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CN116970562B - 一种抗原特异性t细胞的制备方法及其在免疫治疗中的应用 - Google Patents

一种抗原特异性t细胞的制备方法及其在免疫治疗中的应用 Download PDF

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CN116970562B CN202311225921.3A CN202311225921A CN116970562B CN 116970562 B CN116970562 B CN 116970562B CN 202311225921 A CN202311225921 A CN 202311225921A CN 116970562 B CN116970562 B CN 116970562B
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Abstract

本文提供了制备抗原特异性T细胞的方法，包括1)制备高表达TRAIL的DC细胞；2)让所述DC细胞与含有异源抗原并表达TRAIL死亡受体的细胞接触；以及3)让所述DC细胞与HLA I类分子匹配的T细胞接触，以获得对所述异源抗原具有特异性的T细胞。本文还提供了该方法或T细胞在免疫治疗中的应用。

Description

一种抗原特异性T细胞的制备方法及其在免疫治疗中的应用
技术领域
本发明涉及制备抗原特异性T细胞的方法，尤其是通过DC细胞的抗原交叉呈递。本发明还涉及该方法或T细胞在免疫治疗中的应用。
背景技术
树突状细胞（DCs）是专职抗原呈递细胞（APCs），在适应性免疫反应的启动和调节中发挥核心作用。除了呈递内源性的抗原外，DC细胞还能够通过交叉呈递的方式递呈外源性抗原给CD8+T细胞, 这些外源抗原通常来自肿瘤细胞或者病毒感染的细胞。抗原交叉呈递是一个复杂且精密调节的过程，步骤包括DC细胞将外源性抗原摄取并加工成抗原肽，抗原肽在内质网内与MHC-I 分子结合形成抗原肽/MHC复合物后转移至DC细胞表面，再由DC细胞呈递给CD8+T细胞。抗原交叉呈递已经被证明在诱导并促进抗原特异性CD8+T细胞的分化和扩增的免疫反应中发挥了关键作用，基于该原理的技术设计已经被用于开发新的癌症治疗和疫苗，其中包括使用DC细胞作为癌症疫苗载体，并结合佐剂和细胞因子来增强交叉呈递效率和特异性。此外，抗原交叉呈递技术还被用于研究自身免疫疾病、感染和免疫调节等领域。
DC细胞摄取抗原的方式有以下几种。(1) 抗原肽段：通过将DC细胞与合成肽段孵育，可以直接将来自抗原的短肽段加载到DC细胞表面的MHC-I 分子上。(2) 肿瘤裂解物：DC细胞可与肿瘤细胞裂解物孵育以摄取抗原。这种方法模拟了抗原呈递的自然过程，并可能为抗原交叉呈递提供更多样化的抗原。(3) mRNA：可使用电转或基于脂质的转染试剂将编码肿瘤抗原的mRNA转染到DC细胞中。这种方法具有表达多种抗原的优点，可以用于制备个性化定制的DC细胞。(4) 病毒载体：重组病毒可用于将抗原基因传递到DC细胞中，从而实现抗原表达和呈递。(5) 纳米颗粒：可以使用纳米颗粒，如脂质体、树状聚合物或聚合物纳米颗粒，将抗原传递给DC细胞。在实践中，抗原摄取方法的选择可能取决于多个因素，例如抗原的来源以及在临床应用时的可行性。例如，基于mRNA的方法可能更适合为患者制备个性化的DC疫苗。从患者的肿瘤组织中获取肿瘤裂解物作为抗原来源的方法，不必进行抗原纯化，更适用于快速制备DC细胞癌症疫苗。另外，肿瘤裂解物中包含众多肿瘤相关抗原，新生抗原，这种裂解物直接加入DC细胞培养体系，由DC细胞来摄取，加工并决定肿瘤抗原的免疫原性，从而省去了繁杂的抗原筛选过程。最近美国药企Northwest报导的已经完成三期临床的治疗脑胶质瘤的DC细胞疫苗，即采用了肿瘤裂解物的抗原交叉递呈方式。
