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CN116897278A - 用于细胞响应的增强检测的装置 - Google Patents

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CN116897278A
CN116897278A CN202280013987.3A CN202280013987A CN116897278A CN 116897278 A CN116897278 A CN 116897278A CN 202280013987 A CN202280013987 A CN 202280013987A CN 116897278 A CN116897278 A CN 116897278A
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cells
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lfc
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CN202280013987.3A
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S•哈特
C•赫伯特
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Lumakt Co
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Abstract

改进的生物制造装置、设备和方法，用于使用其监测生物产品，如生物制品、疫苗、细胞和基因疗法的病毒安全性和细胞病变效应的鉴定。在某些实施方式中，本文所述的发明能够客观分析外来剂，包括外来病毒、细菌和支原体。

Description

用于细胞响应的增强检测的装置
技术领域
本公开的实施方式一般涉及一种装置，该装置被设计成将细胞暴露于成比例地更大体积的样品流体中，该样品流体包含待通过测量细胞响应或其他特性来检测的痕量分析物。本文所述的实施方式包括使能增强性能和客观分析各种外来剂(adventitiousagent)，其包括外来病毒、细菌和支原体。这些物种中任何一种的检测统称为外来剂测试(AAT)。
发明内容
目前可用的用于表征生物细胞和系统的程序和分析方法，例如感染性测定(例如中和测定、TCID50和临床样品操纵)，需要大量稀释，潜在有害的标记程序，并产生高度可变的结果，使得实验和试验间与实验和试验内比较具有挑战性，并且下游的细胞应用受到限制。具体而言，生物产品(生物制品、疫苗、细胞和基因疗法)的病毒安全性测试尤其困难，并且依赖于在14天内监测的细胞系补体中的细胞病变效应的视觉识别，再加上14天以捕捉感染性病毒剂的任何额外迹象。这种病毒安全性测试，也称为外来剂测试(AAT)，是生物药物、治疗和疗法的释放过程的关键部分。减少测定时间的能力将加快产品释放，并且灵敏度的增加将导致更好的测定，这使这些救命产品更安全，并确保其持续可用。本文公开的发明试图通过使用流体装置来实现所有这些目标，所述流体装置设计成将特定数量的报告细胞(来自相关细胞系)暴露于一定体积的生物反应器流体(条件培养基)。将暴露的细胞与条件培养基一起孵育，然后释放用于随后使用激光力细胞学或其他检测方法的分析。
本发明通过提供一种新的装置来增强外来剂的检测，克服了现有技术的局限性。
附图说明
图1提供了整个装置的一个实施方式，其显示了细胞限制区域(confinementregion)、一个或多个流体储存器以及连接它们的通道网络。
图2提供了一个可选实施方式，该实施方式并入用于将样品流体(如细胞培养基)泵送通过细胞限制区域的环路(loop)。
图3提供了该装置操作的进一步细节，除了细胞培养基之外其还包括引入试剂的多个储存器。这些试剂可用于释放细胞，通过单细胞分析或其他仪器进行直接采样。
