CN116919879A

CN116919879A - 一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN116919879A
Application number: CN202310892869.0A
Authority: CN
Inventors: 李晓红; 张楚东; 杨雨; 谢江红
Original assignee: Qingyuan Wangsha Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningbo Hecaoji Brand Management Co ltd
Priority date: 2023-07-20
Filing date: 2023-07-20
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2043-07-20
Also published as: CN116919879B

Abstract

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物及其制备方法和用途。所述生物益生素组合物包含大豆异黄酮、大豆氨基酸、益生菌溶胞产物和益生菌发酵产物。所述生物益生素组合物由以下原料通过生物发酵技术制备而成：大豆、益生菌和益生元。本发明还涉及生物益生素组合物在制备用于调节皮肤微生态平衡的化妆品中的用途。所述化妆品具有调节皮肤微生态、维持皮肤弱酸性功能、舒缓皮肤过敏反应、抑制过敏反应中的炎症因子和促进皮肤修复的功效，用于皮肤日常护理、敏感肌护理、痤疮皮肤护理、除臭护理、婴幼儿皮肤护理或头皮护理。

Description

一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物及其制备方法和用途。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，被数十亿种微生物(细菌、酵母、真菌、病毒等)定殖，这些微生物统称为“皮肤微生物群”。在这些微生物菌群中可以分成常居菌群和暂居菌群。常居菌群由共生细菌组成，即由于寄主而存活，而不会造成任何损害。暂居菌群主要由无害的真菌、病毒和细菌组成，被称为腐生菌。该菌群不是永久的，具体取决于所进行的活动和周围条件的变化以及个体在这些条件下的暴露程度。这些微生物是生命必不可少的。在正常情况下，即当卫生状况良好时且当皮肤的常居菌群、免疫应答和屏障功能完好无损时，常居微生物和暂居微生物不会引起疾病或功能障碍。皮肤微生物群因此能够充当屏障并保护其宿主。当皮肤微生物群失衡后，肌底屏障功能会遭到破坏，丧失，导致有害菌的生长，使皮肤易出现出油、长痘、粉刺等疾病。

但是，目前流行的护肤品和化妆品的使用会破坏皮肤微生物群的平衡。如粉底的应用会特别通过干扰细菌多样性来干扰皮肤微生物群的平衡。护肤品在皮肤上的隐形化妆膜可以暂时改变皮肤的水脂平衡和产生脱皮，会破坏皮肤微生物群的平衡。

2001年，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)的咨询专家根据益生菌在食物中的健康和营养特性，将益生菌定义为“活的微生物，服用适量，会给宿主的健康带来益处”。益生菌制剂是常见的用于感染性肠炎、或有外来细菌式侵袭导致肠内菌群失衡的治疗方法。据Transparency Market Research研究显示，美国的益生菌、益生元和其他消化酸类产品市场达到了$68.8billion，在2022年甚至能达到$83.5billion。另外，将益生菌制剂直接用于皮肤，以改善皮肤微生物群的概念已经提出了很长时间，但是已成功在市场上销售且非常有效的相关产品还比较少见。

本发明人长期致力于包含益生菌的皮肤外用产品的研究。此前，以“世界长寿之乡·中国人瑞圣地”巴马瑶族自治县筛选出的多种益生菌为基础，融合现代生物发酵技术，以益生元作为益生菌的营养来源，成功开发出了一种用于调节皮肤微生态平衡的三元益生因子组合物(参见CN202310172438.7)。

在本发明中，发明人首次发现特定种类和配比的复合益生菌和益生元以及复合酶的综合作用能够对大豆原料中的大分子有机物进行分解和重组，同时经过复杂的生物化学作用能够形成一种功效更为强大的用于调节皮肤微生态平衡的生物益生素组合物。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物及其制备方法和用途。本发明所述生物益生素组合物具有调节皮肤微生态、维持皮肤弱酸性功能、舒缓皮肤过敏反应、抑制过敏反应中的炎症因子和促进皮肤修复的多重功效。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物，所述生物益生素组合物包含大豆异黄酮、大豆氨基酸、益生菌溶胞产物和益生菌发酵产物。

