CN116949036B - 一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒及提取方法，属于核酸提取技术领域，试剂盒包含设置在盒体内的以下组分：预处理液、裂解液、洗涤液、清洗液、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；预处理液包含以下浓度的组分：3.5‑4.5M异硫氰酸胍，8‑12mM EDTA，0.8‑1.2%质量百分比的Triton‑X100，45‑55mM DTT，18‑22mM Tris‑HCl，所述EDTA的pH为7.0‑8.0，Tris‑HCl的pH为6.6‑7.0；裂解液包含以下浓度的组分：0.4‑0.6M异硫氰酸胍，8‑12mM EDTA，0.8‑1.1%体积百分比的Triton‑X100，0.8‑1.1%质量百分比的SDS，38‑42%体积百分比的异丙醇，0.1‑0.2%质量百分比的磁珠，18‑22mM Tris‑HCl，所述EDTA的pH为7.0‑8.0，Tris‑HCl的pH为6.6‑7.0。本发明能够弥补腹水核酸提取产品的缺乏，应对不同类型腹水的提取，提供一种适用性广、快速、高效且成本低廉的提取方法和试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒及提取方法。
背景技术
生理状态下，机体腹腔内含有少量液体，对肠道蠕动起润滑作用，任何病理状态下使腹腔内积液增加超过200mL时，称为腹水。常见的产生腹水的病因有心血管病、肝硬化、腹膜病、肾损伤、恶性肿瘤等。其中由结核分枝杆菌导致的结核性腹膜炎则可以通过对腹水中进行结核分枝杆菌核酸检测进行诊断。此外，腹水也是包括结直肠癌等恶性肿瘤的一个常见体征，由于细胞学诊断联合活检的方法依然不能准确诊断良恶性肿瘤，因此目前也发展出从腹水中检测游离DNA的癌性突变作为其中一种诊断指标，以辅助临床良恶性腹水鉴别诊断。尤其在动物医学领域，猫冠状病毒（FCoV）致病性突变导致的猫传染性腹膜炎极为常见，由于FCoV往往在母体中就隐藏在体内，可能携带、传播但并不致病，当猫应激导致FCoV产生致病性突变时，则可能转化为致死率极高的猫传染性腹膜炎。因此临床上也常用猫腹水样本来进行猫冠状病毒的核酸检测。因此，利用腹水进行快速、高效的核酸提取，对依赖于腹水样本进行核酸检测的疾病诊断有着重要的意义。
然而腹水本身就是病理产物，由于不同的疾病会导致不同类型的腹水，例如血性腹水、脓性腹水、乳糜腹水等，成分也复杂多样，所以目前专门针对腹水进行核酸提取的方法并不多见，往往只能通过一些通用的体液提取方法或试剂盒进行提取，但这些方法可能无法针对性清除腹水样本中的PCR抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒及提取方法，其能够一定程度上解决上述问题，弥补腹水核酸提取产品的缺乏，应对不同类型腹水的提取，提供一种适用性广、快速、高效且成本低廉的提取方法和试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，包含设置在盒体内的以下组分：预处理液、裂解液、洗涤液、清洗液、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
预处理液包含以下浓度的组分：3.5-4.5M 异硫氰酸胍，8-12mM EDTA，0.8-1.2%质量百分比的Triton-X100，45-55mM DTT，18-22mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为7.0-8.0，Tris-HCl的pH为6.6-7.0；
裂解液包含以下浓度的组分：0.4-0.6M 异硫氰酸胍，8-12mM EDTA，0.8-1.1%体积百分比的Triton-X100，0.8-1.1%质量百分比的SDS，38-42%体积百分比的异丙醇，0.1-0.2%质量百分比的磁珠，18-22mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为7.0-8.0，Tris-HCl的pH为6.6-7.0；
洗涤液包含以下浓度的组分：0.4-0.6M 异硫氰酸胍，8-12mM EDTA，45-55%体积百分比的无水乙醇，18-22mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为7.0-8.0，Tris-HCl的pH为7.0-8.0；
清洗液包含以下浓度的组分：75-85%体积百分比的无水乙醇，8-12mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为7.0-8.0；
洗脱液包含以下浓度的组分：8-12mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为7.0-8.0；
蛋白酶K浓度为18-22mg/mL；
所述磁珠为硅羟基磁珠。
其中，预处理液包含以下浓度的组分：4M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，1%质量百分比的Triton-X100，50mM DTT，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为6.8。
进一步限定，裂解液包含以下浓度的组分：0.5M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，1%体积百分比的Triton-X100，1%质量百分比的SDS，40%体积百分比的异丙醇，0.1%质量百分比的磁珠，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为6.8。
进一步限定，洗涤液包含以下浓度的组分：0.5M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，50%体积百分比的无水乙醇，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为8.0。
进一步限定，清洗液包含以下浓度的组分：80%体积百分比的无水乙醇，10mMTris-HCl，所述Tris-HCl的pH为8.0。
进一步限定，洗脱液包含以下浓度的组分：10mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为8.0。
进一步限定，蛋白酶K浓度为20mg/mL。
另外，本发明还公开了一种快速从腹水中提取核酸的提取方法，包括使用上述的快速从腹水中提取核酸的试剂盒；
具体方法如下：
a.向提取容器中依次加入预处理液、腹水，涡旋混匀后放置2min，离心取上清；
b.在步骤a中得到的液体中依次加入蛋白酶K、裂解液、磁珠，涡旋混匀3min后放置5min，分离磁珠后弃液体；
c.向步骤b中得到的磁珠中加入洗涤液，涡旋混匀后分离磁珠，弃液体；
d.向步骤c中得到的磁珠中加入清洗液，涡旋混匀后分离磁珠，弃液体；重复该步骤一次，
e.向步骤d中得到的磁珠中加入洗脱液，涡旋混匀后弃磁珠，即得样本中总核酸溶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
利用本发明可快速提取腹水中核酸，操作简便，仅需不到15min即可完成从采样到获取核酸溶液的全流程提取，与常规1小时左右的提取时间相比大幅缩短；本发明通过配方优化，能够稳定从仅200μL腹水中富集微量核酸，减少样本量需求，有效清除干扰物质，提取效率明显高于普通商业试剂盒；本发明针对性的对腹水样本的成分设计提取方法和试剂盒，弥补市场腹水样本核酸提取试剂盒的缺乏。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中提取到的样本1~4对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图2为实施例1中提取到的样本5~8对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图3为实施例1中提取到的样本9~12对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图4为实施例1中提取到的样本13~16对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图5为实施例1中提取到的样本17~20对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图6为对比例1中提取到的样本1~4对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图7为对比例1中提取到的样本5~8对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图8为对比例1中提取到的样本9~12对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图9为对比例1中提取到的样本13~16对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线；
图10为对比例1中提取到的样本17~20对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明实施例的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
实施例1
本实施例从腹水中提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包括预处理液、裂解液、洗涤液、清洗液、洗脱液、蛋白酶K和磁珠，采用样本为临床诊断为猫传染性腹膜炎的腹水样本，编号为样本1~20。
其中，预处理液包含以下浓度的组分：4M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，1%质量百分比的Triton-X100，50mM DTT，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为6.8；
其中，裂解液包含以下浓度的组分：0.5M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，1%体积百分比的Triton-X100，1%质量百分比的SDS，40%体积百分比的异丙醇，0.1%质量百分比的磁珠，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为6.8；
其中，洗涤液包含以下浓度的组分：0.5M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，50%体积百分比的无水乙醇，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为8.0；
其中，清洗液包含以下浓度的组分：80%体积百分比的无水乙醇，10mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为8.0；
其中，洗脱液包含以下浓度的组分：10mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为8.0；
所述蛋白酶K浓度为20mg/mL；
所述磁珠为硅羟基磁珠。
提取步骤为：
（1）取200μL拭子样本液，加入200μL预处理液，涡旋混匀后放置2min，离心1min，取上清；
（2）向步骤（1）中依次加入20μL蛋白酶K、500μL裂解液、20μL磁珠，涡旋混匀3min后放置5min，分离磁珠后弃液体；
（3）向步骤（2）中加入500μL洗涤液，涡旋混匀后分离磁珠，弃液体；
（4）向步骤（3）中加入500μL清洗液，涡旋混匀后分离磁珠，弃液体，重复该步骤一次；
（5）向步骤（4）中得到的磁珠中加入100μL洗脱液，涡旋混匀后弃磁珠，即得样本中核酸溶液。
以提取到的核酸溶液为模板，以猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的引物和探针进行实时荧光PCR。
对比例1
以商业试剂盒（诺唯赞VAMNE Magnetic Pathogen DNA/RNA Kit）对猫腹水样本提取核酸的一个对比例，所述商业试剂盒为体液样本通用磁珠法DNA/RNA共提试剂盒，采用样本为实施例1中的样本，编号为样本1~20，按照试剂盒说明书操作。
以提取到的核酸溶液为模板，以猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的引物和探针进行实时荧光PCR。
实验结果如下：
实施例1中提取到的样本1~4对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图1所示；
样本5~8对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图2所示；
样本9~12对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图3所示；
样本13~16对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图4所示；
样本17~20对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图5所示；