图4，歧管用于将流体输送到包含细胞的区域的实施方式。
图5，多个包含细胞的区域串联或并联使用的实施方式。
图6提供了用于使用包含预培养的细胞的一次性插入物将培养的细胞引入装置的装置一个方面的一个实施方式，其中流体层靠近插入物附着的表面。
图7提供了用于使用包含预培养的细胞的一次性插入物将培养的细胞引入装置的装置一个方面的一个实施方式，其中流体层通过插入物的上部区域进入，并且流体向下行进通过并离开包含细胞的区域。
图8提供了用于使用包含预培养的细胞的一次性插入物将培养的细胞引入装置的装置一个方面的一个实施方式，该插入物被旋入或压配合到塑料流体装置中。流体层通过插入物的上部区域进入，并且流体向下行进通过并离开包含细胞的区域。
图9描绘了包含油的注射器，培养基被吸入其中并被油包裹。这可以与注射器的塑料或玻璃壁保持分离，从而潜在地避免由于粘附在血管壁上而导致的病毒损失。
图10提供了装置的实施方式，其中细胞限制区域比周围通道窄，从而将分析物聚焦到细胞上。可渗透的膜或屏障限制了细胞支撑，但允许流体和分析物自由流动。还示出了细胞限制区域的几个实施方式。
图10A和10B提供用于从限制区域移除细胞支撑的各种实施方式。
图11提供了一个实施方式，该实施方式利用力(光学、磁性、电动等)在流体流动经过细胞时将细胞包含在中心区域。
图12提供了装置的一个实施方式，该装置被设计为使用差分力将分析物浓缩到位于限制区域中的细胞，并将其从通道和其他壁排斥。
图13，油相中水相的流体动力学流动聚焦，以在流体装置内并远离装置壁浓缩待测试的条件培养基或其他流体。
具体实施方式
参照具有各种特征的特定实施方式来描述本发明。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以在本发明的实践中进行各种修改和变化。本领域技术人员将认识到，基于给定应用或设计的要求和规范，这些特征可以单独使用或以任何组合使用。本领域技术人员将认识到，本发明的实施方式的系统和装置可以与本发明的任何方法一起使用，并且本发明的任意方法可以使用本发明的任一系统和装置来执行。包括各种特征的实施方式也可以由这些各种特征组成或基本上由这些各种特征组成。考虑到本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。所提供的本发明的描述本质上仅仅是示例性的，因此，不偏离本发明本质的变化旨在落入本发明的范围内。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明的应用不限于以下描述中所述或附图中所示的部件的构造和布置的细节。本发明能够具有其他实施方式，或者能够以各种方式实践或实施。此外，应当理解，本文所使用的措辞和术语是为了描述的目的，不应被视为限制性的。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本技术和方法所涵盖的领域的普通技术人员通常理解或使用的含义相同的含义。
图1显示了用于待测试外来剂或其它样品分析物(115)的条件培养基或其他流体的储存器(135、145)，所述外来剂或其它样品分析物(115)包括病毒、细菌、支原体或毒素，以及具有细胞限制区域(100)的流体装置，所述细胞限制区域(100)用于暴露附着在装置表面、存在于细胞支撑(110)例如微载体、细胞生长盘或其他细胞生长载体上的细胞。这些支撑可以具有各种尺寸、组成和结构。这些支撑可以通过化学或物理手段溶解，并且可以使用诸如光学、声学或磁性的力进行移动。流体流(150)将用于使条件培养基或其他流体通过细胞限制区域，以便引发细胞响应。
图2显示了用于待测试外来病毒的条件培养基或其他流体的储存器(135、145)，以及具有区域(100)的流体装置，所述区域(100)用于暴露附着在装置表面、存在于微载体(110)或细胞生长盘或其他细胞生长载体上的细胞。泵(蠕动式或其他类型)的添加允许培养基通过细胞区域循环。
