CN116949130A - 一种试剂盒及一种核酸提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种试剂盒及一种核酸提取方法，该试剂盒用于核酸样本提取，该试剂盒包括过氧化氢溶液，该过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.1‑2mol/L。对于某些核酸样本，其中含有的菌体被粘液或黏蛋白等物质包裹，难以释放，加入过氧化氢溶液后，菌体中的物质与过氧化氢反应产生气体，生成的气泡可以破坏粘液或块状的样本，使其完全液化，从而释放被粘液或黏蛋白等物质包裹住的菌体，使得后续的核酸提取步骤得以顺利进行。

Description

一种试剂盒及一种核酸提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种试剂盒及一种核酸提取方法。

背景技术

全基因组测序(WGS)可以研究结核分枝杆菌(Mtb)的整个基因组，研究时使用的样本多为痰液样本，由于痰液样本具有粘稠度高、黏蛋白多、不易液化、容易成团结块等特点，痰液样本的核酸检测常规至少需要经历3步处理过程：痰液液化、细胞裂解以及核酸抽提。

常规痰液液化处理过程主要存在以下不足：(1)单独的痰液液化过程由于要求保存细胞的完整性而不添加强变性剂，故极易造成样本中的RNA被RNA酶催化降解，从而导致样本核酸损失；(2)常规的痰液液化常用巯基类试剂，且加入的试剂体积多为5-10倍痰液体积，导致最终的样品体积较大，从而极易发生核酸降解和损失；(3)操作过程较为复杂耗时：所使用的处理方法有氢氧化钠法、DTT(二硫苏糖醇)法以及蛋白酶法。氢氧化钠法是最常用的痰液液化方法，该方法比较简单，利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液在60-80℃(也可在室温条件下)液化痰液，该方法用于核酸检测时其强碱性环境易造成核酸损失。DTT(二硫苏糖醇)法的原来是利用含巯基(-SH)的DTT(二硫苏糖醇)断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)提供生理缓冲，通常还会加入乙醇等试剂来固定细胞。该方法使用的DTT(二硫苏糖醇)成本较高，且该方法易造成RNA损失，不适合大批量处理临床痰液样本。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液黏蛋白，该方法的酶解反应耗时较长，所需蛋白酶成本较高，且黏蛋白消化效率低。

发明内容

为了减少粘稠样本，如痰液样本、唾液样本或脓液样本的核酸提取过程中的核酸损失，提高核酸提取效率和核酸提取得率，本发明的实施方式提供一种试剂盒及一种核酸提取方法。

第一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒用于核酸样本提取，该试剂盒包括过氧化氢溶液，该过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.1-2mol/L。对于某些核酸样本，其中含有的菌体被粘液或黏蛋白等物质包裹，难以释放，加入过氧化氢溶液后，菌体中的物质与过氧化氢反应产生气体，生成的气泡可以破坏粘液或块状的样本，使其完全液化，从而释放被粘液或黏蛋白等物质包裹住的菌体，使得后续的核酸提取步骤得以顺利进行。并且，由于过氧化氢溶液的反应较为温和，基本不会破坏细胞的完整性，相较于使用强碱等物质进行液化的方法，能够减少核酸损失，提高核酸得率。

在一个示例中，过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.3-1mol/L。

在一个示例中，试剂盒还包括裂解液。

在一个示例中，裂解液包括第一表面活性剂。

在一些示例中，第一表面活性剂在裂解液中的质量浓度为0.1％-10％。

较佳地，第一表面活性剂为离子型表面活性剂。

任选地，第一表面活性剂为苯扎溴铵、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。

在一个示例中，裂解液还包括蛋白质变性剂。

任选地，蛋白质变性剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、重金属盐或尿素中的至少一种。

在一些示例中，裂解液还包括蛋白酶。

较佳地，蛋白酶为蛋白酶K。

在一些示例中，试剂盒还包括第一洗液。

在一个示例中，第一洗液中包括第二表面活性剂。

在一些示例中，第二表面活性剂在所述第一洗液中的质量浓度为0.1％-6％。

任选地，第二表面活性剂为苯扎溴铵、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。

在一些示例中，试剂盒还包括第二洗液。

在一个示例中，第二洗液包含乙醇。

在一些示例中，试剂盒还包括预处理试剂。

较佳地，预处理试剂的使用浓度为1-3mg/mL。

较佳地，预处理试剂包括溶菌酶。

较佳地，预处理试剂还包括金属离子螯合剂。

任选地，金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸中的至少一种。

在一个示例中，试剂盒还包括沉淀剂。

较佳地，沉淀剂为异丙醇。

在一些示例中，所述核酸样本为痰液样本、唾液样本或脓液样本。

在另一些示例中，所述核酸样本含有菌体核酸。

在另一些示例中，所述核酸样本含有过氧化氢酶。

另一方面，本发明提供一种核酸提取方法，包括步骤一：将上述试剂盒中的过氧化氢溶液与核酸样本进行混合，提取所述核酸样本中的核酸。

在一些示例中，过氧化氢溶液与样本混合的时间为0.1～10min。

在一些示例中，该方法还包括步骤二：将预处理试剂与所述样本混合。

在一些示例中，该方法还包括步骤三：将裂解液与经过步骤二处理的所述样本混合。

在一些示例中，该方法还包括步骤四：将沉淀剂与经过步骤三处理的所述样本混合。

在一些示例中，该方法还包括步骤五：将第一洗液与经过步骤四处理的所述样本混合。

在一些示例中，该方法还包括步骤六：将第二洗液与经过步骤五处理所述样本混合。

本发明的核酸提取方法，使用过氧化氢溶液液化样本，能够在更短的时间内更温和地液化样本，减少核酸损失，提高核酸提取效率；改进后的裂解液能够更好地裂解样本中的菌体以及分离蛋白质和核酸，进一步减少核酸损失，改进后的第一洗液能够更好地除去杂质，提高提取的核酸的纯度。

附图说明

本发明实施方式的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为实施例1中核酸样本1和核酸样本2的琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为实施例2中各组提取到的细菌核酸(gDNA)的琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

目前对于粘稠样本，如痰液样本、唾液样本和脓液样本等，在进行核酸提取前需要对此类样本进行液化预处理，常采用氢氧化钠法，该方法主要是利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液使样本中蛋白质发生变性后溶解于碱液中，从而达到液化痰液的目的，但氢氧化钠溶液提供的是强碱性环境，该方法容易造成核酸损失，导致核酸提取效率较低，如提取样本是痰液样本时，当痰液样本中结核杆菌含量较少，使用该方法，会有提取不到结核杆菌DNA的风险。

为了减少粘稠样本，特别是痰液样本的核酸提取过程中的核酸损失，提高核酸提取效率，发明人尝试寻找一种新的可以液化具有上述特点的样本的方法。经过多次实验，发明人发现可以通过使用过氧化氢溶液液化具有粘稠度高、黏蛋白多、不易液化、容易成团结块等特点的样本。此外，发明人还研究了使用过氧化氢溶液处理样本的时间以及使用时的浓度对于核酸提取的影响，并得到较为优选的处理时间和使用浓度。发明人在实验中发现，在合适的处理时间和使用浓度下，使用过氧化氢溶液液化样本，特别是痰液样本，相较于氢氧化钠法，能够减少核酸损失，提高核酸提取效率。

除了对液化方法的改进之外，发明人还发现在核酸提取过程中使用苯扎溴铵作为裂解液的成分之一能够更好地裂解样本细胞，以及其用于除去蛋白等杂质的洗液成分能够更好地除去杂质，从而帮助提高核酸提取得率和纯度。基于上述发现，发明人对具有粘稠度高、黏蛋白多、不易液化、容易成团结块等特点的样本的核酸提取方法作出了系列改进，从整体上优化核酸提取方法，以提高核酸得率。

因此，一方面，根据本发明的实施方式，提供一种试剂盒，该试剂盒用于核酸样本提取，该试剂盒包括过氧化氢溶液。采用过氧化氢溶液提取核酸样本中的核酸，可以在温和的条件下释放样本中的核酸，降低对核酸物质的破坏，提高核酸提取得率，所称的核酸提取得率指从样本中提取出的菌体核酸的总量。

对于粘稠样本，特别是粘稠度指标大于同等条件下水的粘稠度20倍以上的核酸样本，其中含有的菌体被粘液或黏蛋白等物质包裹，难以释放，加入过氧化氢溶液后，样本中的物质与过氧化氢反应产生气体，生成的气泡可以破坏粘液或块状的样本，使其完全液化，从而释放被粘液或黏蛋白等物质包裹住的菌体，使得后续的核酸提取步骤得以顺利进行。并且，由于过氧化氢溶液的反应较为温和，基本不会破坏细胞的完整性，相较于使用强碱等物质进行液化的方法，能够减少核酸损失，提高核酸得率。样本中的物质与过氧化氢反应时，可能是过氧化氢导致了样本中的物质产生气体，也可能是样本中的物质导致过氧化氢分解而产生气体。

在一个示例中，过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.1-2mol/L。较佳地，在另一个示例中，过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.3-1mol/L。经过多次实验，确定过氧化氢溶液的较优使用浓度，使用浓度的确定需要根据样本类型和具体的实验条件确定。

上述示例中，使用适宜浓度的过氧化氢溶液处理样本，核酸损失减少，提高了核酸提取得率。

在一个具体示例中，试剂盒还包括裂解液。裂解液用于使样本中的核酸游离于裂解体系中。

在一个示例中，裂解液包括第一表面活性剂。在一些示例中，第一表面活性剂在裂解液中的质量浓度为0.1％-10％。

较佳地，第一表面活性剂为离子型表面活性剂。较佳地，第一表面活性剂为苯扎溴铵、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。第一表面活性剂还可以是非离子型表面活性剂，如乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚或聚山梨酯-20等。在一个具体示例中，第一表面活性剂为苯扎溴铵，其可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜，还能够解聚细胞中的核蛋白，可以起到较好的裂解效果，更彻底地释放细胞中的核酸，从而有助于提高核酸提取得率。

在一个示例中，裂解液还包括蛋白质变性剂。蛋白质变性剂用于快速裂解细胞膜，其能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。较佳地，蛋白质变性剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、重金属盐或尿素中的至少一种。较佳地，蛋白质变性剂的摩尔浓度为4-8mol/L。

在一些示例中，裂解液还包括蛋白酶。蛋白酶用于将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于获得纯度更高的的核酸。较佳地，蛋白酶为蛋白酶K。

上述示例中的裂解液可以包括多种类型的试剂，并且裂解效果可以是依靠一种类型的试剂实现，或依靠多种类型的试剂共同作用实现。可以根据不同类型的核酸提取样本，以及不同的核酸提取需求，选择裂解液的组成。

在一个具体示例中，试剂盒还可以包括沉淀剂。沉淀剂用于沉淀裂解得到的核酸。较佳地，沉淀剂为有机醇。有机醇可以是异丙醇等，其中异丙醇有较高的疏水性，其沉淀核酸的效果较好。

在一个具体示例中，试剂盒还包括第一洗液。第一洗液用于洗涤除去沉淀得到的核酸中的蛋白质。在一个示例中，第一洗液中包括第二表面活性剂。较佳地，第二表面活性剂在第一洗液中的质量浓度为0.1％-6％。较佳地，第二表面活性剂为苯扎溴铵、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。在一个示例中，第二表面活性剂为苯扎溴铵，能够在保证所提取的核酸完整的前提下，提高核酸提取的纯度。

在一个具体示例中，试剂盒还包括第二洗液。第二洗液用于洗涤除去沉淀得到的核酸中的盐离子。在一个示例中，第二洗液包含有机醇。有机醇可以是亲水性较高的醇类，如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇等，其中乙醇有较高的亲水性，其能够除去部分盐离子。在一个示例中，第二洗液还包括非离子型表面活性剂，非离子表面活性剂如聚山梨醇酯-20、聚乙二醇辛基苯基醚等。第二洗液中含有非离子表面活性剂可以进一步洗涤除去沉淀得到的核酸中的蛋白质。在另一个示例中，第二洗液还包括Tris-HCl缓冲液，可以洗去上个步骤残留的试剂。

在一个具体示例中，试剂盒还包括洗脱液。洗脱液用于将核酸从吸附基质上洗脱下来，吸附基质如磁珠、硅基质膜或层析柱等。在一个示例中，洗脱液包含Tris-HCl缓冲液。

在一个具体示例中，试剂盒还包括预处理试剂。预处理试剂用于对液化后的样本进行预处理，破坏样本中菌体的细胞壁，便于后续使用裂解液处理样本。较佳地，预处理试剂的使用浓度为1-10mg/mL。较佳地，预处理试剂包括溶菌酶。溶菌酶能够通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。在一些示例中，预处理试剂还包括金属离子螯合剂。较佳地，金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸中的至少一种。

在一个具体示例中，核酸样本为痰液样本、唾液样本或脓液样本。痰液样本具有粘稠度高、黏蛋白多、不易液化、容易成团结块等特点，需要经过液化处理才能进行后续的核酸提取步骤。指示身体可能产生病变的唾液样本也具有粘稠度高、黏蛋白多等特点，一些脓液样本也具备较高的粘稠度，这两类样本同样需要经过液化处理才能进行后续的核酸提取步骤。

在一些示例中，核酸样本中含有菌体核酸。核酸样本中可能含有一些菌体，其中一些菌体可能是致病菌，如结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等，而由于一些核酸样本粘稠度高、黏蛋白多、不易液化、容易成团结块，这些菌体被粘液或黏蛋白等物质包裹，难以释放，如果直接用裂解液等对样本进行核酸提取，菌体核酸的提取效率极低，因此一般对先对这样的核酸样本进行液化处理，将样本中被包裹的菌体释放出来，再进行后续的核酸提取步骤。

在一些示例中，核酸样本含有过氧化氢酶。样本中含有过氧化氢酶的情况可能有三种：第一种情况是收集样本时样本本身就含有过氧化氢酶；第二种情况是样本中的菌体在样本收集前或收集后产生了过氧化氢酶，发明人查阅资料得知大部分需氧菌，例如结核分枝杆菌、部分兼性厌氧菌，例如金黄色葡萄球菌和小部分厌氧菌，例如巴氏甲烷八叠球菌都能够产生过氧化氢酶，而这些能够产生过氧化氢酶的菌类中有一部分可能是痰液或唾液等生物样本中含有的菌体；第三种情况是样本中含有的过氧化氢酶来自于样本本身和样本中的菌体。对于含有过氧化氢酶且粘稠度高、容易成团结块的样本，如痰液样本、唾液样本等，可以使用过氧化氢溶液对这类样本进行液化处理。利用样本中存在的过氧化氢酶分解过氧化氢溶液，产生气体，因为气体而出现的气泡会破坏粘液或块状的样本，使其完全液化，从而释放被粘液或黏蛋白等物质包裹住的菌体，使得后续的核酸提取步骤得以顺利进行。并且，由于过氧化氢溶液与过氧化氢酶的反应较为温和，基本不会破坏细胞的完整性，相较于使用强碱等物质进行液化的方法，能够减少核酸损失，提高核酸得率。

另一方面，根据本发明的实施方式，提供一种核酸提取方法，包括步骤一：将上述试剂盒中的过氧化氢溶液与样本进行混合。加入过氧化氢溶液后，样本中的物质与过氧化氢反应产生气体，生成的气泡可以破坏粘稠或甚至形成块状的样本，使其完全液化，从而释放被粘液或黏蛋白等物质包裹住的菌体，使得后续的核酸提取步骤得以顺利进行。并且，由于过氧化氢溶液的反应较为温和，基本不会破坏细胞的完整性，相较于使用强碱等物质进行液化的方法，能够减少核酸损失，提高核酸得率。样本中的物质与过氧化氢反应时，可能是过氧化氢导致了样本中的物质产生气体，也可能是样本中的物质导致过氧化氢分解而产生气体。

在一些示例中，使用过氧化氢溶液处理样本的时间为0.1～10min。发明人发现，使用过氧化氢溶液处理样本，在一定浓度内，使得样本完全液化的处理时间为0.1～10min，而使用氢氧化钠法完全液化样本的时间约为30min，比起氢氧化钠溶液，过氧化氢溶液能够在更短的时间内完全液化样本。液化时间变短，使得核酸提取过程时间减少，提高了核酸提取的效率。较佳地，使用过氧化氢溶液处理样本的时间为0.5～3min，在合适浓度下，过氧化氢溶液处理样本0.5～3min即可将样本完全液化。

在一些示例中，该方法还包括步骤二：将上述的预处理试剂与样本混合。预处理试剂用于对液化后的样本进行预处理，破坏样本中菌体的细胞壁，便于后续使用裂解液处理样本。较佳地，预处理试剂的使用浓度为1-10mg/mL。较佳地，预处理试剂包括溶菌酶。溶菌酶能够通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。在一些示例中，预处理试剂还包括金属离子螯合剂。较佳地，金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸中的至少一种。在一个示例中，预处理试剂与样本混合前，先将裂解液与样本混合，可以先破坏可能液化不完全的样本中的生物膜，促进预处理试剂对样本中菌体的细胞壁的破坏效果。

在一些示例中，该方法还包括步骤三：使将裂解液与经过步骤二处理的所述样本混合，裂解液用于使样本中的核酸游离于裂解体系中，具体地，裂解液能够破坏样本中含有的菌体或细胞的细胞膜，释放细胞中的核酸。裂解液与经过步骤二处理的样本混合后释放出样本中含有的核酸，以进行后续的核酸沉淀步骤。

在一个示例中，裂解液包括第一表面活性剂。在一些示例中，第一表面活性剂在裂解液中的质量浓度为0.1％-10％。较佳地，第一表面活性剂为离子型表面活性剂。较佳地，第一表面活性剂为苯扎溴铵、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。第一表面活性剂还可以是非离子型表面活性剂，如乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚或聚山梨酯-20等。在一个具体示例中，第一表面活性剂为苯扎溴铵，其可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜，还能够解聚细胞中的核蛋白，可以起到较好的裂解效果，更彻底地释放细胞中的核酸，从而有助于提高核酸提取得率。

在一个示例中，裂解液还包括蛋白质变性剂。蛋白质变性剂用于快速裂解细胞膜，其能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。较佳地，蛋白质变性剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、重金属盐或尿素中的至少一种。较佳地，蛋白质变性剂的摩尔浓度为4-8mol/L。

在一些示例中，裂解液还包括蛋白酶。蛋白酶用于将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于获得纯度更高的的核酸。较佳地，蛋白酶为蛋白酶K。

上述示例中的裂解液可以包括多种类型的试剂，并且裂解效果可以是依靠一种类型的试剂实现，或依靠多种类型的试剂共同作用实现。可以根据不同类型的核酸提取样本，以及不同的核酸提取需求，选择裂解液的组成。

在一些示例中，该方法还包括步骤四：将沉淀剂与经过步骤三处理的样本混合。该步骤中使用上述沉淀剂沉淀步骤三中样本释放的核酸。较佳地，沉淀剂为有机醇。有机醇可以是异丙醇等，其中异丙醇有较高的疏水性，其沉淀核酸的效果较好。

在一些示例中，该方法还包括步骤五：将第一洗液与经过步骤四处理的样本混合，第一洗液用于洗涤除去沉淀得到的核酸中的蛋白质。在一个示例中，第一洗液中包括第二表面活性剂。较佳地，第二表面活性剂在第一洗液中的质量浓度为0.1％-6％。较佳地，第二表面活性剂为苯扎溴铵、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。在一个示例中，第二表面活性剂为苯扎溴铵，能够在保证所提取的核酸完整的前提下，提高核酸提取的纯度。

在一些示例中，该方法还包括步骤六：将第二洗液与经过步骤五处理所述样本混合，进行洗涤。第二洗液用于洗涤除去沉淀得到的核酸中的盐离子。在一个示例中，第二洗液包含有机醇。有机醇可以是亲水性较高的醇类，如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇等，其中乙醇有较高的亲水性，其能够除去部分盐离子。在一个示例中，第二洗液还包括非离子型表面活性剂，非离子表面活性剂如聚山梨醇酯-20、聚乙二醇辛基苯基醚等。第二洗液中含有非离子表面活性剂可以进一步洗涤除去沉淀得到的核酸中的蛋白质。在另一个示例中，第二洗液还包括Tris-HCl缓冲液，可以洗去上个步骤残留的试剂。在一个示例中，可以使用含有不同成分的第二洗液对步骤五处理的核酸进行多次洗涤，以更好地去除杂质。例如，使用含有有机醇，如乙醇，非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯-20，以及Tris-HCl缓冲液的第二洗液对经过步骤五处理的样本进行一次洗涤，使用含有有机醇，如乙醇，以及Tris-HCl缓冲液的第二洗液进行第二次洗涤。可以根据实验需要选择第二洗液的成分以及洗涤的顺序和次数。

本发明的核酸提取方法，使用过氧化氢溶液液化核酸样本，能够在更短的时间内更温和地液化核酸样本，减少核酸损失，提高核酸提取效率；改进后的裂解液能够更好地裂解样本中的菌体以及分离蛋白质和核酸，进一步减少核酸损失，改进后的第一洗液能够更好地除去杂质，提高提取的核酸的纯度，多个步骤相互作用，提高核酸提取得率、提高核酸提取效率和提高提取的核酸的纯度。

以下通过具体实施例对本发明做详细的阐述，应当理解，实施例仅是示例性的。实施例中涉及的材料、试剂以及序列等，如无特殊说明，可自行制备、合成或者通过市售途径获取。

实施例1

本实施例涉及痰液样本液化的具体操作步骤及相关结果。

1.痰液液化

1.1分别往等体积的痰液样本1、痰液样本2、痰液样本3、痰液样本4和痰液样本5加入10⁸CFU的LP菌液，混合均匀；

1.2分别往痰液样本1、痰液样本2、痰液样本3、痰液样本4和痰液样本5加入等体积的1mol/LNaOH溶液、0.1mol/LH₂O₂溶液、0.3mol/LH₂O₂溶液、1mol/LH₂O₂溶液和2mol/LH₂O₂溶液，观察样本状态，当样本无明显固体杂质且不粘稠时，表示样本完全液化。经观察，加入NaOH溶液的痰液样本1在30min时完全液化，加入0.1mol/LH₂O₂溶液的痰液样本2在10min时完全液化，加入0.3mol/LH₂O₂溶液的痰液样本3在1min时完全液化，加入1mol/LH₂O₂溶液的痰液样本4在0.5min时完全液化，加入2mol/LH₂O₂溶液的痰液样本5在0.5min时完全液化。本实施例取痰液样本1和痰液样本3分别离心弃掉上清，得到液化样本1和液化样本2。

2.样本预处理

2.1分别往液化样本1和液化样本2加入500μL1×PBS震荡混匀，10000×g离心5min，弃掉上清；

2.2在2.1的经处理的液化样本1和液化样本2中分别加入110μL裂解液，混合均匀，加入70μL预处理试剂(其中溶菌酶的质量浓度为10mg/mL)，37℃温育30min；

3.核酸提取

3.1在2.2的经处理的液化样本1和液化样本2中分别加入300μL裂解液(裂解液中含有苯扎溴铵)，混合均匀后加入20μL蛋白酶K，70℃放置15min；

3.2室温放置3min，待管内温度降至室温，分别加入350μL异丙醇，混合均匀；

3.3分别加入40μL硅基包被的磁珠，混合均匀，室温放置5min；

3.4放入磁力架，静置3min，弃上清；

3.5分别加入700μL第一洗液(第一洗液中含有苯扎溴铵)，充分震荡混匀，放入磁力架，静置2min，弃上清；

3.6分别加入700μL第二洗液A，充分震荡混匀，放入磁力架，静置2min，弃上清；

3.7分别加入700μL第二洗液B，充分震荡混匀，放入磁力架，静置2min，弃上清；

3.8

3.9打开EP管盖，室温晾干5min，避免过度干燥磁珠；

3.10分别加入100μL洗脱液，充分混匀，放入磁力架，吸出上清，得到核酸样本1和核酸样本2。

4.核酸提取结果测定

4.1对核酸提取得到的核酸样本1和核酸样本2进行Qubit检测(核酸浓度检测)、Nanodrop检测(核酸浓度检测)、OD260/280比值(核酸纯度的指示值)和OD260/230比值(核酸纯度的指示值)的测定，结果如表1：

表1

注：其中纯LP菌液1和纯LP菌液2为成分和含量相同的未经处理的菌液。

4.2对核酸提取得到的核酸样本1和核酸样本2进行琼脂糖凝胶电泳，得到的结果如图1。

从4.1和4.2的结果中可看到，使用氢氧化钠溶液液化痰液样本的液化时间长于使用过氧化氢溶液液化的时间，并且从Qubit检测(核酸浓度检测)和Nanodrop检测(核酸浓度检测)的测定结果可得到，使用过氧化氢溶液液化痰液样本后经过核酸提取到的核酸浓度远高于使用氢氧化钠溶液液化后提取的核酸浓度。而在纯度方面，OD260/280比值指示两者的核酸纯度基本一致，OD260/230比值指示使用过氧化氢溶液液化痰液样本后经过核酸提取到的核酸纯度高于使用氢氧化钠溶液液化后提取的核酸，上述结果表明使用过氧化氢溶液液化痰液样本核酸损失减少，核酸提取得率高，并且液化时间短，使得核酸提取效率提高，并且在纯度方面也具备一定优势。从琼脂糖凝胶电泳的结果可看到，核酸样本1和核酸样本2均仅有明显一条较为完整、略脱尾的电泳条带，无其他弥散现象和小片段条带，表明电泳的DNA完整性较好，本发明的核酸提取方法提取的核酸完整性较好。

实施例2

本实施例将本发明的试剂盒与其他商品化试剂盒(Tiangen、GeneOptimal和Vazyme)提取痰液样本中革兰阳性菌和革兰阴性菌核酸的结果进行比较。其中本实施例使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，下文简写为LP)作为革兰阳性菌代表，使用大肠杆菌(E.coli，下文简写为EC)作为革兰阴性菌代表。

本实施例中根据试剂盒类型和菌种类型进行实施分组，具体分组如表2：

表2

注：其中W、N表示不同厂家的磁珠。

根据各试剂盒的操作步骤完成核酸提取，对各组提取到的细菌核酸(gDNA)进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，结果见附图2，测定Qubit检测(核酸浓度检测)、Nanodrop检测(核酸浓度检测)、OD260/280比值(核酸纯度的指示值)和OD260/230比值(核酸纯度的指示值)，结果见表3。

表3

从琼脂糖凝胶电泳(图中M为50bpMarker)的结果(附图2)可看到，四种试剂盒提取的细菌gDNA中，参看附图2中5、6和7道，Tiangen试剂盒提取的LP核酸在电泳时加样孔有明显荧光，表明提取的核酸中有较为明显的蛋白质残留，蛋白质与片段较大的核酸结合，使得核酸不能跑出加样孔，因而在孔中产生荧光，而且显示多条较暗条带，表明提取的核酸中出现小片段DNA，说明提取的LPgDNA有断裂、蛋白含量较高；参看附图2中8-13道，GeneOptimal和Vazyme试剂盒提取的核酸几乎看不到加样孔出现荧光，说明这两款试剂盒提取的核酸中蛋白质残留较少，去蛋白比较有优势；参看附图2中1-4道，可看到虽有较为明显的拖尾现象，但均仅有一条条带，表明无其他小片段DNA出现，本发明试剂盒提取的核酸完整性较好，且加样孔无明显荧光，表明蛋白杂质少，提取的核酸纯度较高。这可能是由于本发明试剂盒优化了第一洗液，能够在保证核酸完整的前提下，较好地除去蛋白杂质，提高核酸提取的纯度。

从表3中Qubit检测、Nanodrop检测、OD260/280比值和OD260/230比值的测定结果来看，可看到本发明试剂盒提取革兰阳性菌和革兰阴性菌的核酸浓度均明显高于其他试剂盒，且提取的核酸纯度均较高。本发明试剂盒对液化处理方法、预处理试剂、裂解液、第一洗液和第二洗液等都进行了优化改进，使得液化过程耗时短、液化完全并且核酸损失减少，改进的裂解液裂解效果较好，进一步减少核酸损失，改进后的洗液能够更好地去除蛋白、盐离子之类的杂质，提高提取的核酸的纯度，从实验结果可看到多种试剂的改进共同作用，提高了核酸提取的浓度和纯度，提高了核酸提取效率和核酸提取得率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施方式”、“一些实施方式”、“示意性实施方式”、“示例”、“某些示例”、“具体示例”或“实施例”等的描述意指结合所述实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施方式，可以理解的是，上述实施方式是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施方式进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于核酸样本提取，

所述试剂盒包括过氧化氢溶液，所述过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.1-2mol/L，

任选地，所述过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.3-1mol/L。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括第一表面活性剂，

任选地，所述第一表面活性剂在所述裂解液中的质量浓度为0.1％-10％；

任选地，所述第一表面活性剂为离子型表面活性剂；

任选地，所述第一表面活性剂为苯扎溴铵、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液还包括蛋白质变性剂，

任选地，所述蛋白质变性剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、重金属盐或尿素中的至少一种；

任选地，所述裂解液还包括蛋白酶；

任选地，所述蛋白酶为蛋白酶K。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一洗液，

任选地，所述第一洗液包括第二表面活性剂；

任选地，所述第二表面活性剂在所述第一洗液中的质量浓度为0.1％-6％；

任选地，所述第二表面活性剂为苯扎溴铵、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二洗液，

任选地，所述第二洗液包含有机醇；

任选地，所述试剂盒还包括预处理试剂；

任选地，所述预处理试剂的使用浓度为1-3mg/mL；

任选地，所述预处理试剂包括溶菌酶；

任选地，所述预处理试剂还包括金属离子螯合剂；

任选地，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸中的至少一种；

任选地，所述试剂盒还包括沉淀剂；

任选地，所述沉淀剂为有机醇。

7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸样本为痰液样本、唾液样本或脓液样本，

任选地，所述核酸样本中含有菌体核酸；

任选地，所述核酸样本含有过氧化氢酶。

8.一种核酸提取方法，其特征在于，包括

步骤一：将权利要求1-6任一项所述试剂盒中的过氧化氢溶液与核酸样本进行混合，提取所述核酸样本中的核酸，

任选地，所述过氧化氢溶液与所述样本混合的时间为0.1～10min；

任选地，所述方法还包括步骤二：将预处理试剂与所述样本混合。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤三：将裂解液与经过步骤二处理的所述样本混合，

任选地，所述方法还包括步骤四：将沉淀剂与经过步骤三处理的所述样本混合。

10.根据权利要求8或9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤五：将第一洗液与经过步骤四处理的所述样本混合，

任选地，所述方法还包括步骤六：将第二洗液与经过步骤五处理所述样本混合。