测抗体的杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株1D4和/或杂交瘤细胞株6B3；
所述杂交瘤细胞株1D4的保藏号为CCTCCNO：C202324，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月23日；
所述杂交瘤细胞株6B3的保藏号为CCTCCNO:C202315，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年1月12日。
4.一种兔出血症病毒的单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体组合包括捕获抗体和检测抗体；
所述捕获抗体为权利要求2所述的兔出血症病毒抗体2A11；
所述检测抗体包括兔出血症病毒抗体1D4和/或兔出血症病毒抗体6B3；
所述兔出血症病毒抗体1D4为权利要求3所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体；
所述兔出血症病毒抗体6B3为权利要求3所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的杂交瘤细胞株组合或权利要求4所述的单克隆抗体组合在制备兔出血症病毒检测试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述兔出血症病毒包括RHDV1和RHDV2中的一种或两种组合；
所述试剂盒包括双抗体夹心ELISA试剂盒。
7.权利要求3所述的杂交瘤细胞株组合或权利要求4所述的单克隆抗体组合在制备鉴别RHDV1和RHDV2的试剂盒中的应用。
8.一种检测RHDV1的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体和HRP标记的检测抗体；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为权利要求1所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体为兔出血症病毒抗体1D4；所述兔出血症病毒抗体1D4为权利要求3所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体。
9.一种检测RHDV2的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体和HRP标记的检测抗体；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为权利要求1所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体为兔出血症病毒抗体6B3；所述兔出血症病毒抗体6B3为权利要求3所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
10.一种鉴别RHDV1和RHDV2的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述双抗体夹心ELISA试剂盒包括捕获抗体、HRP标记的检测抗体1和HRP标记的检测抗体2；
所述捕获抗体为兔出血症病毒抗体2A11；所述兔出血症病毒抗体2A11为权利要求1所述的杂交瘤细胞株2A11产生的抗体；
所述检测抗体1为兔出血症病毒抗体1D4；所述兔出血症病毒抗体1D4为权利要求3所述的杂交瘤细胞株1D4产生的抗体；
所述检测抗体2为兔出血症病毒抗体6B3；所述兔出血症病毒抗体6B3为权利要求3所述的杂交瘤细胞株6B3产生的抗体。
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