作为可选的方式，在上述生物益生素组合物中，所述生物益生素组合物由以下原料通过生物发酵技术制备而成：大豆、益生菌和益生元。

作为可选的方式，在上述生物益生素组合物中，所述益生菌选自以下一种或多种：鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌或乳双岐杆菌；所述益生元选自以下一种或多种：乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖或低聚麦芽糖。

作为可选的方式，在上述生物益生素组合物中，鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌分离自广西巴马长寿村健康成人群肠道；嗜热链球菌、干酪乳杆菌、乳双岐杆菌分离自新疆伊犁州牧民自制发酵酸奶。

作为可选的方式，在上述生物益生素组合物中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳双岐杆菌；所述益生元为低聚果糖和低聚半乳糖。

优选地，鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、乳双岐杆菌的重量比为1:1:1:1:1:1。

优选地，低聚果糖和低聚半乳糖的重量比为1:1。

作为可选的方式，在上述生物益生素组合物中，所述益生菌鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双岐杆菌、长双歧杆菌、嗜热链球菌的供应商是山东中科嘉亿生物工程有限公司。

所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌种保藏编号CGMCC NO.16103，保藏日期：2018年7月12日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，参见CN109055278A。

所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)菌种保藏编号CGMCC NO.21373，保藏日期：2020年12月14日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，参见CN112625983A。

所述乳双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)菌种保藏编号CGMCCNO.18093，保藏日期：2019年07月08日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，参见CN112625983A。

所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌种保藏编号CGMCC NO.18094，保藏日期：2019年07月08日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，参见CN112625983A。

所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌种保藏编号CGMCC NO.18045，保藏日期：2019年06月27日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

作为可选的方式，在上述生物益生素组合物中，所述益生菌青春双歧杆菌是青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号：CICC 6175。

作为可选的方式，在上述生物益生素组合物中，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌CGMCCNO.16103、长双歧杆菌CGMCC NO.18094、青春双歧杆菌CICC 6175、嗜热链球菌CGMCCNO.18045、干酪乳杆菌CGMCC NO.21373和乳双岐杆菌CGMCC NO.18093。

在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的生物益生素组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将大豆粉碎，热水提取，提取液加入复合酶，离心，收集大豆提取液，高温灭菌后，冷却至37℃；

(2)在步骤(1)中制备得到的大豆提取液中加入益生菌和益生元，低温发酵24h；

(3)发酵结束后，加入裂解酶对益生菌进行胞溶，溶出胞内活性物质，然后经过微孔滤膜过滤后，去除不溶物质，获得生物益生素组合物。

作为可选的方式，在上述制备方法中，步骤(1)中，复合酶选自以下一种或多种：淀粉酶、糖化酶或蛋白酶，酶解温度为55℃。

优选地，所述复合酶选自淀粉酶、糖化酶和蛋白酶。

更优选地，淀粉酶、糖化酶、蛋白酶的重量比为1:1:1。

另外优选地，以重量百分比计，所述大豆提取液的蛋白含量为0.5％。

优选地，所述热水提取的温度为90℃，提取时间为3h。

另外优选地，所述高温灭菌的温度为90℃，灭菌后离心处理的条件为8000rpm，10min。

作为可选的方式，在上述制备方法中，步骤(2)中，以重量百分比计，所述益生菌的含量为0.1％。

优选地，所述益生菌为复合益生菌，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳双岐杆菌。

更优选地，鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、乳双岐杆菌的重量比为1:1:1:1:1:1。

另外优选地，以重量百分比计，所述益生元的含量为2％。

另外更优选地，所述益生元为重量比为1:1的低聚果糖和低聚半乳糖。

另外优选地，所述低温为30℃。

作为可选的方式，在上述制备方法中，步骤(3)中，所述裂解酶为溶菌酶和木瓜蛋白酶。

优选地，以重量百分比计，所述溶菌酶的加入量为1％，所述木瓜蛋白酶的加入量为0.1％。

另外优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。

在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的生物益生素组合物或者采用上述第二个方面所述的制备方法制备得到的生物益生素组合物在制备用于调节皮肤微生态平衡的化妆品中的用途。

