CN116948998B - 一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR及其编码基因和应用 - Google Patents
一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR及其编码基因和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116948998B CN116948998B CN202311027571.XA CN202311027571A CN116948998B CN 116948998 B CN116948998 B CN 116948998B CN 202311027571 A CN202311027571 A CN 202311027571A CN 116948998 B CN116948998 B CN 116948998B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- flavanone
- reductase
- csfcr
- cleavage
- ring cleavage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 title claims abstract description 39
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 title claims abstract description 39
- ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N SJ000286395 Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 238000003385 ring cleavage reaction Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 150000002207 flavanone derivatives Chemical class 0.000 title description 22
- FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N (S)-naringenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims abstract description 12
- WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N naringenin Natural products C1(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC(C1)C1=CC=C(CC1)O WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000007625 naringenin Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 229940117954 naringenin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000001606 7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 claims abstract description 11
- -1 flavanone compound Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N naringin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC=2C=C3O[C@@H](CC(=O)C3=C(O)C=2)C=2C=CC(O)=CC=2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229930019673 naringin Natural products 0.000 claims abstract description 11
- 229940052490 naringin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 150000002208 flavanones Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 18
- QGGZBXOADPVUPN-UHFFFAOYSA-N dihydrochalcone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)CCC1=CC=CC=C1 QGGZBXOADPVUPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 17
- PXLWOFBAEVGBOA-UHFFFAOYSA-N dihydrochalcone Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1C1=C(O)C=CC(C(=O)CC(O)C=2C=CC(O)=CC=2)=C1O PXLWOFBAEVGBOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N neohesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)OC3C(C(O)C(O)C(C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000001100 (2S)-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 abstract description 3
- QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N Hesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)C(C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 abstract description 3
- QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N aurantiamarin Natural products COc1ccc(cc1O)[C@H]1CC(=O)c2c(O)cc(O[C@@H]3O[C@H](CO[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]4O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)cc2O1 QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N 0.000 abstract description 3
- APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N clematine Natural products COc1cc(ccc1O)[C@@H]2CC(=O)c3c(O)cc(O[C@@H]4O[C@H](CO[C@H]5O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]5O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)cc3O2 APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N 0.000 abstract description 3
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 abstract description 3
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 abstract description 3
- QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N hesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N 0.000 abstract description 3
- VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N hesperidin Natural products COc1cc(ccc1O)C2CC(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(O)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229940025878 hesperidin Drugs 0.000 abstract description 3
- ARGKVCXINMKCAZ-UZRWAPQLSA-N neohesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UZRWAPQLSA-N 0.000 abstract description 3