图3显示了用于待测试外来病毒的条件培养基或其他流体的储存器(135、145)，以及具有区域(100)的流体装置，所述区域(100)用于暴露附着在装置表面、存在于微载体(110)或细胞生长盘或其他细胞生长载体上的细胞。添加其他储存器以允许试剂添加，例如胰蛋白酶，用于从生长载体中移出细胞。此外，在将细胞从装置中移出以输送到分析仪器的值之前，存在足够大以接受微载体并用作分离区域的蛇形区域(serpentine)，所述分析仪器包括但不限于单细胞分析(光学力、细胞术)、核酸分析(PCR或测序)或蛋白质分析(质谱)。
图4，在概念上类似于先前的图，但包括歧管以更低的速度将更多的流体输送到细胞区域，同时利用更小的通道，该通道将不允许微载体逃逸并另外限制堵塞。A)描绘了从主通道到细胞暴露区域的歧管。B)示出了将输入储存器直接连接到细胞暴露区域的通道。虽然显示了3个通道，但在实践中可以使用从微米流体尺寸到毫米流体尺寸的任何数量。
图5显示了在一个装置中串联或并联使用多种不同的细胞类型。
图6描绘了具有区域的流体芯片，该区域用于细胞和流体从上方插入，并且细胞载体沉降到流体流中。待添加的细胞和流体可以被冷冻并且将解冻，并且在暴露于流体或条件培养基之前直接在流体装置中使用。
图7类似于图6，不同之处在于流体流进入细胞固定器(700)的顶部区域，并向下流过细胞载体并流出固定器(700)区域。
图8，细胞固定器(800)和包含细胞的插入物的操作概念，使得插入物将是一次性的，并且流体芯片(820)可以是可重复使用或一次性的。圆柱形细胞固定器将旋入流体装置中，并在装置中的流体与固定器(800)中的细胞(810)之间进行流体接触。流将再次进入固定器并穿过细胞向下移动到另一侧上的出口，从而确保与细胞(810)的良好停留时间。
图9，注射器，用于将CM流体抽取到注射器内部或流体装置中的油相中。这防止CM和病毒粒子接触它们可以粘附的壁，从而将它们从溶液中移出。这也可以使用疏水涂层来实现。
图10显示了一个可选实施方式，其中通道(1000)的直径大于细胞支撑的直径。这可以帮助将任何样品分析物浓缩到细胞限制区域(1010)和细胞支撑(110)。该实施方式的附加特征是使用一个或多个半渗透屏障(1020)，以便将细胞支撑限制在细胞限制区域。这些屏障可以是膜、玻璃料(frit)、过滤器或通道的几何特征，例如柱或堰(weir)，只要它们防止细胞支撑离开限制区域，但允许包括样品分析物的液体自由流动通过细胞限制区域并与细胞支撑上的细胞相互作用。可选地，细胞支撑可以被设计为附着到通道壁或底板或两者，从而在不使用屏障(1020)的情况下被固定。化学、物理或其他结合可以用来固定细胞支撑并防止它们离开细胞限制区域。先前附图中列出的其他特征和实施方式也可用于该设计，包括但不限于图2中的环形泵送、图4和图5中所示的平行通道和多细胞类型以及图6-8中所示细胞插入装置。图的底部部分中还显示了细胞限制区域的横截面的几个实施方式。变体1050在细胞限制区域的两侧上都有屏障(1020)，因此可以相对于重力水平或垂直定向，并且流动可以在任一方向上。变体1051仅在一侧上具有屏障(1020)，因此颗粒必须通过流体流(150)、重力(其通过相对于重力垂直定向通道并使屏障位于底部来实现，如图所示)或一些其他力(例如光学、磁性、声学或流体力)主动地保持抵靠屏障。变体1052也仅具有一个屏障(1020)，其中细胞限制区域相对于重力垂直定向，但是屏障在顶部，因此流体流(150)必须克服重力沉降力，以便将细胞支撑(110)限制在限制区域(1010)内。该设计通过停止流体流并允许细胞支撑(110)克服重力沉降，便于容易地移出细胞支撑以进行细胞回收。最后，变体1053没有屏障并且相对于重力垂直定向。在这种情况下，细胞支撑(110)的沉降力被流体流的力精确地平衡，并且它们的净移动为零或接近于零。这将它们保持在限制区域(1010)内。
