CN116949142A - 一种用于rna靶标检测的扩增方法及试剂盒应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于RNA靶标检测的扩增方法及试剂盒应用。该RNA扩增体系中包含一条逆转录引物T、上游扩增引物F、下游扩增引物R及一条特异性探针P；所述逆转录引物T包含两部分序列T1和T2，近3'端为T1包含与靶标序列特异性结合的碱基，T1序列中间隔引入RNA碱基；近5'端为T2序列；所述的上游扩增引物F与逆转录引物T2序列一致；所述的特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端有重叠碱基。本方法具有检测速度快、特异性好、准确性高等优势，可兼容多种PCR仪器型号，广泛应用于临床检测的多种应用场景中。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于RNA靶标检测的扩增方法及试剂盒应用。
背景技术
核糖核苷酸(RNA)是一类具有重要生物学功能和临床价值的生物大分子。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA、rRNA以及mRNA，都参与了基因表达与调控等重要的机体活动。RNA也是病毒与细菌等病原体的重要标志，对于一部分病毒而言，RNA是唯一的遗传信息载体，对于细菌等其他病原体，由于RNA稳定性差、易降解的特点，相对于DNA的检测RNA也更能够实时的反应病原活性及代谢状态。
呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体均为能够引起呼吸道感染常见的病原体。约50％的婴儿肺炎和90％的婴儿支气管炎均是因感染RSV所致；免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群。肺炎支原体多发于青少年，不仅能够引起一般的肺炎，还能够引发较严重的双侧肺炎以及其他的并发症，严重危害着患者的身体健康。目前临床上对于RSV和肺炎支原体检测的分子生物学法主要有荧光定量逆转录PCR法。本技术方法不仅可以检测以RNA为遗传信息的呼吸道合胞病毒，也能够检测肺炎支原体中的RNA核酸靶标。
定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)是目前一种最常用的RNA检测技术方法。在该方法中，总RNA或信使RNA(mRNA)首先通过逆转录酶逆转录成互补DNA(cDNA)。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。但这种方式难以区分目标中的DNA信息。目前单独针对于RNA检测的技术相对较少，应用发展比较成熟的是RNA等温扩增技术，但其在产品化应用上也有一定的局限性，如需要结合特殊的提取方式、操作复杂等，不同的体系及扩增程序也限制了一些DNA靶标和RNA靶标同时检测需求的应用。因此，亟需开发一种操作简便、兼容性好、且灵敏度高、特异性强的RNA检测方法，以监测疾病的发生发展和评价治疗效果。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种RNA扩增方法，该扩增方法通过对逆转录引物、扩增引物以及特异性探针的设计，能够有效扩增靶标RNA的同时区分目标中的DNA靶标，实现针对RNA靶标的扩增。
一方面，本发明提供了一种RNA扩增方法，该RNA扩增体系中至少包含一条逆转录引物T、上游扩增引物F、下游扩增引物R及一条特异性探针P；所述逆转录引物T包含两部分序列T1和T2，近3'端为T1包含与靶标序列特异性结合的碱基，T1序列中间隔引入RNA碱基；近5'端为T2序列；所述的上游扩增引物F与逆转录引物T2序列一致；所述的特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端有重叠碱基。
具体地，所述的T1可以包含10-25个碱基与靶标序列特异性结合。
具体地，T1序列中间隔3-12碱基引入RNA碱基。
具体地，所述的T2序列可以包含16-28个碱基，该序列可以为人为设计序列，不与靶标序列同源。
具体地，所述的特异性探针P可以包含20-35个碱基。
进一步具体地，所述的特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端重叠3-15个碱基。
具体地，所述的特异性探针P的5'端标记的荧光基团可以是FAM，VIC，TET，CALGold 540，JOE，HEX，TAMRA，ROX，CY3，CY5中的一种或多种；3'端标记的淬灭基团可以是DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、ECLIPE中的一种或多种。
具体地，所述的下游扩增引物R可以包含16-35个碱基。
具体地，所述的T1的Tm40-50℃；所述的T2的Tm50-60℃；所述的上游扩增引物F的Tm50-60℃；所述的下游扩增引物R的Tm50-60℃；所述的特异性探针P的Tm55-70℃。