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 abstract description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 2
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 abstract 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 33
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 29
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 16
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 16
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 3
- 241001134569 Flavonifractor plautii Species 0.000 description 3
- 241000904817 Lachnospiraceae bacterium Species 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241001508458 Clostridium saccharoperbutylacetonicum Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YFKBXYGUSOXJGS-UHFFFAOYSA-N 1,3-Diphenyl-2-propanone Chemical class C=1C=CC=CC=1CC(=O)CC1=CC=CC=C1 YFKBXYGUSOXJGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000242493 Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4(HMT) Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 239000001329 FEMA 3811 Substances 0.000 description 1
- 239000001183 FEMA 4495 Substances 0.000 description 1
- 239000001689 FEMA 4674 Substances 0.000 description 1
- 241001247262 Fabales Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001121408 Homo sapiens L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026388 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241000218376 Magnoliales Species 0.000 description 1
- CWBZAESOUBENAP-QVNVHUMTSA-N Naringin dihydrochalcone Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC=2C=C(O)C(C(=O)CCC=3C=CC(O)=CC=3)=C(O)C=2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O CWBZAESOUBENAP-QVNVHUMTSA-N 0.000 description 1
- 241000220221 Rosales Species 0.000 description 1
- 101100012902 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FIG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100233916 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) KAR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000134968 Sapindales Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930182647 Trilobatin Natural products 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000006122 isoprenylation Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- ITVGXXMINPYUHD-CUVHLRMHSA-N neohesperidin dihydrochalcone Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1CCC(=O)C(C(=C1)O)=C(O)C=C1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ITVGXXMINPYUHD-CUVHLRMHSA-N 0.000 description 1
- 229940089953 neohesperidin dihydrochalcone Drugs 0.000 description 1
- 235000010434 neohesperidine DC Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- GSTCPEBQYSOEHV-QNDFHXLGSA-N trilobatin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C=C1O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 GSTCPEBQYSOEHV-QNDFHXLGSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR及其编码基因和应用，黄酮裂解还原酶可将黄烷酮类化合物中C环进行裂解还原；通过在重组表达系统中高效地转化包括柚皮素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等不同黄烷酮活性物质，从而获得另一种天然产物结构即二氢查耳酮活性化合物，实现化合物的定向生物转化。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR，还涉及编码黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR的基因，还涉及黄酮裂解还原酶在催化生成二氢查耳酮类化合物中的应用。
背景技术
二氢查耳酮类物质作为开链的类黄酮，主要来源于无患子目、蔷薇目、木兰目及豆目的植物中。其具有1,3-二苯基丙酮的结构骨架，在植物合成途径中，经过糖基化、羟基化、甲基化和异戊二烯化的结构修饰进一步提高了二氢查耳酮类物质的多样化。二氢查耳酮类物质已经发展为具有开发潜力的一类甜味剂，如新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮以及三叶苷等。其热量低、甜度高，大约是蔗糖的100～1000倍。同时，二氢查耳酮类化合物也具有一定的生理活性，如降血糖、抗氧化、抗肿瘤等。
目前其合成方法主要依赖于植物提取及化学合成。植物提取的工艺流程复杂，分离纯化成本较高。而化学合成主要以黄烷酮作为底物，经过碱液开环、氢气加氢后得到相应产物，该反应过程涉及大量有机溶剂和危险气体的使用，增加了合成过程风险。目前，生物法从头合成二氢查耳酮是基于植物代谢途径中酶的异源表达及组装，其中涉及到多个酶的级联反应，反应途径复杂，产量低，且目前不能实现大规模的工业化应用。因此迫切需要开发一种高效的生物合成二氢查耳酮的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR，本发明的目的之二在于提供编码所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR的基因，本发明的目的之三在于提供所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR在催化黄烷酮类化合物还原为二氢查耳酮类化合物中的应用；本发明的目的之四在于提供含有所述基因的重组载体；本发明的目的之五在于提供表达所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR的宿主；本发明的目的之六在于提供一种生产二氢查耳酮类化合物的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR，所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR选自：