图11A和11B示出了用于从限制区域(1010)收获细胞支撑(110)的各种实施方式。在实施方式1151中，力1100破坏、移除或使得能够移除屏障1010中的一个。这种力可以是光学的、电的、机械的、热的、声学的或磁性的。一旦屏障中的一个被移除，然后流体流150就可以将细胞支撑(110)推出限制区域并到达收获区域或装置(1120)。在实施方式1152中，力(1100)移除与流体流正交的通道壁(1110)中的一个。这产生了新的侧通道，该侧通道可用于运输细胞支撑以收获(1120)。在图11B中，实施方式1153显示了移除底部屏障(1020)的力(1100)。这允许细胞支撑(110)由于重力而沉降并且容易地被运输到收获区域(1120)。最后，在实施方式1154中，将整个细胞限制区域移出装置并运输到收获区域或装置(1120)。
图12说明了使用一个或多个外力来增强装置性能的概念。这种力可以是电的、磁性的、光学的、声学的、化学的、热的或流体的。实施方式1250示出了使用力将样品分析物(115)浓缩或优先定位在细胞限制区域(1210)内，以增加与细胞支撑(110)的相互作用时间，从而最大化细胞对分析物作出响应的可能性。这还可以包括对细胞限制区域周围的通道的物理修改(1225)。所示的一个实施方式是使用锯齿结构来增强电介质聚焦。在另一个实施方式1251中，以排斥样品分析物(115)的方式修改通道，从而降低痕量的例如病毒或细菌粘附在通道壁上从而不与限制区域(1210)内的细胞相互作用的可能性。这可以通过使用主动力以及可能排斥样品分析物的物理或化学涂层(例如疏水涂层)来实现。图12，实施方式具有相互作用区域/区，其将使用外力(光学、磁性、电动、声学或其他)来定位细胞，使得它们不会由于条件培养基或其他流体利用泵(135、145)前后流动通过它们而丢失。
图13，该实施方式涉及使用3D流体动力学聚焦以将水相(条件培养基/测试流体)包含在油鞘内。聚焦区域将在流体通道中遇到加宽(圆形、方形、金字塔形、圆锥形或其他形状)。细胞将通过附着到表面、固定在支架或大的微载体中而包含在该区域中。油扩散到外部区域和水相覆盖细胞并通过使它们通过包含细胞的区域前后流动而允许暴露。
如本领域技术人员所知，与诸如疫苗以及细胞和基因疗法产品之类的生物产品的制造相关的一个严重问题是无意中引入外来剂(内源性的或外源性的)。使用基于光学力的测量，例如使用LFC来检测生物反应器条件培养基或生物制造中使用的其他流体中的外来剂(AA)获得的那些，是本文所述新方法的重要能力。本发明的方法能够对质量进行关键评估，并防止细菌、病毒或其他复制/活污染物危害药物的生产。使用LFC的高级AAT的最终目标是阻止和限制可导致患者潜在感染的药物产品中的任何可能包括。在生物制造中使用LFC测量病毒传染性的整个过程如图4所示，其中来自生物反应器或其他制造过程的条件培养基(CM)与在悬浮液或粘附培养物中生长的细胞混合，并比根据美国食品药品监督管理局指南需要14天或更长时间的当前方法孵育更短的时期。使用空白样品作为对照对相同的细胞进行监测。细胞暴露于条件培养基的时间量可以作为测定优化的一部分进行调节。
在一个实施方式中，当使用LFC监测AA时的第一道防线是使用CHO或用于生物生产的另一种细胞系直接作为可以使用LFC测量的响应细胞。虽然并非所有病毒都会在CHO细胞(和其他生产细胞系)中引起细胞病变效应，但许多病毒都会引起，这为实时监测CHO细胞在生产过程中的变化奠定了基础。使用LFC测量的变量偏差可用作AA潜在污染的指标。这在图5中示出，其中给出了使用RadianceTM/LFC进行AAT的总体策略。生产中使用的CHO细胞通过采样系统不断监测，该系统移出细胞并将其引入RadianceTM进行LFC分析，以测量其内在特性的变化，从而监测AA。如果存在AA，则CPE可能可见，这与用于监测蛋白质生产的LFC测量变量的任何变化不同。样品也可以从生物反应器中移出，并使用LFC在RadianceTM中单独运行，而不是在线分析。可以移出条件培养基(CM)并与进行或不进行浓缩的细胞一起孵育(例如，离心以浓缩潜在的AA)。在孵育期后或整个孵育期，可以监测细胞的AA的迹象。RadianceTM/LFC可以筛选出潜在感染的细胞，并收集它们使用其他方法进行分析，包括光谱学(荧光、拉曼或其他)、聚合酶链式反应(PCR)、下一代测序(NGS)、质谱(MS)、细胞术(流式、荧光、质量或图像)或其他方法。
