CN116942737A

CN116942737A - 一种中药组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116942737A
Application number: CN202210382202.1A
Authority: CN
Inventors: 肖伟; 刘文君; 董自艳; 顾莎莎; 章晨峰; 王团结; 曹亮; 王振中
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2023-10-27
Also published as: US20250241975A1; EP4509131A1; WO2023197731A1; EP4509131A4

Abstract

本发明涉及一种中药组合物，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍提取得到的活性成分，以质量百分比计，所述活性成分包括：没食子酸含量为0.214％以上，4‑羟基苯甲酸含量为0.008％以上，氧化芍药苷含量为0.083％以上，芍药苷含量为1.112％以上，没食子酸乙酯含量为0.010％以上，1,2,3,4,6‑O‑五没食子酰葡萄糖含量为0.155％以上，苯甲酸含量为0.041％以上，肉桂酸含量为0.015％以上，苯甲酰芍药苷含量为0.093％以上，桂皮醛含量为0.037％以上，丹皮酚含量为0.622％以上，苦杏仁苷含量为1.001％以上，大类成分水溶性多糖含量为1.743％以上，碱溶性多糖含量为29.671％以上，单糖和双糖总含量为9.231％以上。

Description

一种中药组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种中药组合物及其制备方法和应用。

背景技术

桂枝茯苓胶囊处方源自汉代名医张仲景《金匮要略》中的经典方剂桂枝茯苓丸，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍5味中药组成，具有活血、化瘀、消癥的功效，用于妇女瘀血阻络所致癥块、经闭、痛经、产后恶露不尽；子宫肌瘤，慢性盆腔炎包块，痛经，子宫内膜异位症，卵巢囊肿见上述证候者；也可用于女性乳腺囊性增生病属瘀血阻络证，证见乳房疼痛、乳房肿块、胸肋胀闷；或用于前列腺增生属瘀阻膀胱证，证见小便不爽，尿细如线、或点滴而下、小腹胀痛者。

专利申请号：200310116836.X，公开了一种桂枝茯苓组合物在治疗前列腺增生和乳腺的药物中的应用。配方由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍五味中药等比例组成，试验表明，上述复方组合物在治疗前列腺增生和乳腺增生上具有良好药效。

然而，对于中药复方而言，复杂体系中有效成分不明确，哪些主要成分对疗效有明显的影响作用，其合理的优选含量范围是多少，需要对不同有效成分的范围进行合理控制。而且，其原料大多来源于天然产物，受产地、生长时限、采收时节、种植加工技术等因素的影响，药材质量高度变异，即使在药材原料均符合药典规定的前提下，不同产地、批次的药材原料仍会由于有效成分的差异导致不同批次制剂成分不稳定、质量一致性差，可见，仅有药材重量的处方无法满足现代中成药的生产要求，严重制约中医药临床疗效的稳定可控及现代研究结果的可重复性和被认可度。

发明内容

本发明旨在对桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍五味中药组成的中药复方进行进一步研究，通过不同产地、批次药材组配中药复方进行成分分析和药效试验，关注该中药组方中含量差异波动较大的主要成分与药效试验效果的关系，寻找出能影响药效的具体活性成分及适宜含量，筛选出活性更强的中药组合物，保障中成药产品的质量稳定、疗效可靠。

有鉴于此，本发明提出了一种中药组合物，其特征在于，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍提取得到的活性成分，以质量百分比计，所述活性成分包括：没食子酸含量约为0.214％以上，4-羟基苯甲酸含量约为0.008％以上，氧化芍药苷含量约为0.083％以上，芍药苷含量约为1.112％以上，没食子酸乙酯含量约为0.010％以上，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖含量约为0.155％以上，苯甲酸含量约为0.041％以上，肉桂酸含量约为0.015％以上，苯甲酰芍药苷含量约为0.093％以上，桂皮醛含量约为0.037％以上，丹皮酚含量约为0.622％以上，苦杏仁苷含量约为1.001％以上，大类成分水溶性多糖含量约为1.743％以上，碱溶性多糖含量约为29.671％以上，单糖和双糖总含量约为9.231％以上。

优选地，没食子酸含量为0.433％-0.740％，4-羟基苯甲酸含量为0.011％-0.054％，氧化芍药苷含量为0.097％-0.201％，芍药苷含量为1.235％-1.991％，没食子酸乙酯含量为0.012％-0.094％，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖含量为0.294％-0.702％，苯甲酸含量为0.045％-0.135％，肉桂酸含量为0.021％-0.062％，苯甲酰芍药苷含量为0.101％-0.236％，桂皮醛含量为0.045％-0.511％，丹皮酚含量为0.728％-1.202％，苦杏仁苷含量1.114％-1.492％，水溶性多糖含量为1.851％-3.702％，碱溶性多糖含量为30.198％-40.206％，单糖和双糖总含量为9.966％-15.438％。

根据本发明的另一实施方式，本发明组合物中，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍提取得到的活性成分的比例关系为：没食子酸0.433-0.740，4-羟基苯甲酸0.011-0.054，氧化芍药苷含量0.097-0.201，芍药苷1.235-1.991，没食子酸乙酯0.012-0.094，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖0.294-0.702，苯甲酸0.045-0.135，肉桂酸0.021-0.062，苯甲酰芍药苷0.101-0.236，桂皮醛0.045-0.511，丹皮酚0.728-1.202，苦杏仁苷1.114-1.492，水溶性多糖1.851-3.702，碱溶性多糖30.198-40.206，单糖和双糖9.966-15.438。

具体地，所述中药组合物可为任选的制剂形式，包括但不限于提取物、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂。

可选地，所述中药组合物的制备方法包括：桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍药材按复方重量配比1:1:1:1:1称取原料药；以上五味，取80％处方量的茯苓粉碎；牡丹皮用水蒸气蒸溜，收集蒸溜液，分取挥发性成分，备用；药渣与桂枝、白芍、桃仁及剩余的20％处方量的茯苓用90％乙醇提取二次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩；药渣再加水煎煮二次，滤过，合并滤液，减压浓缩，上述二种浓缩液，与茯苓细粉混匀，干燥，粉粹，加入牡丹皮挥发性成分，混匀。

可选地，所述中药组合物的制备方法包括：桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍药材按复方重量配比1:1:1:1:1称取原料药；取桂枝、桃仁、白芍、牡丹皮及50％处方量的茯苓碎成粗粉，混匀加入药材3倍量的90％乙醇，浸泡0.5小时，加热回流1小时，滤过；药渣再加入原药材3倍量的90％乙醇，回流提取，滤过，合并滤液；药渣加入原药材5倍量的水，回流提取0.5小时，滤过；药渣加入原药材5倍量的水，回流提取0.5小时，滤过；合并滤液，药渣弃之；醇提液和水提液分别减压浓缩，醇提液回收至无醇味；合并二浓缩液，得棕褐色浸膏；将另50％处方量的茯苓细粉与上述浸膏混匀，干燥，粉碎，得干膏粉，将所述干膏粉加入辅料。

本发明还提出了上述中药组合物在制备改善痛经的药物中的应用。

所述“应用”是指将上述提取物给予具有相应疾病或该疾病的倾向的受试者，其目的为赋予治疗效果，例如治愈、缓解、改变、影响、改善或预防上述疾病、其症状或其倾向。本领域技术人员，能根据所治疗的疾病的类型、给药途径、赋形剂的使用容易确定具体的有效剂量，该剂量可能会因为同时使用其它药物而有所差异。

本发明利用鼠模型，证实了上述提取物能显著改善原发性痛经等痛经症状。

上述成分含量关系同时为该中药组合物的质量控制提供依据，即本发明提出了上述中药组合物的质量控制方法，其特征在于，所述活性成分中：没食子酸含量约为0.214％以上，4-羟基苯甲酸含量约为0.008％以上，氧化芍药苷含量约为0.083％以上，芍药苷含量约为1.112％以上，没食子酸乙酯含量约为0.010％以上，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖含量约为0.155％以上，苯甲酸含量约为0.041％以上，肉桂酸含量约为0.015％以上，苯甲酰芍药苷含量约为0.093％以上，桂皮醛含量约为0.037％以上，丹皮酚含量约为0.622％以上，苦杏仁苷含量约为1.001％以上，大类成分水溶性多糖含量约为1.743％以上，碱溶性多糖含量约为29.671％以上，单糖和双糖总含量约为9.231％以上。