发明内容
在一方面，本文提供了制备抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：
1) 制备高表达TRAIL的DC细胞；
2) 让所述DC细胞与含有异源抗原并表达TRAIL死亡受体的细胞接触；以及
3) 让所述DC细胞与HLA I类分子匹配的T细胞接触，以获得对所述异源抗原具有特异性的T细胞。
在一些实施方案中，步骤3)包括让所述DC细胞与PMBC细胞接触，并在白介素2存在下继续培养所述PMBC细胞。
在一些实施方案中，所述TRAIL死亡受体为DR5。
在一些实施方案中，所述异源抗原为肿瘤抗原或病毒抗原。
在一些实施方案中，所述HLA I类分子为HLA-A。
在一些实施方案中，所述HLA I类分子为HLA-A0201。
在一些实施方案中，所述含有异源抗原并表达TRAIL死亡受体的细胞为肿瘤细胞或非肿瘤细胞。
在一些实施方案中，所述含有异源抗原并表达TRAIL死亡受体的细胞为经改造而表达所述异源抗原。
在一些实施方案中，所述非肿瘤细胞为293细胞。
另一方面，本文提供了经改造而表达TRAIL死亡受体和异源抗原的非肿瘤细胞。
在一些实施方案中，所述非肿瘤细胞为293细胞。
在一些实施方案中，所述TRAIL死亡受体为DR5。
在一些实施方案中，所述异源抗原为肿瘤抗原或病毒抗原。
另一方面，本文提供了所述非肿瘤细胞在制备抗原特异性T细胞中的用途。
另一方面，本文提供了上述方法制备的抗原特异性T细胞在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病与表达所述抗原相关。
在一些实施方案中，所述抗原为肿瘤抗原或病毒抗原，所述疾病为肿瘤或病毒性疾病。
在一些实施方案中，所述抗原为CMV pp65。
本发明通过将TRAIL基因稳定导入DC细胞，使其高表达TRAIL分子。这类DC细胞，通过作用于肿瘤细胞表面的死亡受体或经改造而表达死亡受体和异源抗原的非肿瘤细胞，可选择性杀伤肿瘤细胞或该非肿瘤细胞，摄取癌抗原或异源抗原，通过抗原交叉递呈方式高效地诱导抗原特异性CD8+T细胞介导的免疫反应。
附图说明
图1显示CA-DC细胞负载并表达TRAIL的检测结果
图2 A和图2B分别显示CA-DC1-TRAIL及CA-DC2-TRAIL摄取A375L及U2OSL细胞中GFP抗原肽实验结果。
图3显示CA-DC1-TRAIL摄取293L-DR5细胞中GFP抗原肽实验结果。
图4显示靶细胞负载并表达CMV pp65的检测结果。
图5 显示CA-DC1-TRAIL摄取CMV pp65抗原肽诱导pp65特异性的CTL对靶细胞的杀伤结果。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
术语“包含”或“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包括”某个具体要素时，也旨在涵盖由该具体要素组成。
术语“抗原特异性T细胞”在本文中指，在MHC分子(在人类称为HLA)匹配的情况下，该T细胞(尤其是CD8+ CTL细胞)可识别MHC-抗原肽复合物，并进一步地，能够杀伤具有或产生该MHC-抗原肽复合物的靶细胞。由于一种抗原(如病毒抗原)在降解后可能产生多种结合于相同或不同MHC分子(如MHC I类分子)的抗原肽，所以与同一种抗原对应的抗原特异性T细胞也可能有多种(例如分别具有不同的T细胞受体(TCR))。由于T细胞对抗原肽的识别是MHC限制性的，在提及“抗原特异性T细胞”时，应意识到该T细胞不仅识别该抗原肽，还同时识别MHC-抗原肽复合物中的MHC分子。
提及T细胞或PBMC时，术语“MHC (或HLA)匹配的”指，在DC细胞通过MHC-抗原肽复合物呈递抗原肽时，该T细胞或PBMC中的T细胞(尤其是初始T细胞(naive T cell))的提供者与该DC细胞的提供者至少具有一种相同的MHC分子，尤其是MHC I类分子，例如HLA-A。在一个具体实施例中，该DC细胞和T细胞均表达HLA-A0201分子或均具有HLA-A0201等位基因。术语“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC) ”是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。目前，MHC I类和MHC II类分子的结构已经得到了完整的解析，属于免疫球蛋白超家族成员。人类的MHC被称为HLA（human leukocyteantigen，HLA），即人白细胞抗原。HLA I类分子主要包括三个功能基因HLA-A、HLA-B、和HLA- C的蛋白产物(重链或α链)。每一个I类HLA重链均与β2微球蛋白(β2m)配对以异二聚体的形式形成完整的MHC I类分子。MHC分子的主要功能之一是参与抗原呈递，即MHC分子通过其肽结合槽与抗原肽结合形成抗原肽-MHC复合物(pMHC)，并将其呈现于细胞表面，供T细胞识别(通过TCR)并促发免疫应答反应。
“高表达TRAIL的DC细胞”在本文中指对DC进行改造使得其TRAIL的表达量高于未经改造的普通DC细胞的表达量。例如，相对于未经改造的普通DC细胞，高表达TRAIL的DC细胞中TRAIL的表达量高出至少50%、100%、2倍、5倍、10倍、50倍、200倍、1000倍或更高。
提及细胞时，所用的术语“改造”指经人为操作而使得该细胞具有发生变化的特征，尤其是通过向细胞中引入外源基因表达盒而使得其可以表达该外源基因(如GFP、TRAIL、CMV pp65等)。例如，为了让DC细胞高表达TRAIL，可向该DC细胞中瞬时引入TRAIL表达质粒，用于TRAIL短期表达；或通过慢病毒向其基因组引入TRAIL基因而使得TRAIL长期表达。
术语“TRAIL死亡受体”在本文中指含有胞内死亡结构域的TRAIL受体，当TRAIL与其结合时可通过该胞内死亡结构域将细胞凋亡信号传递到细胞内，激活Caspase系统(如Caspase 8)，最终引起细胞凋亡。TRAIL死亡受体的实例包括DR4和DR5。
术语“异源抗原”指宿主细胞正常状态下不表达或以较低量表达的抗原。异源抗原的实例包括肿瘤抗原，例如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原；病毒抗原；以及为了特定目的而人为引入的抗原。通常可通过向细胞中引入该异源抗原的表达载体(如质粒或病毒载体)而实现在细胞中表达异源抗原。肿瘤相关抗原的实例包括人端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)，肿瘤-睾丸抗原(CTA)，如MAGE家族蛋白、NY-ESO-1、gp100、GPC3、AFP蛋白等。肿瘤特异性抗原的实例包括肿瘤细胞中因基因突变进而致氨基酸发生变异的蛋白，如hRAS，kRAS等。
术语“293细胞”，也称为“HEK293细胞”，指一种人胚胎肾细胞系(ATCC accessionnumber：CRL-1573)，其广泛应用于现代生物学技术中，例如用于生产蛋白、疫苗、抗癌试剂及重组腺相关病毒等。在提及293细胞时，还旨在涵盖其衍生细胞，例如293T、293FTM和293S细胞等。
树突状细胞 (dendritic cells, DC) 是一种专职抗原递呈细胞。DC细胞通过摄取外来抗原对其进行加工处理生成抗原肽，抗原肽与MHC-I 分子结合形成抗原肽/MHC复合物后到达DC细胞表面。DC细胞再将抗原信息传递给CD8+ T细胞，从而激发特异性抗肿瘤或抗病毒免疫反应。这个复杂过程称为抗原交叉递呈。DC细胞的亚群，数量、活性以及抗原摄取加工的效率等，综合决定了抗原交叉递呈的效率以及抗肿瘤免疫反应的效果。本发明采用一种工程化DC细胞系，建立了一种体外高效抗原交叉递呈体系，并显著提升了抗原特异性CD8+T细胞的数量和质量，为免疫治疗提供了新的方法。
将TRAIL基因稳定导入DC细胞，使其高表达TRAIL分子。这类DC细胞，通过作用于肿瘤细胞表面的死亡受体，可诱导肿瘤细胞凋亡，选择性地直接杀伤肿瘤细胞，并摄取癌抗原。这种抗原交叉递呈方式效率显著优于添加肿瘤裂解物的抗原递呈方式，从而极为高效的诱导抗原特异性、HLA限制性的CD8+T细胞介导的免疫反应。在这个体系中，DC细胞以及DC诱导激活的T细胞，均具备高效靶向并杀伤肿瘤细胞的能力。因此，本发明将有力支持免疫治疗的研究和临床应用。
因此，在一方面，本发明建立了一种新的DC细胞递呈抗原的方式，并在此基础上诱导生成特异性T细胞。
另一方面，本文建立了理想的提供抗原的靶细胞体系。
通过本发明方式诱导产生的特异性T细胞，较现有其他方法的展现出更强的杀伤效果。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实验材料
1、抗体
TRAIL （CD253）、CD3 、CD14 、CD19 、CD56 、CD11c 、CD205、HLA-DR、HLA-ABC 、CCR7（CD197）、CD40、CD80、CD83、CD86 、CD70 、4-1BBL （CD137L）等抗体均购自biolegend。
2、细胞系
CA-DC1（编号为1的可扩增树突状细胞，构建方法参见WO2019205783， 即通过PHA刺激激活PBMC细胞后，导入含STLV3 Tax基因的慢病毒，进而持续培养并筛选得到具备增殖能力的可扩增DC细胞）
CA-DC1-TRAIL（表达TRAIL的可扩增树突状细胞）
CA-DC2（编号为2的可扩增树突状细胞，构建方法与CA-DC1相同，只是PBMC细胞来自不同人）
CA-DC2-TRAIL（表达TRAIL的可扩增树突状细胞）
A375L（表达荧光素酶的人黑色素瘤细胞系）
U2OSL（表达荧光素酶的人骨肉瘤细胞系）
3T3LA0201（表达荧光素酶和HLA-A0201的小鼠胚胎成纤维细胞）
3T3LA0201-CMV pp65（表达荧光素酶、HLA-A0201和CMV pp65抗原的小鼠胚胎成纤维细胞）
293L（表达荧光素酶的人胚肾细胞）
293L-DR5（表达荧光素酶和死亡受体DR5的人胚肾细胞）
数据分析
以上实验数据均以平均值±标准差（SD）表示，显著性分析均通过t检验得到。P<0.05被认为具有统计学意义上的显著性差异，P<0.01表示有极显著差异。
实施例1 TRAIL、DR5慢病毒制备
1.1 TRAIL及DR5表达载体构建
经第三方公司分别合成TRAIL和DR5编码区引物。TRAIL基因以商品化的淋巴结细胞cDNA为模板克隆获得；DR5基因以A375细胞cDNA为模板克隆获得。两段PCR产物经双酶切后插入慢病毒载体，转化到E.coli，经测序正确后，摇菌、提取质粒备用。
1.2 TRAIL、GFP及DR5分子慢病毒包装
（1）复苏293细胞，培养传代，转染前一天按照5×106个细胞/皿接种于培养皿内，37℃培养箱，培养过夜。
（2）转染：慢病毒包装质粒与目的质粒混合，加入500 μl无血清的RPMI 1640培养基，按质粒：转染试剂PEI20000（质量：体积）比为1:3，室温静置15 min。293细胞提前换新鲜的RPMI1640培养基，将转染混合液轻轻逐滴加入到培养皿内，轻轻均匀，37℃培养。
（3）分别于24 h、48 h、72 h收集病毒。