对于那些在CHO细胞中不引起细胞病变效应的病毒，可以使用其他细胞系进行检测。图6显示了病毒的部分列表，并根据细胞病变效应和复制对其进行分类。这表明四种细胞系可以提供对潜在病毒的良好覆盖：Vero细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、MRC-5细胞和人肾成纤维细胞(324K)。该图不限于这四种细胞系，可以使用其他现有的细胞系，以及针对特异性易感性修饰的新开发的细胞系。
在另一个实施方式中，本文所述的方法可用于基于特定的数据模式对病毒或其他AA进行分类。有几种方法可以用于此，包括人工神经网络(ANN)、模式识别或其他预测分析方法。这种使用LFC数据的具体数据示例在图22中示出。这里，使用大约17个LFC参数作为输入，使用ANN将测试样品分类为三种潜在病毒之一。
在某些实施方式中，为了加速分析，多个细胞系可以作为体外岗哨细胞系与条件培养基(CM)或另一种分析物同时运行。在某些实施方式中，岗哨细胞是对被监测或检测的条件(病毒、细菌、支原体、感染或其他AA)易感的细胞，并且可以使用LFC测量它们的响应。图7显示了在每个孔或生物采样系统中使用多个体外岗哨细胞系的多重测定。通过参数空间或使用其他标签、荧光、视觉亮场显微镜鉴定或其他手段在RadianceTM/LFC中分化细胞的能力将通过允许细胞一起孵育并同时运行而大大增加产量。被工程化为在RadianceTM/LFC中具有不同参数(因此它们不会相互混淆)的细胞可以用于多重化测定。通过修饰细胞具有不同性质来进行多重化的方法包括但不限于：基于荧光的——绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和并入巨噬细胞系或其他细胞系中的其他基因修饰，从而可以确定哪一种报告了由于AA引起的细胞病变或其他效应。仅作为实例，使用LFC分析的细胞也可以用染色剂、染料、抗体缀合的珠标记物、亲和结合的珠或分子、纳米颗粒(Au、Ag、Pt、玻璃、金刚石、聚合物或其他材料)进行标记。纳米颗粒可以具有不同的形状(球形、四面体、二十面体、棒状或立方体等)和尺寸，以实现两个目标：1)不同的进入细胞的方式，2)改变使用LFC可测量的光学力。
在某些实施方式中，可以将纳米颗粒与细胞一起孵育，并且对于细胞类型而言摄取将正常发生，或者可选地，可以通过化学或物理(例如通过电穿孔或通过脂质体促进)来增大纳米颗粒摄取，以增强纳米颗粒摄取百分比。细胞将与纳米颗粒和待测试的病毒一起孵育，病毒摄取到细胞中的差异增加将导致使用LFC测量的光学力的更大差异，从而提高病毒检测灵敏度。在可选实施方式中，纳米颗粒可以在暴露于细胞之前与病毒一起孵育。
在另外的可选实施方式中，吞噬特定数量珠的巨噬细胞在LFC中具有不同的性质，但仍会报告AA的存在。此外，可以仅分析细胞的特定部分，如细胞核、线粒体或其他细胞器。这不仅可用于增强AA的性能，还可用于增强包括传染性在内的其他基于细胞的测定的性能。
在多个方面中，细胞可以被基因工程化以具有不同的病毒、细菌、真菌或其他AA易感性，用作体外岗哨细胞，在一个实施方式中，在与RadianceTM/LFC一起使用的组(panel)中，将允许对AA检测的定制方法。将某些基因并入到细胞系中或从细胞系中消除某些基因可以使细胞系更容易感染特定类别的病毒、细菌或其他AA，从而提供具有病原体类型选择性的快速检测。这与使用LFC可能进行的广泛病毒鉴定相结合，将允许更好地鉴定病毒、细菌或其他类型的AA。
本文所述的新方法表明，通过立即使用LFC/RadianceTM(810)的分析，AAT可以直接发生在从生产生物反应器(800)中移出的细胞上，如图8所示。对于在生产细胞系(CHO或其他)中不产生CPE或其他效应的AA，可以在微型分析生物反应器(910)中使用额外的悬浮细胞系来刺激生长和用生产生物反应器中存在的任何AA感染。
在微型生物反应器(910)中生长的细胞系用于随后的采样，例如RadianceTM(920)可用于测试CM的AA，如图9所示。CM的样品从大型工艺生物反应器(900)被泵送到微型生物反应器中，然后可以使用LFC技术(920)(例如RadianceTM)定期对其进行采样，以确定是否存在外来剂。如果需要，可以使用多个生物反应器在生产过程中的不同时间点进行采样。在多个方面中，微型生物反应器将具有用于对细胞系进行感染迹象的光谱学分析的光学窗口，其可用于提供病毒感染或支原体、朊病毒、或细菌、真菌或原生动物感染的鉴定。
图10显示了巨噬细胞(吞噬外来物质(包括病毒、细菌、营养孢子和几乎任何其他物质)的白细胞)在本实例中作为体外岗哨细胞用于检测CM中存在的AA的用途。巨噬细胞以可通过LFC检测的独特方式对外来物质的存在作出响应，并且还可以吞噬外来物质(病毒、病毒包涵体、细菌孢子或营养细胞、外泌体或任何其他生物材料)，从而通过在巨噬细胞吞噬AA时将AA浓缩在其膜内来增加其折射率。这有助于增加LFC对AA的响应，并也使巨噬细胞成为方便和可检测的容器或运载体，供LFC分选和输送预浓缩的AA至其他技术以进行进一步分析。在该应用中，重要的是排除生物产生细胞(CHO或其他细胞)，使其不被巨噬细胞吞噬，从而影响测定结果。尽管推测CHO细胞2通常不会被吞噬，因为它们与巨噬细胞大小相同或更大3。可选的巨噬细胞活化(已知的活化剂，例如板结合、板组成、培养基添加剂、添加生物分子，包括脂多糖(LPS)、细菌或病毒蛋白等)可用于选择性地控制吞噬活性或表型状态，包括基因或蛋白表达的变化。
通过使用LFC/RadianceTM测量的许多参数，包括尺寸、速度(与光学力有关)、尺寸归一化速度、细胞体积、有效折射率、离心率、变形性、细胞粒度、旋转、定向、光学复杂性、膜灰度或使用LFC/RadianceTM测量的其他参数，使病毒、细菌或其他生物体检测的特异性成为可能。这表示使用包括图像在内的多变量参数空间来定义病毒或其他生物体的类别，用于AAT筛查目的。与光谱学联合将提供额外的特异性，包括拉曼、荧光、化学发光、圆二色性或其他方法。
本文所述的方法和装置可与美国专利申请序列号15,853,763(2017年12月23日提交)、16/349,530(2020年12月22日提交)、16/982,935(2020年9月21日提交)和16/378,067(2019年4月8日提交)、17/016,079(2020年9月9日提交)和美国临时专利申请序列号63/049,499(2020年7月8日提交)中描述和要求保护的发明结合使用，其每一篇全部并入本文。
本领域技术人员将认识到，基于给定应用或设计的要求和规范，所公开的特征可以单独使用、以任何组合使用或省略。当实施方式涉及“包括”某些特征时，应当理解的是，实施方式可以可选地“由”或“基本上由”任何一个或多个特征组成。考虑到本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
特别要注意的是，在本说明书中提供了值的范围的情况下，还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个值。这些较小范围的上限和下限也可以独立地包括或排除在该范围内。单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。本说明书和实例本质上被认为是示例性的，并且不偏离本发明本质的变化落在本发明的范围内。此外，本公开中引用的所有参考文献均通过引用整体单独并入本文，因此旨在提供补充本发明的使能公开的有效方式，并提供详细说明本领域普通技术人员水平的背景。

Claims (1)

1.一种用于制造生物产品的设备，其中所述设备防止引入外来剂，包括使用基于光学力的测量来检测生物反应器中的外来剂，并且其中在这样的设备中使用基于光学力的测量的过程基本上如图4所示。
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