CN116942652A - 基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及老年病治疗领域，具体涉及一种基质金属蛋白酶抑制剂——MSAB或其药学上可接受的盐，在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用。本发明采用MSAB抑制软骨细胞中基质金属蛋白酶的表达，减少了关节软骨结构的破坏，达到了预防或治疗骨关节炎的效果。

Description

基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤 药物中的应用

技术领域

本发明涉及老年病治疗领域，具体涉及一种基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用。

背景技术

骨关节炎是一种由关节软骨以及软骨下骨组织进行性破坏引起的慢性退行性疾病，其病理特征表现为关节软骨破坏、活动受限、骨赘形成以及慢性疼痛等。目前，骨关节炎的治疗途径主要为人工关节置换术，但该方法存在一些问题：手术风险较高，如感染、出血、血栓形成等；术后可能出现假体松动、脱位等并发症；假体寿命有限，可能需要再次手术更换假体；治疗需要大量医疗设备和医护人员参与，费用较高，会对患者的经济造成较大负担等。

因此，亟需开发一种可以有效治愈骨关节炎的药物。而药物的开发基于对疾病分子机制的理解和探索，但关于骨关节炎的发生和发展人们仍然知之甚少，使得现今并未研发出能够有效治疗骨关节炎的药物。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，解决上述背景技术中的至少一种缺陷。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用，所述基质金属蛋白酶抑制剂为3-{[(4-甲基苯基)磺酰基]氨基}苯甲酸甲酯或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，所述基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制基质金属蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4和/或Adamts5的表达，实现了骨关节炎软骨损伤的预防或治疗。

在一些实施例中，所述基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制WNT/β-catenin信号通路的激活，实现了基质金属蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4和/或Adamts5表达的抑制。

在一些实施例中，所述基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制半月板的钙化和/或滑膜组织的新生，实现了骨关节炎软骨损伤的预防或治疗。

在一些实施例中，所述基质金属蛋白酶抑制剂的有效浓度为15mg/kg体重。

本发明的有益效果是，将3-{[(4-甲基苯基)磺酰基]氨基}苯甲酸甲酯作为一种潜在的药物小分子，应用于骨关节炎软骨损伤的治疗场景下。该药物通过抑制基质金属蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4以及Adamts5的表达，有效抑制了骨关节炎进程中的软骨结构损伤，为骨关节炎的指导治疗提供了重要参考。

附图说明

图1为3-{[(4-甲基苯基)磺酰基]氨基}苯甲酸甲酯的化学结构式；

图2为一种实施例中的ATDC-5细胞中β-catenin信号通路下游基因的qPCR检测结果，其中图2A和2B分别表示Axin2和Dkk1的mRNA表达水平；

图3为一种实施例中的ATDC-5细胞的细胞外基质相关分子的qPCR检测结果，其中图3A到3D分别表示金属基质蛋白酶基因Mmp3、Mmp13、Adamts4、Adamts5的mRNA转录水平；

图4为一种实施例中的骨关节炎小鼠造模与治疗流程图；

图5为一种实施例中的小鼠膝关节Micro-CT的3D重建图像；

图6为一种实施例中的小鼠膝关节骨赘体积统计图；

图7为一种实施例中的小鼠膝关节番红O-固绿染色图像；

图8为一种实施例中的小鼠膝关节退行性改变评分图，其中图8A-8E分别表示OARSI评分、软骨面积、滑膜炎评分、骨赘大小、骨赘成熟度。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明，应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在以往的研究中，人们发现Indianhedgehog、TGF-β等多条信号通路可以通过直接或间接影响软骨中的合成代谢和分解代谢，来参与骨关节炎的病理进程调控。其中，Wnt/β-catenin信号通路作为一种重要的细胞信号传导途径，被证明其异常活性是骨关节炎的重要易感因素。有研究表明，异常激活软骨细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，会导致关节软骨厚度的降低、软骨基质的降解以及软骨细胞的肥大与凋亡。同时，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活也是膝、髋、下颌关节和椎间盘关节中的重要病理表型。