（4）加入病毒浓缩液，混匀后4℃冰箱静置过夜。
（5）次日离心弃上清，按原来体积1/10的量加入新鲜培养基重悬病毒，分装后-80℃冰箱保存，备用。
实施例2 用于交叉递呈的靶细胞筛选
DC-TRAIL细胞对于不同细胞的敏感性有差异，因此，我们选择了两株肿瘤细胞株A375、U2OS以及一株人胚肾细胞株293细胞，来观察CA-DC细胞对于不同细胞的裂解情况以及抗原摄取状况。由于293细胞不是肿瘤细胞，因此其死亡受体DR5并不表达，因此我们人为将DR5基因转入293细胞后，检测CA-DC-TRAIL对293细胞的裂解情况以及对抗原的摄取状况，以此评价其是否可以作为提供抗原的靶细胞进行应用开发。
2.1 两株肿瘤细胞作为提供抗原的靶细胞的对比检测
2.1.1 DC-TRAIL以及靶细胞构建
（1）取1×106个DC细胞（CA-DC）接种于6孔板内。配置浓缩后的TRAIL病毒混合液，加入到细胞内培养，6小时后，换新鲜的1640完全培养基。
（2）重复步骤（1）2次，培养细胞至足够数量。
（3）收集慢病毒感染后的DC细胞经流式细胞术检测确证TRAIL分子表达(图1)。
（4）A375L、U2OSL细胞按5×105个细胞分别接种于6孔板内，贴壁3小时。配置浓缩后的GFP病毒液（含10ug/ml聚凝胺），加入到细胞内培养，6小时后，换新鲜的1640完全培养基。
（5）重复步骤（4），GFP病毒液二次转染，经流式细胞术检测确证GFP分子在两株肿瘤细胞中表达。
2.1.2 DC-TRAIL与靶细胞共孵育后抗原摄取情况测试
靶细胞A375L及U2OSL经慢病毒转染后高表达GFP蛋白，分别命名为A375L-GFP和U2OSL-GFP；CA-DC1 及CA-DC2外源性表达TRAIL，分别命名为CA-DC1-TRAIL及CA-DC2-TRAIL。将两株DC细胞扩大培养后分别与两种靶细胞共培养，检测对其GFP抗原肽的摄取情况。具体操作如下：
（1）靶细胞消化，计数，按照8×104个细胞/孔接种于24孔板内，贴壁过夜。
（2）取CA-DC1、CA-DC2、CA-DC1-TRAIL、CA-DC2-TRAIL细胞，计数，按照效靶比例2：1分别将DC细胞加入到靶细胞内，37℃混合培养2h、4h、6h、16h后分别进行流式检测；同时取同样数量的靶细胞裂解液与DC细胞共培养4h后进行流式检测。
（3）轻轻吸取悬浮的DC细胞，用含有EDTA的PBS清洗细胞一次，弃掉上清。
（4）加入含有1% FCS的抗体封闭液冰上封闭10 min后，加入APC-CD86抗体孵育30min，同时设置APC及FITC同型对照。
（5）加入1ml EDTA-PBS清洗细胞两次后，流式细胞仪检测。
高表达TRAIL的DC细胞对外源性高表达GFP靶细胞中GFP蛋白的摄取结果如图2A和2B所示，随着共培养时间的延长，CA-DC1-TRAIL对A375L-GFP中GFP蛋白的摄取也增强，随着共培养时间约30%~80%的梯度增加，相比对照具有显著性差异（图2A）；CA-DC1-TRAIL对U2OSL-GFP中GFP的摄取随着共培养时间的延长也呈现增加的趋势，但相比对A375L-GFP中GFP的摄取能力较弱。CA-DC2-TRAIL细胞对两种靶细胞中GFP抗原的能力随着共培养时间的延长而增强，相比U2OSL-GFP细胞，对A375L-GFP作用更强，在共培养4h时高达85%，相比对照组具有显著性差异（图2B）。意外的是，共培养4h的结果显示，这种抗原摄取方式效率显著优于添加等量肿瘤裂解物的抗原摄取方式（图2A和2B），这初步说明DC细胞摄取肿瘤抗原的能力随着对其杀伤性的增强而增加，并且这种抗原摄取的效率显著高于添加肿瘤裂解物的摄取方式。
2.2 293细胞作为提供抗原的靶细胞的测试
2.2.1 DC-TRAIL以及靶细胞构建
（1）取1×106个DC细胞（CA-DC）接种于6孔板内。配置浓缩后的TRAIL病毒混合液，加入到细胞内培养，6小时后，换新鲜的1640完全培养基。
（2）重复步骤（1）2次，培养细胞至足够数量。
（3）收集慢病毒感染后的DC细胞经流式细胞术检测确证TRAIL分子表达。
（4）293L细胞按5×105个细胞分别接种于6孔板内，贴壁过夜。配置浓缩后的DR5以及GFP病毒液（含10ug/ml聚凝胺），加入到细胞内培养，6小时后，换新鲜的1640完全培养基。
（7）重复步骤（6）1次，培养细胞至足够数量后经western blotting检测DR5表达情况。
2.2.2 DC-TRAIL与靶细胞共孵育后抗原摄取情况测试
靶细胞293L-DR5-GFP，按照2.1.2部分所述方法检测CA-DC1-TRAIL对其GFP抗原肽的摄取情况：
高表达TRAIL的CA-DC1-TRAIL细胞对293L-DR5-GFP细胞中的GFP蛋白的摄取结果如图3所示，随着共培养时间的延长，CA-DC1-TRAIL对GFP蛋白的摄取也增强，共培养16小时，CD86+GFP双阳性细胞占比34.6%，相比对照组仅有9%，具有显著性差异；共培养4h的结果显示，这种抗原摄取效率显著优于添加含等量抗原的细胞裂解物的抗原摄取效率。说明CA-DC1-TRAIL细胞通过肿瘤细胞表面的死亡受体DR5诱导肿瘤细胞凋亡，直接性杀伤肿瘤细胞并摄取肿瘤抗原。
考虑到临床应用的安全性，非肿瘤来源的靶细胞作为抗原提供方较肿瘤细胞来源的靶细胞更好。上述数据表明293细胞可以作为一种提供抗原的靶细胞进行应用。
实施例3 CA-DC细胞经交叉递呈方式诱导生成高特异性T细胞
为了确定CA-DC经交叉递呈方式是否能够更高效的诱导抗原特异性T细胞介导的免疫应答反应，A375L经慢病毒转染后高表达CMV pp65抗原，与CA-DC1-TRAIL共培养，待CA-DC1-TRAIL裂解靶细胞实现抗原交叉递呈后与HLA-A匹配的PBMC细胞共培养，测试CA-DC-TRAIL诱导pp65抗原特异性的T细胞的情况。其操作流程如下：
实验分组情况
CA-DC1-TRAIL+PBMC
CA-DC1-TRAIL+A375L+PBMC
CA-DC1-TRAIL+A375L-pp65+PBMC
CA-DC1-TRAIL+A375L-pp65 lysate+PBMC
（1）靶细胞消化，计数，按照8×104个细胞/孔接种于24孔板内，贴壁过夜。
（2）按照以上分组取CA-DC1-TRAIL，计数，按照效靶比例10：1分别将CA-DC1-TRAIL细胞加入到对应的靶细胞内共培养24h。靶细胞死亡裂解后释放pp65蛋白，收集CA-DC1-TRAIL细胞，无菌1×PBS清洗细胞，900rpm，离心3min，更换成含有5%血清替代物的X-VIVO培养基，37℃培养箱放置5h。
（3）步骤2中的CA-DC1-TRAIL与PBMC（HLA-A0201+）按照1：200在含有5%血清替代物的X-VIVO培养基中共培养，37℃培养过夜。
（4）次日起，每天加入白介素2（200 Unit/ml），轻轻混合后继续培养。
（5）根据细胞生长情况，添加适量的新鲜培养基，维持细胞生长，记录生长情况。
（6）第18天，流式检测免疫表型；若NK含量高于5%，则进行磁珠分选以获得T细胞。
（7）第28天，流式免疫表型检测；通过T细胞与靶细胞共孵育后对靶细胞的杀伤实验检测抗原特异性T细胞的生成情况。
提供抗原的靶细胞A375L经抗原负载后的检测情况如图4A所示。用于检测特异性T细胞杀伤作用的靶细胞3T3LA0201经抗原负载后的情况如图4B所示。
CA-DC1-TRAIL与A375L-pp65细胞或者与其细胞裂解物共培养后，收集CA-DC1-TRAIL后与PBMC共培养诱导产生的CTL杀伤靶细胞的结果如图5所示。对照组CA-DC1-TRAIL直接与PBMC共培养未诱导CMV pp65抗原特异性T细胞，对靶细胞几乎无特异性杀伤作用（图5A）；CA-DC1-TRAIL与空白的A375L共培养后，与PBMC共培养未诱导CMV pp65抗原特异性T细胞，对靶细胞几乎无特异性杀伤性（图5B）；而CA-DC1-TRAIL与A375L-pp65细胞共培后或者与A375L-pp65细胞裂解物共培养后，与PBMC共培养后均能诱导pp65抗原特异性的T细胞；并且，相比A375L-pp65细胞裂解物，前者诱导的特异性T细胞对靶细胞的杀伤性远远高于后者，在效靶比例为2：1时，前者的杀伤性高于70%，后者仅仅20%，二者相比具有显著性差异（平均值±SD），P<0.05（图5C，5D），这说明通过CA-DC1-TRAIL细胞作用于肿瘤细胞的死亡受体，选择性地直接杀伤肿瘤细胞，并摄取癌抗原。这种抗原摄取以及交叉递呈方式效率显著优于添加肿瘤裂解物的抗原摄取及递呈方式，从而极为高效的诱导抗原特异性，HLA限制性的CD8 +T细胞介导的免疫反应。在这个体系，DC细胞以及DC诱导激活的T细胞，均具备高效靶向并杀伤肿瘤细胞的能力。

Claims (14)

1.在体外制备抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：
1) 制备高表达TRAIL的DC细胞；
2) 让所述DC细胞与含有异源抗原并表达TRAIL死亡受体DR5和/或DR4的细胞接触；以及
3) 让所述DC细胞与HLA I类分子匹配的T细胞接触，以获得对所述异源抗原具有特异性的T细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤3)包括让所述DC细胞与PBMC细胞接触，并在白介素2存在下继续培养所述PBMC细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述TRAIL死亡受体为DR5。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述异源抗原为肿瘤抗原或病毒抗原。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述HLA I类分子为HLA-A。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述HLA I类分子为HLA-A0201。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述含有异源抗原并表达TRAIL死亡受体DR5和/或DR4的细胞为肿瘤细胞或非肿瘤细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述含有异源抗原并表达TRAIL死亡受体DR5和/或DR4的细胞为经改造而表达所述异源抗原。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述非肿瘤细胞为293细胞。
10.非肿瘤细胞在体外制备抗原特异性T细胞中的用途，其中所述非肿瘤细胞经改造而表达TRAIL死亡受体DR5和/或DR4以及异源抗原。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述非肿瘤细胞为293细胞。
12.如权利要求10或11所述的用途，其中所述TRAIL死亡受体为DR5。
13.如权利要求10或11所述的用途，其中所述异源抗原为肿瘤抗原或病毒抗原。
14.权利要求1-9任一项所述的方法制备的抗原特异性T细胞在制备治疗CMV感染的药物中的用途。
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