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CN116999411A - 一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116999411A
CN116999411A CN202310740844.9A CN202310740844A CN116999411A CN 116999411 A CN116999411 A CN 116999411A CN 202310740844 A CN202310740844 A CN 202310740844A CN 116999411 A CN116999411 A CN 116999411A
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CN
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copper
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姚沙沙
叶林
唐睿康
范顺武
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Zhejiang University ZJU
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明公开了一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法：将BSA溶解后得到溶液A，将柠檬酸钠溶液和CuCl2混合得到溶液B，将溶液B滴加到溶液A中，再滴加Na2S·9H2O，搅拌反应，透析冻干得到Cu2S@BSA；将TEA、CTAB和NaSal溶解后得到溶液C，然后将TEOS和BTESPTS的混合物滴加至溶液C，反应后去除模板，得到MSN；将MSN与Cu2S@BSA混合搅拌装载，得到MSN@Cu2S；将葡聚糖溶解到去离子水中，加入高碘酸钠，避光搅拌反应，再加入丙三醇停止氧化，得到oDEX；(5)将MSN@Cu2S溶解后加入oDEX进行加帽处理，得到MD@Cu2S。本发明还公开了上述制备方法得到的MD@Cu2S及在制备骨肿瘤或骨修复的药物上的应用。本发明提供的制备方法简单，制备得到的MD@Cu2S具有良好的杀肿瘤促进成骨细胞分化和矿化，抑制破骨细胞形成和功能。

Description

一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料及其制备方法和应用。
背景技术
骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种常见的骨肿瘤类型(占骨肿瘤的44.6％)，好发与10～25岁之间，通常预后较差。由于OS具有恶性侵袭性和迁移能力，具有局部侵袭和远处转移的特点，导致OS患者肺转移是最常见导致死亡的并发症。
骨肉瘤可分泌大量RANK配体(RANKLS)，导致前细胞形成破骨细胞，并发挥破骨细胞功能，导致病理性骨折。目前OS的治疗包括手术、放疗和化疗，但仍存在化疗、放疗耐药、生存率低等诸多局限性。针对耐药，如公开号为CN107970241A的中国专利公开了一种新型酪氨酸激酶抑制剂-安罗替尼在骨肉瘤的应用，发现安罗替尼可抑制骨肉瘤生长和转移安罗替尼能够增强化疗药物顺铂对骨肉瘤细胞的杀伤作用。
一种有前景的治疗OS的药物需要具备以下特征：(1)有效的杀伤肿瘤细胞的功能。(2)OS诱导的病理性骨折修复促进成骨和抑制破骨细胞形成。如公开号为CN113908168A的中国专利公开了柳穿鱼叶苷在制备抗骨肉瘤药物中的应用及抗骨肉瘤药物制剂，柳穿鱼叶苷可抑制多种骨肉瘤细胞的生长和增殖，促进骨肉瘤细胞凋亡，干预细胞周期，使细胞阻滞在G1期，并减少G2期细胞数量，细胞分裂能力受到抑制；并且能够抑制HOS和143B骨肉瘤细胞侵袭和迁移；证实柳穿鱼叶苷能明显抑制裸鼠皮下143B细胞瘤的体积，能较好的抑制骨肉瘤的生长；柳穿鱼叶苷有望成为治疗骨肉瘤的药物，在治疗骨肉瘤药物开发方面具有广阔的前景。
