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CN116987700B - 一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法 Download PDF

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CN116987700B CN202310857994.8A CN202310857994A CN116987700B CN 116987700 B CN116987700 B CN 116987700B CN 202310857994 A CN202310857994 A CN 202310857994A CN 116987700 B CN116987700 B CN 116987700B
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Abstract

本发明提供了一种人白细胞介素‑5重组蛋白及其制备方法，通过选取4段能形成抗原表位的序列进行连续重复表达两次，得到编码人白细胞介素‑5重组蛋白抗原表位的核酸分子，构建重组载体并在大肠杆菌表达系统中高效表达，制备的目的蛋白活性更高；并筛选和优化了复性和纯化工艺，显著提高了蛋白收率并保持蛋白生物活性，经一步柱纯化即可获得与人白细胞介素‑5蛋白标准品活性更高的目的蛋白，具有重要的科学意义和临床应用价值。

Description

一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及重组蛋白表达与纯化技术领域，具体涉及一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法。
背景技术
人白细胞介素-5(Interleukin-5，IL-5)是1980年由Takasu等人首先发现的一种分泌型细胞因子，它主要由激活的Th2细胞(辅助性T细胞2)、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生。人白细胞介素-5对嗜酸性粒细胞的生长、成熟、分化、活化、迁移起着最主要的作用，并可以通过抑制凋亡延长嗜酸性粒细胞的生存；在单独或与转化生长因子B联合作用的条件下，人白细胞介素-5可以通过体液免疫应答促进活化的B细胞产生IgA。
流行病学研究显示，Th2型细胞因子相关的过敏性疾病(如哮喘、特异性皮炎、过敏性腹泻和其他特应性疾病)近年来呈现盛行的趋势，其特征是出现炎症，即T细胞和粒细胞(包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞)明显浸润。Th2细胞产生的人白细胞介素-5作为过敏性炎症发生过程中的关键细胞因子，通过与异源二聚体人白细胞介素-5受体(IL-5R)结合会导致嗜酸性粒细胞过量增殖累积。嗜酸性粒细胞通过产生主要碱性蛋白、嗜酸性阳离子蛋白(ECP)和嗜酸性粒细胞源性神经毒素(EDN)，在保护性免疫反应中发挥重要作用，然而主要碱性蛋白和嗜酸性阳离子蛋白有溶解细胞的能力，会造成机体的组织损伤。以往的研究中也发现，嗜酸性粒细胞可能通过流入肿瘤生长部位参与肿瘤监测，如在肺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤等疾病发展过程中，嗜酸性粒细胞的浸润可能抑制肿瘤的形成和帮助转移病灶的清除。因此，对患者血液中人白细胞介素-5的及时检测，在炎症或过敏性疾病的诊断和急性排斥反应或肿瘤的治疗预后中具有广泛的应用前景。
现有的人白细胞介素-5重组蛋白主要通过昆虫杆状病毒系统与CHO系统生产获得，昆虫杆状病毒系统与CHO系统的表达周期长，从获得表达质粒到完成蛋白表达需要1个月甚至更长的时间，而且在上述真核系统中得到的人白细胞介素-5重组蛋白是完全糖基化的活性蛋白。但研究表明，真核系统的糖基化过程对人白细胞介素-5拥有生物活性是非必要的，人白细胞介素-5的生物活性主要是与其C端残基和二聚体结构有关，所以使用原核系统表达也能够得到具有完全活性的人白细胞介素-5重组蛋白。
原核系统表达与真核系统表达相比，具有操作流程简单快捷、表达产量高、成本低、适合工业化等优点。由于人白细胞介素-5重组蛋白不需要真核系统的进一步加工修饰即可获得完全活性，所以原核表达是更适合人白细胞介素-5重组蛋白快速生产的方式。但现有的原核表达人白细胞介素-5重组蛋白(如FEBS Lett.(1993)27；331(1-2):49-52.doi:10.1016/0014-5793(93)80295-6./Protein Expr Purif.(1997)11(1):86-94.doi:10.1006/prep.1997.0785.)，普遍采用了表达完整序列并通过多步纯化的方式，制备的人白细胞介素-5重组蛋白与天然蛋白相比，反应性并无优势，且纯化过程较繁琐，不易纯化，普遍需要通过3-4种凝胶层析柱纯化才能获得较高纯度的目的蛋白，周期长、成本高。
因此，急需找到一种制备具有更高活性，更高反应性，且更易纯化的人白细胞介素-5重组蛋白的方法，用于在疾病诊断和治疗预后阶段对人白细胞介素-5进行定量检测具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法，通过选取合适的能形成抗原表位的序列进行连续表达，得到编码人白细胞介素-5重组蛋白抗原表位的核酸分子，构建重组载体并在大肠杆菌表达系统中高效表达，制备的目的蛋白活性更高；并筛选和优化了变性清洗液和复性工艺，显著提高了蛋白收率并保持蛋白生物活性，经一步柱纯化即可获得与人白细胞介素-5蛋白标准品活性更高的目的蛋白，具有重要的科学意义和临床应用价值。
一方面，本发明提供了一种用于编码人白细胞介素-5重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子包括重复两次的Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134序列，所述Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134分别具有如SEQ IDNO:1～4所示的核苷酸序列。
本发明根据NCBI官网查询获得人白细胞介素-5的mRNA序列(SEQ ID NO:7)，从人白细胞介素-5的mRNA序列中选取除信号肽以外的Ile20-Ser134(SEQ ID NO:8)序列，基于疏水性、蛋白二级结构、抗原决定簇等参数，对人白细胞介素-5的抗原表位进行预测，筛选到4段(Ala45-Cys63(SEQ ID NO:1)，Ser75-Thr82(SEQ ID NO:2)，Lys103-Arg110(SEQ IDNO:3)，Val124-Ser134(SEQ ID NO:4))可能形成抗原表位的序列进行连续表达。发现采用这4段序列构建的核酸分子，能够表达具有更高生物活性的目的蛋白。
由于人白细胞介素-5具有二聚体形式，因此本发明还尝试针对这4段序列使用柔性连接肽重复表达两次，研究证明，重复表达两次能显著提高目的蛋白的生物活性。
进一步地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如上所述的核酸分子。
本发明中，重组载体具有多克隆位点，是一种可以调控外源基因表达的分子生物学载体。
在一些方式中，所述重组载体的空载体包括pET21a(+)。
再一方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达系统，所述大肠杆菌表达系统用于转化如上所述的重组载体。
在一些方式中，所述大肠杆菌表达系统包括已DE3溶源化的大肠杆菌宿主菌。
在一些方式中，所述大肠杆菌宿主菌为BL21(DE3)。
再一方面，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白，所述重组蛋白由如上所述的核酸分子编码获得。
本发明所述人白细胞介素-5重组蛋白采用如上所述的大肠杆菌表达系统表达获得。
进一步地，所述重组蛋白具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
再一方面，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法，通过构建包含如上所述的核酸分子的重组载体，再经原核系统表达获得。
进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将核酸分子插入大肠杆菌表达载体得到重组载体；
(2)重组载体转化到大肠杆菌表达系统，得到菌体溶液；
(3)菌体溶液中加入变性裂解液进行裂解，离心，得到蛋白溶解液；
(4)蛋白溶解液经柱纯化，洗脱获得蛋白洗脱液；
(5)蛋白洗脱液中加入复性液，超滤浓缩，透析，制得人白细胞介素-5重组蛋白。
进一步地，所述方法包括：
(1)将编码人白细胞介素-5重组蛋白的核酸分子插入大肠杆菌表达载体，获得重组载体；
(2)重组载体转化入大肠杆菌表达系统，诱导培养；
(3)收集所述大肠杆菌表达系统的菌体，含变性裂解液重悬，经过破碎离心获得蛋白溶解液(包涵体溶解液)；
(4)将包涵体溶解液进行柱纯化，得到蛋白洗脱液；
(5)将蛋白洗脱液缓慢加入复性液中，使人白细胞介素-5重组蛋白在低温条件下充分复性，再进行浓缩和透析，得到复性的人白细胞介素-5重组蛋白。
在一些方式中，步骤(1)所述大肠杆菌表达载体包括pET21a(+)。
在一些方式中，步骤(1)所述核酸分子插入大肠杆菌表达载体的BamHI和XhoI限制性酶切位点。
在一些方式中，步骤(2)所述大肠杆菌表达系统包括已DE3溶源化的大肠杆菌宿主菌。
在一些方式中，所述大肠杆菌宿主菌为BL21(DE3)。
在一些方式中，步骤(2)所述转化的方法为化学转化。
进一步地，步骤(3)所述变性裂解液包括PBS(磷酸盐缓冲液)、尿素、咪唑、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和PMSF(苯甲基磺酰氟)。
进一步地，步骤(3)所述变性裂解液包括0.005～0.015M的PBS、浓度为6～10M的尿素、浓度为4～6mM的咪唑、浓度为0.5～1.5％的Triton X-100和0.5～1.5mM的PMSF，pH7.5～8.5。
在一些方式中，步骤(3)所述变性裂解液为，0.01M PBS、8M尿素、5mM咪唑、1％Triton X-100、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，pH 8.0。所述变性裂解液能够将溶液中的人白细胞介素-5重组蛋白尽量溶解并防止所述目的蛋白降解。
在一些方式中，步骤(3)所述破碎的方法为超声破碎。
进一步地，步骤(4)所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；所述变性清洗液能够尽量将其他蛋白清洗掉，柱上只保留所述目的蛋白。
在一些方式中，步骤(4)所述变性清洗的变性清洗液包括0.005～0.015M PBS、6～10M尿素和30～100mM咪唑，pH7.5～8.5。
在一些方式中，步骤(5)所述的变性清洗液为：0.01M PBS、8M尿素和80mM咪唑，pH8.0。经过研究证明，针对人白细胞介素-5重组蛋白，所述变性清洗液相比其他咪唑浓度条件下的变性清洗液更有利于在保证目的蛋白不损失的情况下尽可能减少杂蛋白的含量。
在一些方式中，步骤(4)所述变性洗脱的变性洗脱液包括0.005～0.015M PBS，6～10M尿素和400～600mM咪唑，pH7.5～8.5。所述变性洗脱液能够将人白细胞介素-5重组蛋白从亲和柱完全洗脱。
在一些方式中，步骤(4)所述柱纯化的方法包括亲和层析。
在一些方式中，所述亲和层析采用镍柱进行。
进一步地，步骤(5)所述复性液含有Tris(三羟甲基氨基甲烷)，pH为8.0。
在一些方式中，步骤(5)所述的复性液包括40～60mM Tris、0.4～0.6M NaCl、0.2～0.4M Arg(L-精氨酸)、0.5～2.5mM GSH/GSSG(还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽)和0.5～1.5mM DTT(二硫苏糖醇)。
在一些方式中，步骤(5)所述的复性液为：50mM Tris、0.5M NaCl、0.3M Arg、2mM/1mM GSH/GSSG和1mM DTT，pH8.0。经过研究证明，从蛋白得率和蛋白反应性两个方面综合考虑，针对人白细胞介素-5重组蛋白，所述复性液相比其他pH条件下的复性液更优。
本发明经研究证明，选择pH 8.0的Tris缓冲体系制备复性液，并在Tris缓冲体系中添加NaCl和Arg，制备的人白细胞介素-5重组蛋白的蛋白反应性更高，蛋白得率也更高。
进一步地，步骤(5)所述透析的透析液包括Tris、NaCl和精氨酸。
在一些方式中，步骤(5)所述的低温条件为0-4℃。
在一些方式中，步骤(5)所述的浓缩条件为3kDa超滤管4℃、5000g或PEG6000包埋4℃过夜。
在一些方式中，步骤(5)所述透析液包括40～60mM Tris、0.4～0.6M NaCl、0～0.2Arg，pH7.5～8.5。
在一些方式中，步骤(5)所述透析液为pH8.0、50mM Tris、0.5M NaCl、0.2M/0.1M/0MArg。所述透析液能够保证所述目的蛋白在透析过程中保证人白细胞介素-5重组蛋白的稳定性，减少沉淀析出，提高人白细胞介素-5重组蛋白的收率。
再一方面，本发明提供了一种核酸分子在制备高活性的人白细胞介素-5重组蛋白上的用途，所述核酸分子包括重复两次的Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134序列，所述Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134分别具有如SEQ ID NO:1～4所示的核苷酸序列。
再一方面，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白在人白细胞介素-5进行定量检测中的用途。
进一步地，所述人白细胞介素-5进行定量检测，可用于炎症或过敏性疾病的诊断和急性排斥反应或肿瘤的治疗预后。
本发明的有益效果：
1、提供了一种使用原核表达系统快速、经济、有效的制备高效反应性的人白细胞介素-5重组蛋白的方法；
2、根据人白细胞介素-5的mRNA序列，选取除信号肽以外的Ile20-Ser134序列，基于疏水性、蛋白二级结构、抗原决定簇等参数，对人白细胞介素-5的抗原表位进行预测，选取4段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134)可能形成抗原表位的序列进行连续表达并使用柔性连接肽重复表达两次，得到编码人白细胞介素-5重组蛋白抗原表位的核酸分子；
2、将所述核酸分子经人工合成后克隆至大肠杆菌表达载体得到重组载体，转染至大肠杆菌表达系统中，实现了人白细胞介素-5重组蛋白的高效表达，目的蛋白占总蛋白比例为40％-50％，并对其变性清洗和复性等条件进行了优化和调整，100mL菌液可获得1.3mg有高活性的人白细胞介素-5重组蛋白，在同样的蛋白浓度条件下其抗原反应性优于表达完整序列的人白细胞介素-5重组蛋白；
3、仅需一步纯化就能获得纯度大于95％的高纯度人白细胞介素-5重组蛋白；
4、制备方法步骤简单、成本低、回收率较高、抗原反应性强的特点，对炎症或过敏性疾病的诊断和急性排斥反应或肿瘤的治疗预后以及对人白细胞介素-5进行定量检测具有重要意义和广泛前景，可用于制备标准品，也可用作免疫动物制备抗体的抗原。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳结果图，其中，左图为原始序列制备的人白细胞介素-5重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，右图为优化后序列制备的人白细胞介素-5重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，泳道1为纯化前样品，泳道2为柱后收集液，泳道3为洗涤收集液，泳道4为洗脱收集液，泳道5为蛋白Marker；
图2为实施例3中对人白细胞介素-5的氨基酸序列进行蛋白疏水性预测结果图；
图3为实施例3中对人白细胞介素-5的氨基酸序列进行蛋白二级结构预测结果图；
图4为实施例3中对人白细胞介素-5的氨基酸序列进行抗原决定簇预测结果图；
图5为大肠杆菌表达载体的质粒pET21a(+)结构图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料与试剂：
感受态细胞：大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。
培养基成分：Yeast Extract Powder、Tryptone购自OXOID公司，NaCl购自国药集团化学试剂有限公司、氨苄青霉素购自天根生化科技(北京)有限公司。
裂解液、平衡液、清洗液、洗脱液、复性液成分：尿素、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl购自国药集团化学试剂有限公司，咪唑购自Sigma公司，GSH、GSSG、Arg、DTT购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
生化试剂：PierceTM BCA Protein Assay Kit、FastDigest BamHI、FastDigestXhoI购自Thermo Fisher公司；High Affinity Ni-NTA Resin购自金斯瑞生物科技股份有限公司、BiofurawTM快速蛋白染液购自上海天能科技有限公司；2×Loading buffer、12％SDS-PAGE预制蛋白胶、MOPS电泳缓冲液购自南京艾思易生物科技有限公司。
人白细胞介素-5标准品购自赛基生物，为免疫荧光法细胞因子联合检测试剂盒(注册证编号：赣械注准20192400359)中的自带标准品。
实施例1：本发明提供的人白细胞介素-5重组蛋白的制备
本实施例提供的人白细胞介素-5重组蛋白的制备过程包括以下步骤：
1、人白细胞介素-5重组蛋白编码基因的设计与合成
以NCBI已公开的人白细胞介素-5的mRNA序列(NCBINCBI Reference Sequence登录号：NM_000879.3)作为优化对象，选取Ile20-Ser134序列如SEQ ID NO:8所示，作为对照序列；基于疏水性、蛋白二级结构、抗原决定簇等参数，对人白细胞介素-5的抗原表位进行预测，选取4段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134)可能形成抗原表位的序列进行连续表达并使用柔性连接肽重复表达两次，得到编码人白细胞介素-5重组蛋白抗原表位的核酸分子，序列如SEQ ID NO:5，并进行人工合成。
制备的编码人白细胞介素-5重组蛋白抗原表位的核酸分子(SEQ ID NO:5)序列如下：
ATG-GCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCGGTGGTGGT GGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCTGA
其中包括重复两次表达的4段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134)序列，具体如下：
2、人白细胞介素-5重组工程菌的获得
(1)化学合成人白细胞介素-5重组蛋白的编码基因(SEQ ID NO:5)并在两端分别添加BamHI和XhoI酶切位点(在金斯瑞生物科技股份有限公司进行化学合成)，使用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切人白细胞介素-5重组蛋白的编码基因(SEQ ID NO:5)后，用TaKaRaFragment Purification Kit纯化回收；将回收的编码基因插入同样经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切的pET21a(+)中，构建重组载体；所采用的大肠杆菌表达载体的质粒结构如图5所示。
(2)取大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞于冰上缓慢融化，加入约40ng重组载体轻柔混合，继续冰浴20min；
(3)将加入重组载体后的感受态细胞于42℃水浴锅中热激90s，迅速转移至冰上2min-5min；
(4)在无菌工作台内向含重组载体的感受态中加入500uL LB培养液(无抗性)，37℃条件下，低速培养0.5h；
(5)在无菌工作台中取200μL培养液滴氨苄抗性的LB固体培养基上，使用一次性无菌涂布棒把培养液涂布均匀，倒置于37℃恒温孵箱中培养12-16小时，次日长出的菌落即为人白细胞介素-5重组工程菌。
3、人白细胞介素-5重组蛋白的表达
(1)将长出的人白细胞介素-5重组工程菌单克隆接种至氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，得到种子液；
(2)以1:100比例将种子液加入氨苄抗性2YT液体培养基进行扩大培养，37℃、220rpm条件下培养至OD600≈1后，加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导，37℃、220rpm条件下继续培养4h；
(3)培养完毕后，12000rpm离心5min，弃去上清，获得表达了人白细胞介素-5的菌体。
4、人白细胞介素-5重组蛋白的纯化与复性
(1)将100mL菌液离心得到的湿菌体和10mL变性裂解液(0.01M PBS、8M尿素、5mM咪唑、1％ Triton X-100、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，pH 8.0)混合，加入终浓度为1mM的PMSF，充分混匀后置于装有冰水混合物中；
(2)使用超声破碎仪进行超声破碎，功率300W，5s，5s，总工作时间5min；
(3)超声后的菌液12000rpm离心5min，保留上清液，使用0.45μM的PVDF滤膜过滤；
(4)取2mL镍柱填料装柱，使用10倍柱体积的变性结合液平衡镍柱，将过滤后的超声上清缓慢上柱，收集柱后液；本实施例仅需一步纯化过柱操作；
(5)分别使用5倍柱体积的变性清洗液(0.01M PBS、8M尿素和80mM咪唑，pH8.0)和2倍柱体积的变性洗脱液(0.01M PBS，8M尿素和500mM咪唑，pH8.0)进行洗脱，收集清洗液和洗脱液，洗脱液中即为纯化后的人白细胞介素-5蛋白；
(6)采用稀释复性的方法，按照1:50稀释比例，将镍柱洗脱液逐滴缓慢滴入含有0.3MArg的蛋白复性液(50mM Tris、0.5M NaCl、0.3M Arg、2mM/1mM GSH/GSSG和1mM DTT，pH8.0)中，低温持续搅拌36h；
(7)使用3KD超滤管对充分复性后的蛋白液进行浓缩，离心条件为4℃，5000g；
(8)使用透析方法对蛋白复性浓缩液分别在含有0.2M、0.1M、0M Arg的透析液(pH8.0，50mM Tris、0.5M NaCl)中进行梯度置换，最终获得已复性的可溶人白细胞介素-5重组蛋白。
5、人白细胞介素-5重组蛋白的SDS-PAGE和蛋白浓度测定
分别取20μL上述提到的超声上清、柱后液、清洗液、洗脱液，与20μL ACE 2×Loading buffer混匀，于金属浴中100℃煮沸10min；10000rpm离心5min后，取10μL上清用12％ACE梯度预制胶进行SDS-PAGE，120V运行1h，结果见图1中的右图，其中，泳道1为纯化前样品，泳道2为柱后收集液，泳道3为洗涤收集液，泳道4为洗脱收集液，泳道5为蛋白Marker。
可以看出，纯化的表达产物在10kDa处有明显的条带，与预计的人白细胞介素-5单体分子量大小(10kDa)相符，目的蛋白的纯度>95％。
将复性浓缩后的人白细胞介素-5采用Thermo PierceTM BCA Protein Assay Kit测定纯化后蛋白的浓度，计算出所得目的蛋白的含量，最终得出100mL细胞表达量可获得近1.3mg较高纯度的人白细胞介素-5重组蛋白。
6、人白细胞介素-5重组蛋白的活性分析
取复性浓缩后的人白细胞介素-5重组蛋白使用赛基生物免疫荧光法细胞因子联合检测试剂盒(注册证编号：赣械注准20192400359)进行活性检测，检测方式为双抗体夹心法，检测有活性的人白细胞介素-5蛋白含量。
将纯化后的人白细胞介素-5重组蛋白采用细胞因子联合检测试剂盒中的标准品稀释液分别稀释至10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL后，使用流式荧光法进行活性检测。结果显示，人白细胞介素-5重组蛋白稀释至2.5ng/mL时荧光值为123053.60，标准品2.5ng/mL时的荧光值为75231.60，证明本发明得到的人白细胞介素-5重组蛋白和人白细胞介素-5蛋白标准品相比，活性更高。
实施例2：人白细胞介素-5重组蛋白的纯度、生物活性验证
本实施例分别采用如SEQ ID NO:5所示的核酸分子(优化后序列)，与SEQ ID NO:8所示的核酸分子(为原始mRNA序列SEQ ID NO：7去除信号肽序列的序列)，按照实施例1提供的方法，经大肠杆菌表达系统后进行纯化和复性，分别进行SDS-PAGE、蛋白浓度测定和生物活性分析。
1、SDS-PAGE和蛋白产量测定
分别取20μL上述提到的超声上清、柱后液、清洗液、洗脱液，与20μL ACE 2×Loading buffer混匀，于金属浴中100℃煮沸10min；10000rpm离心5min后，取10μL上清用12％ACE梯度预制胶进行SDS-PAGE，120V运行1h，结果见图1，其中左图为原始序列(SEQ IDNO:8)制备的人白细胞介素-5重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，右图为优化后序列(SEQ IDNO:5)制备的人白细胞介素-5重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，泳道1为纯化前样品，泳道2为柱后收集液，泳道3为洗涤收集液，泳道4为洗脱收集液，泳道5为蛋白Marker。
根据图1可以看出，两种核酸分子表达产物分别在13kDa、10kD处有明显的条带，与预计的人白细胞介素-5单体分子量大小相符，都能成功制备人白细胞介素-5重组蛋白。
按照实施例1，对两组人白细胞介素-5重组蛋白进行纯化和复性，将复性浓缩后的人白细胞介素-5采用Thermo PierceTM BCA Protein Assay Kit测定纯化后蛋白的浓度，结合蛋白液体积，最终产量检测结果见表1。
表1、两组人白细胞介素-5重组蛋白的产量
核酸分子 产量(mg/100mL菌液表达量)
SEQ ID NO:5(优化后序列) 1.3
SEQ ID NO:8(原始序列) 0.704
可见本发明提供的核酸分子(SEQ ID NO:5)制备的人白细胞介素-5重组蛋白，仅需一步纯化，就能够制得具有更高的蛋白产量，更高的纯度的目的蛋白(>95％)。
2、人白细胞介素-5重组蛋白的生物活性分析
分别取两组复性浓缩后的人白细胞介素-5重组蛋白，采用细胞因子联合检测试剂盒中的标准品稀释液分别稀释至10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL后，使用赛基生物免疫荧光法细胞因子联合检测试剂盒(注册证编号：赣械注准20192400359)，在BD公司的CantoⅡ流式细胞仪上进行活性检测，检测结果见表2。
表2、两组人白细胞介素-5重组蛋白的活性
根据表2可以看出，本发明提供的核酸分子(SEQ ID NO:5)制备的人白细胞介素-5重组蛋白，明显具有更高的活性。
实施例3：抗原表位序列的筛选
本实施例在人白细胞介素-5重组蛋白编码基因的构建过程中，基于疏水性、蛋白二级结构、抗原决定簇等参数，对人白细胞介素-5的抗原表位进行预测和筛选，具体步骤如下：
1、蛋白质疏水性预测
通过https://www.expasy.org/resources/protscale，对人白细胞介素-5的氨基酸序列进行蛋白疏水性预测，预测结果如图2所示。
根据图2可见，此预测选择除信号肽以外的Ile20-Ser134序列(即有1-115位氨基酸)，在预测结果中选取亲水性强(预测值小于0)的片段作为可能的抗原表位，即57-63、75-85、100-110。
2、蛋白二级结构
通过https://www.uniprot.org/uniprotkb/P05113/entry，对人白细胞介素-5的氨基酸序列进行蛋白二级结构预测，检测结果见图3。
根据图3，螺旋helix(紫红色)和折叠strand(黄色)区域为较难形成抗原表位区域，绿色为两个二硫键形成区域。选择非螺旋和折叠区域和包括二硫键形成区域的序列，即45-50、63、75-82、103，可能为抗原表位序列。
3、抗原决定簇
通过http://www.detaibio.com/tools/index.php？r＝epitope-prediction％ 2Findex，对人白细胞介素-5的氨基酸序列进行抗原决定簇预测，预测结果见图4。
根据图5，此预测选择除信号肽以外的Ile20-Ser134序列(即有1-115位氨基酸)，选择抗原决定簇分析结果中分数较高的区域，即57-63、72-84、98-113、124-128，可能为抗原表位序列。
综合以上分析，根据疏水性、蛋白二级结构、抗原决定簇的预测结果，选取Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，三段可能形成抗原表位的序列；考虑到IL-5生物活性可能与其C端残基和二聚体结构有关，故选取C端Val124-Ser134为第四段序列。
经比对，Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134分别具有如SEQ ID NO:1～4所示的核苷酸序列。
本实施例尝试采用分别选用不同的抗原表位序列，以及尝试重复表达抗原表位序列，制备的核酸分子经大肠杆菌表达系统后进行纯化和复性，分别进行SDS-PAGE、蛋白浓度测定和生物活性分析，从而筛选核酸分子，用于制备更高活性、更高纯度、且更易纯化的人白细胞介素-5重组蛋白。
分别选取如下所示的5组核酸分子进行人白细胞介素-5重组蛋白表达：
1、选取4段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134)可能形成抗原表位的序列进行连续表达，中间使用柔性连接肽序列GGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGC连接，重复表达两次，该核酸分子具有如SEQ ID NO:5所述的核苷酸序列；
2、选取4段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134)可能形成抗原表位的序列进行连续表达，中间使用刚性连接肽序列GAAGCTGCGGCAAAAGAAGCAGCGGCTAAA连接，重复表达两次，该核酸分子具有SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列；所表达的刚性连接肽具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
3、选取4段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134)可能形成抗原表位的序列进行连续表达，未进行重复表达，该核酸分子的核苷酸序列为：
ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGT GTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATG AACACCGAGTGGATTATCGAGAGCTGA(SEQID NO:11)
4、选取4段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110，Val124-Ser134)可能形成抗原表位的序列进行连续表达，中间无连接，重复表达两次，该核酸分子的核苷酸序列为：ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCTGA(SEQ ID NO:12)
5、选取3段(Ala45-Cys63，Ser75-Thr82，Lys103-Arg110)可能形成抗原表位的序列进行连续表达，中间使用柔性连接肽序列GGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGC连接，重复表达两次，该核酸分子的核苷酸序列为：
ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCTGA(SEQ ID NO:13)
6、原始序列中截取的Ile20-Ser134序列(SEQ ID NO:8)(为原始mRNA序列SEQ IDNO：7去除信号肽序列的序列)
分别采用6组核酸分子按照实施例1提供的方法制备人白细胞介素-5重组蛋白，并检测其产量和活性，结果如表3所示。
表3、6组人白细胞介素-5重组蛋白的产量和活性
可见本发明提供的核酸分子(SEQ ID NO:5)制备的人白细胞介素-5重组蛋白，浓度和纯度都能达到更高水平，更重要的是，具有非常高的活性，且仅需一步纯化就可制备获得比人白细胞介素-5蛋白标准品更高活性的人白细胞介素-5重组蛋白，可用于制备标准品，也可用作免疫动物制备抗体的抗原。第1组与第2组数据的对比显示，连接肽也会影响重组蛋白的活性，其中，第一组SEQ ID NO:5核酸分子的柔性连接肽比第二组刚性连接肽SEQID NO:10更有利于此重组蛋白发挥作用，说明柔性连接肽更有利于蛋白折叠形成稳定的二级结构。
实施例4：复性工艺的优化
本实施例按照实施例1提供的方法制备人白细胞介素-5重组蛋白，其中在纯化复性过程中，分别采用如表4所示的50mM的MOPS、HEPES、PBS、TRIS等不同缓冲体系，用于配制复性液，复性液中的其他成分保持不变，分别检测复性后的蛋白得率和蛋白反应性，其中蛋白得率的检测方法为：采用实施例1提供的方法进行蛋白产量检测来计算最后得到的总蛋白量，总蛋白量与使用的蛋白菌液量的比值为蛋白得率。
蛋白反应性的检测方法为：采用实施例2提供的方法进行蛋白活性的检测，计算每ng目的蛋白测得荧光值/每ng标准品测得蛋白荧光值。
考察不同缓冲体系配制的复性液对人白细胞介素-5重组蛋白复性效果的影响，检测结果见表4。
表4、不同复性液对制备人白细胞介素-5重组蛋白的影响
pH值 缓冲体系 蛋白得率/50mL菌液 蛋白反应性(ng/ng)
6 MOPS 530μg±50μg 1.2
7 HEPES 500μg±50μg 1.9
7.4 PBS 560±50μg 1.3
8 TRIS 610±50μg 2.2
9 TRIS 650±50μg 1.3
根据表4可以看出，采用pH9.0的Tris缓冲体系配制复性液，人白细胞介素-5重组蛋白的得率最高，但是其蛋白反应性(活性)偏低，采用pH8.0的Tris缓冲体系配制复性液，能显著提高蛋白反应性，虽然其得率相对于pH9.0时略有降低，但仍处于较高水平，因此优选的复性液配方为：50mM Tris、0.5M NaCl、0.3M Arg、2mM/1mM GSH/GSSG和1mM DTT，pH8.0。
实施例5：纯化工艺的优化
本实施例按照实施例1提供的方法制备人白细胞介素-5重组蛋白，其中在纯化过程中，分别采用如表5所示的5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、70mM、80mM、90mM、100mM咪唑浓度用于配制变性清洗液，变性清洗液中的其他成分保持不变，分别检测清洗液中的目的蛋白损失率和洗脱液中的目的蛋白占总蛋白比例。
目的蛋白损失率的检测方法为：清洗液中目的条带灰度值*2.5/(清洗液中目的条带灰度值*2.5+洗脱液中目的条带灰度值)。
目的蛋白占洗脱液总蛋白比例的检测方法为：洗脱液中目的条带灰度值/洗脱液中所有蛋白条带灰度值。
考察使用不同咪唑浓度的变性清洗液对制备人白细胞介素-5重组蛋白的影响，检测结果见表5。
表5、使用不同咪唑浓度的变性清洗液对制备人白细胞介素-5重组蛋白的影响
咪唑浓度 目的蛋白损失率 目的蛋白占洗脱液总蛋白比例
5mM 7％ 76％
10mM 10％ 77％
20mM 15％ 75％
30mM 18％ 80％
40mM 20％ 82％
50mM 25％ 85％
60mM 35％ 86％
70mM 40％ 89％
80mM 42％ 96％
90mM 65％ 97％
100mM 75％ 97％
根据表5可以看出，采用80mM咪唑浓度的变性清洗液，能在蛋白纯度保持较高水平的同时，更大程度地去除杂质、减少目的蛋白流失，实现一步纯化，一步纯化纯度就能达到95％以上。
而现有技术中制备的人白细胞介素-5重组蛋白通常需要多步纯化步骤(如FEBSLett.(1993)27；331(1-2):49-52.doi:10.1016/0014-5793(93)80295-6./Protein ExprPurif.(1997)11(1):86-94.doi:10.1006/prep.1997.0785.)，因为其一步过柱纯化制得的目的蛋白纯度(68％)明显较低，难以通过一步纯化制备高纯度人白细胞介素-5重组蛋白。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
Seq ID NO.1
Ala45-Cys63：
GCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGT
Seq ID NO.2
Ser75-Thr82：
AGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACG
Seq ID NO.3
Lys103-Arg110：
AAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGC
Seq ID NO.4
Val124-Ser134：
GTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGC
SEQ ID NO:5
编码人白细胞介素-5重组蛋白的核酸分子：
ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCTGA
SEQ ID NO:6
人白细胞介素-5的重组蛋白序列：
ANETLRIPVPVHKNHQLCSQTVQGGTKCGEERRRVMNTEWIIESGGGGSGGGGSANETLRIPVPVHKNHQLCSQTVQGGTKCGEERRRVMNTEWIIES
SEQ ID NO:7
人白细胞介素-5的mRNA序列：
ATGCACTTTCTTTGCCAAAGGCAAACGCAGAACGTTTCAGAGCCATGAGGATGCTTCTGCATTTGAGTTTGCTAGCTCTTGGAGCTGCCTACGTGTATGCCATCCCCACAGAAATTCCCACAAGTGCATTGGTGAAAGAGACCTTGGCACTGCTTTCTACTCATCGAACTCTGCTGATAGCCAATGAGACTCTGAGGATTCCTGTTCCTGTACATAAAAATCACCAACTGTGCACTGAAGAAATCTTTCAGGGAATAGGCACACTGGAGAGTCAAACTGTGCAAGGGGGTACTGTGGAAAGACTATTCAAAAACTTGTCCTTAATAAAGAAATACATTGACGGCCAAAAAAAAAAGTGTGGAGAAGAAAGACGGAGAGTAAACCAATTCCTAGACTACCTGCAAGAGTTTCTTGGTGTAATGAACACCGAGTGGATAATAGAAAGTTGAGACTAAACTGGTTTGTTGCAGCCAAAGATTTTGGAGGAGAAGGACATTTTACTGCAGTGAGAATGAGGGCCAAGAAAGAGTCAGGCCTTAATTTTCAGTATAATTTAACTTCAGAGGGAAAGTAAATATTTCAGGCATACTGACACTTTGCCAGAAAGCATAAAATTCTTAAAATATATTTCAGATATCAGAATCATTGAAGTATTTTCCTCCAGGCAAAATTGATATACTTTTTTCTTATTTAACTTAACATTCTGTAAAATGTCTGTTAACTTAATAGTATTTATGAAATGGTTAAGAATTTGGTAAATTAGTATTTATTTAATGTTATGTTGTGTTCTAATAAAACAAAAATAGACAACTGTT
SEQ ID NO:8
Ile20-Ser134：
ATGATCCCCACAGAAATTCCCACAAGTGCATTGGTGAAAGAGACCTTGGCACTGCTTTCTACTCATCGAACTCTGCTGATAGCCAATGAGACTCTGAGGATTCCTGTTCCTGTACATAAAAATCACCAACTGTGCACTGAAGAAATCTTTCAGGGAATAGGCACACTGGAGAGTCAAACTGTGCAAGGGGGTACTGTGGAAAGACTATTCAAAAACTTGTCCTTAATAAAGAAATACATTGACGGCCAAAAAAAAAAGTGTGGAGAAGAAAGACGGAGAGTAAACCAATTCCTAGACTACCTGCAAGAGTTTCTTGGTGTAATGAACACCGAGTGGATAATAGAAAGTTGA
SEQ ID NO:9
更改连接肽的重组蛋白分子核酸序列：
ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCGAAGCTGCGGCAAAAGAAGCAGCGGCTAAAGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCTAA
SEQ ID NO:10
更改连接肽的重组蛋白分子链接肽氨基酸序列：
EAAAKEAAAK
SEQ ID NO:11
第3组核酸分子：
ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCTGA
SEQ ID NO:12
第4组核酸分子：
ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGTTATGAACACCGAGTGGATTATCGAGAGCTGA
SEQ ID NO:13
第5组核酸分子：
ATGGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGCTAATGAAACCTTACGTATTCCGGTTCCGGTGCACAAGAACCACCAACTGTGTAGCCAAACCGTTCAGGGCGGTACGAAGTGCGGCGAGGAGCGCCGTCGCTGA

Claims (9)

1.一种用于编码人白细胞介素-5重组蛋白的核酸分子，其特征在于，包括重复两次的Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134序列，所述Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～4所示；所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.一种人白细胞介素-5重组蛋白，其特征在于，由如权利要求1所述的核酸分子编码获得。
3.如权利要求2所述的人白细胞介素-5重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
4.如权利要求3所述的人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法，其特征在于，构建包含如权利要求1所述的核酸分子的重组载体，再经原核系统表达获得。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将核酸分子插入大肠杆菌表达载体得到重组载体；
(2)重组载体转化到大肠杆菌表达系统，得到菌体溶液；
(3)菌体溶液中加入变性裂解液进行裂解，离心，得到蛋白溶解液；
(4)蛋白溶解液经柱纯化，用变性清洗液和变性洗脱液进行清洗、洗脱获得蛋白洗脱液；
(5)蛋白洗脱液中加入复性液，超滤浓缩，透析，制得人白细胞介素-5重组蛋白。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述变性清洗液pH为8.0，包括0.01M PBS、8M尿素和80mM咪唑。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述复性液含有Tris，pH为8.0。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述复性液包括50mM Tris、0.5M NaCl、0.3M Arg、2mM/1mM GSH/GSSG和1mM DTT，pH8.0。
9.一种核酸分子在制备人白细胞介素-5重组蛋白上的用途，其特征在于，所述核酸分子包括重复两次的Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134序列，所述Ala45-Cys63、Ser75-Thr82、Lys103-Arg110和Val124-Ser134的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1～4所示；所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
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