另一方面，本发明提供了一种RNA扩增试剂盒，所述的试剂盒中至少包含一条逆转录引物T、上游扩增引物F、下游扩增引物R及一条特异性探针P；所述逆转录引物T包含两部分序列T1和T2，近3'端为T1包含与靶标序列特异性结合的碱基，T1序列中间隔引入RNA碱基；近5'端为T2序列；所述的上游扩增引物F与逆转录引物T2序列一致；所述的特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端有重叠碱基。
具体地，该试剂盒还可以包括逆转录酶、核酸内切酶RNase HII、聚合酶、缓冲液。
具体地，所述的试剂盒能够用于检测目标病原中的核酸RNA靶标。
进一步具体地，所述的病原体可以是呼吸道合胞病毒和肺炎支原体。
优选地，所述的呼吸道合胞病毒检测的逆转录引物T的序列为SEQ ID NO.1；上游引物F的序列为SEQ ID NO.2；下游引物R的序列为SEQ ID NO.3；特异性探针P的序列为SEQID NO.4。
所述的肺炎支原体检测的逆转录引物T的序列为SEQ ID NO.8；上游引物F的序列为SEQ ID NO.9；下游引物R的序列为SEQ ID NO.10；特异性探针P的序列为SEQ ID NO.11。
具体地，所述的检测步骤包括：
(1)病原体RNA的提取；
(2)通过前述的扩增方法或试剂盒对步骤(1)中的RNA进行扩增；
(3)根据扩增曲线阈值判定阴阳性。
进一步具体地，步骤(1)中提取的RNA OD260/OD280的值应在2.0-2.2，浓度应在2-50ng/μL之间。
本发明所取得的技术效果：在呼吸道合胞病毒和肺炎支原体RNA检测中，本发明公开的方法能够特异性检测靶标RNA，并且该扩增方法具备区分目标中的DNA靶标的能力。
附图说明
图1为本发明公开方法检测呼吸道合胞病毒样本的扩增曲线图。
图2为传统Taqman探针法检测呼吸道合胞病毒样本的扩增曲线图。
图3为实施例1中以包含扩增子片段的DNA质粒为模板的扩增曲线图。
图4为本发明公开方法检测肺炎支原体样本的扩增曲线图。
图5为传统Taqman探针法检测肺炎支原体样本的扩增曲线图。
图6为实施例2中以包含扩增子片段的DNA质粒为模板的扩增曲线图。
图7为本发明公开方法的扩增原理流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所有的试剂信息详见表1：
表1
实施例1呼吸道合胞病毒RSV的检测
1.1材料及仪器
采集呼吸道合胞病毒RSV感染的临床患者咽拭子样本，4℃保存于常规采样管或拭子保存液中。
紫外分光光度计(NanoDrop 2000，ThermoFisher)、实时荧光PCR仪(ABI 7500)。
1.2引物和探针
根据呼吸道合胞病毒RSV对应的基因序列，利用oligo 7.0软件设计特异性的检测引物，具体设计方式如下：包含一条逆转录引物T、上游扩增引物F、下游扩增引物R及一条特异性探针P；逆转录引物T(26-48bp)包含两部分序列T1和T2，近3'端为T1包含10-25个碱基与靶标序列特异性结合，Tm40-50℃，T1序列中间隔3-12nt引入一个RNA碱基；近5'端为T2序列，包含16-28个碱基，Tm50-60℃，此部分序列为人为设计序列，不与靶标序列同源；上游扩增引物F包含16-28个碱基，与逆转录引物T2序列一致，Tm50-60℃；下游扩增引物R包含16-35个碱基，与靶标序列一致Tm50-60℃；上下游扩增引物形成扩增子长度为60-150bp；特异性探针P包含20-35个碱基，Tm55-70℃，特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端重叠3-15个碱基。
引物和探针均由上海生工公司合成，具体序列如表2所示：
表2
注：加粗字体为引物中引入的RNA碱基；R、Y代表简并碱基，其中R表示A/G，Y表示C/T。
本实施例所用逆转录引物为引入RNA碱基的引物，探针P的5'端修饰荧光基团为FAM，3'端修饰淬灭基团为BHQ1。
1.3呼吸道合胞病毒RSV的检测
检测原理：含有RNA碱基的逆转录引物T与靶标RNA单链序列特异性结合，引导逆转录合成cDNA第一链，生成RNA-cDNA杂合链，杂合链中靶标RNA单链会被RNase H消化降解。下游引物R与上一步消化后的cDNA链特异性结合生成cDNA第二链，并延伸出逆转录引物中T2的互补序列，生成的带有T2互补序列的cDNA第二链可作为后续PCR流程中的上下游引物的扩增模板。扩增过程的特征在于，荧光探针优先结合到靶标序列上，上游扩增引物F引发扩增延伸，延伸的过程中，聚合酶的外切活性特异性切割探针P产生荧光信号。逆转录过程中，含有RNA碱基的逆转录引物T与DNA模板序列特异性结合时，核酸内切酶RNase HII会特异性切割引物中的RNA碱基，使下游引物不能反向延伸生成T2互补序列，因此DNA不能成为PCR扩增模板；PCR扩增过程中，逆转录引物与探针位置部分重叠，只有上游扩增引物参与的扩增才能引发荧光信号产生；因此，达到只扩增RNA靶标的目的。
1.3.1样品RNA的提取