目前，针对杀伤肿瘤、抑制破骨细胞分化和促进病理性骨破坏的材料是本领域的研究热点和亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，制备方法简单，制备得到的双响应型铜死亡纳米颗粒材料具有良好的杀肿瘤促进成骨细胞分化和矿化，抑制破骨细胞形成，可应用在制备骨肿瘤或骨修复的药物上。
本发明提供如下技术方案：
一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将牛血清蛋白溶解后得到溶液A，将柠檬酸钠溶液和CuCl2混合得到溶液B，将溶液B滴加到溶液A中，再滴加Na2S·9H2O(硫化钠九水合物)，搅拌反应，透析冻干得到Cu2S@BSA(胎牛血清硫化亚铁)；
(2)将TEA(三乙胺醇)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和NaSal(水杨酸钠)溶解后得到溶液C，然后将TEOS(硅酸四乙酯)和BTESPTS(双-[γ-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物)的混合物滴加至溶液C，反应后去除模板，得到MSN(介孔二氧化硅)；
(3)将MSN与Cu2S@BSA混合搅拌装载，得到MSN@Cu2S；
(4)将葡聚糖溶解到去离子水中，加入NaIO4(高碘酸钠)，避光搅拌反应，再加入丙三醇停止氧化，得到oDEX(氧化葡聚糖)；
(5)将MSN@Cu2S溶解后加入oDEX进行加帽处理，得到MD@Cu2S。
本发明提供的双响应型铜死亡纳米颗粒材料为一种pH和GSH(还原型谷胱甘肽)双响应树枝状二氧化硅搭载Cu2S，也可以称之为响应型MSN搭载Cu2S纳米颗粒。
本发明的技术原理在于：本发明根据肿瘤微环境微酸性和还原性特点，设计的树枝状MSN具有酸性和GSH响应性特点，使得搭载Cu2S在肿瘤部位大量释放，直接杀伤肿瘤细胞。此外Cu2S在紫外可吸收光谱中1064附近具有吸收峰，而1064吸收峰是二区光热的理想材料，因此通过NIRII(近红外二区)光热治疗能进一步杀伤肿瘤细胞。同时在破骨细胞中，少量的Cu2S释放能够抑制破骨细胞的能量代谢，抑制破骨细胞的形成和分化。而铜离子是成骨细胞发挥分化和矿化的关键离子。因此在成骨细胞中MD@Cu2S释放出的铜离子能够促进成骨细胞的矿化。从而使本发明制备得到的响应型MSN搭载Cu2S纳米颗粒在骨肿瘤治疗以及修复中有较为广阔的应用前景。
在步骤(1)中，所述溶液A中BSA(胎牛血清)浓度为1-5mg/ml；将4-6ml浓度为10-16mM的柠檬酸钠溶液和4-6ml浓度为10-16mM的CuCl2混合得到溶液B；滴加4-6ml浓度为10-16mM的Na2S·9H2O。
步骤(1)中，溶液A中BSA浓度太小会导致Cu2S形成颗粒较大，不易装载到MSN中，因此BSA浓度不能低于5mg/ml。另外，通过控制柠檬酸钠溶液、CuCl2(氯化铜)和Na2S·9H2O的添加量来调控Cu2S的颗粒大小。
在步骤(1)中，将溶液B滴加到溶液A中的滴加速率不能快于1ml/min。当滴加速率不能快于1ml/min，会使得溶液温度低于37℃，温度过低会导致Cu2S形成颗粒较大。
在步骤(1)中，所述Na2S·9H2O的滴加速率不能快于1ml/min。Na2S·9H2O溶液滴加速度不能太快，不能超过1分钟1ml，否者会导致温度过低，导致Cu2S形成颗粒较大。同时速度过快会导致反应不完全，也会导致Cu2S形成颗粒较大。
在步骤(1)中，Cu2S@BSA透析换液至少12小时一次，至少透析5天，而且透析液必须至少8小时一次，确保BSA能够完全透析出。
在步骤(1)中，溶液A和溶液B必须在37℃溶解，搅拌速率在300rpm，且至少搅拌15分钟。
在步骤(2)中，将40-60μl TEA、0.2-0.5g CTAB、50-63mg NaSal溶解后得到溶液C；将1-2ml TEOS和1-2ml BTESPTS的混合物滴加至溶液C。通过调控TEA、CTAB、NaSal以及TEOS和BTESPTS的混合物的添加量使其可以形成树枝状MSN。