(1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；
(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有黄烷酮C环裂解还原酶功能的多肽。
本发明优选的，所述一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR选自以下形式：菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液或其组合。
2、编码所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR的基因，所述基因选自：
(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的序列；
(2)或与SEQ ID NO.2所示序列同源性≥95％且编码SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列。
3、所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR在催化黄烷酮类化合物还原为二氢查耳酮类化合物中的应用。
本发明优选的，所述黄烷酮类化合物的结构如式Ⅰ，所述二氢查耳酮类化合物如式Ⅱ；
其中R1、R2选自H、OH或OCH3；R3选自H、OH、O-芸香糖苷、O-新橙皮苷或O-葡萄糖苷。
4、含有所述基因的重组载体。
本发明优选的，所述载体为表达载体、穿梭载体或整合载体。
5、表达所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR的宿主。
本发明优选的，所述宿主为真核细胞或原核细胞，所述真核细胞为酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞；所述原核细胞为大肠杆菌。
6、一种生产二氢查耳酮类化合物的方法，将所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR与黄烷酮类化合物，在含有NADH和磷酸钠缓冲液条件下反应，
所述黄烷酮类化合物的结构如式Ⅰ所示：
其中R1、R2选自H、OH或OCH3；R3选自H、OH、O-芸香糖苷、O-新橙皮苷或O-葡萄糖苷。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR，该酶为黄酮裂解还原酶CsFCR，所述裂解还原酶来源于Clostridium sp.、Lachnospiraceaebacterium、Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4(HMT)、Flavonifractorplautii等菌株，黄酮裂解还原酶CsFCR可将黄烷酮类化合物中C环进行裂解还原。通过在重组表达系统中高效地转化包括柚皮素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等不同黄烷酮活性物质，从而获得另一种天然产物结构即二氢查耳酮活性化合物，实现化合物的定向生物转化。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为CSFCR蛋白表达的SDS-PAGE电泳图；
图2为CsFCR生物转化柚皮素的HPLC图谱及产物的MS图谱(A：HPLC图谱；B：MS图谱)；
图3为CsFCR生物转化柚皮苷的HPLC图谱及产物的MS图谱(A：HPLC图谱；B：MS图谱)。
图4为黄酮裂解还原酶生物转化柚皮素、柚皮苷的反应途径示意图。
图5为CsFCR黄酮裂解还原酶酶活测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明从梭状芽抱杆菌(Clostridium sp.)中发现了一个特殊的黄酮裂解还原酶，命名为CsFCR，进一步研究发现在毛螺旋菌(Lachnospiraceae bacterium)、丁基乙酰糖合梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)和普氏梭杆菌Flavonifractorplautii等菌株菌存在黄酮裂解还原酶。
黄酮裂解酶编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例1、含不同黄酮裂解还原酶基因的重组大肠杆菌构建
根据梭状芽抱杆菌(Clostridium sp.)、毛螺旋菌(Lachnospiraceaebacterium)、丁基乙酰糖合梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)和普氏梭杆菌Flavonifractor plautii等菌株中的黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR序列，设计针对大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，优化后的基因序列分别如SEQ ID No.2中所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
将经过密码子优化的黄酮裂解还原酶基因合成后，克隆到pET21c质粒的NdeI和BamHI之间。具体的克隆过程为：将合成后的酶基因进行目的片段的扩增，将pET21c质粒分别用Takara公司的Quickcut NdeI和BamHI进行双酶切，37℃孵育1h后，对载体和目的基因进行DNA琼脂糖凝胶电泳，然后进行凝胶回收。将纯化的目的基因片段和pET21c载体进行连接反应。连接采用Exnase II，连接反应在37℃孵育30min。获得的连接产物转化入E.coliDH10B的感受态细胞中，并在含终浓度100μg/mL羧苄青霉素的LB平板上筛选。获得的阳性转化子进行测序分析，得到正确转化子命名为E.coli BL21(DE3)(pET21c-CsFCR)。正确的转化子转化至E.coli BL21(DE3)的感受态中，对其进行诱导表达，用聚丙烯酰胺电泳检测表达情况(图1)。
实施例2、含黄酮裂解还原酶基因的重组大肠杆菌摇瓶培养
挑选重组大肠杆菌单菌落接种至含有5mL LB培养基(加入终浓度100μg/mL羧苄青霉素)的25mL培养管中，37℃、220rpm培养12h。然后，转移1％的种子液接种至含30mL TB培养基(加入终浓度100μg/mL羧苄青霉素)的摇瓶中，37℃、220rpm培养至OD600为0.6～0.8后，培养温度降低至30℃，加入终浓度为0.2mM的IPTG，继续培养12h后，离心收获培养的菌体。获得的菌体用得到的菌体用去离子水清洗，细胞沉淀用50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)重悬后，用于催化活性、底物转化的测试。
实施例3、全细胞转化黄烷酮生产二氢查耳酮
黄酮裂解还原酶重组大肠杆菌细胞在体外按照以下反应体系进行功能验证(1mL)：50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)，重组大肠杆菌细胞(OD600＝10)，2mM NADH，2mM柚皮素、柚皮苷等黄烷酮底物。加入等体积甲醇终止反应，震荡混匀，12000rpm离心10分钟，取上清过0.22μm有机滤膜，利用液相色谱-质谱检测反应产物组成。仪器型号：LC-20。进样量10μL，色谱柱：中谱红AQ-C18(5μm，250×4.6mm)，柱温：40℃。色谱条件：UV 280nm，流动相：(A)：水(含1％乙酸)，(B)：乙腈，流速：1mL/min，洗脱程序：0-10min，5％线性增长至50％B；10-25min，线性增长至58％B。将含有空质粒pET21c的BL21(DE3)进行诱导，取重组细胞与不同的底物按照以上条件进行反应，以此反应体系作为对照。
液质联用检测结果显示(图2)，在柚皮素的催化体系中，实验组在15.8min多一个明显的产物峰，并且底物峰面积明显降低，表明CsFCR确实能够转化柚皮素。
液质联用检测结果显示(图3)，在柚皮苷的催化体系中，实验组在13.0min多一个明显的产物峰，并且底物峰面积明显降低，表明CsFCR确实能够转化柚皮苷。
黄酮裂解还原酶生物转化柚皮素、柚皮苷的反应途径示意图如图4所示。
同时CsFCR也能以橙皮苷、新橙皮苷等为底物还原为二氢查耳酮类化合物，表明CsFCR能够实现黄烷酮类系列化合物定向转化为二氢查耳酮类化合物。
实施例4、含黄酮裂解还原酶基因的重组大肠杆菌酶活的测定
酶活测定方法为：在10mL反应体系中，加入100μL 2mM柚皮素、柚皮苷等黄烷酮底物，100μL 2mM的辅因子NADH，9.8mL 50mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.5)重悬的重组大肠杆菌粗酶液。以上混合物混合均匀后，在30℃孵育1h后，加入等体积的甲醇终止反应。通过测定二氢查耳酮产物的浓度计算黄酮裂解还原酶的酶活。重组大肠杆菌的黄酮裂解还原酶的酶活测定结果如图5所示。由该图可知，其表现出了裂解还原酶的活性，且对柚皮素的酶活较高，为7.73U·mL-1。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (4)