在Wnt/β-catenin信号通路的相关的分子机制研究中，人们发现该通路的关键成分包括Wnt蛋白、β-catenin、Frizzled受体和LDL受体相关蛋白等。正常情况下，Wnt通路处于不活跃状态，β-catenin被磷酸化并被降解。当Wnt蛋白与Frizzled受体和LDL受体相关蛋白相结合，Axin和GSK-3β被激活，进而抑制β-catenin的降解，导致β-catenin在胞浆中积累并进入细胞核。在细胞核中，β-catenin与TCF/LEF结合形成复合物，进而激活Wnt/β-catenin信号通路的下游基因表达。其中，小鼠及人类骨关节炎模型证实，WISP-1蛋白在关节软骨与滑膜组织中的显著上调表达，基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase，MMPs)、聚集蛋白聚糖酶在软骨细胞以及巨噬细胞的上调表达，均会促进关节软骨损伤。

以下实施例将3-{[(4-甲基苯基)磺酰基]氨基}苯甲酸甲酯(Methyl3-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-yl)-4-(dimethylamino)benzoate，MSAB)作为骨关节炎软骨损伤治疗的潜在小分子药物，其结构式如图1所示。目前，MSAB作为一种抗肿瘤研究药物，显示出了对Wnt依赖性癌细胞的生长抑制作用，其机制与MSAB同Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白——β-catenin结合有关，两者结合可以促进β-catenin泛素化和降解，降低其稳定性和活性，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性。

此外，以下实施例采用了ATDC5细胞作为研究骨关节炎治疗的体外实验细胞。ATDC5细胞是一种常用于骨骼发育研究的小鼠成纤维细胞系，由小鼠胚胎骨骼肌组织获得，可以在体外多次分裂，并分化为软骨细胞和骨细胞。ATDC5细胞的分化路径类似于胚胎发育中软骨和骨的形成过程，因此被广泛用于骨骼发育、软骨和骨的疾病研究。

与此同时，以下实施例采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导体外的ATDC5细胞中β-catenin信号通路的激活和基质金属蛋白酶相关基因的表达，以研究MSAB影响骨关节炎的作用机制。TNF-α是一种炎症介质，它在骨关节炎的发生和发展中发挥了重要作用。在骨关节炎患者的关节内，存在大量的TNF-α，这些TNF-α会刺激滑膜细胞和软骨细胞分泌一系列的炎症因子和酶类，如IL-1β、IL-6、MMPs等，进一步加剧关节炎病情。此外，TNF-α还可以促进炎性细胞的浸润和活化，导致关节软骨的破坏和骨质的吸收，从而加速骨关节炎的发展。因此，TNF-α已经成为了骨关节炎体外研究的一种重要手段。

本发明生物材料来源：软骨细胞系ATDC-5购于Americantypeculture collection公司；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶购于Gibico公司；MSAB、TNF-α购于Selleckchem公司；NGF抗体购于上海碧云天生物技术有限公司；CGRP抗体购于Abcam公司；qPCR所用引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司；LABORAS平台购于Metris公司；C57BL/6小鼠购于江苏省集萃药康生物科技股份有限公司。

需要理解的是，以下实施例中的所有统计学比较均使用PrismGraphPad统计软件进行，此外，所有数据均在不同组别中使用单因素方差分析进行比较，并进行Tukey多重比较检验，当P＜0.05时认为差异有统计学意义，结果表示则为平均值±SD。

本发明提供一种基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用，即采用MSAB降低骨关节炎小鼠的骨赘增生以及组织病理学评分，缓解软骨结构损伤，进而为骨关节炎的治疗和预防提供了参考，其机制与MSAB抑制β-catenin信号通路的激活、抑制基质金属蛋白酶相关基因的表达有关。

下面通过具体实验实施例来对本发明作进一步的阐述。

实施例1：MSAB对软骨细胞中β-catenin信号通路的下游基因的影响

(1)将生长状态良好的ATDC5细胞铺于12孔培养板中进行培养，直至细胞密度达到70-80％，随后分成四组——空白处理组、MSAB处理组、TNF-α处理组、TNF-α+MSAB处理组，每组重复3孔。