在步骤(2)中，TEOS和BTESPTS的混合物的滴加速度不能快于1ml/min。滴加速度过快，会导致树枝状MSN形成被破坏。
在步骤(2)中，TEA、CTAB和NaSal在50ml ddH2O中搅拌速度至少大于500rpm，因为转速太低CTAB溶解不均匀。BTESPTS和TEOS混合物滴加前，需要超声进行混合，超声时间不能低于5分钟，以促进两者完全混合。
在步骤(2)中，还包括反应后进行离心收集和洗涤，洗涤过程具体为：先用无水乙醇洗涤3次，每次离心后通过螺旋震荡以及超声震荡，使得MSN完全分散在无水乙醇中；无水乙醇洗涤3次后，用ddH2O进行同样的操作洗涤3次，确保原材料完全去除干净。
在步骤(2)中，去除模板的方法为：使用热乙醇-盐酸混合物洗去模板，具体为：无水乙醇与浓盐酸的比例为5:1，同时在70℃温度进行搅拌，12小时后离心收集，再次重复上述步骤至少5次，以完全去除模板。
在步骤(2)中，热乙醇-盐酸混合物洗去模板操作后，需要再次进行洗涤，洗涤步骤包括至少3次无水乙醇洗涤和至少3次ddH2O洗涤，以完全去除浓盐酸。
在步骤(3)中，Cu2S装载试验中，搅拌时间大于12小时，同时搅拌速度不低于300rpm，以促进MSN跟Cu2S能够完全接触装载；Cu2S装载试验结束后，用ddH2O洗涤进行至少3次洗涤(如需用ddH2O至少清洗3次，无水乙醇3次)，以完全去除多余的Cu2S。
在步骤(4)中，所述葡聚糖浓度为25-100mg/ml，所述高碘酸钠浓度为25-100mg/ml，所述丙三醇浓度为25-100mg/ml。
优选地，在步骤(4)中，氧化葡聚糖至少透析5天，确保原材料完全去除干净。
进一步优选地，所述步骤(4)具体为：(4)将葡聚糖稀释到去离子水中，在50℃下搅拌。然后将NaIO4溶于上述混合物中，避光搅拌12h。加入丙三醇终止氧化反应，继续搅拌至混合均匀。用透析膜对溶液进行透析以去除未反应物质，透析5天后进行冻干处理得到氧化葡聚糖。
优选地，在步骤(5)中，所述氧化葡聚糖的加入质量大于MSN@Cu2S。
在步骤(5)中，氧化葡聚糖加帽形成席夫碱键时，氧化葡聚糖质量加入至少要大于M@Cu2S的质量，确保M@Cu2S形成MD@Cu2S。在步骤(4)中，氧化葡聚糖加帽形成席夫碱键时，要在避光下进行，避免氧化葡聚糖被破坏。
在步骤(5)中，加帽结束后，用ddH2O洗涤进行至少3次洗涤(如需用ddH2O至少清洗3次，无水乙醇3次)，以完全去除多余的oDEX。
本发明还提供了一种上述制备方法得到的双响应型铜死亡纳米颗粒材料。
本发明还提供了一种上述双响应型铜死亡纳米颗粒材料在制备骨肿瘤或骨修复的药物上的应用。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
(1)本发明提供的制备方法操作简单、原料易得、成本低廉、无污染、易于重复和工业化应用。
(2)本发明制备得到的响应型MSN搭载Cu2S纳米颗粒，具备良好的酸性释放和还原性释放，而在中性和非还原性环境中，释放量非常少。
(3)本发明制备得到的响应型MSN搭载Cu2S纳米颗粒，具有良好的杀肿瘤促进成骨细胞分化和矿化，抑制破骨细胞形成，可以作为高效的骨肿瘤骨破坏的修复药物。
附图说明
图1中的A-G分别为实施例1的制备得到的小尺寸的Cu2S的宏观照片、紫外可吸收谱、Cu2S的XPS图、MSN透射电镜照片、MSN的孔隙、MD的透射电镜图、元素分布照片；图中标尺：A为50nm、D为100nm和F为100nm；
图2为MD的酸性和还原性的崩解试验以及释放试验(A，B，C和D)，图中标尺：50nm；
图3为MD@Cu2S杀伤骨肉瘤细胞143B和U2OS两种细胞系：(A)CCK-8试验，死活染色以及统计图(B，C)；
图4为破骨细胞毒性(A、B和C)实验，以及破骨标记基因抑制，破骨细胞分化试验(D)，图中比例尺100μm；
图5为MD@Cu2S对成骨细胞的毒性试验(A，B，C)，已经对成骨标记基因的影响；
图6为原位骨肉瘤示意图(A)、体内光热图(B，C，E和F)、试验动物的大体图(D)；
图7为原位骨肉瘤的骨破坏。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
(1)将牛血清蛋白溶解在1ml ddH20溶液中，剧烈震荡促进溶解，得到溶液A浓度为5mg/ml。
(2)将柠檬酸钠溶液(5ml，16mM)和CuCl2(5ml，16mM)混合得到溶液B。
(3)将B液体滴加到A液体，37℃搅拌15分钟后，滴加Na2S·9H2O(5ml，16mM)继续搅拌8小时。10kkda透析袋透析5天，冻干得到Cu2S@BSA。
(4)40μl TEA、0.2g CTAB、63mg NaSal与50ml ddH2O混合，大力搅拌3h，得到溶液C，然后，将混合物(2ml TEOS和1ml BTESPTS)滴入上述溶液C继续反应16h后，离心(10000rpm,20min)收集，洗涤。离心后，用热乙醇-盐酸混合物洗去模板，50℃烘干，得到MSN。
(5)将10mg MSN与5mg Cu2S@BSA在ddH2O中混合搅拌装载，多余的Cu2S@BSA在离心后洗去。
(6)葡聚糖浓度为25mg/ml溶解到去离子水中，高碘酸钠浓度为100mg/ml加入到葡聚糖溶液中，避光搅拌12h，加入100mg/ml丙三醇终止氧化，并在黑暗环境中透析5天，冻干得到氧化葡聚糖粉末oDEX。
(7)MSN@Cu2S溶解在pH＝8的ddH2O中，加入氧化葡聚糖(oDEX)进行加帽处理，得到MD@Cu2S。
如图1中的A所示，为本实施例制备得到的小尺寸Cu2S。如图1中的B所示，紫外吸收光谱在1064有吸收峰，是二区光热的理想材料。图1中的C为小尺寸的Cu2S的XPS数据。图1中的D为MSN的透射电镜。图1中的E为MSN的孔隙数据，大约在11nm左右。图1中的F为MD的透射电镜。图1中的G为MD@Cu2S的元素分析，证明Cu2S顺利装载到MSN上。
实施例2
图2中的A为不同浓度GSH和不同pH值下MD的崩解电镜情况，我们发现在pH等于7.4的时候，MD在48小时内几乎没有崩解。而在弱酸性情况下，MD的崩解加快了。在同时有GSH和弱酸性的情况下，崩解进一步加快。
图2中的B、C和D为不同浓度GSH和不同pH值下，MD@Cu2S的释放情况，定量结果显示，在正常生理条件下(pH＝7.4,GSH＝0mM)，60h内Cu2S的释放率约为8％，说明该材料具有良好的阻断能力。然而，随着pH值的降低和GSH浓度的增加，Cu2S纳米颗粒的释放速率显著增加。例如，培养60h后，Cu2S纳米颗粒的累积释放率分别达到16％(pH＝6.5)和23％(pH＝6.0)。这是由于在酸性环境下席夫碱键的断裂，表明Cu2S的释放量随着pH值的降低而增加。当pH值为6.5时，分别施用0mM GSH、5mM GSH和10mM GSH时，Cu2S纳米颗粒的累积释放率分别为18％、45％和55％。
应用例1MD@Cu2S的体外抗肿瘤效果
图3中的A为通过CCK-8试验，证明MD@Cu2S对143B和U2OS两种骨肉瘤细胞系具有杀伤作用。其具体实验法为，在96孔板内加入3千个143B和U2OS骨肉瘤细胞和100μl的10％胎牛血清高糖培养基，放入细胞培养箱过夜(条件为37℃，5％CO2)使得细胞贴壁。对细胞加入不同浓度的MD@Cu2S，静置6小时，让材料崩解吞噬，并用无血清高糖培养基清洗多余材料，同时进行NIR II激光照射5分钟。在不同的时间点，加入CCK-8液，放置2小时进行检测。实验证明MD@Cu2S对骨肉瘤细胞有杀伤作用，激光进一步杀伤两个骨肉瘤细胞系。通过死活染色法，检测材料对143B骨肉瘤细胞作用。其具体步骤为材料对细胞处理后，加入死活染色液，通过荧光显微镜进行观察。死活染色能够更直观的看到材料的杀伤效果，并且也进一步验证的CCK-8试验的结果(图3中的B和C)。
应用例2MD@Cu2S的体外抑制破骨分化和破骨功能作用
在96孔板内加入3千个BMMs(骨髓单核细胞)和100μl的10％胎牛血清α培养基(添加50ng/ml M-CSF)，放入细胞培养箱过夜(条件为37℃，5％CO2)使得细胞贴壁。对细胞加入不同浓度的MD@Cu2S，静置6小时，让材料崩解吞噬，并用无血清α培养基清洗多余材料，同时进行NIR II激光照射5分钟。在不同的时间点，加入CCK-8液，放置2小时进行检测。图4中的A，CCK-8结果显示，处理24和72小时后，MD@Cu2S纳米颗粒与对照组和MSN组相比，增殖和毒性活性不显著。活/死图像显示各组BMM细胞呈纺锤状形态(图4中的B)。定量结果也显示各组细胞活力均接近100％，说明MD@Cu2S生物材料具有良好的细胞相容性(图4中的C)。
在24孔板内加入3千个BMMs(骨髓单核细胞和100μl的10％胎牛血清α培养基，放入细胞培养箱过夜(条件为37℃，5％CO2)使得细胞贴壁。对细胞加入不同浓度的MD@Cu2S，静置6小时，让材料崩解吞噬，并用无血清α培养基清洗多余材料，同时进行NIR II激光照射5分钟，后继续用破骨细胞条件培养基培养5天直到对照组成熟的破骨细胞形成。图4中的D实为时定量逆转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)结果显示，与MD@Cu2S@NIRII组共培养的BMMs中c-Fos、DC-STAMP、NFATc1和CTSK的表达相对低于MD@Cu2S组、MSN组和对照组，说明MD@Cu2S纳米颗粒对BMMs具有良好的抑制作用。
在24孔板内加入3千个BMMs(骨髓单核细胞和100μl的10％胎牛血清α培养基，放入细胞培养箱过夜(条件为37℃，5％CO2)使得细胞贴壁。对细胞加入不同浓度的MD@Cu2S，静置6小时，让材料崩解吞噬，并用无血清α培养基清洗多余材料，同时进行NIR II激光照射5分钟，后继续用破骨细胞条件培养基培养5天直到对照组成熟的破骨细胞形成，用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗3次，4％多聚甲醛固定15分钟后继续用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗3次，添加TRAP细胞染色液。图4中的E和F TRAP染色结果显示，MD@Cu2S@NIRII组用RANKL刺激BMMs所形成的破骨细胞数量比其他三组更小。
应用例3MD@Cu2S的体外促进成骨的分化和矿化试验
在96孔板内加入3千个BMSC(骨髓间充质干细胞)和100μl的10％胎牛血清α培养基，放入细胞培养箱过夜(条件为37℃，5％CO2)使得细胞贴壁。对细胞加入不同浓度的MD@Cu2S，静置6小时，让材料崩解吞噬，并用无血清α培养基清洗多余材料，同时进行NIR II激光照射5分钟。在不同的时间点，加入CCK-8液，放置2小时进行检测。图5中的ACCK-8实验显示MSN、MD@Cu2S生物材料和热疗照射对骨髓间充质干细胞无毒。活/死结果显示，含有材料的骨髓间充质干细胞没有明显诱导细胞死亡(图5中的B-C)。考虑到骨髓间充质干细胞的成骨分化和矿化是骨再生的重要进展，采用碱性磷酸酶(ALP)、茜素红S(ARS)和qRT-PCR法评价其成骨和矿化活性。在24孔板内加入3千个BMSC(骨髓间充质干细胞)和100μl的10％胎牛血清α培养基，放入细胞培养箱过夜(条件为37℃，5％CO2)使得细胞贴壁。对细胞加入不同浓度的MD@Cu2S，静置6小时，让材料崩解吞噬，并用无血清α培养基清洗多余材料，同时进行NIR II激光照射5分钟，在成骨诱导条件培养基中继续培养7天和14天。相比于其他三组中，MD@Cu2S@NIRII组的ALP、OPN、RUNX2、OCN、BMP2的qRT-PCR结果最高(图5中的D-E)。
应用例4MD@Cu2S的体内抗肿瘤试验
为了测试生物材料的功能和体内照射，植入荧光素酶标记的143B，建立原位自发转移OS模型，直到肿瘤组织达到近50mm3时，将裸鼠随机分为6组(n＝5)：(1)PBS，(2)MSN，(3)Cu2S，(4)Cu2S@NIRII，(5)MD@Cu2S，(6)MD@Cu2S@NIRII。