利用商品化的核酸提取试剂盒对临床咽拭子样本进行核酸提取，用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其RNA OD260/OD280的值应在2.0-2.2，浓度应在2-50ng/μL之间，样本核酸质检不合格不得用于检测，核酸质检合格后，在20℃条件下保存作为备用。
1.3.2定量逆转录PCR
本实验分为以下三个实验，具体扩增反应体系如表3所示，每个实验设置三个重复。
表3
(1)实验1-1为本发明方法检测样本：
引物及探针见表2。
空白对照：模板为水；
实验组：模板为采集的RSV感染的临床患者咽拭子样本RNA；
阳性对照：模板为自构建含有目标RNA序列的RSV假病毒，该RSV假病毒的载体为pET 32a-MS2，插入位点为BamHI/NotI，目标RNA序列为SEQ ID NO.5。
(2)实验1-2为传统Taqman探针法检测样本：
引物及探针均由上海生工合成，见表4。
表4
| 引物探针类型 | SEQ ID NO | 序列 |
| 上游引物F | SEQ ID NO.6 | AGATCAACTTCTRTCATCCAGCA |
| 下游引物R | SEQ ID NO.3 | TGCACATCATAATTAGGAGTRTCA |
| 探针P | SEQ ID NO.4 | AYACCATCCAACGGAGCACAGGAGA |
空白对照：模板为水；
实验组：模板为采集的RSV感染的临床患者咽拭子样本RNA；
阳性对照：模板为自构建含有目标RNA序列的RSV假病毒。
(3)实验1-3为本发明方法验证DNA样本检测效果：
引物及探针见表2。
实验组：模板为包含扩增子片段的DNA质粒(Ct20-25)，其中质粒为PUC质粒；质粒中插入的扩增片段的DNA序列为SEQ ID NO.7。
将PCR反应管置于实时荧光PCR仪上进行测试，反应程序设置如表5所示：
表5
根据靶标的扩增曲线进行阳性结果判定，若FAM通道有扩增曲线出现判定为阳性。实验1-1和实验1-2结果表明同一个呼吸道合胞病毒临床样本，分别使用传统Taqman探针法和本发明公开方法进行检测，两种检测方法结果一致，均判定为阳性，见图1和图2。实验1-3结果表明本发明的检测方法具备区分目标中的DNA靶标的能力，见图3。
实施例2肺炎支原体RNA的检测
2.1材料及仪器
灭菌容器采集肺炎支原体感染患者的临床痰液样本，4℃保存并尽快提取检测。
仪器同1.1
2.2引物和探针
引物和探针的设计方法同1.2，具体序列如表6所示：
表6
| 引物探针类型 | 名称 | SEQ ID NO | 序列 |
| 逆转录引物T | MP-T | SEQ ID NO.8 | TACACAGGCATCCACAGACATGACCGCGAACTAT |
| 上游引物F | MP-F | SEQ ID NO.9 | TACACAGGCATCCACAGAC |
| 下游引物R | MP-R | SEQ ID NO.10 | TGGTTTGGAGCAAAACATCGC |
| 探针P | MP-P | SEQ ID NO.11 | TATCCGCCCAGTTGAAGAACGCCCAAGT |
注：加粗字体为引物中引入的RNA碱基。
本实施例所用逆转录引物为引入RNA碱基的引物，探针P的5'端修饰荧光基团为FAM，3'端修饰淬灭基团为BHQ1。
2.3肺炎支原体RNA的检测
2.3.1样品RNA的提取
利用商品化的核酸提取试剂盒对临床样本进行液化及核酸提取，用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其RNA OD260/OD280的值应在2.0-2.2，浓度应在2-50ng/μL之间，样本核酸质检不合格不得用于检测，核酸质检合格后，在20℃条件下保存作为备用。
2.3.2定量逆转录PCR
本实验分为以下三个实验，具体扩增反应体系如表7所示，每个实验设置三个重复。
表7
(1)实验2-1为本发明方法检测样本：
引物及探针见表6。
空白对照：模板为水；
实验组：模板为采集的肺炎支原体感染患者的临床痰液样本RNA；
阳性对照：模板为体外转录RNA靶标片段(SEQ ID NO.12)，使用试剂盒TranscriptAid T7 High Yield Transcription，ThermoFisher K0441。
(2)实验2-2为传统Taqman探针法检测样本：
引物和探针均由上海生工合成，见表8。
表8
| 引物探针类型 | SEQ ID NO | 序列 |
| 上游引物F | SEQ ID NO.13 | TTGGATCCCAAGGYSATGACC |
| 下游引物R | SEQ ID NO.10 | TGGTTTGGAGCAAAACATCGC |
| 探针P | SEQ ID NO.11 | TATCCGCCCAGTTGAAGAACGCCCAAGT |
注：S代表简并碱基，表示C/G；Y表示C/T。
空白对照：模板为水；
实验组：模板为采集的肺炎支原体感染患者的临床痰液样本RNA；
阳性对照：模板为体外转录RNA靶标片段，使用试剂盒TranscriptAid T7HighYield Transcription，Thermofisher K0441。
(3)实验2-3为本发明方法验证DNA样本检测效果：
引物及探针见表6。