对比例1中提取到的样本1~4对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图6所示；
样本5~8对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图7所示；
样本9~12对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图8所示；
样本13~16对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图9所示；
样本17~20对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的扩增曲线如图10所示；
实施例1和对比例1中提取到的样本1~20对猫GAPDH基因DNA、猫B2M基因RNA和FCoV基因组RNA的检测Ct值结果如表1所示：
表1为实施例1和对比例1 Ct值
由图1~图10以及表1可知，20个猫腹水样本提取后，实施例1中猫GAPDH基因DNA和猫B2M基因RNA的Ct值全部小于对比例1。
而对于FCoV基因组RNA，对比例1在20个样本中仅检出8个，而实施例1则检出了19个，检出率达到95%，除样本9的Ct比对比例1大0.11以外，其他Ct值均小于对比例1。
实施例1和对比例1中20个样本分为5次，每次4组样本进行提取，实施例1每次提取4个样本平均耗时15min左右，对比例1则需要100min左右。
因此，本发明提供的从腹水中提取核酸的方法和试剂盒，不仅明显缩短了提取时间，还比目前市面针对体液样本通用DNA/RNA提取试剂盒提取效率明显提高，通过FCoV基因组RNA的提取效果对比，尤其对低浓度的核酸也有更优的富集效果。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，其特征在于：包含设置在盒体内的以下组分：预处理液、裂解液、洗涤液、清洗液、洗脱液、蛋白酶K和磁珠；
预处理液包含以下浓度的组分：3.5-4.5M 异硫氰酸胍，8-12mM EDTA，0.8-1.2%质量百分比的Triton-X100，45-55mM DTT，18-22mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为7.0-8.0，Tris-HCl的pH为6.6-7.0；
裂解液包含以下浓度的组分：0.4-0.6M 异硫氰酸胍，8-12mM EDTA，0.8-1.1%体积百分比的Triton-X100，0.8-1.1%质量百分比的SDS，38-42%体积百分比的异丙醇，0.1-0.2%质量百分比的磁珠，18-22mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为7.0-8.0，Tris-HCl的pH为6.6-7.0；
洗涤液包含以下浓度的组分：0.4-0.6M 异硫氰酸胍，8-12mM EDTA，45-55%体积百分比的无水乙醇，18-22mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为7.0-8.0，Tris-HCl的pH为7.0-8.0；
清洗液包含以下浓度的组分：75-85%体积百分比的无水乙醇，8-12mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为7.0-8.0；
洗脱液包含以下浓度的组分：8-12mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为7.0-8.0；
蛋白酶K浓度为18-22mg/mL；
所述磁珠为硅羟基磁珠。
2.根据权利要求1所述的一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，其特征在于：预处理液包含以下浓度的组分：4M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，1%质量百分比的Triton-X100，50mMDTT，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为6.8。
3.根据权利要求2所述的一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，其特征在于：裂解液包含以下浓度的组分：0.5M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，1%体积百分比的Triton-X100，1%质量百分比的SDS，40%体积百分比的异丙醇，0.1%质量百分比的磁珠，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为6.8。
4.根据权利要求3所述的一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，其特征在于：洗涤液包含以下浓度的组分：0.5M 异硫氰酸胍，10mM EDTA，50%体积百分比的无水乙醇，20mM Tris-HCl，所述EDTA的pH为8.0，Tris-HCl的pH为8.0。
5.根据权利要求4所述的一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，其特征在于：清洗液包含以下浓度的组分：80%体积百分比的无水乙醇，10mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为8.0。
6.根据权利要求5所述的一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，其特征在于：洗脱液包含以下浓度的组分：10mM Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH为8.0。
7.根据权利要求6所述的一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒，其特征在于：蛋白酶K浓度为20mg/mL。
8.一种快速从腹水中提取核酸的提取方法，其特征在于：包括使用权利要求1-7中任意一项所述的快速从腹水中提取核酸的试剂盒；
具体方法如下：
a.向提取容器中依次加入预处理液、腹水，涡旋混匀后放置2min，离心取上清；
b.在步骤a中得到的液体中依次加入蛋白酶K、裂解液、磁珠，涡旋混匀3min后放置5min，分离磁珠后弃液体；
c.向步骤b中得到的磁珠中加入洗涤液，涡旋混匀后分离磁珠，弃液体；
d.向步骤c中得到的磁珠中加入清洗液，涡旋混匀后分离磁珠，弃液体；重复该步骤一次，
e.向步骤d中得到的磁珠中加入洗脱液，涡旋混匀后弃磁珠，即得样本中总核酸溶液。
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