作为可选的方式，在上述用途中，所述化妆品具有调节皮肤微生态、维持皮肤弱酸性功能、舒缓皮肤过敏反应、抑制过敏反应中的炎症因子和促进皮肤修复的功效。

作为可选的方式，在上述用途中，所述化妆品用于皮肤日常护理、敏感肌护理、痤疮皮肤护理、除臭护理、婴幼儿皮肤护理或头皮护理。

作为可选的方式，在上述用途中，所述化妆品是爽肤水、乳液、精华、面霜或面膜。

作为可选的方式，在上述用途中，以重量百分比计，所述生物益生素组合物在所述化妆品中的用量为1％-10％。

优选地，以重量百分比计，所述生物益生素组合物在所述化妆品中的用量为1％-5％。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明首次发现特定种类和配比的复合益生菌和益生元以及复合酶的综合作用能够对大豆原料中的大分子有机物进行分解和重组，同时经过复杂的生化作用能够形成一种功效更为强大的用于调节皮肤微生态平衡的生物益生素组合物。

(2)本发明生物益生素组合物具有调节皮肤微生态、维持皮肤弱酸性功能、舒缓皮肤过敏反应、抑制过敏反应中的炎症因子和促进皮肤修复的复合功效。

(3)本发明所述生物益生素组合物长期使用不会产生耐药性，无任何副作用，十分安全可靠。

附图说明

图1：表皮葡萄球菌增殖实验流程示意图。

图2：本发明生物益生素组合物对皮肤弱酸性的维持作用。

图3：效果实施例4中组胺致敏反应后的实验区域测试结果。

图4：效果实施例4中组胺致敏反应后实验区域测试结果的Tivi指数比较。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

制备实施例：

实施例1：

一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物，所述生物益生素组合物由以下原料通过生物发酵技术制备而成：大豆、益生菌和益生元，所述生物益生素组合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将大豆粉碎至80目，使用90℃热水提取3h，提取液降温至55℃加入复合酶(以重量百分比计，0.1％α-淀粉酶、0.1％糖化酶、0.1％木瓜蛋白酶)，酶解2h，8000rpm离心10min，收集大豆提取液(以重量百分比计，蛋白含量为0.5％)，90℃高温灭菌后，冷却至37℃；

(2)底糖液配置：以大豆发酵液重量百分比计，1％低聚半乳糖和1％低聚果糖使用纯化水溶解，90℃高温灭菌后，于发酵前一次性补入步骤(1)中制备得到的大豆提取液中，以获得大豆发酵培养液；

(3)配置种子液：配置种子液肉汤培养液(以重量百分比计，酪蛋白酶消化物1％、牛肉膏粉1％、酵母膏粉1％、葡萄糖2％)高温灭菌后，冷却至37℃，接种含鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳双岐杆菌的菌种管，37℃厌氧摇瓶培养8h，菌液OD₆₀₀约为1，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.16103、长双歧杆菌CGMCCNO.18094、青春双歧杆菌CICC 6175、嗜热链球菌CGMCC NO.18045、干酪乳杆菌CGMCCNO.21373和乳双岐杆菌CGMCC NO.18093，所述益生菌为重量比为1:1:1:1:1:1的鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳双岐杆菌；

(4)以重量百分比计，在步骤(2)中处理得到的大豆发酵培养液中火焰保护下按0.1％的比例接种步骤(3)中制备的益生菌种子液低温厌氧30℃发酵24h，；

(5)发酵结束后，75℃灭活菌体活力，冷却至55℃加入裂解酶(以重量百分比计，1％溶菌酶和0.1％木瓜蛋白酶)对益生菌进行胞溶4h，溶出胞内活性物质，8000rpm离心10min，收集上清液，然后经过0.45μm的微孔滤膜过滤后，去除不溶物质，获得生物益生素组合物。

对比例1：

一种生物益生素组合物，所述生物益生素组合物由以下原料通过生物发酵技术制备而成：大豆、益生菌和益生元，所述生物益生素组合物的制备方法包括以下步骤：

(3)配置种子液：配置种子液肉汤培养液(以重量百分比计，酪蛋白酶消化物1％、牛肉膏粉1％、酵母膏粉1％、葡萄糖2％)高温灭菌后，冷却至37℃，接种含鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌的菌种管，37℃厌氧摇瓶培养8h，菌液OD₆₀₀约为1，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.16103、长双歧杆菌CGMCCNO.18094和青春双歧杆菌CICC 6175，所述益生菌为重量比为1:1:1的鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌；

对比例2：

(3)配置种子液：配置种子液肉汤培养液(以重量百分比计，酪蛋白酶消化物1％、牛肉膏粉1％、酵母膏粉1％、葡萄糖2％)高温灭菌后，冷却至37℃，接种含鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳双岐杆菌的菌种管，37℃厌氧摇瓶培养8h，菌液OD₆₀₀约为1，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌ATCC53103、长双歧杆菌ATCC15708、青春双歧杆菌ATCC5703、嗜热链球菌ATCC19258、干酪乳杆菌ATCC393和乳双岐杆菌TACC29521，所述益生菌为重量比为1:1:1:1:1:1的鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳双岐杆菌；

对比例3：

(2)底糖液配置：以大豆发酵液重量百分比计，2％低聚半乳糖使用纯化水溶解，90℃高温灭菌后，于发酵前一次性补入步骤(1)中制备得到的大豆提取液中，以获得大豆发酵培养液；

对比例4：

(1)将大豆粉碎至80目，使用90℃热水提取3h，提取液降温至55℃加入复合酶(以重量百分比计，0.2％α-淀粉酶、0.1％木瓜蛋白酶)，酶解2h，8000rpm离心10min，收集大豆提取液(以重量百分比计，蛋白含量为0.5％)，90℃高温灭菌后，冷却至37℃；

效果实施例：

效果实施例1：本发明生物益生素组合物对表皮葡萄球菌增殖情况的影响

表皮葡萄球菌能抑制金黄色葡萄球菌的辅助基因调节因子(SA agr)活性，降低金黄色葡萄球菌在皮肤表面定殖。表皮葡萄球菌可产生较广谱的细菌素，对葡萄球菌属外的其他菌丛如棒状杆菌、链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属甚至芽胞杆菌和梭菌都有杀菌作用，从而抑制有害菌的滋生，保护宿主皮肤及其健康。表皮葡萄球菌还可减轻感染后炎症、促进抗菌肽(AMP)表达和促进调节性T细胞活性，抑制常规CD4⁺T细胞发育。表皮葡萄球菌细胞壁成分通过结合TLR2减轻炎症，限制组织损伤并促进伤口愈合。表皮葡萄球菌增殖实验的实验流程如图1所示。

1.菌悬液的制备

取一支表皮葡萄球菌(购自海博生物技术有限公司，CMCC26069)斜面菌株，用3mLPBS少量多次冲洗斜面菌苔于100mL试剂瓶中，取适量洗出来的菌液到9mL PBS中，用麦氏比浊管调整为0.5个麦氏单位，其菌悬液浓度大致为1×10⁵-9×10⁵cfu/g。(要求浓度为：取0.1mL滴于5.0mL对照样液(PBS)内，回收菌数为1×10⁴-9×10⁴cfu/mL)

2.操作步骤

(1)将试验样品用无菌标准硬水稀释至规定的浓度(1:10)；

(2)吸取试验菌悬液0.1mL加入到含5mL稀释后样品的试管中(①)，迅速混匀，并立即计时；

(3)作用20min后，取试验菌与样品混合液1mL，加入到含9mL经灭菌的PBS试管中(②)，充分混匀；再吸取上述样液1mL到含9mL经灭菌的PBS试管中(③)，充分摇匀；

(4)吸取比浊后的菌悬液1mL到含9mL经灭菌的PBS试管中(10⁷)，依次稀释成10⁶、10⁵、10⁴、10³；

(5)吸取上述样液稀释液①②③；比浊稀释液10³、10⁴、10⁵各1mL，置于灭菌平皿内，每个样液或稀释液接种三个灭菌平皿。用凉至40℃-45℃的营养琼脂基础培养基15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，37℃培养1-2天后，做活菌菌落计数；

(6)实验重复3次，求其平均值；

另外：培养1个(1:10)样液、1个PBS溶液、1个标准硬水溶液，作为参考。

3.计算公式

增殖率(％)按以下公式计算。

增殖率％＝(A-B)/A*100

式中：

A┈┈试验样品平均菌落数；

B┈┈对照样品平均菌落数

4.实验结果

本发明生物益生素组合物对表皮葡萄球菌增殖情况的影响实验结果如表1所示。

表1：本发明生物益生素组合物对表皮葡萄球菌增殖情况的影响

组别	增殖率(％)
		实施例1	45.39
对比例1	31.25
		对比例2	34.57
对比例3	35.66
		对比例4	37.21

实验结果表明，与对比例组相比，实施例1组能够显著促进表皮葡萄球菌的增殖。此外，从对比例1-2组的实验结果可以看出，益生菌的种类和配比对本发明生物益生素组合物促进表皮葡萄球菌的效果具有显著影响。另外，从对比例3-4组的实验结果可以看出，作为益生菌的营养来源的益生元的种类以及对大豆水提液进行酶解的复合酶的种类及其配比对于本发明生物益生素组合物促进表皮葡萄球菌的效果也具有非常显著的影响。