实验组：模板为包含扩增子片段的DNA质粒(Ct20-25)，其中质粒为PUC质粒；质粒中插入的扩增片段的DNA序列为SEQ ID NO.14。
将PCR反应管置于实时荧光PCR仪上进行测试，反应程序设置如表9所示：
表9
根据靶标的扩增曲线进行阳性结果判定，若FAM通道有扩增曲线出现判定为阳性。实验2-1和实验2-2结果表明同一个肺炎支原体临床样本，分别使用传统Taqman探针法和本发明公开方法进行检测，两种检测方法结果一致，均判定为阳性，见图4和图5。实验2-3结果表明本发明的检测方法具备区分目标中的DNA靶标的能力，见图6。
对比例
参照实施例2中实验2-3的方法设置对比例并进行实验，对比例设置方式见表10：
表10
实验结果表明对比例1-3均不能有效扩增靶标RNA同时区分目标中的DNA靶标，进一步说明了本申请所公开的对逆转录引物、扩增引物以及特异性探针的设计方法可唯一针对RNA靶标进行扩增。
Claims (16)
1.一种RNA扩增方法，其特征在于，该RNA扩增体系中至少包含一条逆转录引物T、上游扩增引物F、下游扩增引物R及一条特异性探针P；所述逆转录引物T包含两部分序列T1和T2，近3'端为T1包含与靶标序列特异性结合的碱基，T1序列中间隔引入RNA碱基；近5'端为T2序列；所述的上游扩增引物F与逆转录引物T2序列一致；所述的特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端有重叠碱基。
2.根据权利要求1所述的RNA扩增方法，其特征在于，所述的T1包含10-25个碱基与靶标序列特异性结合。
3.根据权利要求2所述的RNA扩增方法，其特征在于，T1序列中间隔3-12碱基引入RNA碱基。
4.根据权利要求1所述的RNA扩增方法，其特征在于，所述的T2序列包含16-28个碱基，该序列为人为设计序列，不与靶标序列同源。
5.根据权利要求1所述的RNA扩增方法，其特征在于，所述的特异性探针P包含20-35个碱基。
6.根据权利要求5所述的RNA扩增方法，其特征在于，所述的特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端重叠3-15个碱基。
7.根据权利要求5-6任一项所述的RNA扩增方法，其特征在于，所述的特异性探针P的5'端标记的荧光基团为FAM，VIC，TET，CAL Gold 540，JOE，HEX，TAMRA，ROX，CY3，CY5中的一种或多种；3'端标记的淬灭基团为DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、ECLIPE中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的RNA扩增方法，其特征在于，所述的下游扩增引物R包含16-35个碱基。
9.根据权利要求1所述的RNA扩增方法，其特征在于，所述的T1的Tm40-50℃；所述的T2的Tm50-60℃；所述的上游扩增引物F的Tm50-60℃；所述的下游扩增引物R的Tm50-60℃；所述的特异性探针P的Tm55-70℃。
10.一种RNA扩增试剂盒，其特征在于，至少包含一条逆转录引物T、上游扩增引物F、下游扩增引物R及一条特异性探针P；所述逆转录引物T包含两部分序列T1和T2，近3'端为T1包含与靶标序列特异性结合的碱基，T1序列中间隔引入RNA碱基；近5'端为T2序列；所述的上游扩增引物F与逆转录引物T2序列一致；所述的特异性探针P的5'端与逆转录引物T1序列3'端有重叠碱基。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶、核酸内切酶RNaseHII、聚合酶、缓冲液。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，用于检测目标病原中的核酸RNA靶标。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述的病原体为呼吸道合胞病毒和肺炎支原体。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的呼吸道合胞病毒检测的逆转录引物T的序列为SEQ ID NO.1；上游引物F的序列为SEQ ID NO.2；下游引物R的序列为SEQ IDNO.3；特异性探针P的序列为SEQ ID NO.4。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的肺炎支原体检测的逆转录引物T的序列为SEQ ID NO.8；上游引物F的序列为SEQ ID NO.9；下游引物R的序列为SEQ IDNO.10；特异性探针P的序列为SEQ ID NO.11。
16.根据权利要求10-15任一项所述的试剂盒，其特征在于，检测步骤包括：
(1)病原体RNA的提取；
(2)通过权利要求1-9任一项所述的扩增方法或权利要求10-15任一项所述的试剂盒对步骤(1)中的RNA进行扩增；
(3)根据扩增曲线阈值判定阴阳性。
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