按照分组要求，空白处理组注射磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferedSaline，PBS)，MSAB处理组加入50μmol/LMSAB处理细胞3h，TNF-α处理组更换为含20ng/mLTNF-α的完全培养基处理9h，TNF-α+MSAB处理组先更换为含20ng/mLTNF-α的完全培养基处理9h，再加入50μmol/LMSAB处理细胞3h。

(2)对步骤(1)获得的四组细胞进行总RNA提取，并按照试剂盒说明书对软骨细胞中β-catenin信号通路的下游基因Axin2和Dkk1进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR)实验。

结果：图2展示了ATDC-5细胞中β-catenin信号通路下游基因的qPCR检测结果，其中图2A和2B分别表示Axin2和Dkk1的mRNA表达水平，纵坐标表示以β-Actin为对照基因的基因上调倍数，横坐标表示组别，依次为空白处理组、MSAB处理组、TNF-α处理组、TNF-α+MSAB处理组，空白处理组的Axin2或Dkk1表达水平设为1。

可以看出，相比空白处理组，TNF-α处理组Axin2和Dkk1的mRNA表达水平均有显著增高，说明作为阳性对照，向软骨细胞系ATDC5注射TNF-α，可以诱导β-catenin信号通路的靶基因Axin2和Dkk1的mRNA表达上调。

相比空白处理组，MSAB处理组Axin2和Dkk1的mRNA表达均呈现了显著降低，说明生理情况下，MSAB可以抑制β-catenin信号通路的下游基因Axin2和Dkk1的表达。

相比TNF-α处理组，TNF-α+MSAB处理组在利用TNF-α处理细胞后还注射了50μmol/LMSAB，此时Axin2和Dkk1的mRNA表达水平显著下降，说明MSAB可以抑制TNF-α诱导的基因Axin2、Dkk1的表达上调，进而抑制ATDC-5细胞中的β-catenin信号通路的活性，缓解骨关节炎进程。

实施例2：MSAB对软骨细胞的细胞外基质的影响

对实施例1中步骤(1)获得的四组细胞进行总RNA提取，并按照试剂盒说明书对软骨细胞中金属基质蛋白酶基因Mmp3、Mmp13、Adamts4、Adamts5进行RT-qPCR实验。

结果：图3展示了ATDC-5细胞的细胞外基质相关分子的qPCR检测结果，其中图3A到3D分别表示金属基质蛋白酶基因Mmp3、Mmp13、Adamts4、Adamts5的mRNA转录水平，纵坐标表示以β-Actin为对照基因的基因上调倍数，横坐标表示组别，依次为空白处理组、MSAB处理组、TNF-α处理组、TNF-α+MSAB处理组，各组均以β-Actin作为内参。

可以看出，相比空白处理组，金属基质蛋白酶基因Mmp3、Mmp13、Adamts4和Adamts5的mRNA水平均在TNF-α处理组中呈现出了显著的上升，说明TNF-α可以诱导软骨细胞系ATDC-5中金属基质蛋白酶基因的表达，促进软骨细胞的细胞外基质降解，进而加速骨关节炎病程中关节软骨的结构破坏。

相比TNF-α处理组，TNF-α+MSAB处理组在采用TNF-α诱导软骨细胞损伤的同时加入了50μmol/LMSAB，可以检测到Mmp3、Mmp13、Adamts4和Adamts5的mRNA水平表达均有显著下降，说明了采用MSAB可以抑制软骨细胞中基质金属蛋白酶的表达，进而通过减少软骨细胞外基质的降解，减轻骨关节炎的病理表型。

此外，相比空白处理组，MSAB处理组的基质金属蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts5的mRNA转录水平未有明显变化，而基质金属蛋白酶Adamts4的mRNA转录水平发生了显著变化，说明了MSAB在生理情况下仅抑制基质金属蛋白酶Adamts4的表达，在病理情况下对四种基质金属蛋白酶的表达均有抑制作用，进而发挥其对骨关节炎的治疗作用。

实施例3：MSAB对软骨结构损伤的影响的micro-CT检查评估

(1)如图4所示，选取30只、体重在25-30g的10周龄无特定病原的雄性C57BL/6小鼠，在动物房环境中适应一周。其中，动物房的温度为22-25℃，动物可在笼中自由汲取水与食物，并设置每天12小时/12小时的白夜循环。此外，所有的动物护理和实验程序都遵循中国科学院先进技术研究院实验动物科学中心的动物管理和使用委员会要求进行。

适应一周后，随机将小鼠分为三组——Sham+PBS处理组、DMM+PBS处理组、DMM+MSAB处理组，每组10只，进行手术。其中，Sham+PBS处理组只切开髌骨韧带内侧，暴露关节腔后便缝合组织与皮肤，DMM+PBS处理组和DMM+MSAB处理组构建内侧半月板失稳(DestabilizationoftheMedialMeniscus，DMM)的骨关节炎小鼠模型。内侧半月板胫骨韧带切除术的具体步骤如下，将小鼠麻醉固定、消毒后，用显微刀片切开髌骨韧带内侧，暴露关节腔，然后钝性分离股骨髁间的脂肪垫，暴露髁间区域，用显微刀片挑断内侧半月板胫骨韧带，缝合组织与皮肤。术后不固定手术肢体，笼内自由活动，并于腹腔注射青霉素预防感染。

于术后第4周开始向各组小鼠的关节腔注射给药，其中DMM+MSAB处理组注射MSAB，Sham+PBS处理组和DMM+PBS处理组注射PBS。各组小鼠采用相同的给药方法并给予等剂量的试剂，具体来讲，三组均从第4周开始治疗4周，每三天注射一次，共注射8次，按15mg/kg小鼠体重进行关节腔注射。第16周对所有小鼠进行安乐死，并分离右膝关节。

(2)第16周对三组小鼠进行微型计算机断层扫描(micro-CT)检查，具体来讲，将小鼠膝关节置于4％多聚甲醛中固定48h后，用透明保鲜膜固定位置，70％乙醇湿润，然后置于Micro-CT扫描管内进行扫描，并利用分析软件和三维重建平台进行定量分析。其中，检测区域为钙化半月板和滑膜组织，即骨赘，检测参数为钙化半月板和滑膜组织的体积。

结果：图5展示了膝关节Micro-CT的3D重建图像，从左至右分别为Sham+PBS处理组、DMM+PBS处理组、DMM+MSAB处理组。图6展示了膝关节骨赘体积统计图，其中纵坐标为骨赘体积，横坐标为组别，依次为Sham+PBS处理组、DMM+PBS处理组、DMM+MSAB处理组。

可以看出，与Sham+PBS处理组相比，DMM+PBS处理组小鼠的膝关节骨赘生成显著增加，说明膝关节内侧半月板造模使得小鼠膝关节微结构发生变化，出现了异常的骨重塑，导致膝关节不稳。

与DMM+PBS处理组相比，DMM+MSAB处理组向小鼠关节腔注射了MSAB，有效减少了骨赘的生成，说明MSAB可以有效缓解骨质破坏和吸收，减少异常的骨重塑，从而发挥了保护膝关节骨结构的作用。

实施例4：MSAB对软骨结构损伤的影响的组织学检查

将实施例3中步骤(1)获得的三组小鼠的右膝关节组织固定在4％多聚甲醛溶液中3天，然后在甲酸溶液中脱钙1周，期间每3天换液一次，之后梯度乙醇脱水并石蜡包埋，切成5μm的厚矢状切片，利用番红O-固绿染色并在普通光镜下观察组织形态的变化，以评估小鼠膝关节软骨退变。

结果：图7展示了小鼠右膝关节的番红O-固绿染色图像，从左至右分别为Sham+PBS处理组、DMM+PBS处理组、DMM+MSAB处理组。

可以发现，Sham+PBS处理组的胫骨软骨表面光亮完整，而DMM+PBS处理组的软骨表面几乎消失并显露出软骨下层的骨组织，大量基质丢失，软骨细胞数目也出现了降低，说明对小鼠进行内侧半月板失稳造模会导致关节的破坏，并且畸形十分严重。

相比DMM+PBS处理组，DMM+MSAB处理组的关节软骨表面有着更少的缺损病灶并保留了大部分的软骨组织，胫骨平台软骨表面连续，说明对骨关节炎小鼠注射MSAB可以显著抑制基质的丢失，改善软骨层着色，减少软骨细胞肥大和凋亡，减轻软骨结构损伤的症状。

实施例5：MSAB对软骨结构损伤的影响的退行性改变评分

由不同研究人员对实施例4中获得的三组切片进行退行性改变评分，内容包括软骨面积、软骨退变评分、滑膜炎评分、骨赘评分。其中，软骨退变评分标准参考软骨国际骨关节炎研究学会(OsteoarthritisResearchSociety International，OARSI)评分。滑膜炎评分由滑膜衬里细胞增生、绒毛增生和血管周围淋巴细胞和单核细胞浸润细胞的程度的评分总和获得，以评价滑膜的病理变化。这之中，滑膜衬里细胞增生评分标准为1-2层细胞计0分，3-5层细胞计2分，6层及以上计2分；绒毛增生评分标准为不存在计0分，少、分散且短计1分，手指状投影计2分，手指状投影和漫反射计3分；血管周围淋巴细胞和单核细胞浸润细胞的程度评分标准为正常计0分，明显的细胞浸润与淋巴滤泡混合计5分。骨赘评分包括骨赘的大小和成熟度，其中骨赘的大小分为4级：0级正常、1级轻度增加、2级中度增加、3级显著增加；骨赘的成熟度分为4级：0级正常、1级显著的软骨化、3级骨和软骨的混合、4级显著骨化。

结果：图8展示了退行性改变评分结果，其中图8A-8E分别表示OARSI评分、胫骨软骨面积量表、滑膜炎评分、骨赘大小评分、骨赘成熟度评分，横坐标为组别，从左至右分别为Sham+PBS处理组、DMM+PBS处理组、DMM+MSAB处理组。

可以看出，与Sham+PBS处理组相比，DMM+PBS处理组小鼠的OARSI评分显著增加，而胫骨软骨面积严重减少，说明DMM+PBS处理组小鼠的股骨和胫骨处关节软骨损伤程度增大，出现了磨损，软骨也变薄了，表明其产生了骨关节炎。此外，DMM+PBS处理组的滑膜炎评分显著增加，表明该组小鼠的关节囊受到撞击，使得滑膜出现了炎症，间接反映了骨关节炎的产生。另外，DMM+PBS处理组的骨赘大小评分和骨赘成熟度评分同样显著增加，表明该组小鼠关节腔内的生物力学不稳定，支撑方向发生变化，刺激了滑膜组织产生骨赘，同时软骨出现钙化，成熟度高。综上，各指标均直接或间接说明了DMM+PBS处理组成功构建了内侧半月板失稳的骨关节炎小鼠模型。

相比DMM+PBS处理组小鼠，经关节腔注射MSAB治疗的DMM+MSAB处理组小鼠OARSI评分、滑膜炎评分、骨赘大小评分、骨赘成熟度评分显著下降，关节软骨面积明显增加，说明MSAB可以有效缓解骨关节炎进程中的软骨损伤，达到预防或治疗的目的。

综上所述，本发明提供一种基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用。具体采用了MSAB以抑制软骨细胞中基质金属蛋白酶的表达，进而改善了骨性关节病程中软骨结构的破坏，为骨关节炎的指导治疗提供了重要参考。

以上所述仅是本发明的一些实施方式。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用，其特征在于，所述基质金属蛋白酶抑制剂为3-{[(4-甲基苯基)磺酰基]氨基}苯甲酸甲酯或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用，其特征在于，所述基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制基质金属蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4和/或Adamts5的表达，实现了骨关节炎软骨损伤的预防或治疗。

3.根据权利要求2所述的基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用，其特征在于，所述基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制WNT/β-catenin信号通路的激活，实现了基质金属蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4和/或Adamts5表达的抑制。

4.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用，其特征在于，所述基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制半月板的钙化和/或滑膜组织的新生，实现了骨关节炎软骨损伤的预防或治疗。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的基质金属蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎软骨损伤药物中的应用，其特征在于，所述基质金属蛋白酶抑制剂的有效浓度为15mg/kg体重。