实验过程如图6中的A所示，在注射肿瘤细胞后，用1064nm激光照射小鼠5min、10个周期和持续20天。光热结果显示，与其他两组相比，MD@Cu2S@NIRII组的温度上升过程更高(图6中的B)，这是因为Cu2S纳米颗粒的尺寸相对较低，可在体内代谢。具体而言，MD@Cu2S@NIRII组照射5min后的温度为51.3℃，而Cu2S@NIRII组和Control@NIRII组的温度分别升高到39.5和34.8(图6中的C)。此外，与其他5组相比，MD@Cu2S@NIRII组的肿瘤体积和肿瘤重量最小(图6中的D-F)，说明MMD@Cu2S@NIRII能有效抑制肿瘤的发展。
应用例5MD@Cu2S的体内抗骨肿瘤骨破坏试验
前期实验发现MD@Cu2S@NIRII组具有抑制破骨细胞形成和促进成骨细胞功能的作用，因此推测在体内OS引起的骨破坏可以通过纳米颗粒的处理得到修复。为了验证这一假设，使用μCT和组织学分析研究了应用例6中骨组织的破坏和退化。显然，μCT扫描图像显示，对照组、MSN组、Cu2S组、Cu2S@NIRII组、MD@Cu2S@NIRII组和MD@Cu2S@NIRIII组的骨破坏程度不同。图7显示，对照组和MSN组胫骨出现了严重的骨缺损，而MD@Cu2S组和MD@Cu2S@NIRII组相同区域的胫骨相对完整。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将牛血清蛋白BSA溶解后得到溶液A，将柠檬酸钠溶液和CuCl2混合得到溶液B，将溶液B滴加到溶液A中，再滴加Na2S·9H2O，搅拌反应，透析冻干得到Cu2S@BSA；
(2)将TEA、CTAB和NaSal溶解后得到溶液C，然后将TEOS和BTESPTS的混合物滴加至溶液C，反应后去除模板，得到MSN；
(3)将MSN与Cu2S@BSA混合搅拌装载，得到MSN@Cu2S；
(4)将葡聚糖溶解到去离子水中，加入高碘酸钠，避光搅拌反应，再加入丙三醇停止氧化，得到氧化葡聚糖；
(5)将MSN@Cu2S溶解后加入氧化葡聚糖进行加帽处理，得到MD@Cu2S。
2.根据权利要求1所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述溶液A中BSA浓度为1-5mg/ml；将4-6ml浓度为10-16mM的柠檬酸钠溶液和4-6ml浓度为10-16mM的CuCl2混合得到溶液B；滴加4-6ml浓度为10-16mM的Na2S·9H2O。
3.根据权利要求1所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，将溶液B滴加到溶液A中的滴加速率不能快于1ml/min。
4.根据权利要求1所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述Na2S·9H2O的滴加速率不能快于1ml/min。
5.根据权利要求1所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将40-60μl TEA、0.2-0.5g CTAB、50-63mg NaSal溶解后得到溶液C；将1-2ml TEOS和1-2ml BTESPTS的混合物滴加至溶液C。
6.根据权利要求1所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述TEOS和BTESPTS的混合物的滴加速度不能快于1ml/min。
7.根据权利要求1所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述葡聚糖浓度为25-100mg/ml，所述高碘酸钠浓度为25-100mg/ml，所述丙三醇浓度为25-100mg/ml。
8.根据权利要求1所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述氧化葡聚糖的加入质量大于MSN@Cu2S。
9.一种权利要求1-8任一所述的制备方法得到的双响应型铜死亡纳米颗粒材料。
10.一种权利要求9所述的双响应型铜死亡纳米颗粒材料在制备骨肿瘤或骨修复的药物上的应用。
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