效果实施例2：本发明生物益生素组合物对透明质酸酶活性的影响

细胞间基质中透明质酸(HA)在维持皮肤水分和弹性、创伤愈合和血管形成、过敏反应等过程中起主要的作用。抑制透明质酸酶的活性可使透明质酸不被分解，维持正常的生理功能，有助于舒缓过敏反应、修复皮肤损伤、延缓皮肤衰老。

透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)可降解透明质酸，研究表明透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，当肌肤存在内热症状，如炎症时，会伴随透明质酸酶活性的升高。抗敏实验采用透明质酸酶体外抑制实验检测受试液抑制透明质酸酶活性效果，以验证本发明抗过敏、抗刺激性效果。实验测试采用10.0％浓度的待测物进行测试。其结果如表2所示。

表2：本发明生物益生素组合物对透明质酸酶活性的影响

组别	透明质酸酶抑制率(％)
		实施例1	93.28
对比例1	69.43
		对比例2	78.22
对比例3	82.45
		对比例4	84.31

实验结果表明，与对比例组相比，实施例1组对透明质酸具有显著更强的抑制作用。此外，从对比例1-2组的实验结果可以看出，益生菌的种类和配比对本发明生物益生素组合物抑制透明质酸酶的效果具有显著影响。另外，从对比例3-4组的实验结果可以看出，作为益生菌的营养来源的益生元的种类以及对大豆水提液进行酶解的复合酶的种类及其配比对于本发明生物益生素组合物抑制透明质酸酶的效果也具有非常显著的影响。

效果实施例3：本发明生物益生素组合物维持皮肤弱酸性功能

(1)年龄在16-65岁之间(妊娠或哺乳期妇女除外)的受试者30人。要求受试者无严重系统疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病者，无活动性过敏性疾病，既往对护肤类化妆品无严重过敏史者，近一月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂，未参加其他临床试验者。

(2)测试组：护肤水安慰组和2％生物益生素组(使用本发明实施例1制备得到的生物益生素组合物)。每天早晚使用1次，涂抹喷淋于手臂，持续28天。

(3)测试前应该在符合标准的房间内(测试环境温度：22±1℃，湿度：50±5％，并且进行实时动态监测)静坐至少30min，不能喝水，前臂暴露，呈测试状态放置，保持放松，双手前臂内测标记3×3cm²试验区域，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm。

(4)使用皮肤酸碱度测试探头SKIN-PH-METER PH905检测受试者在使用消毒洗手液清洗消毒前后的pH。

实验结果如图2所示，实验结果表明，使用2％生物益生素，可降低清洗消毒液导致的皮肤pH升高，维持皮肤弱酸性pH值的功效。效果实施例4：本发明生物益生素组合物对组胺刺激的舒缓作用

1.检测仪器：

皮肤敏感度测试仪Tivi700。

2.实验方法：

(1)使用5％盐酸组胺溶液刺激志愿者手臂内侧(标识区域：3*3cm)，志愿者出现红肿痒的过敏反应，记录。

(2)在标识区域划分样品组与空白组，在样品组涂抹20μL本发明生物益生素组合物(实施例1)；空白组涂抹20μL去离子水，1h后记录。

3.实验结果：

实验结果如表3，以及图3A-图3C以及图4所示。实验结果表明，与空白组对比，生物益生素2％浓度下，可降低由组胺引起的皮肤过敏反应，具有显著性差异(P<0.05)，具有舒缓功能。

表3：敏感度Tivi值变化量

	2％生物益生素组	空白对照组
			样品舒缓(1h)	-6.10％	+2.94％
样品舒缓(2h)	-21.95％	-10.29％

效果实施例5：本发明生物益生素组合物对皮肤的修复作用

(1)细胞接种：用细胞培养基稀释3T3小鼠成纤维细胞(购自中国科学院细胞库，目录号：GNM25)至接种密度(接种后24h融合度达到45％-60％)，接种至96孔板中，每孔液量为200μL，放置于CO₂培养箱中培养24±2h。

(2)给药：弃掉96孔板中的培养基，开展给药操作。受试物孔中加入含有受试物(使用本发明实施例1制备得到的生物益生素组合物)的培养基，空白/溶剂对照孔中加入正常的细胞培养基，每孔200μL。给药完毕后将96孔板放置在CO₂培养箱中培养24h±2h。

(3)细胞上清液收集：孵育培养结束后，收集200μL细胞培养上清液于1.5mL无菌离心管中，置于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

(4)ELISA检测：根据小鼠Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫试剂盒的使用说明书进行检测。

实验结果如表4所示。实验结果表明，使用本发明实施例1制备得到的生物益生素，可促进成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成，具有修复功效。

表4：本发明生物益生素组合物对成纤维细胞合成胶原蛋白情况的影响

效果实施例6：本发明生物益生素组合物对过敏中炎症因子的抑制作用

(1)细胞接种：用细胞培养基稀释巨噬细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7，购自中国科学院细胞库，目录号：TCM13)至接种密度(接种后24h融合度达到45％-60％)，接种至96孔板中，每孔液量为200μL，放置于CO₂培养箱中培养24±2h。

(2)给药：弃掉96孔板中的培养基，开展诱导及给药操作。受试物(使用本发明实施例1制备得到的生物益生素组合物)孔中加入含有一定浓度受试物和1μg/mL LPS的培养基，阴性对照孔中加入含有LPS的细胞培养基，空白对照孔中加入细胞培养基，每孔200μL，CO₂培养箱中继续培养24±2h。

(4)ELISA检测：根据TNF-αELISA检测试剂盒的操作说明书进行检。

实验结果如表5所示。实验结果表明，与模型组对比，0.1％、1％生物益生素能显著降低LPS刺激下巨噬细胞炎症因子(TNF-ɑ)的分泌。

表5：本发明生物益生素组合物对TNF-α细胞因子的抑制作用

综上所述，本发明生物益生素组合物以及包含其的化妆品具有调节皮肤微生态、维持皮肤弱酸性功能、舒缓皮肤过敏反应、抑制过敏反应中的炎症因子和促进皮肤修复的复合功效。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种具有调节皮肤微生态作用的生物益生素组合物，其特征在于：所述生物益生素组合物包含大豆异黄酮、大豆氨基酸、益生菌溶胞产物和益生菌发酵产物。

2.根据权利要求1所述的生物益生素组合物，其特征在于：所述生物益生素组合物由以下原料通过生物发酵技术制备而成：大豆、益生菌和益生元。

3.根据权利要求2所述的生物益生素组合物，其特征在于：所述益生菌选自以下一种或多种：鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌或乳双岐杆菌；所述益生元选自以下一种或多种：乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖或低聚麦芽糖。

4.根据权利要求3所述的生物益生素组合物，其特征在于：鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌分离自广西巴马长寿村健康成人群肠道；嗜热链球菌、干酪乳杆菌、乳双岐杆菌分离自新疆伊犁州牧民自制发酵酸奶。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的生物益生素组合物，其特征在于：所述益生菌为鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳双岐杆菌；所述益生元为低聚果糖和低聚半乳糖。

6.权利要求1至5中任一项所述的生物益生素组合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的复合酶选自以下一种或多种：淀粉酶、糖化酶或蛋白酶，步骤(2)中的低温为30℃。

8.权利要求1至5中任一项所述的生物益生素组合物或者采用权利要求6或权利要求7所述的制备方法制备得到的生物益生素组合物在制备用于调节皮肤微生态平衡的化妆品中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述化妆品具有调节皮肤微生态、维持皮肤弱酸性功能、舒缓皮肤过敏反应、抑制过敏反应中的炎症因子和促进皮肤修复的功效，所述化妆品用于皮肤日常护理、敏感肌护理、痤疮皮肤护理、除臭护理、婴幼儿皮肤护理或头皮护理。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，其特征在于：所述化妆品是爽肤水、乳液、精华、面霜或面膜，以重量百分比计，所述生物益生素组合物在所述化妆品中的用量为1％-10％。