进一步地，上述活性成分的比例关系为：没食子酸0.433-0.740，4-羟基苯甲酸0.011-0.054，氧化芍药苷含量0.097-0.201，芍药苷1.235-1.991，没食子酸乙酯0.012-0.094，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖0.294-0.702，苯甲酸0.045-0.135，肉桂酸0.021-0.062，苯甲酰芍药苷0.101-0.236，桂皮醛0.045-0.511，丹皮酚0.728-1.202，苦杏仁苷1.114-1.492，水溶性多糖1.851-3.702，碱溶性多糖30.198-40.206，单糖和双糖9.966-15.438。

进一步地，上述中药组合物所用桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍的图谱在表5-表9数据范围内，或者分别和表5-表9相比，相似度不低于0.90，优选0.95。

本发明通过研究中药组合物活性成分对小鼠扭体以及血清雌二醇(E2)，孕酮(P)含量的影响，表明特定活性成分含量特征的中药组合物具有更好的改善慢性盆腔炎、子宫内膜异位症、痛经的治疗效果，上述活性成分含量特征可用于该中药组合物的质量控制。

附图说明

图1为桂枝药材指纹图谱；

图2为茯苓药材指纹图谱；

图3为牡丹皮药材指纹图谱；

图4为白芍药材指纹图谱；

图5为桃仁药材指纹图谱。

具体实施方式

如前所述，本发明旨在提供一种中药组合物、制备方法、应用及质量控制方法。以下将结合实验例的内容进行具体描述。

特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明中，中药组合物中主成分的含量测定方法具体如下：

供试品溶液1的制备取本品内容物(过四号筛)约0.25g，精密称定，分别以50％甲醇25mL为提取溶剂，平行提取2份，超声30min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，14000r/min下离心5min，取上清液即得供试品溶液1(含内容物约10mg/mL)。

供试品溶液2的制备取本品内容物(过四号筛)约0.5g，精密称定，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，回流提取30min，室温放冷，用甲醇补重，摇匀，14000r/min下离心5min，上清液即为供试品溶液2(含内容物约20mg/mL)。

(1)桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、桂皮醛、肉桂酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、4-羟基苯甲酸、没食子酸乙酯、苯甲酸和苦杏仁苷的含量测定

分别利用HPLC-DAD法和HPLC-UV-ELSD联用法建立了制剂中12个主成分(芍药苷、丹皮酚、桂皮醛、肉桂酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、4-羟基苯甲酸、没食子酸乙酯、苯甲酸和苦杏仁苷)含量测定方法，通过专属性、系统适用性、方法学和耐用性等多方面的考察证明所建立方法可靠，适用性好。

苦杏仁苷含量测定方法：

对照品溶液的制备：精密称取苦杏仁苷10mg置10mL量瓶中，加入70％甲醇溶液少许，超声溶解，放冷后，加甲醇定容至刻度，摇匀，得对照品储备液。再精密移取2mL储备液，置10mL量瓶中，70％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照品溶液。

色谱条件

选用Thermo acclaim^TM120C₁₈(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相：甲醇(B)-水(A)，梯度洗脱：0～20min(82％B)，20～25min(82～5％B)，25～30min(5～5％B)；流速1mL·min^-1，柱温35℃，检测波长210nm；

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液1各10μL，注入高效液相色谱仪，按照外标一点法计算即得。

11个主成分(芍药苷、丹皮酚、桂皮醛、肉桂酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、4-羟基苯甲酸、没食子酸乙酯、苯甲酸)的含量测定：

对照品溶液的制备

1)没食子酸、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、丹皮酚、桂皮醛混合对照品溶液的制备

精密称量没食子酸10mg，芍药苷25mg，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖6mg，丹皮酚12mg，一同置于25mL量瓶中。精密称量8mg桂皮醛于10mL的量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，从中精密移取2mL置前述的25mL的量瓶中，50％甲醇定容至刻度，即得没食子酸、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、丹皮酚、桂皮醛混合对照品2。取混合对照品溶液用50％甲醇稀释4倍对照品溶液3。

2)氧化芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、没食子酸乙酯、肉桂酸、4-羟基苯甲酸混合对照品溶液的制备

精密称取氧化芍药苷10mg，苯甲酸7.5mg，苯甲酰芍药苷15mg，置于25mL的量瓶中，精密称量没食子酸乙酯15mg，肉桂酸12mg，4-羟基苯甲酸10mg，置于10mL的量瓶中，50％甲醇溶解并定容，摇匀，从中精密移取2mL置前述25mL容量瓶中，50％甲醇定容至刻度，摇匀，即得氧化芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、没食子酸乙酯、肉桂酸、4-羟基苯甲酸混合对照品4。取混合对照品溶液3用50％甲醇稀释4倍对照品溶液5。

色谱条件

选用Thermo Acclaim^TM120C₁₈色谱柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：乙腈(B)-0.2％甲酸水(A)，梯度洗脱：0～11min(3～3％B)，11～15min(3～10％B)，15～28min(10～15％B)，28～29min(15～16％B)，29～39min(16～20％B)，39～45min(20～23％B)，45～47min(23～23％B)，47～51min(23～35％B)，51～71min(35～43％B)，71～76min(43～95％B)，76～80min(95％B)。流速：1mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：230nm(芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷)、254nm(4-羟基苯甲酸、氧化芍药苷)、275nm(没食子酸、没食子酸乙酯、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、肉桂酸、丹皮酚)、290nm(桂皮醛)。

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液2各10μL，注入高效液相色谱仪，按照外标两点法计算即得。

(2)多糖的含量测定

a.优化建立了多糖含量测定的方法——蒽酮-硫酸显色法的最佳条件为：显色剂中硫酸的浓度为85％，测定波长为621nm，沸水浴加热显色时间为15分钟，经显色后的溶液在120分钟内稳定且标准曲线的线性关系良好。b.通过单因素考察优化了水溶性多糖供试品溶液的制备条件，包括除杂方法的考察、提取方法和精制方法的考察。通过70％乙醇超声处理除去桂枝茯苓胶囊中脂溶性小分子、单糖寡糖和β-环糊精等影响水溶性多糖测定结果的杂质，并照除杂方法处理分子量为50000、270000、670000Da的葡聚糖标准品，验证70％乙醇除杂方法几乎不会对多糖造成损失。c.通过单因素考察优化了碱溶性多糖的制备条件，包括提取方法和精制方法的考察。并经系统的方法学验证，证明本含量测定方法的可行性。

水溶性多糖供试品溶液的制备：

本品内容物，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇50mL，超声处理(300W，50HZ)20分钟，离心(4500r/min，10min)，弃去上清液，沉淀物再用70％乙醇50mL，同法提取2次。取沉淀物，加水50mL，回流提取60分钟，离心(4500r/min，10min)，分取上清液，沉淀物再用水50mL，同法提取2次，合并3次上清液，60℃以下减压浓缩至约5mL，边搅拌边缓慢滴加乙醇20mL，摇匀，冷藏12小时，离心(4500r/min，10min)，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至100mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

碱溶性多糖供试品溶液的制备：

取水溶性多糖供试品溶液制备方法提取后的沉淀物，同“本品内容物，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇50mL，超声处理(300W，50HZ)20分钟，离心(4500r/min，10min)，弃去上清液，沉淀物再用70％乙醇50mL，同法提取2次。取沉淀物，加水50mL，回流提取60分钟，离心(4500r/min，10min)，分取上清液，沉淀物再用水50mL，同法提取2次”，加1mol/L NaOH溶液50mL，超声处理(300W，50HZ)30分钟，离心(4500r/min，10min)，分取上清液，沉淀物再用1mol/L NaOH水溶液50mL，同法提取2次，合并3次上清液，用5mol/L HCL调pH约为5，冷藏12小时，离心(4500r/min，10min)，弃去上清液，沉淀物用1mol/LNaOH溶液溶解并转移至100mL量瓶中，加1mol/L NaOH溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置100mL量瓶中，加1mol/L NaOH溶液至刻度，摇匀，即得。

(3)单糖双糖含量测定研究

优化建立了单糖双糖含量测定的色谱条件为：XBridge Amide色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以0.2％三乙胺-乙腈(15:85)为流动相等度洗脱，柱温45℃，流速1mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器(漂移管温度95℃，载气流速2.5L/min)。考察优化了供试品溶液制备的条件，并经系统的方法学验证，证明本方法的可行性。

实施例1：中药组合物的制备

1.原料组成：桂枝240g，茯苓240g，牡丹皮240g，白芍240g，桃仁240g,制成1000粒。

2.制备工艺：以上五味，取茯苓192g粉碎成细粉；牡丹皮用水蒸气蒸溜，收集蒸溜液，分取挥发性成分，备用；药渣与桂枝、白芍、桃仁及剩余的茯苓用90％乙醇提取二次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至适量；药渣再加水煎煮二次，滤过，合并滤液，减压浓缩至适量，上述二种浓缩液，与茯苓细粉混匀，干燥，粉碎，加入适量的糊精，制颗粒，干燥，加入牡丹皮挥发性成分，混匀，装入胶囊，制成1000粒(每粒装0.31g)，即得。

选用符合药典规定的不同产地、批次的药材组合，共制备12批次中药组合物，经检测各批次具体含量见表1：

表1 12批中药组合物胶囊内容物主要成分含量(％，100g内容物的主要成分g数)

实施例2：12批中药组合物对痛经大鼠的实验研究

1.材料

1.1药品与试剂

本发明制备例一制得的12批样品；苯甲酸雌二醇注射液(批号：200507，厂家：上海全宇生物科技(驻马店)动物药业有限公司)；缩宫素注射液(批号：20200505，厂家：江西博莱大药厂有限公司)；0.9％氯化钠注射液(批号：2011262011，厂家：石家庄四药有限公司)；PGE2试剂盒(货号：E-EL-0034c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；PGF2α试剂盒(货号：E-EL-R0795c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；COX-2试剂盒(货号：H200，南京建成生物工程研究所)。

1.2动物

SD大鼠，雌性，SPF级，体重200±10g，购于苏州大学实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2014-0030。大鼠饲养于标准实验室的条件下，室温22±2℃，湿度60±5％，昼夜交替(12h光照12h黑暗)。

1.3仪器

酶标仪：Molecular Devices公司；

移液器：Eppendorf公司；

离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：L530。

1.4统计学方法

实验数据用表示，所有数据用SPSS17.0软件进行分析。采用方差分析统计，P＜0.05有统计学差异。

2.实验方法

2.1动物分组及给药

将140只大鼠随机分14组，分别为空白组、模型组，本发明12个样品组，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠连续10天每天皮下注射雌二醇(第1、10两天皮下注射0.5mg，其余为0.2mg，从第5天开始，灌胃给予样品药)。第10天灌胃各组相应药物45min后，各组大鼠腹腔注射缩宫素为2U，出现扭体反应即原发性痛经大鼠模型复制成功。其中，空白组和模型组每天灌胃生理盐水10mL/kg。

2.2检测指标：

以扭体反应为大鼠痛经疼痛程度的指标。最后1次大鼠药物灌胃45min后，除空白组外，每只大鼠腹腔注射缩宫素0.2mL/只，观察记录30min内扭体动物扭体次数、各组平均扭体次数。

大鼠麻醉后，背部固定，解剖大鼠暴露子宫，取出子宫体部，用生理盐水冲洗1-2次，加入10倍量的生理盐水，研磨成组织匀浆，离心后取上清液，置于-20℃低温冰箱中保存待测。

实验前禁食12小时，大鼠麻醉后，取血，3000转/分，离心15min，取血清进行检测。

3.实验结果

3.1本发明样品对大鼠扭体的影响

观察30min内扭体次数。结果见表2。

表2本发明样品对扭体次数的影响(n＝10)

*与模型组比较P<0.05，**与模型组比较P<0.01；

#与空白组比较P<0.05，##与空白组比较P<0.01。

表2显示与模型组相比，本发明样品各样品组的大鼠扭体次数均有不同程度下降，其中A、C、D、F、H组与模型组比较下降明显，且P<0.01。

3.2本发明样品对大鼠子宫中PGF2α和PGE2的影响

取组织匀浆上清液进行PGF2α和PGE2的含量测定。结果见表3。

表3各组对原发性痛经大鼠模型子宫中PGF2α和PGE2含量的影响(n＝10)

*与模型组比较P<0.05，**与模型组比较P<0.01；

#与空白组比较P<0.05，##与空白组比较P<0.01。

结果表明，模型组PGF2α水平升高、PGE2水平降低，与正常组比较，P<0.01；与模型组相比，本发明各样品组中A、C、D、F、L组与模型组比，均有显著性差异，两个指标的P值均<0.01。

3.2本发明样品对大鼠血清中COX-2的影响

取血清进COX-2的含量测定。结果见表4。

表4各组对原发性痛经大鼠模型中COX-2含量的影响(n＝10)

*与模型组比较P<0.05，**与模型组比较P<0.01；

#与空白组比较P<0.05，##与空白组比较P<0.01。

结果表明，模型组COX-2水平升高，与正常组比较，P<0.01；与模型组相比，本发明各样品组中A、C、D、F、L组与模型组比，均有显著性差异，P值<0.01。

4结论

本发明制备的12批样品可不同程度的降低扭体次数、降低PGF2α和COX-2含量和升高PGE2含量，其中以A、C、D、F组样品对扭体次数和PGF2α、COX-2、PGE2含量的影响均有显著性差异(P<0.01)，因此根据上述实验结果，优选出能改善原发性痛经的药效最佳的含量范围应为：主成分没食子酸含量为(0.433％-0.740％)，4-羟基苯甲酸含量含量为(0.011％-0.054％)，氧化芍药苷含量含量为(0.097％-0.201％)，芍药苷含量为(1.235％-1.991％)，没食子酸乙酯含量为(0.012％-0.094％)，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖含量为(0.294％-0.702％)，苯甲酸含量为(0.045％-0.135％)，肉桂酸含量为(0.021％-0.062％)，苯甲酰芍药苷含量为(0.101％-0.236％)，桂皮醛含量为(0.045％-0.511％)，丹皮酚含量为(0.728％-1.202％)，苦杏仁苷含量(1.114％-1.492％)，水溶性多糖含量为(1.851％-3.702％)，碱溶性多糖含量为(30.198％-40.206％)，单糖和双糖总含量为(9.966％-15.438％)。

实施例3：制定内控标准

根据上述药效优选样品，我们回溯药材原料的成分含量特征，建立相关的药材指纹图谱作为内控标准，并完善制备工艺，保障了产品质量提升、均一稳定。

1、建立桂枝药材内控标准：

色谱条件与系统适用性：以十八烷基键合为填充剂(色谱柱：Luna C18，4.6×250mm，5μm)，以0.02％三氟乙酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长275nm，理论板数按桂皮醛色谱峰计算不得低于3000，洗脱程序见下表：

参照物溶液的制备取桂皮醛对照品适量，精密称定，桂皮醛对照品适量，精密称定，加乙醇分别配制成每1ml含105g的对照品溶液。

供试品溶液的制备本品粉末(过四号筛)约0.25g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，回流提取40min，放冷，称重，加70％乙醇并补足减失重量，摇匀，离心，取上清液作为供试品。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

本品指纹图谱的主要特征：应呈现6个与对照指纹图谱相对应的特征峰，相对保留时间与相对峰面积符合表5规定。

1香豆素，2肉桂醇，3肉桂酸，42-甲氧基肉桂酸，S桂皮醛，52-甲氧基肉桂醛。

表5桂枝药材指纹图谱特征

2、建立茯苓药材内控标准：

色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil 100-3.5-C18(4.6×150mm))，以0.1％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长210nm，理论板数按茯苓酸色谱峰计算不得低于3000，洗脱程序见下表。

参照物溶液的制备取茯苓酸对照品溶液适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含450μg的对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品粉碎，过四号筛，取约3g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，超声(500W，40Hz)超声30分钟，用滤纸过滤，取滤液，蒸干，加入适量甲醇溶解，定容至5ml，离心，取上清液作为供试品溶液。

本品指纹图谱的主要特征：应呈现16个与对照指纹图谱相对应的特征峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。同时满足相对保留时间和相对峰面积要求，见表6。

表6茯苓药材指纹特征

积分条件：4分钟之前不积分。

3、建立牡丹皮药材内控标准：

色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters SymmetryC18(4.6×250mm)；以0.02％三氟乙酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；理论塔板数按参照物(芍药苷)峰计算不得低于4000。检测波长：230nm。洗脱程序见下表：

参照物溶液的制备取芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚分别为100μg、30μg、200μg的混合对照品溶液，即得。以丹皮酚为参照物。

供试品溶液的制备本品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量，水浴回流30分钟，放冷，称重，加入50％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心(12000rpm，5min)，取上清液作为供试品溶液。

本品指纹图谱的主要特征：应呈现6个与对照指纹图谱相对应的特征峰，相对保留时间与相对峰面积符合表7规定。

表7牡丹皮指纹图谱特征

4、建立白芍药材内控标准：

参照物溶液的制备取芍药苷、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含芍药苷、苯甲酰芍药苷分别为100μg、30μg的混合对照品溶液，即得。以芍药苷为参照物。

供试品溶液的制备取白芍中粉约0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量，水浴回流40分钟，放冷，称重，加入50％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心(12000rpm，5min)，取上清液作为供试品溶液。

本品指纹图谱的主要特征：应呈现7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，相对保留时间与相对峰面积符合表8规定。

表8白芍药材指纹图谱特征

含量测定：参照高效液相色谱法(USP621)测定。方法同指纹图谱。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

5、建立桃仁药材内控标准：

色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水溶液为流动相A，甲醇为流动相B；理论塔板数按参照物(苦杏仁苷)计算不得低于3000。检测波长：218nm，洗脱程序见下表：

参照物溶液的制备取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含600μg的溶液，以苦杏仁苷溶液为参照物。

供试品溶液的制备取本品适量，全部研细过二号筛，混匀后，取约0.5g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，回流提取30分钟，放冷，称重，加70％甲醇补足减失的重量，摇匀，取适量离心，取离心液作为供试品溶液。

本品指纹图谱的主要特征：应呈现4个与对照指纹图谱相对应的特征峰，相对保留时间与相对峰面积符合表9规定。

表9桃仁指纹图谱特征

6、验证试验

选用不同产地、批次的药材，经检验符合上述内控标准，组合按上述标准选择原料、以及前述工艺和方法制备和测定10批次中药组合物，检测相关成分含量，结果如下：

10批次中药组合物胶囊内容物主成分含量(％)测定结果

结果表明，符合前述的内控标准和制备方式所得到的组合物有效成分含量稳定，表明其具有稳定的疗效。

以上仅是本发明的实施方式示范性说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种中药组合物，其特征在于，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍提取得到的活性成分，以质量百分比计，所述活性成分包括：没食子酸含量为0.214％以上，4-羟基苯甲酸含量为0.008％以上，氧化芍药苷含量为0.083％以上，芍药苷含量为1.112％以上，没食子酸乙酯含量为0.010％以上，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖含量为0.155％以上，苯甲酸含量为0.041％以上，肉桂酸含量为0.015％以上，苯甲酰芍药苷含量为0.093％以上，桂皮醛含量为0.037％以上，丹皮酚含量为0.622％以上，苦杏仁苷含量为1.001％以上，大类成分水溶性多糖含量为1.743％以上，碱溶性多糖含量为29.671％以上，单糖和双糖总含量为9.231％以上。

2.根据权利要求1所述中药组合物，其特征在于，所述活性成分包括：没食子酸含量为0.433％-0.740％，4-羟基苯甲酸含量为0.011％-0.054％，氧化芍药苷含量为0.097％-0.201％，芍药苷含量为1.235％-1.991％，没食子酸乙酯含量为0.012％-0.094％，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖含量为0.294％-0.702％，苯甲酸含量为0.045％-0.135％，肉桂酸含量为0.021％-0.062％，苯甲酰芍药苷含量为0.101％-0.236％，桂皮醛含量为0.045％-0.511％，丹皮酚含量为0.728％-1.202％，苦杏仁苷含量1.114％-1.492％，水溶性多糖含量为1.851％-3.702％，碱溶性多糖含量为30.198％-40.206％，单糖和双糖总含量为9.966％-15.438％。

3.一种中药组合物，其特征在于，包含桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍提取得到的活性成分，所述活性成分的比例关系为：没食子酸0.433-0.740，4-羟基苯甲酸0.011-0.054，氧化芍药苷含量0.097-0.201，芍药苷1.235-1.991，没食子酸乙酯0.012-0.094，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖0.294-0.702，苯甲酸0.045-0.135，肉桂酸0.021-0.062，苯甲酰芍药苷0.101-0.236，桂皮醛0.045-0.511，丹皮酚0.728-1.202，苦杏仁苷1.114-1.492，水溶性多糖1.851-3.702，碱溶性多糖30.198-40.206，单糖和双糖9.966-15.438。

4.根据权利要求1-3所述的中药组合物，其特征在于，该中药组合物为任选的制剂形式。

5.根据权利要求4所述的中药组合物，其特征在于，所述制剂形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂。

6.一种如权利要求4或5所述中药组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍药材按复方重量配比1:1:1:1:1称取原料药；以上五味，取80％处方量的茯苓粉碎；牡丹皮用水蒸气蒸溜，收集蒸溜液，分取挥发性成分，备用；药渣与桂枝、白芍、桃仁及剩余的20％处方量的茯苓用90％乙醇提取二次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩；药渣再加水煎煮二次，滤过，合并滤液，减压浓缩，上述二种浓缩液，与茯苓细粉混匀，干燥，粉碎，加入牡丹皮挥发性成分，混匀。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述口服制剂为胶囊剂，所述制备方法包括：所述两种浓缩液与所述茯苓细粉混匀干燥后得干膏粉，加入糊精制粒干燥，再加入所述牡丹皮挥发性成分装入胶囊。

8.一种如权利要求4或5所述中药组合物的制备方法，其特征在于，所述中药组合物的制备方法包括：桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍药材按复方重量配比1:1:1:1:1称取原料药；取桂枝、桃仁、白芍、牡丹皮及50％处方量的茯苓碎成粗粉，混匀加入药材3倍量的90％乙醇，浸泡0.5小时，加热回流1小时，滤过；药渣再加入原药材3倍量的90％乙醇，回流提取，滤过，合并滤液；药渣加入原药材5倍量的水，回流提取0.5小时，滤过；药渣加入原药材5倍量的水，回流提取0.5小时，滤过；合并滤液，药渣弃之；醇提液和水提液分别减压浓缩，醇提液回收至无醇味；合并二浓缩液，得棕褐色浸膏；将另50％处方量的茯苓细粉与上述浸膏混匀，干燥，粉碎，得干膏粉。

9.权利要求1-3任一所述的中药组合物在制备改善痛经的药物中的应用。

10.一种权利要求1-5任一所述的中药组合物的质量控制方法，其特征在于，以质量百分比计，没食子酸含量约为0.214％以上，4-羟基苯甲酸含量约为0.008％以上，氧化芍药苷含量约为0.083％以上，芍药苷含量约为1.112％以上，没食子酸乙酯含量约为0.010％以上，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖含量约为0.155％以上，苯甲酸含量约为0.041％以上，肉桂酸含量约为0.015％以上，苯甲酰芍药苷含量约为0.093％以上，桂皮醛含量约为0.037％以上，丹皮酚含量约为0.622％以上，苦杏仁苷含量约为1.001％以上，大类成分水溶性多糖含量约为1.743％以上，碱溶性多糖含量约为29.671％以上，单糖和双糖总含量约为9.231％以上。