1.黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR在催化黄烷酮类化合物还原为二氢查耳酮类化合物中的应用，其特征在于：所述黄烷酮类化合物为柚皮素和柚皮苷；黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR选自以下形式：菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液或其组合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种生产二氢查耳酮类化合物的方法，其特征在于：将权利要求1中所述的黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR与黄烷酮类化合物，在含有NADH和磷酸钠缓冲液条件下反应，所述黄烷酮类化合物为柚皮素和柚皮苷。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311027571.XA CN116948998B (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR及其编码基因和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311027571.XA CN116948998B (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR及其编码基因和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116948998A CN116948998A (zh) | 2023-10-27 |
| CN116948998B true CN116948998B (zh) | 2024-07-23 |
Family
ID=88462060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311027571.XA Active CN116948998B (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR及其编码基因和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116948998B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170025324A (ko) * | 2015-08-28 | 2017-03-08 | 이화여자대학교 산학협력단 | 해양 산성화에 대응하는 큰수지맨드라미 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008505657A (ja) * | 2004-07-10 | 2008-02-28 | ザ リサーチ ファウンデイション オブ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 組換え微生物によるフラボノイドの生成 |
| DE102012213492A1 (de) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | Symrise Ag | Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Dihydrochalkonen |
| CN103865864B (zh) * | 2014-03-04 | 2016-09-07 | 江南大学 | 一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法 |
| CN107858369B (zh) * | 2016-09-18 | 2021-03-02 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 一种提高植物对抗有害昆虫能力的基因及其应用 |
| CN106636145B (zh) * | 2017-02-10 | 2020-03-17 | 沈阳师范大学 | Nemesia strumosa KLM花青素生物合成基因及编码蛋白和应用 |
| CN113234699A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-08-10 | 西南大学 | α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用 |
| CN114107329A (zh) * | 2021-11-22 | 2022-03-01 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法及应用 |
| CN115927240B (zh) * | 2023-01-04 | 2025-07-01 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用 |
-
2023
- 2023-08-15 CN CN202311027571.XA patent/CN116948998B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170025324A (ko) * | 2015-08-28 | 2017-03-08 | 이화여자대학교 산학협력단 | 해양 산성화에 대응하는 큰수지맨드라미 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FAD-dependent oxidoreductase[Clostridium sp.SY8519];Mande SS等;Genbank Database;20220517;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116948998A (zh) | 2023-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112813131B (zh) | 一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用 | |
| WO2007142210A1 (ja) | 光学活性アルコールの製造方法 | |
| CN112143764B (zh) | 一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法 | |
| WO2021170097A1 (zh) | 新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用 | |
| CN106636020A (zh) | 短链脱氢酶的突变体、重组表达载体、基因工程菌和应用 | |
| CN109762832B (zh) | 羧酸酯酶基因、重组质粒、重组工程菌及编码蛋白和应用 | |
| Gao et al. | High-yield production of D-1, 2, 4-butanetriol from lignocellulose-derived xylose by using a synthetic enzyme cascade in a cell-free system | |
| CN103865959A (zh) | 一种生物法合成木糖酸的方法 | |
| CN106701723B (zh) | D-果糖-6-磷酸醛缩酶a突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用和反应产物 | |
| CN117143841A (zh) | 一种羧酸还原酶突变体及其应用 | |
| CN116948998B (zh) | 一种黄烷酮C环裂解还原酶CsFCR及其编码基因和应用 | |
| CN111454998A (zh) | 一种手性羟基酸酯的生物制备方法 | |
| CN112409493B (zh) | 一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用 | |
| CN114058601B (zh) | 具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶及其应用 | |
| CN107513525B (zh) | 一种d-扁桃酸脱氢酶、基因、基因工程菌及其应用 | |
| CN112410385B (zh) | 一种细胞色素p450环氧酶及其应用 | |
| CN117737014A (zh) | 烯还原酶突变体及其应用 | |
| CN112921021B (zh) | 一种醛缩酶突变体及其在生产1,3-丙二醇中的应用 | |
| CN116656634A (zh) | 双加氧酶突变体及其在合成(2s,3r)-3-羟基哌啶酸中的应用 | |
| CN110343728B (zh) | 一种生物转化合成六氢哒嗪-3-羧酸的方法 | |
| CN115820588A (zh) | 一种来源于亚麻荠的糖基转移酶及其应用 | |
| CN114606212B (zh) | 一种圆锥铁线莲来源的香豆素合酶、基因、载体及其应用 | |
| CN114686547A (zh) | 一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶a的方法 | |
| CN119432788B (zh) | (r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯生产能力提高的醇脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN115322975B (zh) | 路德维希肠杆菌氧化还原酶的突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |