CN116903578B - 连钱草中的酚酸类化合物及其提取分离方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了连钱草中的酚酸类化合物及其提取分离方法与应用，属于中药提取分离、植物化学及医药技术领域。本发明提供了从连钱草中提取的一种酚酸类化合物，其化学结构式如式(I)或式(II)所示，式(I)为右旋体命名为(+)‑连钱草酸A，式(II)为左旋体命名为(‑)‑连钱草酸A，经研究发现该对化合物均具有抗肿瘤活性，且(+)‑连钱草酸A抗肿瘤活性强于(‑)‑连钱草酸A；同时本发明还提供一种针对该对化合物的简便、快速的提取分离方法。本发明提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产；所得对映异构体化合物具有抗肿瘤的作用，在制备治疗胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌的药物中具有良好的应用前景。

Description

连钱草中的酚酸类化合物及其提取分离方法与应用

技术领域

本发明属于中药提取分离、植物化学及医药技术领域，具体涉及连钱草中的酚酸类化合物及其提取分离方法与应用。

背景技术

传统中药材连钱草是唇形科植物活血丹(Glechomalongituba(Nakai) Kupr.)的干燥地上部分；春至秋季采收，除去杂质，晒干即得；味辛、微苦，性微寒，入肝、肾、膀胱经。连钱草功能主治为：利湿通淋，清热解毒，散瘀消肿；临床用于热淋、石淋、湿热黄疸、疮痈肿痛、跌打损伤。

现代药理研究证实，连钱草的急性毒性很小，具有利尿利胆、调血脂、溶石、降血糖、抗炎、抗菌等作用。连钱草所含化学成分复杂多样，目前从连钱草中分离得到的主要为黄酮类、有机酸类、萜类等化合物，但尚未见到酚酸类对映异构体成分的报道。

发明内容

基于背景技术所述，本发明目的之一在于提供从连钱草中提取分离的一对对映异构体酚酸类化合物，该对化合物具有新型结构与药理活性，为连钱草药理作用研究提供了物质基础。

本发明目的之二在于提供从连钱草中提取分离该对化合物的方法，整个提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。

本发明目的之三在于提供该对化合物抗肿瘤的作用，为发掘潜在的抗肿瘤新药提供有力依据。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：

本发明提供了从连钱草中提取的一种酚酸类化合物，其化学结构式如式(I)或式(II)所示，式(I)为右旋体、将其命名为(+)-连钱草酸A，式(II)为左旋体、将其命名为(-)-连钱草酸A，经研究发现该对化合物均具有抗肿瘤活性，且(+)-连钱草酸A抗肿瘤活性强于(-)-连钱草酸A。

所述酚酸类化合物的化学结构式如下式(I)或式(II)所示：

。

本发明还提供了上述酚酸类化合物的提取分离方法，包括如下步骤：

步骤1、用乙醇溶液对连钱草回流提取，将提取液减压浓缩得到无醇干浸膏；

步骤2、无醇干浸膏加水混悬，然后采用二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取，将所得乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取浓缩物；

步骤3、取步骤2所得乙酸乙酯萃取浓缩物经硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到12个馏分；

其中，洗脱剂三氯甲烷-甲醇体积配比为100：1、25：1、20：1、17：1、15：1、12：1、10：1、7：1；

步骤4、取步骤3所得其中一个馏分经硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到6个馏分；

其中，洗脱剂三氯甲烷-甲醇体积配比为8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1；

步骤5、取步骤4所得其中一个馏分经C₁₈中压柱层析，以甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，经高效液相色谱检视合并得到7个馏分；

其中，洗脱剂甲醇-水体积配比为20：80、30：70、40：60、50：50、60：40；

步骤6、取步骤5所得其中一个馏分经反相高效制备液相色谱，以乙腈-0.01%三氟乙酸为流动相，制备得到外消旋体；

其中，流动相乙腈-0.01%三氟乙酸体积比为32：68，体积流量为10 mL/min；

步骤7、对所得外消旋体进行手性拆分即得酚酸类化合物式(I)和式(II)。

作为优选，步骤1、步骤2减压浓缩条件均为：温度50℃，转速60 rpm，真空度40mbar。

作为优选，步骤7手性拆分为使用Lux 5µm Cellulose-4手性半制备色谱柱，经反相高效液相色谱进行分离。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的上述的式(I)、式(II)化合物中的至少一种，以及可药用载体或赋形剂。

本发明还提供了上述酚酸类化合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

作为优选，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明从连钱草药材中提取分离得到了一种外消旋体，还根据氢谱碳谱等相关数据确定了其分子构型，将其手性拆分后得到一对对映异构体化合物(+)-连钱草酸A和(-)-连钱草酸A。

2、本发明以连钱草药材为原料，通过乙醇回流提取、减压浓缩、萃取、色谱分离等步骤得到对映异构体化合物，整个提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。

3、体外生物活性实验表明，本发明对映异构体化合物(+)-连钱草酸A和(-)-连钱草酸A对胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌细胞均具有明显的抑制作用，在制备治疗癌症的药物中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为化合物(+)-连钱草酸A和(-)-连钱草酸A的结构图。

图2为手性拆分HPLC色谱图。

图3为hyprhombin E的结构图。

图4为(±)-连钱草酸A的高分辨质谱图。

图5为(±)-连钱草酸A的UV光谱图。

图6为(±)-连钱草酸A的¹H-NMR谱图。

图7为(±)-连钱草酸A的¹³C-NMR谱图。

图8为(±)-连钱草酸A的HSQC谱图。

图9为(±)-连钱草酸A的HMBC谱图。

图10为(+)-连钱草酸A的ECD谱图。

图11为(-)-连钱草酸A的ECD谱图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本申请及其应用或使用的任何限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1 连钱草中(±)-连钱草酸A的提取分离

1、取连钱草20 kg，粉碎后用体积分数75%的乙醇溶液回流提取3次，每次2小时，合并提取液减压浓缩得到无醇干浸膏。无醇干浸膏加入其20倍重量的去离子水混悬得到混悬液，依次采用二氯甲烷、乙酸乙酯分别萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液并减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取浓缩物210 g。

2、取所得乙酸乙酯萃取浓缩物，经硅胶柱（硅胶粒度100-200目）层析，用三氯甲烷-甲醇（体积比100：1、25：1、20：1、17：1、15：1、12：1、10：1、7：1）为洗脱剂梯度洗脱（8个梯度体积比洗脱时间均为1.5 h）。收集洗脱液，每1 L收集一份并依次编号，将收集的洗脱液依次经薄层色谱检视，合并相近的组分，得到12个馏分记为F1~F12；其中得到20.527 g馏分F11，馏分F11为第81-86份洗脱液合并得到。

3、取所得馏分F11经硅胶柱（硅胶粒度100-200目）层析，用三氯甲烷-甲醇（体积比8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1）为洗脱剂梯度洗脱（7个梯度体积比洗脱时间均为1 h）。收集洗脱液，每500 mL收集一份并依次编号，将收集的洗脱液依次经薄层色谱检视，合并相近的组分，得到6个馏分记为F11-1~F11-6；其中得到9.352 g馏分F11-5，馏分F11-5为第26-30份洗脱液合并得到。

4、取所得馏分F11-5经C₁₈中压柱层析，用甲醇-水（体积比20：80、30：70、40：60、50：50、60：40）为洗脱剂梯度洗脱（5个梯度体积比洗脱时间均为2 h）。收集洗脱液，每500 mL收集一份并依次编号，将收集的洗脱液依次经高效液相色谱检视，合并相近的组分，得到7个馏分记为F11-5-1~F11-5-7；其中得到123.78 mg馏分F11-5-5，馏分F11-5-5为第24-27份洗脱液合并得到。

5、取所得馏分F11-5-5经反相高效制备液相色谱，以乙腈-0.01%三氟乙酸（体积比32：68，流量为10 mL/min）为流动相，制备得到(±)-连钱草酸A（47.34 mg）。

实施例2 手性拆分得到一对对映异构体化合物

取实施例1所得47.34 mg (±)-连钱草酸A，加入甲醇溶解，经反相高效液相色谱，采用Lux 5μm Cellulose-4（Size: 10.0×250 mm, P/N: 00G-4491-N0）手性半制备色谱柱，以乙腈-0.01%三氟乙酸（体积比32：68，流量为2 mL/min）为流动相，得到化合物(+)-连钱草酸A 18.35 mg和(-)-连钱草酸A 16.24 mg。化合物(+)-连钱草酸A和(-)-连钱草酸A的结构图见图1，手性拆分HPLC色谱图如图2所示。

实施例3 结构解析与鉴定

取实施例1所得(±)-连钱草酸A，其为灰白色粉末，溶于甲醇，UV-260紫外分光光度计测定紫外UV (MeOH)λ _max(logε): 291 (1.96) nm, 323 (1.96) nm；通过WatersACQUITY UPLC/Xevo G2 Q TOF测得HRESIMSm/z549.1052 [M－H]^－(calcd for C₂₈H₂₁O₁₂,549.1033)，确定其分子式为C₂₈H₂₂O₁₂。

¹H-NMR谱显示3个1,3,4-三取代苯基[δ _H7.27 (1H, d,J= 1.8 Hz)，6.93 (1H, d,J= 8.4 Hz)和7.16 (1H, dd,J= 1.8, 8.4 Hz)；6.87 (1H, d,J= 1.2 Hz)和6.76 (2H，重叠)；7.02 (1H, d,J= 1.8 Hz)，6.76 (1H，重叠)和6.93 (1H, dd,J= 1.8, 8.4 Hz)]。两对反式取向烯烃质子氢[δ _H7.67 (1H, d,J= 16.2 Hz)和6.46 (1H, d,J= 16.2 Hz)；7.59(1H, d,J= 15.6 Hz)和6.21 (1H, d,J= 15.6 Hz)]，两个连氧次甲基[δ _H6.53 (1H, d,J=3.0 Hz)和5.13 (1H, d,J= 3.0 Hz)]以及一个连氧亚甲基信号δ _H4.71 (1H, s)。

¹³C-NMR谱揭示了28个信号，包括18个芳烃、4个烯烃碳、3个含氧甲烷碳(δ _C91.2，76.7和61.7)和3个羧碳(δ _C168.0，166.8和171.6)。

HMBC谱显示H-7(δ _H7.67)和C-2(δ _C117.7)、C-6(δ _C123.7)、C-9(δ _C168.0)相关；H-7″(δ _H7.59)和C-2″(δ _C115.3)、C-6″(δ _C123.5)、C-9″(δ _C166.8)相关；H-7′(δ _H5.13)和C-8′(δ _C91.2)、C-2′(δ _C115.0)、C-6′(δ _C119.8)、C-3 (δ _C144.3)相关；H-8′(δ _H6.53)和C-7′(δ _C76.7)、C-4 (δ _C144.2)、C-9″(δ _C166.8)相关；这些数据表明(±)-连钱草酸A具有1，4-苯并二恶烷骨架， 进一步通过HMBC显示H-10(δ _H4.71)和C-9 (δ _C168.0)、C-11 (δ _C171.6)相关，表明(±)-连钱草酸A是hyprhombin E（图3为hyprhombin E的结构图）的羧基甲酯结构，由于H-7'和H-8'(J= 3.0 Hz)的耦合常数与hyprhombin E(J= 1.3 Hz)的耦合常数不同，这两个质子被指定为顺式取向。

(±)-连钱草酸A的高分辨质谱图如图4所示；UV光谱图如图5所示；¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、HSQC谱、HMBC谱、分别见图6-图9，由图6-图9确证了本发明(±)-连钱草酸A的结构。

表1为(±)-连钱草酸A的核磁数据：¹H-NMR(600 MHz)与¹³C-NMR(150 MHz)在CD₃OD中。

表1 (±)-连钱草酸A的¹H-NMR、¹³C-NMR核磁数据

通过Perkin-Elmer 341旋光仪测定(±)-连钱草酸A其旋光度显示为0，表明(±)-连钱草酸A是外消旋体，使用Lux 5µm Cellulose-4手性半制备色谱柱经HPLC成功分离成两个光学纯对映异构体，并分别测量对映异构体的实验ECD光谱。

取实施例2所得化合物(+)-连钱草酸A，其为灰白色粉末，溶于甲醇，Perkin-Elmer341旋光仪测定 [α]²⁰ _D+202.9 (c0.035, MeOH)；JASCO J-815圆二色光谱仪测定ECD(MeOH)λ _max(∆ε): 218 (3.78) nm, 237 (-1.67) nm, 295 (4.95) nm, 341 (-5.97) nm。通过其ECD在237 nm处显示的负的棉花效应，其7'R构型与hyprhombin E相似，结合其7'，8'位为顺式取向，因此，(+)-连钱草酸A的绝对构型被指定为7'R，8'R。(+)-连钱草酸A的ECD谱如图10所示。

取实施例2所得化合物(-)-连钱草酸A，其为灰白色粉末，溶于甲醇，Perkin-Elmer341旋光仪测定 [α]²⁰ _D-204.3 (c0.046, MeOH)；JASCO J-815圆二色光谱仪测定ECD(MeOH)λ _max(∆ε): 219 (-3.06) nm, 238 (1.39) nm, 291 (-3.35) nm, 342 (4.58) nm。通过其ECD在238 nm处显示的正的棉花效应，其7'S构型与(+)-连钱草酸A相反，结合其7'，8'位为顺式取向，因此，(-)-连钱草酸A的绝对构型被指定为7'S，8'S。(-)-连钱草酸A的ECD谱如图11所示。

实施例4 对映异构体化合物(+)-连钱草酸A和(-)-连钱草酸A体外抗肿瘤活性测试

测试原理：MTT法：活细胞线粒体中存在着与NAPP（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶Ⅱ）相关的脱氢酶，琥珀酸脱氢酶能使外源性黄色的噻唑蓝MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，死细胞中此酶消失，MTT不被还原。用二甲亚砜（DMSO）溶解甲瓒后可用酶标仪在570 nm，630 nm处检测吸光度，光密度值与活细胞数成正比。

所用细胞株为：BGC-823（人胃癌细胞）、Bel（人肝癌细胞）、HCT-8（人结肠癌细胞)、A2780（人卵巢癌细胞）和A549（人肺癌细胞)。

试验方法：MTT法：取对数生长细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×10⁵个/mL，接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24小时后，弃去原培养液。每一样品设计8个浓度梯度，然后在试验孔中加入100 μL含有各浓度梯度的样品的培养基，每一浓度平行6孔。将96孔培养板置于37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养72小时后，每孔加入新鲜配制的含5 mg/mL MTT的无血清培养基20 μL，37℃下继续培养4小时后，去除上清液。每孔加入150 μL DMSO溶解Formazan沉淀，震荡5分钟，在酶标仪上测定570 nm，630 nm处的吸光度，可反映活细胞数量。通过SPSS软件计算药物的抑制浓度（IC₅₀）值。

计算公式如下：肿瘤细胞生长抑制率（%）=1－（试验孔测定值/对照孔测定值）×100%。

表2 肝癌细胞Bel

表3 胃癌细胞BGC-823

表4 结肠癌细胞HCT-8

表5 卵巢癌细胞A2780

表6 肺癌细胞A549

可见，对映异构体化合物(+)-连钱草酸A和(-)-连钱草酸A对BGC-823（人胃癌细胞）、Bel（人肝癌细胞）、HCT-8（人结肠癌细胞)、A2780（人卵巢癌细胞）和A549（人肺癌细胞)均有明显的抑制作用，且(+)-连钱草酸A抗肿瘤活性强于(-)-连钱草酸A，二者均可用作治疗或用于研究治疗癌症或肿瘤的药物。

最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.从连钱草中提取分离的酚酸类化合物，其特征在于，所述酚酸类化合物的化学结构式如下式(I)或式(II)所示：

。

2.如权利要求1所述酚酸类化合物的提取分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、用乙醇溶液对连钱草回流提取，将提取液减压浓缩得到无醇干浸膏；

步骤2、无醇干浸膏加水混悬，然后采用二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取，将所得乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取浓缩物；

步骤3、取步骤2所得乙酸乙酯萃取浓缩物经硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到12个馏分；

其中，洗脱剂三氯甲烷-甲醇体积配比为100：1、25：1、20：1、17：1、15：1、12：1、10：1、7：1；

步骤4、取步骤3所得其中一个馏分经硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到6个馏分；

其中，洗脱剂三氯甲烷-甲醇体积配比为8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1；

步骤5、取步骤4所得其中一个馏分经C₁₈中压柱层析，以甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，经高效液相色谱检视合并得到7个馏分；

其中，洗脱剂甲醇-水体积配比为20：80、30：70、40：60、50：50、60：40；

步骤6、取步骤5所得其中一个馏分经反相高效制备液相色谱，以乙腈-0.01%三氟乙酸为流动相，制备得到外消旋体；

其中，流动相乙腈-0.01%三氟乙酸体积比为32：68，体积流量为10 mL/min；

步骤7、对所得外消旋体进行手性拆分即得酚酸类化合物式(I)和式(II)。

3.根据权利要求2所述提取分离方法，其特征在于，步骤1、步骤2减压浓缩条件均为：温度50℃，转速60 rpm，真空度40 mbar。

4.根据权利要求2所述提取分离方法，其特征在于，步骤7手性拆分为使用Lux 5µmCellulose-4手性半制备色谱柱，经反相高效液相色谱进行分离。

5.一种药物组合物，其特征在于，其包含作为活性成分的权利要求1所述的式(I)、式(II)化合物中的至少一种，以及可药用载体或赋形剂。

6.权利要求1中酚酸类化合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌。